METODOS GENERALES DE ANALISIS MICROBIOLOGICO DE LOS ALIMENTOS Principios de garanta de la calidad microbiolgica de los alimentos.

Generalidades sobre la toma de muestras y el anlisis microbiolgico de los productos finales: Principios ecolgicos, Fundamentos de los procedimientos analticos (heterogeneidad de la presencia de microorganismos en los alimentos, transporte de muestras, confianza en los procedimientos, dao o lesin subletal, evaluacin sistemtica de los medios de cultivo): Necesidad de valores de referencia. Muestreo: muestra nica, toma de muestras representativas. Utilizacin de microorganismos como marcadores (ndices e indicadores). 1. Principios de garanta de la calidad microbiolgica de los alimentos. El anlisis microbiolgico de alimentos no tiene carcter preventivo sino que simplemente es una inspeccin que permite valorar la carga microbiana. Por tanto, no se puede lograr un aumento de la calidad microbiolgica mediante el anlisis microbiolgico sino que lo que hay que hacer es determinar en la Industria cules son los puntos de riesgo de contaminacin o multiplicacin microbiana (los llamados Puntos Crticos del proceso) y evitarlos siguiendo un cdigo estricto de Buenas Prcticas de Elaboracin y Distribuccin del alimento (BPE). La prevencin, por tanto, est en evitar manufacturar productos de baja calidad microbiolgica y no en comprobar la calidad microbiolgica de los ya elaborados (lo que, por otra parte, presenta una relacin coste - beneficio muy baja por la gran cantidad de muestras que es necesario analizar). En el dasarrollo de las BPE hay que hacer un anlisis del riesgo consistente en determinar el peligro para la salud humana de un factor patgeno presente en un alimento y el medio como puede reducirse ese riesgo hasta valores infinitesimales por medios tecnolgicos. Este riesgo depede de de la DMI (Dosis Mnima Infectiva) del microorganismo y de los valores del mismo que se encuentren en el alimento; asmismo hay que valorar la carga inicial de microorganismos en cada una de las raciones del alimento, y el nmero de raciones o partes consumidas por la poblacin en un determinado tiempo. La letalidad del tratamiento a aplicar viene dada por la frmula = log10(N0/Nc) donde Nc son los valores aceptables del microorganismo a controlar y N0 la carga microbiana inicial para dicho microorganismo. Aplicando estas BPE las oscilaciones en la calidad microbiolgica del producto disminuyen y el anlisis microbiolgico es ms consistente puesto que permite detectar alejamientos de las BPE.

2. Generalidades sobre la toma de muestras y el anlisis microbiolgico de los productos finales. A.- Principios ecolgicos: Es necesario considerar la distribucin desigual de los microorganismos en los alimentos, lo que hace necesario seguir un esquema de toma de muestras para obtener resultados representativos. El nmero de criterios utilizados a la hora de juzgar la calidad microbiolgica de los alimentos debe limitarse al mnimo necesario para as poder aumentar el nmero de anlisis. Los criterios de anlisis aplicados han de ser especficos de cada alimento poque son diferentes los microorganismos patgenos y alterantes de cada tipo de alimento. B.- Fundamentos de los procedimientos analticos: B.1.- Heterogeneidad de la presencia de microorganismos en los alimentos: El factor ms importante en el anlisis es el muestreo, que incluye: (a) Evaluacin de la muestra necesaria para evitar la distorsin producida por los microorganismo que se encuentran en diferentes partes de las superficies, por ejemplo de las canales o de las mquinas, sistemas de alimentos heterogneos (ensaladas, platos congelados, etc.); (b) Determinacin del modo ptimo de remocin del micoorganismo de la muestra o lugar de muestreo y (c) La evitacin de la contaminacin ambiental durante la toma o transporte de muestras. B.2.- Transporte de muestras: Es importante evitar que durante el transporte de las muestras se produzca: (a) Multiplicacin de los microorganismos presentes y (b) Inactivacin de algn microorganismo. En general es conveniente hacer el transporte a temperaturas del entorne de 0 C por un tiempo no superior a las 24 horas, excepto en el caso de grmenes termotrofos. B.3.- Confianza en los procedimientos: Normalmente es necesario detectar bacterias que suponen entre 10-4 y 10-7 de la flora normal del alimento, flora sta inocua. Es necesario utilizar medios selectivos para detectar estos microorganismos presentes en proporciones tan bajas. Como norma general conviene probar experimentalmente los medios usados para determinar su selectividad y su productividad; as como no debe usarse un medio diseado para un producto en otro producto diferente porque las condiciones

