IV CLASE METABOLISMO Y PRODUCCIN DE ENERGIA El metabolismo es el conjunto de reacciones qumicas que se producen en las clulas gracias al flujo de energa

y a la participacin de las enzimas. El trmino de metabolismo incluye dos tipos de procesos: catabolismo (destruccin de los alimentos para obtener energa) y anabolismo (uso de alimentos en la sntesis de las clulas). En el catabolismo las molculas grandes y complejas son descompuestas en molculas ms pequeas y sencillas con la liberacin de energa. En este proceso de catabolismo, la mayora de las molculas utilizadas como fuente de energa se convierten en productos de desecho, aunque parte de estas molculas ms simples pueden incorporarse a rutas anablicas. En el anabolismo se sintetizan molculas ms complejas a partir de otras ms sencillas con consumo de energa. Aqu sucede lo contrario de lo anterior, los nutrientes se convierten en componentes celulares (pared celular, membrana citoplasmtica, cromosoma, citoplasma, etc.). En el catabolismo, la energa qumica es liberada cuando se oxidan los compuestos orgnicos o inorgnicos; siendo la mayor parte de reacciones exotrmicas, es decir, se libera energa. Las reacciones anablicas son endotrmicas. La energa necesaria es aportada por las reacciones catablicas, haciendo que el metabolismo en su conjunto sea un proceso energticamente favorable. Todo el proceso ocurre a una velocidad mayor que si se tratara de una simple mezcla de los sustratos implicados. Esto se debe a la participacin de las enzimas = catalizadores orgnicos que disminuye la energa de activacin, aumentando la velocidad de las reacciones, y que hace posible el funcionamiento de los seres vivos. Muchos alimentos son insolubles en agua y son grandes y complicadas molculas que no pasan directamente a travs de las membranas celulares. Las que no las pueden utilizar hasta que no lo degraden en molculas ms pequeas, que sean solubles. A menudo estos nutrientes insolubles estn hechos de unidades repetitivas de molculas muy pequeas. Por ejemplo, el almidn est formado de muchas molculas de azcar entrelazadas entre s hasta formar largas cadenas ramificadas. Las protenas estn hechas por la polimerizacin de muchos aminocidos, constituyndose una larga cadena. Al invertir este proceso de sntesis, se obtiene pequeas molculas solubles que son susceptibles de penetrar a la clula y ser utilizado como energtico. Hay enzimas que catalizan este tipo de hidrlisis. Esta enzimas son extracelulares se difunden a travs del medio ambiente, y catalizan la degradacin de largas molculas en pequeas. Cada vez que se realiza la reaccin, se rompe una unidad de la macromolcula al mismo tiempo, siempre se consume una molcula de agua. Por esta razn se le denomina al proceso hidrlisis, lisis (rompimiento) por medio de agua. De esta manera el almidn se hidroliza obtenindose un azcar soluble, la maltosa. Las protenas se hidrolizan en unidades ms pequeas llamadas pptidos; y las grasas (lpidos) se hidrolizan hasta cidos grasos y glicerol. PAPEL DEL ATP Para sintetizar nuevo material celular se requiere energa. La obtencin de esta energa es una de las principales ocupaciones de una clula bacteriana.

En la clula, la transferencia de electrones desde donadores a aceptores se realiza a travs de intermediarios conocidos como transportadores. Al donador inicial se le conoce como donador primario, y al aceptor ltimo, aceptor final de electrones. El cambio neto de energa de la reaccin completa est determinada por la diferencia entre el potencial de reduccin del donador primario y del aceptor final. Los transportadores pueden ser de dos tipos: libres, que difunden en el medio acuoso de los compartimientos celulares, y anclados a enzimas, que estn unidas a las membranas de la clula. Entre los transportadores que difunden libremente, estn las coenzimas: nicotinamida adenina dinucletido (NAD) y nicotinamida adenina dinucletido fosfato (NADP). Ambos son transportadores de hidrgeno y siempre transfieren dos tomos de hidrgeno al siguiente transportador de la cadena. Sin embargo, funcionan en procesos distintos dentro de la clula NAD / NADH est directamente involucrados en reacciones catablicas y NADP / NADPH (nicotinamida adenina dinucletido trifosfato-con hidrgeno) participan en las reacciones anablicas. La energa liberada en los procesos catablicos de xido reduccin se almacena para ser utilizada en las funciones celulares. La energa para la biosntesis proviene del ATP (adenosina trifosfato), ste no es ms que el ribonucletido de adenosina con tres molculas de fosfato unidas en serie. La energa de sus enlaces se suele emplear en las reacciones biosintticas y otras funciones celulares; el cual, es el mismo compuesto utilizado por todas las formas de vida para almacenar y transferir energa. Adems de los compuestos altamente energticos con fosfato, en la clula tambin se producen otros con capacidad para almacenar la energa generada en el catabolismo. Entre estos estn los derivados de la coenzima A (como la acetil-CoA), que contiene enlaces sulfoanhdrido con suficiente energa libre par sintetizar enlaces fosfato de alta energa. PAPEL DEL ATP La eliminacin de un fosfato del ATP da como resultado una cantidad adecuada de energa suficiente para llevar a cabo los diferentes pasos de las reacciones involucradas en la sntesis de materiales como CHO, protenas, lpidos y otras como cido murmico. TIPOS DE REACCIONES QUE SUMINISTRAN ENERGA 1. La respiracin aerbica. Es en la que se producen reacciones que suministran energa y que dependen del oxgeno. Si el sustrato es un azcar simple y se le extrae el mximo de energa, obtenemos la siguiente reaccin: C6 H12O6 + 6 O2 6CO2 + 6H2O y adems,

