1.

introduccin Cebada puede ser cultivado en condiciones ms duras que muchos otros cultivos, principalmente debido a su alto tolerancia a la sequa y bajas temperaturas *1+. La comprensin de los mecanismos por los cuales la cebada capas pluviales por el fro y las heladas, es esencial para la obtencin de nuevas variedades tolerantes y por lo tanto para aumentar los rendimientos en zonas de baja produccin. Al igual que otras plantas de la tribu Triticeae, existe la cebada en las variedades de primavera e invierno. Para el invierno variedades, cultivadas en las zonas donde las temperaturas durante el invierno cada por debajo de cero, el alto heladas la tolerancia es crucial. Por otra parte, estos cultivares requieren una seal externa para la transicin vegetativa a partir fase en fase reproductiva, esta seal puede ser vernalizacin o longitud del fotoperodo *2+. La se alcanza la mxima tolerancia a las heladas durante la fase vegetativa de crecimiento por el fro endurecimiento proceso (aclimatacin), que se lleva a cabo principalmente en el otoo *3+. La primera etapa de fro endurecimiento comienza a bajas temperaturas por encima de 0 C, mientras que la segunda etapa requiere considerablemente ms baja pero an las temperaturas no letales *4+. Endurecimiento en fro conduce a alteraciones en la membrana plasmtica la composicin, cambios en el metabolismo de hidratos de carbono y el metabolismo secundario, la fotosntesis, mejorar los procesos de desintoxicacin y oxidoreduccin, el aumento de la produccin de osmolitos y la sntesis de las protenas relacionadas con el estrs *5+. Entre las protenas de choque trmico, estos ltimos (HSP) y finales abundantes protenas embriognesis (LEA) representan una clase importante de molculas protectoras *6+. Protemica estudios relativos a estrs abitico en las plantas se resumieron recientemente *7+; a bajas temperaturas, una aumento en la acumulacin de enzimas glucolticas, los componentes de transporte de electrones fotosinttica cadena, la protena de unin al ARN CP29, especies reactivas del oxgeno enzimas eliminadoras, protenas LEA, acompaantes y 70 kDa de protenas de choque trmico (HSP70) se ha observado en varias ocasiones mientras que la acumulacin de las enzimas que participan en el anabolismo sacrido se redujo.

Slo unos pocos estudios protemicos tratados bajas temperaturas efecto sobre las plantas que pertenecen a la tribu Triticeae, en todos ellos, el trigo se utiliza como un modelo *8-11+. Nuestro conocimiento de los procesos de endurecimiento en fro en la cebada es hasta la fecha basado principalmente en transcriptmica estudios y estudios utilizando una electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional. Entre los mejores caracterizado genes inducidas por el fro, no pertenecen Wcs120 *12+ y DHN5 *7,13+; protenas codificadas por estos genes podran servir como marcadores heladas tolerancia *14,15+. Se demostr que la mayora de fro genes regulados en la cebada reaccionaron tan pronto como corto perodo de fro (1 da) producido y slo una limitada nmero de genes de cebada muestra respuesta duradera al tratamiento fro prolongado *16+. Alrededor del 67% de genes de respuesta al fro se encontr que eran los genes del cloroplasto dependiente de fro-regulados en tejidos de hojas. Por lo tanto se sugirieron los cloroplastos para jugar un papel importante en el control de la adaptacin molecular cebada al fro *17+ y que se proponen como un objetivo para la mejora de los cultivos *18+. El vnculo entre el cloroplasto

Actividad y la susceptibilidad de la planta al estrs junto con retrgrada plstido-a-ncleo de sealizacin se demostr en Arabidopsis thaliana *19+. En los cereales de invierno, se ha demostrado que la supervivencia de una planta depende de la supervivencia de su corona tejidos *20-22+. Esta parte de una planta conecta las races y el tallo y contiene tejido meristemtico que es responsable de la restauracin del crecimiento en la primavera. Recientemente, diferentes patrones de transcripcin de los genes involucrados en las vas responsables de la produccin osmolyte (sacarosa, rafinosa, cido -aminobutrico), metabolismo de sealizacin de azcar (metabolismo de trehalosa) y secundaria (sntesis de lignina) se observaron en hojas de cebada y coronas a bajas temperaturas *23+. En nuestro estudio, la respuesta de las hojas de cebada y coronas a las bajas temperaturas (1 da de choque fro, 21 das aclimatacin al fro, 1 da frost shock) ha sido estudiado por acoplamiento 2D-DIGE con huellas dactilares pptido mtodo de identificacin de protenas mediante MALDI-TOF espectrometra de masas. El objetivo de este estudio fue caracterizar los procesos que conducen a una mayor resistencia al invierno en tejidos distintos a nivel roteoma. 2. Resultados y Discusin 2.1. Anlisis protemico Las plntulas de cebada de invierno fueron expuestos a "golpe de fro" (1 da de 3 C), "aclimatacin" (21 das de 3 C) y "Choque de Escarcha" (1 da de -3 C despus, aclimatacin al fro) y las protenas extradas de las hojas y coronas fueron separados utilizando 2D-DIGE (Figura S1 en los datos suplementarios). En cada uno de gel, se distinguieron aproximadamente 1200 puntos de protenas (Figura 1) y con respecto al gel para gel varianza, que era posible cuantificar aproximadamente 700 protenas en coronas y 600 protenas en hojas. El menor nmero de protenas cuantificados en hojas podra explicarse por la presencia de muy protenas de cloroplastos abundantes (como Rubisco grandes y pequeas cadenas, vea la Figura 1b, aproximadamente 60 kDa y 20 kDa) en las hojas lo que disminuye la posibilidad de detectar las protenas de baja abundancia. Este dificultad puede ser resuelto por el agotamiento de la Rubisco, sin embargo, cada manipulacin con muestras trae tambin cambios artificiales en protenas niveles de abundancia. Por lo tanto, el uso de tejidos no photosyntetic, tales como coronas en los cereales, para los enfoques protemicos basados gel puede proporcionar una mejor visin sobre el comportamiento de baja abundantes protenas que no son detectables en las muestras de hojas.

