DETERMINACIN DE PROTEINAS

I.

INTRODUCCIN: Existen varios mtodos para determinar la concentracin de protenas de una muestra, tales como la determinacin de la absorbancia a 280 nm, o mediante la formacin de derivados coloreados de las protenas, base de los mtodos de BIURET o de LOWRY. En estos casos se forma un complejo coloreado de cobre con el enlace peptdico; en el mtodo de Lowry, adems del complejo anterior tambin se forma un derivado de las tirosinas que contribuye a la absorbancia total. Las protenas son molculas formadas por cadenas lineales de aminocidos. Por sus propiedades fsico-qumicas, las protenas se pueden clasificar en protenas simples (holoproteidos), que por hidrlisis dan solo aminocidos o sus derivados; protenas conjugadas (heteroproteidos), que por hidrlisis dan aminocidos acompaados de sustancias diversas, y protenas derivadas, sustancias formadas por desnaturalizacin y desdoblamiento de las anteriores. Las protenas son indispensables para la vida, sobre todo por su funcin plstica, pero tambin por sus funciones biorreguladoras (forman parte de las enzimas) y de defensa. Las protenas desempean un papel fundamental para la vida y son las biomolculas ms verstiles y diversas. Son imprescindibles para el crecimiento del organismo y realizan una enorme cantidad de funciones diferentes, entre las que destacan: Estructural, inmunolgica (anticuerpos), enzimtico, contrctil (actina y miosina), homeosttica, transduccin de seales, protectora o defensiva. Adems estn formadas por aminocidos los cuales a su vez estn formados por enlaces peptdicos para formar esfingocinas.

II.

MATERIALES Y MTODOS EQUIPOS: Espectrofotmetro Centrfuga Estufa

MATERIALES Y REACTIVO Proporcionado por el alumno 01 aguja descartable n21 Algodn Alcohol medicinal Leche de vaca 100 ml Leche de soya 100ml

Proporcionado por el laboratorio Reactivo de Biuret Pipetas de 1 y 5 ml

Procedimiento experimental:

Armado del siguiente sistema: COMPONENTES (ml) I II III IV V VI Sol. Almidn 1% 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 Buffer fosfato 0.1M pH 4.6 5.0 Buffer fosfato 0.1M pH 6.6 5.0 5.0 5.0 5.0 Buffer fosfato 0.1M pH 9.0 5.0 Sol. NaCl 0.2% 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 Agua destilada 2.6 3.4 2.0 2.0 2.0 2.0 Mezclar, incubar los tubos del I al VII a 37C en la estufa durante 5 VIII mantenerlo en un bao helado entre 0C y 4C a igual tiempo. Solucin enzimtica 2% 0.0 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 VII 1.0 5.0 VIII 1.0 5.0

1.4 1.4 2.0 2.0 min.; el tubo 0.6 0.6

Se procedi a mezclar, seguidamente se continu con la incubacin. Observacin: Se comput el tiempo desde el momento que el preparado enzimtico fue agregado. Los controles de la actividad enzimtica se realizan a los 10 y 30 minutos de acuerdo a los sistemas que a continuacin se presentan.

Control de la actividad enzimtica Control del sustrato no transformado.- Se realiz por la reaccin con el iodo. Se procedi a armar dos series paralelas de tubos marcados como: 1) Control 10 min. (Tubos del I al VIII) 2) Control 30 min. (Tubos I, VI, VII) Control 10 min. A1 Control 30 min. A2 I II III IV V I AGREGAR A AMBAS SERIES cido clorhdrico 0.05 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 N Control de la actividad enzimtica a los 30 min A) Cumplimos los primeros 10 min de incubacin en el cual se transfiri 0.5 ml del incubado a los correspondientes tubos control, y se procedi a mezclar. B) Se agreg a cada tubo control 0.5 ml de sol. Iodada para ser mezclado prosteriormente. C) Se observ y anot los resultados de las reacciones valorando en forma de cruces: VI VI 2.5 VII VII 2.5 VIII

2.5

O = Sin cambio en el color + = una disminucin ligera del color ++ = Otra algo ms intensa

Control de la actividad enzimtica a los 30 min. A) Cumplidos los primeros 30 min de incubacin en el cual se transfiri 0.5 ml del incubado a los correspondientes tubos control, finalmente se procedi a mezclar. B) Se agreg a cada tubo control 0.5 ml de sol. Iodada y mezclar. C) Observar y anotar los resultados de las reacciones.