se forma cerca de 38 molculas de ATP. Todos los tomos de hidrgeno son removidos y reaccionando con el oxgeno forman agua, que es otro producto microbiano. Los tomos de carbono son separados uno del otro y adheridos al oxgeno con el fin de producir dixido de carbono que es otro producto microbiano. En vista que el oxgeno desempea un papel prominente debido a

que reacciona con los tomos de hidrgeno y de carbono se reconoce a esta reaccin como oxidacin. Las Bacterias son muy verstiles en cuanto a la gran variedad de compuestos orgnicos que utilizan en la respiracin aerbica. Esta respiracin incluye todas las reacciones que proveen energa a la clula, siempre y cuando el oxgeno sirva como aceptor del hidrgeno. Se dice que el oxgeno es el aceptor terminal del hidrgeno, o bien, de los electrones que acompaan a los tomos de hidrgeno. La definicin ms precisa de respiracin aerbica es: la serie de reacciones que suministran energa, en las cuales el oxgeno es el aceptor final de electrones. La respiracin anaerbica. Es el trmino que se emplea para describir las reacciones que suministran energa, en las cuales el sulfato, carbonato, o el nitrato actan como aceptores finales de electrones. Estas reacciones se verifican en condiciones anaerbicas. Cuando se usa el sulfato el producto microbiano es H2S, que es el anlogo correspondiente al H2O formado en la respiracin aerbica. 3. La Fermentacin. Describe las reacciones que proveen de energa y mediante las cuales algunos compuestos orgnicos actan como aceptores finales de electrones. Por ejemplo el alcohol etlico es el producto que se obtiene cuando el acetaldehdo es el aceptor final de los electrones. Cada tipo de fermentacin posee un sistema para obtener energa a expensas de los compuestos orgnicos, sin usar para nada el oxgeno. Muchas bacterias y levaduras fermentadoras tienen la capacidad de vivir en medios ambientales privados de aire. Los organismos que viven por medio de la fermentacin o por respiracin anaerbica se les llama anaerobios. Muchas fermentaciones producen algo de dixido de carbn, adems de que el sustrato inicial nunca es degradado por completo, y por esta razn se produce menor nmero de molculas de ATP que en las respiraciones aerbicas. C6 H12 O6 + zimasa 2 C 2 H5 OH + 2 CO2 .
2C6 H10 O5 + H2 O + diastasa C12 H22 O11 + maltasa = 2 C 6 H12 O6 + zimasa H2O

2.

4 C 2 H5 OH + 4 CO2 . Una de las series de reacciones ms importantes es la que conduce a la oxidacin completa del cido pirvico hasta el dixido de carbono y agua, la cual es realizada por organismos aerbicos. Esta es una serie de reacciones cclicas conocidas como ciclo de Krebs o del cido ctrico, o ciclo de los cidos tricarboxlicos. Los hidrgenos sustrados durante este ciclo son oxidados por una serie de citocromos hasta ser finalmente aceptados por el oxgeno.

