Quim. Nova, Vol. 27, No.

1, 157-159, 2004

Said G. C. Fonseca Departamento de Farmcia, Faculdade de Farmcia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Cear, Rua Capito Francisco Pedro, 1210, 60430-370 Fortaleza - CE Leila B. L. da Silva, Rebeka F. Castro e Davi P. de Santana* Departamento de Farmcia, Faculdade de Farmcia, Universidade Federal de Pernambuco, Rua Prof. Arthur de S, s/n, Cidade Universitria, 50750-520 Recife - PE Recebido em 17/10/02; aceito 10/6/03

VALIDATION OF THE ANALYTICAL METHODOLOGY FOR EVALUATION OF LAPACHOL IN SOLUTION BY HPLC. Lapachol is a naphthoquinone found in several species of the Bignoniaceae family possessing mainly anticancer activity. The present work consists of the development and validation of analytical methodology for lapachol and its preparations. The results here obtained show that lapachol has a low quantification limit, that the analytical methodology is accurate, reproducible, robust and linear over the concentration range 0.5-100 g/mL of lapachol. Keywords: lapachol; validation; HPLC.

INTRODUO O lapachol [2-hidroxi-3-(3-metil-butenil)-1,4-naftoquinona] (1) uma naftoquinona encontrada em diversas espcies vegetais da famlia Bignoniaceae, especialmente aquelas do gnero Tabebuia. Possui atividade antimicrobiana contra bactrias e fungos, antiviral, antiinflamatria e principalmente anticncer, atuando sobretudo nos tumores slidos1. Em virtude de suas propriedades farmacolgicas, este ativo tem sido bastante estudado visando sua utilizao na teraputica. Como passo inicial de um estudo de desenvolvimento galnico com a droga2, faz-se necessrio o desenvolvimento e A validao de uma metodologia analtica capaz de quantificar a droga e os produtos farmacuticos preparados a partir dela. Os objetivos deste trabalho consistem no desenvolvimento e validao de metodologia analtica para o doseamento do lapachol e suas preparaes. MATERIAIS E MTODOS Materiais e equipamentos Lapachol Sigma, Lote: 33H34575; -lapachona preparado pelo Instituto de Antibiticos da UFPE; metanol grau UV/HPLC; gua purificada obtida atravs de Milli-Q para uso em CLAE. Os demais reagentes e solventes utilizados foram de grau analtico. Sistema de cromatografia lquida de alta eficincia HP-Srie 1100 (Hewlet Packard), munido de degaseificador, bomba quaternria, injetor manual com loop de 20 L, coluna cromatogrfica Lichrosorb RP-18 250x4 mm (Merck), detector UV e integrador HP 3395. Metodologia A escolha da fase mvel foi realizada atravs da mistura binria de solventes constitudos por metanol e soluo aquosa de cido
*e-mail: d-santana@bol.com.br

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actico a 5%, partindo-se da proporo 95:5 at 70:30, observando o cromatograma quanto ao perfil cromatogrfico e resoluo entre o pico do lapachol (1) e da -lapachona (2), fixando-se o fluxo em 1 mL/min. Foi selecionado, em termos de sensibilidade e repetibilidade, o melhor comprimento de onda a ser utilizado na deteco do lapachol, dentre os comprimentos de 251, 278 e 331 nm citados na literatura3. A validao da metodologia analtica foi determinada segundo os critrios descritos na norma ICH International Conference on Harmonization of Thechnical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for human Use tpico Q-2b, de 19964. Almejando as melhores e mais reprodutveis condies de integrao, as concentraes de 1, 2, 5, e 8 g/mL foram repetidamente injetadas e cada cromatograma obtido foi reintegrado usando o parmetro Rudo (Threshold) em diferentes valores, sendo possvel a construo de 9 curvas de calibrao e seus respectivos coeficientes linear e angular da reta, os quais foram comparados. Os valores de rea de uma das concentraes (1 g/mL) tambm foram diretamente comparados entre diferentes pares de valores de rudo em relao quele considerado como mais adequado para a construo da curva de calibrao, atravs da anlise de varincia entre duas mdias, objetivando constatar a existncia ou no de significncia na sua diferena. Cada cromatograma teve a altura do pico de lapachol medida com paqumetro (0,002 cm), sendo os valores encontrados corrigidos para seu equivalente em atenuao zero (ATT^0), segundo a especificao do fabricante do integrador, e todos os ensaios acima descritos foram repetidos usando os valores de altura dos picos em lugar da rea. Para avaliao da repetibilidade, uma mesma concentrao foi repetidamente injetada pelo mesmo operador e os valores de rea,