Figura 1. Mapas representativos proteoma de 50 mu g de protenas totales (a) y coronas (b) las hojas de cebada (Hordeum vulgare L.) separados por dos gel diferencia dimensional electroforesis (2D-DIGE) (24 cm inmovilizados gradiente (IPG) tira pH, pI 4-7, 1 mm gel espeso). Por lo menos dos veces arriba o hacia abajo-acumulada protenas (p = 0,05, t-test, n = 3) sonmarcados con los nmeros de puntos correspondientes.

En total, 90 protenas en coronas y 63 protenas en las hojas cambian su abundancia por lo menos dos veces en consecuencia del tratamiento de fro y las heladas de acuerdo a la prueba t de Student (p = 0,05, tres biolgica repeticiones). Al emplear el mtodo de toma de huellas digitales de pptidos, protenas en coronas 48 y 39 en protenas Se identificaron hojas (Tablas 1 y 2, el cuadro S1 en los datos adicionales); entre ellos varias protenas con la relacin que se ha documentado el estrs por fro o congelacin se encuentran, por ejemplo, (HSP70) y chaperoninas *24,25+. Con el fin de facilitar la comparacin con los estudios de transcriptoma, sonda correspondiente establece los identificadores de Cebada 1 chip de Affymetrix *16,17,23+ han encontrado 8 protenas identificadas (Tablas 1 y 2, Int. J. Mol. Ciencia. 2013, 14 8004 Tabla S1 en los datos adicionales). Varias protenas (por ejemplo, en lugar fructoquinasa n. 1304, 1311) fueron identificado ms de una vez en el mismo tejido; estas protenas observadas repetidamente diferan en molecular de masa y / o pI observ en gel que es probablemente debido a las diferentes isoformas de la misma protena, protena modificaciones o protelisis intracelular. Algunas de las protenas acumuladas diferente no eran identificado como sus abundancias sobre gel de no eran lo suficientemente alta para el mapeo de pptido posterior (Los espectros de masas de pptidos de calidad adecuada no se obtuvieron los espectros de masas o pptido no lo hizo coincidir con ninguna protena en la base de datos). Slo una protena se identific en las muestras de ambos tejidos-glutamina sintetasa (gi | 755762) con una disminucin casi similar de la abundancia despus de fro en ambos tejidos (punto n. 6.806 en coronas y 2510 en las hojas), por otra parte, la glutamina sintetasa GSr1 (gi | 40317416) isoforma de coronas tambin se redujo su abundancia. En total, cinco miembros de diferentes familias de protenas se han identificado en ambos tejidos; AAA ATPasa (gi | 255070529 en hojas y gi | 194707130 en coronas), protenas ribosomal (60S en hojas-gi | 225465175; 40S en coronas-gi | 357113738), factor de elongacin Tu (gi | 226508704 en hojas, gi | 326514754 y gi | 357149925 en coronas), protones ATPasa vacuolar (gi | 145351306 en hojas, gi | 11527563 en coronas) y chaperonina 60 kDa (gi | 255560267 en hojas, gi | 326533328 en coronas). Se observ la notable diferencia entre la hoja y el tejido de la corona en lugar de la protena identificada 4106 como AAA ATPasa en geles de hoja. Punto 4106 aument su abundancia despus de choque trmico y la disminucin de su abundancia despus de aclimatacin al fro en las hojas, mientras que en las coronas de la abundancia de AAA ATPasa fue disminuyendo constantemente en el transcurso de la exposicin a bajas temperaturas. La diferencia tambin se encontr en chaperonina 60 kDa, se produjo un aumento en la abundancia despus de la aclimatacin al fro en las hojas (Gi | 255560267) mientras que en las coronas, su abundancia se redujo (gi | 326533328) al mismo tiempo. Diferentes cambios en la abundancia de protenas de AAA ATPasa y de chaperonina 60 kDa podran explicarse mediante la identificacin de las diferentes isoformas con actividad probablemente un poco diferente bajo estrs por fro. Sin embargo, la mayora de las protenas identificadas en ambos tejidos mostraron cambios similares en abundancia en virtud el tratamiento en fro y este resultado lo pueden indicar en cierta medida la regulacin anloga de comn va fra respuesta en los tejidos vegetales estresados fros (como el aumento de los niveles deshidrina en fro con tratamiento

2.2. Procesos Biolgicos influenciada por bajas temperaturas en hojas y coronas Las funciones biolgicas de las protenas acumuladas diferente fueron determinadas por su GO anotacin en dominio de los procesos biolgicos de acuerdo con UniProtKB (Tablas 1 y 2, Tabla S1 en complementario datos). En total, 19 protenas (22% de las protenas identificadas) fueron asignados a la categora "desconocida" como su funciones no se han determinado todava. Sin embargo, este resultado indica que estos an "desconocido" protenas son fros reguladas (14 protenas revelaron una disminucin de la acumulacin y 5 protenas revel una aumento de la acumulacin durante el tratamiento en fro). La visin global de los procesos biolgicos afectados por las bajas temperaturas que se obtuvo mediante la aplicacin WEGO, la clasificacin funcional utilizando WEGO refleja el hecho de que una sola protena puede estar implicada en diversos procesos y por lo tanto clasificado en ms de una categora funcional. Despus de establecer el nivel de GO anotacin y cinco, 16 funcionales categoras fueron elegidos para cubrir nuestros datos y seal las diferencias existentes entre las hojas y coronas en respuesta a temperaturas bajas (Figura 2, Tablas S1 y S2 en los datos suplementarios).