Algunas bacterias y levaduras son capaces de utilizar las vas metablicas respiratorias que requieren del oxgeno o bien otras vas que utilizan otro tipo de aceptor de electrones, esto, dependiendo de las circunstancias ambientales en que se encuentran. Se les dice que son anaerbicas facultativas

ACCIONES QUIMICAS PRODUCIDAS POR LAS BACTERIAS Las bacterias, levaduras y hongos, como todas las clulas, producen sus procesos metablicos, por medio de enzimas, agentes responsables de todas sus actividades sintticas (anablicas) y analticas (catablicas). Los microorganismos pueden atacar una gran cantidad de sustancias inorgnicas y orgnicas, obteniendo la energa para su normal metabolismo, as como material para su crecimiento. Cuando utilizan alimento para obtener energa provocan un proceso catablico y esta energa la pueden extraer de los carbohidratos o de otras sustancias. Cuando utilizan alimento para crecer el sustrato es descompuesto, y de estos productos de degradacin se llega a sintetizar el protoplasma celular. Todos estos procesos son llevados a cabo por enzimas. Las enzimas son protenas simples o conjugadas, solubles, que son producidas por un organismo vivo y tienen por funcin catalizar reacciones especficas. Las enzimas son catalizadores orgnicos, es decir sustancias que por su presencia, cambian la velocidad de una reaccin qumica. No inician la reaccin, puesto que, sin la enzima tambin se realiza dicha reaccin, aunque en forma sumamente lenta. Los catalizadores o enzimas al terminar la reaccin en la cual intervienen se los encuentra sin modificacin alguna. Por accin de las enzimas los azcares son transformados en cidos, las protenas en amoniaco y los compuestos amoniacales en nitritos y nitratos. Sin enzimas no se concebira la vida bacteriana. Esta tienen una actividad especfica y cada una efecta un determinado trabajo. Las enzimas de las bacterias pueden ser divididas en dos grupos segn permanezcan confinadas dentro de las clulas, o sean segregadas al medio circundante. A las del primer grupo se les llama enzimas endocelulares o intracelulares y a las del segundo grupo, extracelulares o exoenzimas. Las enzimas extracelulares son las encargadas de los procesos digestivos y convierten los compuestos coloidales indifusibles, en sustancias ms simples, difusibles; que pueden pasar a travs de la membrana celular. Casi todas son de naturaleza proteica y a varias de ellas se les ha conseguido obtener en estado cristalizado. Ej. Tripsina, pepsina, ureasa, amilasa. A las enzimas, se las ha clasificado segn su modo de actuar entre otras en enzimas amilolticas, (que hidrolizan los almidones), proteolticas (que hidrolizan las protenas), lipolticas (que hidrolizan los lpidos). Otra designacin obedece al sustrato sobre el que actan, con la terminacin asa. As, una enzima que acta sobre la lactosa, se llama lactasa, sobre la arginina se llama arginasa, etc.

La accin enzimtica est influenciada en forma marcada, por la temperatura, existiendo una temperatura mxima y mnima, sobre y bajo las cuales la actividad disminuye. La mayora de enzimas, son destruidas entre 70 y 100 C y su mayor actividad la desarrollan entre 35 y 45 C. El pH tambin juega un papel muy importante en la actividad enzimtica. Cada enzima tiene su pH ptimo, as hay unas que actan eficientemente a pH 7, otras a pH 9, y otras con un pH cido. Las sales de metales como Hg, Ag, Zn, Ni, Co actan inhibiendo la accin enzimtica, formndose un compuesto complejo (sal-metlica-enzima). Las enzimas son en general especficas con respecto al sustrato sobre el que actan, as, una enzima que fermenta o ataca a un disacrido, no ataca a otros; tambin se ha demostrado algn grado de especificidad, en las enzimas que atacan las protenas; en cambio no se ha demostrado una especificidad marcada en las enzimas que atacan a las grasas (lipasas), pudiendo la misma enzima atacar a varias clases de grasas. Las enzimas oxidantes y reductoras parecen ser las menos especficas. Las exoenzimas o enzimas extracelulares, segregadas por los microorganismos en el medio circundante pueden ser obtenidas ya por filtracin o centrifugacin del medio de cultivo. En los medios que contienen carbohidratos las bacterias producen acidez y otras producen acidez y gas. La acidez se pone de manifiesto con indicadores o determinando el pH del medio por mtodos colorimtricos y el gas se pone de manifiesto en campanitas (Campana de Durham) que se colocan dentro del medio de cultivo lquido, en las cuales se acumula el gas. Las enzimas proteolticas se ponen de manifiesto en sustratos nitrognicos (protenas o sus productos de degradacin, en la prctica se emplea las peptonas, pero mejor son las triptonas). Algunas bacterias producen como resultado de la protelisis compuestos inodoros; otros en cambio descomponen los aminocidos produciendo compuestos de olor desagradable. As por ejemplo algunas bacterias atacan al triptfano (aa) produciendo como producto final: cido-indol actico, cido indol propinico. La formacin de indol puede ser detectada en los medios por diferentes mtodos. El mtodo ms sencillo consiste en introducir aspticamente en el tubo con el medio de cultivo sembrado con el microorganismo una tira seca de papel filtro embebida en una solucin saturada de cido oxlico u oxalato de amonio y luego secada. La tira se coloca paralela a la pared del tubo y acodada en ngulo obtuso sobre la superficie del cultivo. Esto se hace antes de llevar el cultivo a la estufa. Se tapa con el tapn de algodn y su lectura se hace despus de las 48 horas de incubacin, si hay produccin de indol los cristales de cido oxlico toman color rosado. Otro de los resultados de la accin de las diastasas sobre las protenas es la produccin H2S, en este caso el sustrato sobre el cual las bacterias actan es el aminocido cistina. El H2S formado se investiga generalmente en los cultivos bacterianos aprovechando el ennegrecimiento que forma dicho cido con ciertas sales como Fe, Pb, por formacin del sulfuro correspondiente. Para efectuar esta reaccin se sigue dos mtodos: 1. Incorporando las sales metlicas en el medio de cultivo. 2. Utilizando tiras de papel de filtro embebidas en soluciones saturadas de las sales metlicas citadas y que se han dejado secar en estufa.