Nota Tcnica

VALIDAO DE METODOLOGIA ANALTICA PARA DOSEAMENTO DE SOLUES DE LAPACHOL POR CLAE

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tempo de reteno, largura e altura dos picos obtidos foram registrados e comparados. A reprodutibilidade, em termos de preciso intermediria, foi avaliada atravs da comparao entre as injees de uma mesma concentrao realizada em dias diferentes e por analistas diferentes, inferindo-se os resultados atravs da anlise de varincia. A linearidade foi avaliada pela aplicao de solues constitudas de diluies autnticas de lapachol padro em metanol nas concentraes de 0,01 g/mL at 1000 g/mL, que foram injetadas em triplicata no cromatgrafo e registraram-se os valores de rea e altura dos picos encontrados. Os valores foram acompanhados at constatar a continuidade ou no da resposta linear entre concentrao e rea e/ou altura do pico, avaliando-se segundo o modelo linear pelo mtodo dos mnimos quadrados. Os limites de deteco e de quantificao foram determinados matematicamente atravs da relao entre o desvio padro da curva de calibrao e sua inclinao, usando o fator multiplicador apropriado conforme sugerido pela norma ICH4. A robustez do mtodo foi avaliada mediante a utilizao de fases mveis ligeiramente diferentes, preparadas atravs da mistura dos componentes em balo volumtrico, proveta ou realizao da mistura no prprio equipamento. RESULTADOS E DISCUSSO Trabalhos anteriores5,6 relatam a utilizao de fase mvel constituda de acetonitrila : soluo aquosa de cido actico a 0,25% (1:1), fluxo de 2 mL/min e coluna RP-18, obtendo-se resoluo entre lapachol e quinonas relacionadas, incluindo metablitos como - e -lapachona. Em virtude do custo mais elevado da acetonitrila em relao ao metanol, testou-se a substituio daquele solvente como componente da fase mvel, ao mesmo tempo em que se buscava manter a resoluo sob um fluxo menor. Foi conseguida, com a mistura constituda de metanol : soluo aquosa de cido actico a 5% (80:20), fluxo de 1 mL/min, coluna Hibar Lichrosorb RP-18 250 x 4 mm, num tempo de corrida de 7 min, uma boa resoluo (4,53) entre o Lapachol e a -lapachona, como mostrado na Figura 1, onde se demonstra a especificidade do mtodo em relao aos analitos citados. Com relao seleo do melhor comprimento de onda a ser utilizado para doseamento do lapachol, os resultados (Tabela 1) mostram que, apesar da deteco no comprimento de onda de 251 nm apresentar maior sensibilidade (demonstrada pela rea mdia maior que nos demais comprimentos), houve maior variabilidade entre os valores, demonstrada pelo desvio padro da mdia e pelo respectivo coeficiente de variao, bem como pelos tipos diferentes de integrao. Com relao deteco no comprimento de onda de 331 nm, o valor integrado cinco vezes menor que aquele obtido a 278 nm, demonstrando pequena sensibilidade de deteco neste comprimento de onda. Em virtude disto, foi selecionado o comprimento de onda de 278 mn. O estudo de linearidade com injeo das concentraes de 0,01 g/mL at 1000 g/mL, em triplicata, encontra-se na Tabela 2.

