FACULTAD DE MEDICINA HIPLITO UNANUE ESCUELA DE MEDICINA

CURSO: BIOLOGA CELULAR Y MOLECULAR PRCTICA N 10

PRCTICA N10 EXTRACCIN DE ADN

1. Fundamento El ADN es un polmero de desoxiribonucletidos, y constituye el componente principal de la cromatina en organismos eucariotes. En la cromatina se pueden encontrar adems nucleoprotenas conocidas como histonas, protaminas y en menor proporcin protenas de tipo cidas.

Para poder extraer el ADN a partir de una muestra celular se debe tener en cuenta la naturaleza de sus cargas negativas, la cual permite que esta molcula interacte con iones salinos, facilitando as su disolucin y posterior purificacin. El primer paso consiste en la lisis de las clulas mediante la accin de un detergente que permita la disolucin de los fosfolpidos de las membranas celulares y nucleares. Posteriormente el ADN es liberado al medio y se disuelve en un medio tamponado, arrastrando adems otros componentes celulares como ARN, carbohidratos, protenas y diversas sustancias en menor proporcin. Las protenas asociadas al ADN se habrn fraccionado en cadenas ms pequeas y separadas de esta molcula por accin del detergente. En algunos casos se deben utilizar solventes orgnicos como el cloroformo, el cual extrae a las protenas dejando insoluble el ADN. Finalmente, la extraccin del ADN a partir del medio tamponado y su separacin del detergente se realizan por solubilidad diferencial en alcohol y a bajas temperaturas. 2. Objetivo Adiestrar al alumno en las tcnicas que permitan la extraccin del ADN a partir de un tejido animal, comprobando su estructura fibrilar y gran longitud. -1-

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3. Materiales Hgado de pollo fresco Tubos de ensayo (16 x 150 mm) Vasos de precipitacin (100 mL) Baguetas de vidrio delgadas Embudo de vidrio Mortero con piln Pipetas de 10 mL Gasa estril - Bao de incubacin a 60 C - Etanol puro (4C) Medio de Homogenizacin (1 L): SDS 50.000 g NaCl 8.770 g Citrato de Sodio 4.110 g EDTA 0.292 g

4. Procedimiento Homogenizacin del tejido El mtodo para desintegrar el tejido debe estar adaptado a las caractersticas de ste. Para grandes volmenes de tejidos blandos, suelen usarse licuadoras esencialmente iguales a las licuadoras domsticas. Para volmenes menores, en general es suficiente un mortero y un piln. Para tejidos ms resistentes, como por ejemplo hueso o diente, se necesitan tratamientos mecnicos especiales. Aquellos tejidos con clulas cuya pared celular es resistente, como por ejemplo vegetales, hongos o bacterias, se requieren adems condiciones drsticas como la congelacin de la muestra en nitrgeno lquido y, mantenindola as congelada, pulverizarla con un mortero. De esta forma, adems de desintegrar la muestra, se logra que sta se mantenga a muy baja temperatura durante el tratamiento, con lo cual se evita la accin de enzimas endgenas que pudieran degradar el material de inters. En esta prctica se emplear un mtodo de ruptura con mortero (sin congelamiento). La principal ventaja de este mtodo es que se adapta bastante bien a tejidos muy diversos. Asimismo, dado que se opera a temperatura ambiente, las ribonucleasas celulares pueden degradar parcialmente las molculas de ARN. Para ayudar a la solubilizacin de los componentes celulares, a la ruptura de membranas y de complejos proticos, el medio de homogenizacin contiene al SDS (dodecil sulfato de sodio), el cual es un detergente inico que dispersa los componentes de las membranas facilitando su ruptura y separa a las protenas asociadas a la cromatina desnaturalizndolas. El NaCl produce el estallido de los ncleos para liberar las fibras de cromatina. Adems EDTA, el cual es un agente quelante de cationes divalentes, y que impide la accin de las DNasas (dependientes de Mg2+), aunque no tiene efectos sobre la mayor parte de las ribonucleasas.

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Para esta seccin, seguir los siguientes pasos: - Es OBLIGATORIO antes de realizar la prueba: (1) limpiar la zona de trabajo con abundante alcohol y papel toalla; (2) usar guantes de latex durante todo el procedimiento para evitar la contaminacin de la muestra con DNasas provenientes del sudor de las manos, las cuales pueden degradar nuestras muestras de ADN. - Fraccionar el tejido utilizando mortero y piln agregando 10 mL del medio de homogenizacin por cada gramo de tejido con que se inicia el proceso. - Una vez que se haya homogenizado la mezcla, transferirla a un vaso de precipitado de 100 mL e incubar el preparado en un bao de temperatura a 60C por 15 min. El calor ablandar el tejido permitiendo que los componentes del medio de homogenizacin ingrese a la clula. Adems, esta temperatura denatura muchas enzimas que podran interferir con el procedimiento. - Finalizado el tiempo, filtrar el homogenizado empleando la gasa esteril y colectar en tubos de ensayo (16 x 150 mm) - Colocar la preparacin filtrada en una cubeta con hielo por 10 minutos a fin de detener cualquier proceso degradativo del ADN.

Precipitacin del ADN La precipitacin de los cidos nucleicos es un procedimiento que permite su purificacin y concentracin. Se basa en la neutralizacin de las cargas negativas y en la deshidratacin de la molcula, lo cual posibilita su agregacin y precipitacin. Este fenmeno se caracteriza por ser reversible (el cual permite la resuspensin del ADN en soluciones acuosas) y no debe ser confundido ni con la desnaturalizacin (potencialmente reversible), ni con la degradacin (irreversible) de los cidos nucleicos. Para esta seccin, seguir los siguientes pasos: - Lentamente y por las paredes de los tubos de ensayo, agregar etanol puro (4 C) hasta que se aprecie que la muestra adquiere una consistencia blanquecina. Esto significa que el ADN ha precipitado. - Reconocer en las soluciones la formacin de 3 fases: (1) alcohol (fase superior), (2) ADN precipitado (fase intermedia) y (3) contenido celular (fase inferior). - Suavemente girar una bagueta de vidrio enrollando el ADN precipitado en una sola direccin. El ADN en la bagueta se apreciar de forma similar a una madeja de hilo sumamente fino o como copos de algodn.

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CUESTIONARIO

1. Cul es el fundamento de la precipitacin del ADN utilizando etanol? Qu otros procedimiento se emplean para la separacin de esta molcula? Explicar brevemente el fundamento de cada uno de ellos. 2. Describir el procedimiento de extraccin de ADN a partir de las siguientes muestras: a) b) c) d) Cultivo de Escherichia coli Biopsia de pulmn embebida en parafina Sangre Epitelio bucal

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