CH3 COO Pb COO CH3

Acetato de plomo + sulfuro de H Sulfuro de Pb + cido actico

+ H2S

PbS

2CH3 - COOH

Otra de las enzimas proteolticas de las bacterias (gelatinasa) tiene la propiedad de licuar a la gelatina; otras actan sobre la leche, otras permiten a las bacterias utilizar los nitritos. CULTIVO DE MICROORGANISMOS Si queremos conocer las caractersticas de un microorganismo determinado, es necesario poder cultivarlo y mantenerlo en el laboratorio, separado de otros precedentes de su mismo hbitat, o de contaminantes ambientales. Por tanto, para cultivar un microorganismo con vistas al estudio de sus caractersticas genticas, bioqumicas, fisiolgicas u otras, son necesarios dos requisitos: primero, conseguir un medio en el que pueda crecer y, segundo obtener un cultivo puro. Anteriormente ya hemos hablado de los medios de cultivo y sus clases, ahora vamos hablar cultivos puros y la siembra de los microorganismos SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS Sembrar una bacteria, es colocarla en un medio de cultivo, elegido de acuerdo con las exigencias vitales del microorganismo, que permite as su desarrollo y multiplicacin, si se lo coloca a una temperatura adecuada y un tiempo conveniente. Dos pueden ser las finalidades de las siembras en medios de cultivo: a) Transplante, b) Aislamiento. Transplante.- El material que se siembra contiene una sola especie bacteriana, y su objeto es renovar el medio de cultivo, ya para perpetuar la especie de que se trate, o bien para conocer algunas de sus propiedades culturales o biolgicas. Aislamiento.- El material que se siembra contiene mezclas de especies bacterianas y su objeto es separarlas, obteniendo cultivos al estado puros.

Obtencin de cultivos puros Un cultivo puro es aquel que contiene un nico tipo de microorganismos y se obtiene mediante aislamiento de la progenie de una sola clula.