Tabla 1. Lista de las protenas de altura o hacia abajo-acumul despus de la exposicin a bajas temperaturas en las coronas de las plantas de semillero de cebada de invierno. Las plantas fueron expuestos al choque fro, aclimatacin al fro y el choque heladas; protenas cumuladas diferente fueron las que cambi abundancia al menos dos veces (Prueba t de Student, p = 0.05, n = 3) en el curso del tratamiento a baja temperatura.

Figura 2. Clasificacin funcional de las protenas acumuladas diferente que muestra una comparacin entre las coronas y las hojas de cebada de invierno expuestos al fro y las heladas. En total, 48 protenas en coronas y 39 protenas en hojas fueron asignados a uno o ms de 16 categoras seleccionadas para la clasificacin utilizando Web Gene Ontology Anotacin de trazado (WEGO) aplicacin. En el eje Y el porcentaje de protenas acumuladas diferente possesing funcin biolgica similar en distintos tejidos se puede ver, en el eje x respectivos procesos biolgicos estn en la lista. WEGO clasificacin refleja el hecho de que la protena solo puede ser involucrado en varios procesos, por lo tanto suma de% en todas las categoras es superior a 100.

Los procesos metablicos "protenas" representa la categora funcional ms grande est formado por aproximadamente el 15% de las protenas identificadas tanto en las hojas y coronas. Regulacin del metabolismo de protenas; epresented por proteasas, factores de elongacin y protenas ribosomales, parece ser de la misma importancia en las hojas y las coronas en la respuesta a las bajas temperaturas. Nmero de protenas de esta categora sugiere importancia de unfunctional eliminacin protenas y la necesidad de proteosntesis reglamentacin. La segunda categora ms grande "procesos catablicos" (6% de las protenas acumuladas diferente identificados en hojas y 14% en coronas) confirma hallazgo de que el endurecimiento en fro es un proceso exigente activa y energtica anterior *27+. La siguiente categora grande, "metabolismo de compuesto de nitrgeno", fue influenciado a medida similar en ambos tejidos (11% de las protenas identificadas en las hojas y el 8% en coronas, por ejemplo, la sintetasa de glutamina) lo que implica importancia universal de estas protenas en respuesta al estrs

fro. Los cambios en el metabolismo de nitrgeno acumulacin de protenas relacionada Hasta ahora se han observado principalmente como consecuencia de la sequa y la salinidad estrs *7+.

Otras categoras funcionales notables contenan protenas implicadas en el "metabolismo de hidratos de carbono" (6% de las protenas identificadas en las hojas y 11% en Int.. J. Mol. Sci.. 2013, 14 8011 coronas, por ejemplo, la piruvato quinasa) y "respuesta al estrs" ( 6% de las protenas identificadas en las hojas y 11% en coronas, por ejemplo, peroxigenasa). Curiosamente, la protena de agruparse en la categora "metabolismo lipdico" (es decir, la lipasa "mayor susceptibilidad a la enfermedad 1"-EDS1; gi | 149 939 605, Tabla S1) se encontr slo en coronas. En este caso, es ms probable que la acumulacin de esta protena tambin se ha cambiado en las hojas, pero estos cambios fueron indetectables debido a la presencia de muy abundantes protenas fotosintticas en las hojas (vea la seccin 2.1.). No es de extraar que las protenas (33 kDa oxgeno evolucin de protenas del fotosistema II (PsbO), gi | 115436780; protenas de unin a clorofila ab, gi | 115778 y gi | 115793, Tabla S1) agrupados en "la fotosntesis, la reaccin de la luz" categora funcional tiene se encuentra slo en las hojas y no en las coronas que son tejidos no fotosintticos.

A causa de las diferencias encontradas en el nmero y la calidad de las protenas responsables de los procesos biolgicos por separado la influencia de las bajas temperaturas en distintos tejidos, es razonable creer en la existencia de algo diferentes estrategias de respuesta a la tensin baja temperatura en coronas (supervivencia de las plantas y la renovacin del crecimiento) y hojas (metabolismo de la energa), es decir, tejidos con diferente funcin biolgica *20+.

2.3. Las protenas con grandes cambios en la abundancia El anlisis exploratorio de los datos revel protenas perifricas en nuestros conjuntos de datos, las protenas que cambiaron su abundancia en exceso en comparacin con el resto de las protenas acumuladas diferente. Sobre la base de los grandes cambios en la acumulacin de estas protenas, podemos concluir que pueden desempear papeles importantes en la respuesta tolerante a las heladas cebada de invierno a baja temperatura. Dado que los conjuntos de datos observados en las hojas y coronas diferan en sus caractersticas, la magnitud de los cambios en la abundancia de protenas en las hojas fue mayor en comparacin con las coronas (Figura S3 S2 y Tabla de datos complementarios), el lmite de valores atpicos (las protenas que muestran cambios excesivos en abundancia) se ha establecido como valores diferentes para las hojas y coronas, respectivamente. El mtodo de diagrama de caja (2.698 ) sugiri 8 valores atpicos en las hojas que cambiaron su abundancia por lo menos 8 horas y 7 valores atpicos en las coronas que cambiaron la abundancia por lo menos 6 veces (Tablas 1 y 2, con ms detalle Tablas S1 y S3 en los datos adicionales).