ecolgicas pueden ser diferentes dando lugar a una distorisin de los resultados. B.4.- Dao o lesin subletal: Tratamientos tecnolgicos pueden producir daos subletales en los microorganismos que no pueden, en esas condiciones, ser sometidos rigurosamente a medios selctivos. Son necesarios medios de recupe-racin en los que hay que considerar: (a) El tipo de microorganismo a recuperar (G+, G-, hongo...), (b) El carcter y la intensidad del dao infligido, (c) El tipo de alimento en el que est el microorganismo y (d) El medio selectivo final. Una vez considerado esto puede decidirse el tratamiento a seguir. De una forma general, hay dos tipos de tratamiento de recuperacin: recuperacin en lquido (2 h. 25 en agua peptona) o en slido (>6 h. en agua LB o similar, incubando luego 4 - 6 h. a 25 C) seguido del tratamiento selectivo (siembra en medio selectivo o recubrimiento con agar blando selectivo). B.5.- Evaluacin siotemtica de los medios de cultivo: Dada la variabilidad debida a pequeos errores en la preparacin de los medios de cultivo, tanto los generales como los selectivos, es necesario hacer controles peridicos que permitan comprobar tanto que las bacterias buscadas crecen incluso a partir de clulas aisladas (colonias aisladas) como que las bacterias de la flora general son satisfactoriamente inhibidas (no crecen salvo cuando se siembra un gran volumen). Este tipo de control de los medios de cultivo se denomina ecomtrico. C. Necesidad de valores de referencia. Es necesario comparar los resultados con valores microbiolgicos de referencia. Estos valores de referencia no son formulaciones tericas de la carga microbiana aceptable, sino los valores obtenidos cuando la produccin del alimento se ha ajustado a las BPE (Buenas Prcticas de Elaboracin). La Microbiologa de alimentos puede evaluar el riesgo asociado a estos valores de referencia y cuantificar los valores asociados a un alimento concreto para medir su alejamiento de la referencia (y por tanto de las BPE). 3. Muestreo. El muestreo consiste en separa una serie de muestras representativas del lote para someterlas al anlisis microbiolgico. A. Muestreo nico

Cuando hay que hacer un muestreo de una partida nica de alimento hay que considerar que los datos de mayor importancia los proporcionan las normas de elaboracin y conservacin del alimento. Esto es especialmente importante en partidas de alimentos importados, sobre todo los enlatados. Ningn muestreo nico puede dar una garanta total de calidad microbiolgica del alimento; si se analizan 30 muestras de una partida suficientemente grande y no aparece ninguna en malas condiciones microbiolgicas, an hay una probabilidad razonable de que el 10% del lote sea microbiolgicamente defectuoso. Como norma general, si se trata de un lote desconocido es conveniente analizar un nmero de muestras equivalente al 1% si el lote es grande y al 10% si es pequeo. Aunque estos valores hay que adecuarlos a las condiciones reales. Cuando se analiza una muestra nica el mejor criterio de seguimiento son las especificaciones del fabricante. Las muestras nicas estn siempre sometidas a una gran probabilidad de falsos negativos. B. Analisis repetido. Se pueden definir dos tipos de riesgomicrobiolgico: (a) el riesgo del consumidor: probabilidad de aceptacin de lotes substndard y (b) el riesgo del fabricante: probabilidad de rechazo de lotes substndard. Un sistema de muestras basado en el anlisis de 10 muestras al azar y rechazo del lote cuando se detecte una defectuosa obligar al fabricante a establecer medidas de seguridad suficientes para proteger adecuadamente al consumidor. C Planes de muestreo de tres categoras. Se aceptan con condiciones algunos alimentos que sobrepasen la norma microbiolgica establecida conforme a los valores microbiolgicos de referencia. Clase: aceptable, grado intermedio, inaceptable. [En aquellos casos en que el obtener valores ms altos que los de referencia no hace inaceptable el alimento]. D. Toma de muestras representativas. Una vez decidido el nmero de muestras que hay que tomar, han de seleccionarse stas de forma estadsticamente representativa utilizando tablas de nmero al azar. Dentro de cada unidad hay que tomar muestras representativas de todos los constituyentes del alimento, para ello se debe homogeniezar la muestra usando batidoras o stomacher.

4. Utilizacion de los microorganismos como marcadores (indices e indicadores). A. Introduccin histrica, terminologa y bases de su utilizacin. Historicamente, desde hace un siglo se estudia la deteccin de, primero, E. coli y posteriormente, el grupo coli-aerogenes (enterobacteriaceas) como ndice de contaminacin final en lugar de investigar la presencia de Salmonella typhi. B. Terminologa Microorganismo ndice: aqul cuya presencia aletar de la posible presencia de un microorganismo patgeno relacionado ecolgicamente con l. (Ej.: E. col ndice de S. typhi). Microorganismo indicador: aquel cuyo mumero indica un tratamiento inadecuado o una contaminacin posterior del alimento analizado. Un microorganismo dado puede actuar como ndice e indicador simultaneamente, incluso en un mismo alimento. A pesar de que actualmente es posible detectar casi cualquier tipo de microorganismo patgeno, se siguen llevando a cabo anlisis de microorganismo determinados como marcadores por razones de economa, rapidez y sensibilidad. Los princiaples marcadores son: grupo coli-aerogenes, E. coli, y estreptococos del grupo D de Lancefield.