Introduccin Existen diversos mtodos para cuantificar el nmero de microorganismos presentes en muestras lquidas y slidas.

Dentro de las tcnicas ms comunes se encuentra el recuento directo por microscopia de fluorescencia, as como los procedimientos basados en diluciones en serie, haciendo crecer microorganismos en medios de cultivo sintticos slidos o lquidos, como el recuento en placa de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) o la estimacin por el mtodo del Nmero Ms Probable (NMP). El mtodo del nmero ms probable fue descrito por McCrady en 1915 y actualmente sigue siendo ampliamente utilizado. En un principio este mtodo fue empleado para estimar el nmero de microorganismos en muestras de alimentos y aguas. Sin embargo, se ha demostrado que tambin puede ser aplicado para la determinacin de microorganismos aerobios y anaerobios en lodos, sedimentos marinos y suelos contaminados, por tanto este mtodo es aplicable para estimar el nmero de microorganismos en muestras de suelo y agua, tanto para bacterias aerobias como anaerobias. Los Coliformes Fecales son un subgrupo de los Coliformes totales, capaces de fermentar la lactosa a 44 C en vez de 37 C como lo hacen los totales. Aproximadamente el 95% del grupo de los Coliformes presentes en heces estn formados por Escherichia coli y ciertas especies de Klebsiella. Ya que los Coliformes Fecales se encuentran casi exclusivamente en las heces de los animales de sangre caliente, se considera que reflejan mejor la presencia de contaminacin fecal. stos ltimos se denominan termotolerantes por su capacidad de soportar temperaturas ms elevadas. Esta es la caracterstica que diferencia a Coliformes Totales y Fecales. La capacidad de los Coliformes fecales de reproducirse fuera del intestino de los animales homeotrmicos es favorecida por la existencia de condiciones adecuadas de materia orgnica, pH, humedad. Desde hace mucho tiempo se han utilizado como indicador ideal de contaminacin fecal. Su presencia se interpreta como una indicacin de que los organismos patgenos pueden estar presentes y su ausencia indica que el agua o el alimento estudiado se hallan exentos de organismos productores de enfermedades. Objetivo Cuantificacin de bacterias coliformes totales y bacterias coliformes fecales y determinar presencia de E. coli.

Materiales 30 tubos de ensaye 15 tubos Durham 7 cajas Petri 1 botella de vidrio 4 pipetas 1 matraz 500 ml 1 magneto Parrilla Baso de licuadora Cuchillo Tenedor Balanza electrnica Caldo lauril sulfato triptosa Caldo bilis verde brillante Caldo E. C. Eosina azul de metileno (EMB) Porta objetos Aceite de inmersin

Asas bacteriolgicas Cristal violeta Lugol

Alcohol acetona Safranina Agua peptonada

Mtodos Para esta prctica se utiliz el mtodo del nmero ms probable o NMP. Se toma una muestra, aspticamente (200g) Se mezclan 200 ml de peptona con 25g de muestra

Se hacen diluciones tomando 1mL colocndolo en un tubo de ensaye como se muestra en la figura:

Fase presuntiva De las diluciones se toma 1 ml y se vacan en tubos de ensaye con tubos Durham, los cuales fueron preparados con caldo lauril sulfato triptosa. Haciendo 3 repeticiones por tubo, es decir 3 de 1:10, 3 de 1:100 y 3 de 1:1000, todas estas en tubos de ensaye con tubos Durham dentro, con el medio caldo lauril sulfato triptosa. Se mete a incubar por 24-48Hrs a 37C. Fase confirmativa Si hay produccin de gas, se procede a preparar 2 medios diferentes para identificar coliformes totales y los coliformes fecales. Los medio son: caldo bilis verde brillante y caldo E. C. teniendo 1 tubo de ensaye con tubo Durham por cada tubo que haya

tenido produccin de gas, inoculando los medios con el asa bactereologica. Se mete a incubar por 24-48Hrs a 37C. Si hay produccin de gas, se va a las tablas de NMP. Los resultados obtenidos se anotan de la siguiente forma: 1 0 2. Y se busca la combinacin en la tabla. Prueba complementaria Los tubos con produccin de gas en BCT y BCF se siembran en placa en medio solido: Eosina Agar Metileno (EMB) y Se mete a incubar por 24-48Hrs a 37C. De las colonias obtenidas en las placas se hace tincin de gram y se observa al microscopio. Se purifican las cepas Se hacen las pruebas IMVIC.