En las hojas, se encontr que los valores extremos en todos los grupos (ver la seccin 2.4., La Figura 3, Tabla 2), excepto Cluster 1 (aumento de la abundancia) y slo 5 de las 8 protenas identificadas se conoce la funcin (Tabla 2, Tabla S1 en los datos adicionales ). Entre ellos, haba AAA ATPasa (gi | 255 070 529), que se encuentra en dos puntos, en lugar de 4106, su abundancia era 10 veces mayor despus de las heladas choque / aclimatacin al fro, mientras que en lugar de 3329, la abundancia fue 9 veces disminuy (Tabla S1 en de datos). De acuerdo a la posicin en gel, estos dos puntos difieren ligeramente en el peso molecular y pI (punto 4106: 117 kDa, pI 5,37 y el punto 3329: 112 kDa, pI 5,6), estas diferencias podran ser causados por modificaciones de protenas en respuesta a estrs heladas. Las protenas de la familia AAA son esenciales para muchas funciones celulares, incluyendo la degradacin de las protenas mal plegadas; previamente que se han observado como hasta-acumulada durante la aclimatacin en fro *28+. Otra protena altamente acumulado en las hojas era protena PsbO (gi | 115 436 780, 19 veces aumento despus de las heladas choque / golpe de fro), una parte del complejo de oxgeno en evolucin que estabiliza manganeso. Junto con el gen de la protena del cloroplasto PsbO varios otros genes son co-expresados, incluyendo ATPasas *29+, que est de acuerdo con nuestro hallazgo. La enzima UDP-glucosa 6-deshidrogenasa (gi | 226505792), la cual est involucrada en la desviacin de UDP-Glc a la biosntesis de la pared celular entre otros procesos, el aumento de la abundancia dos veces despus de choque de fro y luego se redujo la abundancia en exceso (10 veces disminuyeron despus de las heladas de choque / fro shock). Tensin baja temperatura conduce Int. J. Mol. Ciencia. 2013, 14 8012 a la deshidratacin celular y provoca cambios en el volumen celular y la organizacin compartimiento de la celda, por lo tanto, el ajuste de la pared celular es una necesidad para la celebracin de integridad de la clula; varias enzimas que participan en la formacin de UDP-Glc y biognesis de la pared celular por lo tanto han sido ya observada como arriba acumulado despus tratamientos de fro cortos, por ejemplo, UDP-glucosa pirofosforilasa o sacarosa sintasa 1 *30+. En las hojas, la protena hipottica VITISV_033291 "(gi | 147 785 747) fue 11 veces disminuyeron despus de choque trmico y luego 3 veces mayor tanto despus de aclimatacin al fro y los golpes heladas. Esta protena pertenece a la familia de protenas fosfatasa C (PP2C), una de las ms grandes familias del reino vegetal, y protenas de esta familia han sido encontrados como reguladores de las vas de transduccin de seales y tambin participa en el desarrollo *31+. Se ha demostrado por los enfoques antisentido que la baja regulacin de desarrollo de la planta PP2C acelerada y aumento de la tolerancia a la congelacin *32+; se observ una tendencia similar en nivel de protenas en nuestro experimento.

Outliers Corona se encuentran en todos los grupos, pero la mayora de ellos pertenecan al Grupo 2, 5 de los 7 valores atpicos fueron identificados. Entre las protenas identificadas con funcin conocida, se ha encontrado cloroplasto HSP70 (gi | 326492960, 7 veces mayor despus del choque de las heladas), que es una chaperona molecular en la prevencin de la agregacin de protenas y replegamiento en condiciones normales y de estrs. Tambin participa en la importacin de protenas, la translocacin y la degradacin *33+. Otra protena con cambios perifricos en abundancia en coronas era EDS1 (gi | 149939605, 7 veces aument despus del choque de las heladas en comparacin con el choque de fro) que controla, entre otros

procesos, la propagacin de la muerte celular en respuesta a especies reactivas del oxgeno cloroplasto derivados de *34+. Los siguientes dos valores atpicos identificados en coronas (OsI_16233 hipottica protena y protena hipottica SORBIDRAFT_06g029250) son de acuerdo a GO anotacin involucrados en la respuesta de defensa, la ltima protena identificada (prevista protena gi | 326 505 132) no ha sido asignado a cualquier funcin todava.

Curiosamente, la medida de los cambios en la abundancia de protenas y la aparicin de valores atpicos son generalmente ms altos en las hojas, lo que implica una necesidad de un mayor nivel de proteosntesis y la degradacin de protenas durante la aclimatacin al fro. El hecho de que los nmeros de todas las protenas acumuladas diferente fueron mayores en coronas (Tabla 1) corresponda a la importancia de coronas para la supervivencia de las plantas *20+.

Por otra parte, los valores atpicos se encuentran en las hojas mostraron gran aumento (por ejemplo, 33 kDa oxgeno evolucin protena del fotosistema II) o disminuir (por ejemplo, UDPglucosa 6-deshidrogenasa) en abundancia principalmente despus de aclimatacin al fro y el choque heladas y que pertenecan sobre todo a la Categora 2 y 3 mientras que en la mayora de las coronas de los valores extremos montado su abundancia despus del choque heladas (por ejemplo, EDS1) y fueron ordenados a la Categora 3. Esto implica que las protenas con grandes cambios en la abundancia fueron altamente acumulan en tratamiento fro en coronas (por ejemplo, HSP70, EDS1) contraria a la alta disminucin de cierta acumulacin protenas en las hojas (por ejemplo, PsbO, UDP-glucosa 6-deshidrogenasa, AAA ATPasa) en al menos un tiempo de muestreo durante el tratamiento en fro. Desde nuestros estudios anteriores sobre dehidrinas, por ejemplo, *7+, se sabe que los cultivares de invierno cultivos se acumulan algunos compuestos protectores tales como dehidrinas tambin bajo condiciones de temperatura ptima de 20 C y estas protenas se acumulan en los niveles ms altos en coronas que en las hojas *26 +. Por otro lado, deja como rganos hotosynthetic juegan un papel importante en un proceso de energa-exigente de aclimatacin en fro, que se necesita para la supervivencia de las plantas a bajas temperaturas. Por lo tanto, nuestros resultados indican que despus de detectar fra las clulas de las hojas reorganizaron algunas de sus anablico y catablico procesos en un grado superior en comparacin con las clulas de la corona, estos grandes cambios podran ser el fin de proteger aparato fotosinttico.