Tabela 1. rea dos picos referentes a amostras de lapachol obtidos sob diferentes comprimentos de onda de deteco Injeo e Resultados 1 2 3 4 5 Mdia Desvio Padro C.V. (%) 251 nm Comprimentos de onda 278 nm 331 nm 850.099,0 852.727,0 832.776,0 859.724,0 857.736,0 850.612,4 010.684,6 1,256% 178.613 O valor muito pequeno da rea, comparado com os anteriores, mostrou ser intil continuar com as leituras neste de onda

1.459.371,0 1.383.330,0 1.241.549,0 1.205.572,0 1.253.367,0 1.308.637,8 0.107.793,5 8,237%

Tabela 2. reas e alturas dos picos obtidos a partir das concentraes de lapachol em soluo Concentrao (g/mL) 0,01 rea Resposta Altura (att^0) (cm) ---------3,623 3.561 3.619 7.302 7.242 7.402 33.736 33.216 33.504 65.872 65.472 65.472 690.816 707.584 721.280 1352.704 1353.216 1363.456 6987.776 6840.320 6893.568 ----

0,05

0,10

0,50

1,00

10,00

20,00

100,00

1000,00

22.835 PV 17.570 VV 2.761 PV 37.764 PV 39.069 PV 37.990 PV 68.253 PV 69.747 PV 72.034 PV 278.122 PB 276.757 PB 276.727 PB 533.832 PB 535.091 PB 531.170 PB 5.466.730 PB 5.626.221 VB 5.702.128 VB 10.662.224 PB 10.589.360 PB 10.565.024 PB 56.901.056 ISPH 56.800.832 ISPH 57.015.808 ISPH 240.266.880 ISHH

Figura 1. Perfil cromatogrfico de -Lapachona (tr=4,329) e Lapachol (tr=5,335)

Foi obtida a linearidade do mtodo analtico na faixa de estudo de 0,05 a 100 g/mL para dados medidos em altura e de 0,1 a 20 g/mL para os dados medidos em rea. Injees de uma mesma concentrao (20 g/mL) realizadas no mesmo dia e mesmo laboratrio, pelo mesmo analista, encontram-se na Tabela 3 e demonstram a repetibilidade dos resultados, analisados por rea como por altura, tendo valores de coeficiente de variao menores que 0,5%. Os resultados das injees de uma mesma concentrao realizadas em dias diferentes pelo mesmo analista ou por analistas diferentes encontram-se na Tabela 4. A anlise de varincia demonstra no haver diferena significativa ao nvel de 95% de confiana entre todos os pares de valores. Foi constatado que o mtodo bastante sensvel a modificaes da forma de preparao da fase mvel, como ilustram os dados da Tabela 5, referentes aos dados de rea e altura para o pico do lapachol,

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Validao de Metodologia Analtica

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Tabela 3. Avaliao da repetibilidade do lapachol em relao rea e altura rea Dados 10.694.480 VB 10.700.296 PB 10.696.592 PB 10.694.544 PB 10.674.776 PB 10.689.632 PB 10.691.720 8992.58 0.0841 Altura (cm) 1348.608 1341.440 1353.216 1350.656 1345.024 1348.096 1347.840 4.156 0.3084

Tabela 4. Avaliao da reprodutibilidade do lapachol Analista Dia Mdia Varincia Desvio padro Coeficiente de variao A 1
5.486.534,5

2
5.340.423,25

B 3
5.416.555,8

1,50752 x 1010 4,92164 x 109 4,88665 x 109 122.781,1 2,2379% 70.154,4 1,3136% 69.904,6 1,2906%

Mdia Desvio padro Coeficiente de Variao (%)