En 1882 Roberto Koch y sus colaboradores emplearon por primera vez agar como agente solidificante del medio de cultivo. El uso del agar supuso un avance enorme y contribuy a la identificacin de muchos de los agentes patgenos productores de enfermedades infecciosas. El agar es un polisacrido complejo obtenido de las algas rojas. En agua funde a unos 95 C y permanece lquido al enfriarse a 40 C, luego se solidifica. Para el aislamiento de microorganismos, los medios de cultivo de agar se disponen en placas de Petri, debidamente esterilizadas, en donde se vierte el medio slido fundido. Para aislar microorganismos en placas de agar nutritivo u otros medios en placa se hace empleando mtodos de siembra en placa. Este mtodo implica la separacin e inmovilizacin de los microorganismos individuales sobre o dentro del medio slido. Cada microorganismo viable da origen, al crecer, a una colonia, que puede transferirse fcilmente. Siembra en placa por estra Con un asa de siembra previamente esterilizada, se toma una porcin de la mezcla microbiana y se va extendiendo sobre la superficie del agar haciendo estras en sucesivas secciones de la placa; esterilizando el asa de siembra para cada seccin y al final obtendremos un agotamiento del contenido de la muestra y as podremos obtener clulas aisladas, por lo que obtendremos un cultivo puro. Siembra en placa en superficie o por extensin En este caso es necesario hacer diluciones de una muestra en un lquido estril y con una pipeta estril se pone una pequea cantidad de la mezcla microbiana, que ya est diluida, se coloca en el centro de una placa y se extiende uniformemente sobre la superficie con una varilla doblada de vidrio estril o con el asa de siembra., si se ha hecho correctamente obtendremos colonias aisladas. Siembra en profundidad o por vertido Se hace una serie de diluciones de la muestra original, como en el caso anterior. Alcuotas de los ltimas diluciones se deposita en tubos con agar fundido y enfriarlo hasta 45 C y se mezcla por agitacin. Luego se vierte a placas de Petri estriles, se deja solidificar y luego se incuba. Algunas colonias quedarn atrapadas en el interior del agar y otras crecern en la superficie. Las tcnicas de incubacin varan segn se trate de bacterias aerbicas, anaerbicas o microaerfilas; hacindose la siembra en todos los casos en una forma ms o menos parecida. Las muestras que se remiten o reciben en el laboratorio para efectuar un aislamiento pueden ser las siguientes: Saliva Leche Semen Moco vaginal

1. Secreciones

2.- Excreciones 3.- Fluidos del organismo

Orina Heces Sangre Suero sanguneo Lquido cefalo- raqudeo Pus Exudado abdominal o torxico Exudado uterino

4.- Exudados

5.- Fragmentos de rganos y tejidos afectados EMPLEO DE ANIMALES DE LABORATORIO EN EL AISLAMIENTO Para efectuar el aislamiento de algunos microorganismos puede emplearse animales de laboratorio, los que son inoculaos con las muestras y una vez que mueran vctimas de la inoculacin o que sean sacrificados se obtendr muestras que sern inoculadas en medios de cultivo adecuados y de estos se har el aislamiento de la especie bacteriana en forma pura. Los animales que pueden emplearse en el laboratorio son: conejos, cobayos, ratones, ratas, hmsteres y algunos animales domsticos. Las vas de inoculacin en los animales pueden ser: 1.- Administracin por la va oral. 2.- Instalacin en la conjuntiva. 3.- Administracin por la trquea. 4.- Inoculacin cutnea 5.- Inoculacin intravaginal o intrauterina 6.- Inoculacin vesical 7.- Inoculacin intranasal. 8.- Inoculacin intramamaria 9.- Inoculacin parenteral la que a su vez puede ser: intradrmica, subcutnea, endovenosa, intramuscular, intracraneal, intraperitoneal, epidural o raqudea. ESTUDIO SISTEMTICO DE LOS MICROORGANISMOS Las bacterias as como los hongos, levaduras y algas son identificados principalmente por su tamao, forma, estructura, color, composicin qumica, caracteres de cultivo, patogenicidad para animales etc. En cambio los virus y rickettsias son identificadas casi exclusivamente sobre la base de su estructura antignica, husped susceptible y aspectos inmunolgicos. Procedimiento en la identificacin 1.- Morfologa y tensin. Una vez aislada la bacteria, la primera etapa en su identificacin es determinar a que grupo importante pertenece para esto debe estudiarse: la movilidad, (es mvil o inmvil) utilizndose la observacin por gota colgante de

cultivos frescos en medios apropiados; la morfologa y propiedades tintoriales, debe determinarse primero si es bacilo o coco o espirilo, luego el tamao y forma del mismo. En cuanto a sus caractersticas tintoriales debe determinarse si es Gram positivo o Gram negativo, as mismo si posee o no cpsula, si es cido resistente o no. 2.-Caracteres de cultivo.-Debe hacerse un estudio cuidadosote las exigencias nutritivas del germen, exigencias de oxgeno, clases de colonias que producen (forma, tamao, bordes, etc), fermentacin de los carbohidratos y diversas pruebas bioqumicas que se tiene que realizar para cada bacteria aislada. 3.- Patogenicidad para animales de laboratorio.-Finalmente debe determinarse la patogenicidad del germen en estudio para los animales de laboratorio. Por ejemplo el Bacillus anthracis es patgeno para todos los animales de laboratorio (no para las aves).