Figura 3. Jerrquica anlisis de agrupamiento de las protenas acumuladas diferente en (a) las coronas y (b) en las hojas en el curso de la exposicin a bajas temperaturas. Cajas rojas marcan los grupos de protenas que tienen modo similar de acumulacin; dendrograma usando El mtodo de Ward y cortar a la altura h = 10. El signo * representa protenas que cambiaron su abundancia por lo menos 8 veces en hojas y 6 veces en coronas, la letra "c" marca las protenas de cloroplastos.

Los grandes cambios en la abundancia de protenas despus del tratamiento fro observado en los valores atpicos tambin podra indicar un potencial de estas protenas para evaluar la tolerancia al fro de cereales (tales como dehidrinas, por ejemplo, *35+). Sin embargo, estas protenas en fro reguladas deben ser probados por primera vez en un gran conjunto de diferente genotipos de cebada tolerantes al fro para verificar como posibles marcadores de protenas.

2.4. Modos de acumulacin de protenas inducidas por el anlisis de conglomerados jerrquico de baja temperatura ordenados protenas acumuladas de manera diferente a los tres grupos en las coronas y los cinco grupos en hojas (Tablas 1 y 2, las figuras 3 y 4, el cuadro S1 en los datos adicionales). Las protenas de las cuales abundancias fueron predominantemente aumentando en el transcurso de la exposicin a bajas temperaturas se encuentran en la Categora 1 en las

hojas (27 proteins/15 identificados) y Grupo 2 de coronas (29/12 protenas identificadas), la abundancia de montaje continua sugiere su importancia en todas las fases del proceso de endurecimiento en fro. Entre estas protenas, hay, por ejemplo, HSP70 en coronas y metaloproteasas de zinc dependiente de ATP FTSH en 2 hojas con relacin documentada de estrs por fro *6,28+.

La Figura 4. Modos de acumulacin de protenas en (a) las coronas y (b) las hojas despus de la baja exposicin a altas temperaturas. El eje vertical representa la abundancia de protenas y el eje horizontal representa diferentes tratamientos, todas las protenas en el mismo grupo se dibujan en el mismo color. Representante protenas spots imgenes en 2D geles para diferentes tratamientos se administran para cada grupo, nmero de punto es en la esquina superior izquierda de la imagen y las protenas correspondientes se enumeran en las tablas 1 y 2.

En el Grupo 4 de las hojas (21 proteins/13 identificados) y en el Grupo 1 de coronas (56 proteins/34 identificado), hay protenas de las cuales abundancia disminuye gradualmente despus de la exposicin a bajas temperaturas, por ejemplo, 23 kDa protena jasmonato inducida (JIP- 23) en coronas (gi | 400094, Contig1675_s_at); JIP-23 podra regular la sntesis de polisacridos de la pared celular *36+. En hojas de cebada, JIP-23 genes se expresan en varios tipos de estrs como la sequa, el tratamiento con sorbitol y fro *16,37+. Sin embargo, transcripcin (Contig1675_s_at) del gen perteneciente a esta protena est representada regulacin a la baja despus del tratamiento prolongado fro (4 C, 49 das) en la cebada *16+. Las protenas de las cuales han disminuido en abundancia fro tanto en hojas como en coronas incluyen el factor de elongacin Tu y glutamina sintetasa (GS1 y GS2).

Factor de elongacin Tu juega un papel clave en la fase de elongacin de la sntesis de protenas en orgnulos de plantas incluyendo las mitocondrias y los plastos y tiene un papel importante en las respuestas de estrs, se ha informado en un estudio transcriptmica *38+ como hasta-acumul despus de estrs por fro 6 / 2 C ya nivel protemico como arribaacumula despus de estrs por fro 15 C, pero no se observ hasta despus de la acumulacin

de estrs por fro de 5 C *30+, que est de acuerdo con nuestros resultados. La glutamina sintetasa est implicada en nitrgeno primaria la asimilacin y la generacin de glutamina (forma isoenzima GS1), as como en NH4 + Reasimilacin lanzado a travs de la fotorrespiracin (forma isoenzima GS2) *39+. La glutamina sintetasa se ha observado a ser de hasta acumul durante el estrs sal *40,41+, sin embargo, a partir de experimentos sobreexpresin *42+ se puede concluir que la menor abundancia de GS1 podra tener una influencia positiva sobre la resistencia a las heladas.

Por otra parte, se puede observar que en las coronas protenas clave de metabolismo de nitrgeno (glutamina sintetasas GS1 y GS2) y casi todas las protenas relacionadas con el metabolismo de los carbohidratos (gluclisis derivacin andpentose-fosfato) se colocan en el Grupo 1, por lo que son poco a poco en downregulated una manera similar. La excepcin es el punto 7012-enolasa, que monta su abundancia despus de tratamiento en fro, pero de acuerdo con su peso molecular observado en gel (Tabla S1 en los datos suplementarios), es ms probable que slo un fragmento despus de la degradacin. Curiosamente, C2 protena que contiene el dominio (grupo 1; gi | 61889374, disminuy gradualmente despus de fro) se ha observado en el nivel de transcriptmica (Contig112_at) como upregulated despus del choque de calor en plantas de cebada (4 C, 1 da, *16+). Esta discrepancia es una ilustracin de la comparacin de los resultados problemtica transcriptmica y resultados protemicos. Generalmente, los cambios en la abundancia de las transcripciones de estrs regulados entre el control y las muestras tratadas con el estrs son ms altos que los cambios similares observados en el nivel de protena (por ejemplo, JIP-23 en *16+).