Tabela 5. Avaliao da robustez do mtodo de dosagem do lapachol Balo rea 1143949 1144094 1152584 1146778 1144738 1148348 1146749 3332,8 0,2498 Altura (*) 144,704 144,800 145,088 145,088 144,736 144,512 144,821 0,2278 0,1573 rea 1060262 1068458 1071394 1062848 1077589 1062131 1067114 6630,7 0,6214 Proveta Altura (*) 129,408 130,080 129,088 129,728 130,016 129,984 129,717 0,3959 0,3052 rea 1134899 1112294 1132881 1152405 1134703 1136145 1133888 12782,6 1,1273 CLAE Altura (*) 144,320 144,032 145,280 144,929 145,344 145,088 144,832 0,5366 0,3705

Mdia D.P. C.V. (%)

(*) As medidas da altura, em cm, correspondem a medida equivalente obtida em atenuao 0 (zero), segundo especificaes tcnicas do fabricante do integrador HP obtidos com fases mveis preparadas em proveta ou em balo volumtrico, ou ainda misturados pelo prprio equipamento durante a anlise. Com os dados desta tabela, foi realizada a anlise de varincia entre pares de colunas. Apenas os valores de altura obtidos com fase mvel preparada em balo e os obtidos com a mistura diretamente em CLAE no so significativamente diferentes ao nvel de 95% de confiana. Todos os demais pares de valores foram considerados significativamente diferentes. Assim como o grau de disperso das mdias, representado pelo respectivo desvio padro e ainda pelo coeficiente de variao, para os valores obtidos com a fase mvel preparada em balo volumtrico apresenta-se menor, optou-se por utiliz-lo em todas as demais anlises. Atravs da medida da linearidade, com os dados obtidos por rea, foi calculado o limite de deteco e quantificao atravs das Equaes 1 e 2, respectivamente, tendo sido obtidos os valores 0,318 g/mL para o limite de deteco e de 0,953 g/mL para o limite de quantificao. Esses resultados demosnstram que o mtodo proposto suficientemente sensvel para detectar e quantificar uma amostra na qual cada 20 L contenha 6,4 ng e 19,0 ng de lapachol e -lapachona respectivamente. Esses valores so menores que os citados por Awang5, que apresenta 100 ng como o limite de deteco para o lapachol a 254 nm. O prprio ensaio de linearidade demonstra ser capaz de quantificar concentraes de 0,05 g/mL, correspondendo a uma quantidade de 2,5 ng de lapachol num volume injetado de 20 L, portanto inferior quele determinado pelas equaes abaixo: (1) LD e LQ, Limite de deteco e de quantificao, respectivamente; DP o desvio padro da reta de calibrao; B o coeficiente angular da reta de calibrao CONCLUSO O mtodo analtico proposto para a deteco e quantificao do lapachol por CLAE, usando coluna Lichrosorb RP-18 250x4 mm e fase mvel constituda por metanol: soluo aquosa de cido actico a 5% (80:20) preparada em balo volumtrico, deteco em UV a 278 nm, mostrou-se sensvel, preciso, econmico, reprodutvel, robusto e linear nas faixas de 0,05 a 100 g/mL, sendo adequado avaliao da qualidade de amostras diversas que contenham lapachol. REFERNCIAS
1. Rao, R. V.; McBride, T. J.; Oleson, J. J.; Cancer Res. 1968, 28, 1952. 2. Fonseca, S. G. C.; Tese de Mestrado, Universidade Federal de Pernambuco, Brasil, 2001. 3. The Index Merck, 12a ed., 1996. 4. European Agency for the Evaluation of Medicinal Products: ICH topic Q2b, London. 1996, 4. ICH topic Q-2b Validation of analytical procedures: methodology , European Agency for the Evaluation of Medicinal Products, London, 1996. 5. Awang, D. V. C.; Kindack, D.; Dawson, B. A.: J. Chromatogr. 1986, 368, 439. 6. Glen, V. L.; Hutson, P. P.; Kehrli, N. J.; Bootman, D. A.; Wilding, G.; J. Chromatogr., B: Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 1997, 692, 181. 7. Fonseca, S. G. C.; Castro, R. F.; Santana, D. P.; Resumos do 6o Pharmatech, Recife, Brasil, 2001.

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