Tcnica NMP (nmero ms probable) Fase presuntiva Nuestra muestra de anlisis fueron galletas glaseadas adquiridas en la cafetera del Departamento de Ingeniera Agroindustrial. Se tom una muestra unitaria de la unidad de muestreo la cual fue de 25 gramos por ser un material slido, diluimos en 200 ml de agua peptonada al 0.1% para posteriormente homogeneizar la muestra. Se hicieron una serie de diluciones de 1:10 hasta 1:10000 se seleccionaron las tres ltimas diluciones 1:100 a 1:10000 con las que se inocularon nueve tubos con 9 ml de Caldo Lauril Sulfato Triptosa (CLST) y 1 ml del inoculo, cada uno de los tubos contena un tubo Durham cuyo objetivo es detectar la presencia de gas producido por los coliformes o bacillus. Se incubaron a 37C por un periodo de 48 horas. Los resultados de este procedimiento fueron: Dilucin 1:100 1:1000 1.10000 Positivo 3 3 1 Negativo 0 0 2

Fase confirmativa De los resultados positivos de la fase anterior se inocularon 7 tubos con asa bacteriolgica en un medio ms selectivo para coliformes Caldo Billis Verde Brillante usando el mismo principio de produccin de gas en tubos Durham invertidos. Se incubaron nuevamente a 37C durante 48 horas. Se obtuvieron los siguientes resultados: Dilucin 1:100 1:1000 1.10000 Positivo 0 0 0 Negativo 3 3 1

Por lo que la produccin de gas de la fase presuntiva se debi a microorganismos distintos a coliformes que al igual que ellos producen gas bacillus. FASE DE CONFIRMACIN: BCF En esta fase se utilizaron nicamente los tubos de la fase presuntiva que fueron positivos a la produccin de gas de los cuales se inocularon con asa bacteriolgica 7 tubos que contenan 9 ml de caldo E. coli, posteriormente se llevaron a incubar a 44.5 C por 48 horas. El resultado que se obtuvo fue: Dilucin 1:100 1:1000 1.10000 Positivo 1 0 1 Negativo 2 3 0

Por ende el nmero 101 marcado por las muestras positivas y comparando con la tabla de ndice de NMP fue de 4 NMP/g. PRUEBA COMPLEMENTARIA De los tubos positivos obtenidos en la fase de confirmacin BCF se tomaron inculos para sembrarlos en estra cruzada en placas con EMB, se incubaron a 37C por un tiempo de 24 horas. Posteriormente se hicieron tinciones de Gram para observar el tipo de microorganismo que era (Gram positivo o Gram negativo)

Una vez observado el tipo de microorganismo, se purificaron las cepas en un medio de agar nutritivo inclinado. PRUEBAS BIOQUIMICAS (IMVIC) El IMVIC es una prueba utilizada en microbiologa para la identificacin bacterias. Se compone de cuatro pruebas: Indol, Rojo de metilo, Voges-Proskauer y Citrato. El resultado de este test se expresa mediante simbolos de positivo o negativo(+ o -) segn el resultado de cada prueba, siguiendo siempre el orden establecido por las iniciales del mtodo. As por ejemplo, el IMViC de la bacteria Salmonella y Citrobacter es -+-+. Para E.coli es ++-- y para Klebsiella y Enterobacter es --++.