La acumulacin de transcripcin en el tejido no indica necesariamente la abundancia real de la protena correspondiente, ya que hay varios niveles de regulacin de la traduccin, las protenas traducidas se pueden mantener durante un largo tiempo (como dehidrinas menores de fro, por ejemplo, *13,26+ o degrada en poco tiempo. Por lo tanto, los cambios en la expresin gnica a nivel de transcripcin no siempre corresponde a los cambios en el nivel de protena *7+.

Grupo 5 en hojas (2/2 protenas identificadas) de las cuales contiene protenas abundancias fueron fuertemente disminuido despus de choque de fro y luego aument ligeramente de nuevo despus de aclimatacin al fro; una de las protenas identificadas era "hipottica protena VITISV_033291" (gi | 147785747), que mostr una amplia disminucin en su abundancia.

Cambios conspicuos en abundancia inducidas por cualquiera de choque trmico o choque heladas fueron exhibidos principalmente por las protenas en la Categora 2 en las hojas (6/5 protenas identificadas), por lo tanto, estas protenas parecen ser de importancia durante el estrs repentino corto a baja temperatura, por ejemplo, AAA ATPasa y protena de unin a la clorofila ab 1 observada previamente en *28,43+.

Int. J. Mol. Ciencia. 2013, 14 8017

Las protenas de los cuales abundancias aumentaron exclusivamente despus de aclimatacin al fro se encontraron en el Grupo 3 en hojas (7/4 protenas identificadas), por ejemplo, de chaperonina 60 kDa, peroxigenasa 1. Peroxygenases son enzimas implicadas en la biosntesis de phytooxylipins, que desempean papeles importantes en las respuestas de defensa de las plantas *44+. Del mismo modo, Grupo 3 de coronas (5/2 protenas identificadas) se compone de protenas que no cambiaron su abundancia despus de choque trmico notable, pero su abundancia aument significativamente despus de aclimatacin al fro o descarga heladas, por lo que es probable que el papel considerable en las fases posteriores de fro endurecimiento proceso. Dos protenas identificadas fueron "predijo protenas" gi | 326494312 que es un esponsible haperon de plegamiento de protenas y "predijo protenas" gi | 326505132 de familia del factor de von Willebrand protena, tipo A con la actividad de unin al ARN. Recientemente, LGD1 protena que posee von Willebrand factor de tipo Un dominio (SVA) ha sido estudiado en el arroz. Se detectaron isoformas de esta protena principalmente en el ncleo y en parte en el citoplasma y se demostr que LGD1 regula el crecimiento vegetativo del arroz y el desarrollo *45+.

2.5. Importancia de los cloroplastos en el proceso de endurecimiento en fro Localizacin celular de protenas acumuladas diferente identificados se determin por Gene Ontology anotacin y por el servidor TargetP 1,1; 6 protenas de coronas y 11 protenas de las hojas fueron localizados a los cloroplastos (Tablas 1 y 2, Tablas S1 y S4 en los datos suplementarios). En las hojas, se prev la ocurrencia frecuente de las protenas del cloroplasto acumulados de manera diferente, ya que constituyen la mayora de las protenas totales en hojas. Para sostener la reaccin fotosinttica parece ser un requisito previo importante para el proceso de aclimatacin al fro depende de la energa *7+. Tanto la clorofila-b protenas de unin (Gi | 115793 y gi | 115778, parte del complejo de la luz-cosecha) disminuy la abundancia en tratamiento en fro. En condiciones cambiantes, la fosforilacin reversible, de protenas de unin de clorofila ab (LHCII) representa un sistema para equilibrar la energa de excitacin entre los fotosistemas I y II *46+. Por lo tanto, la disminucin de los puntos identificados como protenas de unin a clorofila ab parece ser el resultado de la fosforilacin reversible despus de nivel inferior de la fotosntesis en las plantas tratadas con fro. Sin embargo, las coronas no son fotosintticamente activa y que estn formadas por tejido meristemtico donde slo proplastids estn presentes, por lo tanto, un nmero relativamente alto de protenas localizadas en los cloroplastos en tejido de la corona es notable. Lo ms probable, estas protenas se originan a partir de proplastidios. Un hecho notable es que PsbO encuentra en las hojas y HSP70 se encuentran en las coronas, tanto de la localizacin del cloroplasto, han puesto de manifiesto un cambio excesivo en abundancia lo que confirma un importante papel de la acumulacin de protenas en el cloroplasto cebada proceso de endurecimiento en fro de invierno *17,18+.

3. Seccin Experimental 3.1. Las muestras de plantas Plantas de invierno cebada (Hordeum vulgare L., cultivar Luxor) se cultivaron como se describe en Jnsk et al. *23+. En resumen, las plantas de semillero se cultivaron en el suelo bajo un fotoperodo de 12 h y una intensidad de irradiacin ~ 200 mmol m-2s-1 en un da / noche de temperatura de 18/13 C en un armario de crecimiento. En la segunda etapa de la hoja, las plantas fueron expuestas durante un mximo de 3 semanas a un da / noche la temperatura 3/2 C y la intensidad de la radiacin se redujo a ~ 120 mmol m-2s-1. Tras el periodo de aclimatacin de 21 das, un conjunto de plantas de semillero tambin fue expuesto a una descarga heladas de -3 C durante 1 da. Para el anlisis de 2D-DIGE, aproximadamente diez Int. J. Mol. Ciencia. 2013, 14 8018 plantas para cada uno de los tres rplicas biolgicas se utiliza para hacer una muestra de corona o una parte media de la segunda hoja de tejido. As, por cada tres repeticiones biolgica, al menos dos tcnicos repeticiones (20 plantas) se tomaron en cada momento de muestreo (0 muestras del da de "control", muestras de 1 da "shock fro", 21 das-muestras "aclimatacin" y 21 das a 1 da de congelacin "shock escarcha" muestras) de diferentes macetas en cada armario de crecimiento.

3.2. Extraccin de protenas Las protenas totales solubles se extrajeron como se describe en *47+ con algunas modificaciones. Aproximadamente 200 mg de material vegetal se muele a polvo fino en nitrgeno lquido y luego 1,5 ml de TCA al 10% en acetona se aadi. Despus de una hora a 20 C, la muestra se centrifug 10 min a 12.000 x g. Sedimento resultante se lav tres veces con TDT fro 0,07% en acetona y se sec al aire. Seco sedimento se resuspendi en 0,5 ml de tampn de SDS (30% de sacarosa, 2% de SDS, 5% 2-mercaptoetanol, 0,1 M de Tris-HCl, pH 8,0) y 0,5 ml de fenol (0,5 M Tris-HCl saturado, pH 8,0). Las protenas se extrajeron una hora a temperatura ambiente y despus se centrifugaron 10 min a 12.000 x g. Fenol fase superior se coloc en un nuevo microtubo y las protenas se precipitaron con 5 volmenes de acetato de amonio fro 0,1 M en metanol durante la noche a -20 C. A continuacin, la muestra se centrifug durante 10 min a 12.000 x g y se lav tres veces con acetona fra, sedimento resultante se sec al aire. Las protenas se disolvieron en tampn de lisis (7 M de urea, 2 M hiourea, 4% de CHAPS w / v, 30 mM de Tris, pH 8,0) y el pH del lisado se ajust a 8,5 mediante la adicin de hidrxido de sodio 50 mM. La concentracin de protena se determin utilizando el kit Quant 2D (GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ, EE.UU.). 3.3. Anlisis de imagen Las muestras de protena 2D-DIGE y se marcaron con Amersham CyeDye DIGE Fluors (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La unin covalente de colorantes a las protenas permite la separacin y la posterior cuantificacin de hasta tres muestras en un gel. En nuestros experimentos, dos muestras y un patrn interno (30 g de protenas por cada muestra) se marcaron, a continuacin, mezclan y se aplican en una banda con un gradiente de pH inmovilizado (IPG tira, ReadyStrip tiras IPG de 24 cm, pH 4 - 7, Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) segn las instrucciones del fabricante. A continuacin, el enfoque isoelctrico se llev a cabo

en Protean IEF clula (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) con tensin mxima 10000 V hasta que se alcanz 75.000 V-hora. Despus de isoelectroenfoque, las protenas en tiras IPG se redujeron durante 12 min por TDT 1% y alquilarse durante 12 min por 2,5% de IAA disuelto en tampn de equilibrio (6 M de urea, 2% SDS, 20% de glicerol, 0,375 M de Tris-HCl, pH 8.8). Entonces, las tiras de IPG fueron colocados en la parte superior de 12,5% en geles de poliacrilamida (1 mm de espesor) y se sellaron con 0,5% agarosa de baja fusin.

Electroforesis en gel de poliacrilamida se realiz utilizando Ettan Sistema de Electroforesis Daltsix (GE Healthcare) durante aproximadamente 6 horas. Los geles con protenas separadas etiquetadas con CyeDyes fueron digitalizadas en Pharos FX Plus (Bio-Rad) a una resolucin de 100 micras. A diferencia acumulada protenas, es decir, los que cambiaron su abundancia al menos dos veces de acuerdo con el estudiante de la t-test (p = 0,05, tres repeticiones), se encontraron con el programa PDQuest 8.0.1 (Bio-Rad). El cambio en la abundancia de protenas en un solo tejido (en hojas o en coronas) se calcula como una proporcin de la abundancia media de la protena en dos fechas diferentes de muestreo (por ejemplo, abundancia media en la muestra de hoja "fro Int. J. Mol. Ciencia. 2013, 14 de 8019 de choque "con la abundancia media en la hoja" muestra de control "). Slo las manchas de protenas que podran ser detectados en gel de tres repeticiones se consideraron para el anlisis posterior.

3.4. Identificacin de protenas Las manchas que contienen protenas acumuladas diferente se cortaron a partir de un gel de 2D preparativa que contiene 1 mg de mezcla de protenas y se tieron con azul brillante de Coomassie (Bio-Rad). Piezas de gel fueron de-teidas utilizando NH4HCO3/ACN 100 mM 01:01 (v / v) y las protenas en el gel se digirieron durante 3 horas a 37 C en 50 mM de NH4HCO3 con tripsina (concentracin de 12,5 mg / ml, la secuenciacin de grado , Promega, Madison, WI, EE.UU.). Los pptidos resultantes se extrajeron con 0,1% de TFA y luego se desalaron y concentrado utilizando ZipTip C-18 (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.). Muestras de pptidos, as como estndar de calibracin externa (Bruker pptido patrn de calibracin que, Bruker, Bremen, Alemania) se mezclaron 1:1 con cido 2,5-dihidroxibenzoico (20 mg / ml en 33% de ACN y TFA al 0,1%, Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemania) y se aplic a una placa de MALDI objetivo. Todos los anlisis de espectrometra de masas utilizado Biflex IV MALDI-TOF (Bruker, Bremen, Alemania) en el modo de iones positivos reflexiva en el gama de 800-4000 Da (300 disparos de lser para cada espectro). Los espectros se analiz en mMass programa 3.10.0 (Praha, Repblica Checa) *48+; seal al umbral de ruido fue ajustado a 3. Para la identificacin de protenas, las peaklists extrados se registraron utilizando el servidor de la mascota contra la base de datos NCBInr (versin 20120623, 18713758 secuencias; 6412106995 residuos) con los siguientes valores: plantas organismViridiplantae verde; tripsina (1 misscleavage permitido), carbamidomethylation cistena se cre como un fijo modificacin y oxidacin de metionina como una modificacin variable, la tolerancia pptido se establece en 0,2 Da. Esta configuracin cortaron marcador era 72. Puesto que el genoma de la cebada no est completamente secuenciado, una parte de las protenas se identificaron sobre la base de homologa con las protenas de diferentes especies de plantas.