Indol (I) Consiste en cultivar al microorganismo en estudio en un caldo rico en triptfano; despus de 24-48 horas de crecimiento se adiciona al tubo sobre el caldo xilol, para conseguir separar el indol producido, y tras agitar se incorpora el reactivo de Kovacs (p-dimetil animo benzaldehido) un resultado positivo mostrar la formacin de un anillo de color rojo sobre el caldo de cultivo, lo cual pondra de manifiesto la presencia de Indol debido a la utilizacin del triptfano por el microorganismo (la molcula de tritfano se rompe y uno de esos productos es el Indol), un resultado negativo solo mostrara un anillo de color amarillo propio del reactivo de Kovacs.

Resultado Positivo para prueba de Indol Rojo de Metilo (M) El rojo de metilo es un indicador de pH. (Frmula: C15H15N3O2). Acta entre pH 4,2 y 6,3 variando desde rojo (pH 4,2) a amarillo (pH 6,3). Por lo tanto, permite determinar la

formacin de cidos organicos que se producen durante la fermentacin de un carbohidrato. El microorganismo en estudio se cultiva en un caldo de cultivo con algn carbohidrato fermentable, el ms comn es la glucosa aunque se pueden utilizar otros carbohidratos como lactosa, sacarosa, manitol, etc, adicionado con el rojo de metilo como indicador de pH. Una reaccin positiva, es decir, el viraje del medio a un color rojo, indica que el microorganismo realiza la fermentacin de la glucosa por la va cido-mixta y el pH del medio se torna hasta 4.2 por la gran cantidad de cidos orgnico producidos. Una prueba negativa no cambia el color del medio (color amarillo) Voges-Proskauer (VI) Algunos microorganismos producen acetona o acetil metil carbinol por descarboxilacin de dos molculas de cido pirvico (producto final de la gluclisis). La acetona es un producto intermedio de la fermentacin butiln-gliclica, que conduce a la formacin de 2, 3 butanodiol. Tanto la acetona como el 2,3 butanodiol son productos neutros de la fermentacin de la glucosa que llevan el pH del medio a un valor aproximado de 6 o ms, y un aumento en la produccin de dixido de carbono, respecto a la prueba Rojo de Metilo. La acetona en un medio fuertemente alcalino (NaOH o KOH) y en presencia de Oxgeno se oxida a diacetilo. El diacetilo reacciona con compuestos que contengan ncleos de guanidina, como la arginina, presente en el medio (peptona por ejemplo), y da un compuesto color rojo-rosado-violceo. Se agrega -naftol para aumentar la sensibilidad. Esta prueba caracteriza a ciertas especies de las Enterobacteriaceae, e indicar que la glucosa es fermentada por la va butanodilica. Citrato (C) Sirve para determinar si un microorganismo puede crecer utilizando citrato como nica fuente de carbono debido a la sntesis de la enzima citrato permeasa la cual permite la introduccin del citrato al interior de la clula, una vez dentro, el citrato es incorporado al ciclo de los cidos tricarboxilicos o ciclo de Krebs. Se hace crecer al microorganismo en estudio en caldo citrato. Un resultado positivo es cuando se observa turbidez en el tubo, debido al crecimiento bacteriano. Un resultado negativo es cuando no se observa crecimiento. Actualmente el medio ms utilizado es el Agar Citrato de Simmons un medio slido en tubo con pico de flauta el cual posee un indicador de pH (azul de bromotimol) si el microorganismo es capaz de crecer, producira cidos organicos provenientes de la utilizacin del citrato, el medio se alcaliniza y el indicador vira a color azul, esto ser un resultado positivo, el medio sin inocular es de color verde, de esta manera un resultado negativo no habr crecimiento y el color seguir siendo verde. IMViC resultados: -+-Bibliografa http://www.turevista.uat.edu.mx/ANO%206%20NUMERO%2022/coli-metodos.htm http://www.monografias.com/trabajos89/determinacion-coliformes-totalesfecales/determinacion-coliformes-totales-fecales.shtml