Correspondientes identificadores de genes en el "Cebada Genoma matriz GeneChip" chip Affymetrix se encontraron en el archivo "Barley1.na32.annot.csv" en los sitios web de Affymetrix *49+. 3.5. Funciones biolgicas de las protenas identificadas las funciones biolgicas de las protenas y su localizacin celular se realizaron bsquedas en la base de datos UniProtKB *50+ de acuerdo a su anotacin Gene Ontologa (GO) *51+. Para confirmar la localizacin celular de las protenas identificadas con GO anotacin y determinar la localizacin de las personas sin GO anotacin, servidor TargetP 1,1 *52+ fue utilizado; especificidad se establece en> 0,95.

Con el fin de obtener una visin global de los procesos biolgicos influenciados por las bajas temperaturas, las protenas se clasifican en categoras utilizando Web Gene Ontologa anotacin Terreno (WEGO) *53,54+.

3.6. Anlisis estadstico de las protenas diferencia acumulada Las protenas acumuladas diferente se analizaron en un entorno R 2.15.0 para el clculo estadstico *55+. Con el fin de resumir las principales caractersticas de los datos, el anlisis exploratorio de los datos se realiz utilizando histograma, diagrama QQ y el diagrama de caja (2.698 ). La atencin se dirige a observaciones atpicas (protenas perifricas) sugeridos por diagrama de caja, que son los que aparecen a desviarse notablemente de otros miembros del conjunto de datos en el que se producen *56+. Todas las protenas acumuladas de manera diferente, incluyendo los valores extremos fueron luego ordenados en grupos de acuerdo con su modo de acumulacin utilizando jerrquica Int. J. Mol. Ciencia. 2013, 14 de 8020 clustering (paquete de "estadsticas", la funcin "hclust", el mtodo de Ward). Los dendrogramas fueron cortadas a la altura de h = 10 de manera que se crearon grupos con distintamente diferentes modos de acumulacin. Por otra parte, los cambios en la abundancia de protenas se muestran en el mapa de calor (paquetes "gplots" y "RColorBrewer", funcin "heatmap.2"). Dado que las protenas difieren en gran medida en sus abundancias, todos los datos fueron normalizado (fila centrada y escalada). 4. Conclusiones En este estudio, los procesos de cebada de invierno fro endurecimiento se han vislumbrado a nivel proteoma mediante el seguimiento y la comparacin de la respuesta de las hojas y las coronas de diferentes perodos de fro y las heladas. Se ha observado que los procesos metablicos de protena y nitrgeno fueron influenciados por las bajas temperaturas en un grado similar en ambos tejidos, mientras que el catabolismo, el metabolismo de hidratos de carbono y la respuesta de estrs eran ms afectados de coronas. Creemos que estas diferencias pueden reflejar el hecho de que las coronas son cruciales para la supervivencia de toda la planta. Entre las protenas que mostraron grandes cambios en la abundancia, y por lo tanto pueden jugar papeles importantes en helada tolerante respuesta cebada de invierno a baja temperatura, se han encontrado AAA

ATPasa en hojas o HSP70 en coronas. Protenas de cloroplastos se observaron con frecuencia como acumulada diferente. Por lo tanto, nuestros resultados indican la importancia de los cloroplastos en respuesta de la cebada baja temperatura. Todas las protenas que significativamente (al menos dos veces) cambiaron su acumulacin en el curso de perodos de fro o las heladas fueron surtidos a las agrupaciones de acuerdo con el perfil theiraccumulation, se han encontrado cinco grupos de protenas en las hojas y tres grupos en crowns.We concluyeron que estos grupos pueden tener una influencia decisiva en fases distintas de barleycold endurecimiento como las protenas de diferentes grupos montan su abundancia en diversos puntos temporales oflow exposicin a altas temperaturas. La base molecular de los cereales de invierno proceso de endurecimiento en fro se ha estudiado hasta ahora predominantemente mediante mtodos transcriptmica. En general, nuestro estudio protemico mostr un acuerdo con estudios anteriores transcriptmica, sin embargo, pueden existir diferencias sustanciales entre los niveles de protena expressionand reales de mRNA debido a diferentes mecanismos de regulacin de la expresin gnica. Por lo tanto, se necesitan ms estudios protemicos para entender la regulacin fra respuesta de los cereales que se presentan los resultados ms profoundly.The pueden considerarse como un punto de partida en el proceso de seleccin de las protenas resistancemarker heladas adecuadas para el mejoramiento de cultivos fcil y rpido. En esta perspectiva, sern los imprescindibles para llevar a cabo estudios de seguimiento para comparar ms genotipos de cebada que difieren en su frostresistance, desde este punto de vista, nuestro experimento puede considerarse como un estudio piloto.