INTRODUCCIN

Dentro bacterias

de

las pueden

eubacterias ser

existen

tres en

grupos a

de la

que

diferenciados

relacin

estructura de la pared celular. Para poder diferenciar a estos grupos no es necesario utilizar complejos sistemas de identificacin, y basta con un microscopio ptico y unas cuantas soluciones de colorantes. La forma ms sencilla de iniciar una identificacin del microorganismo que se desea estudiar es realizar una coloracin o tincin de Gram. La tincin de Gram es una tincin diferencial porque no todas las clulas se tien de la misma manera y permite discriminar entre dos grandes grupos de eubacterias, las eubacterias Gram positivas y Gram negativas. Los la microorganismos de Gram Gram a positivos, que contienen a la como una de el pared los

Staphylococcus aureus, adquieren un color violeta despus de coloracin debido muy celular estructuralmente diferente

microorganismos Gram negativos, como la Escherichia coli, que adquieren un color rosado.

TINCIN

COLORACIN

GRAM

Esta tincin fue desarrollada empricamente por Christian Gram en 1884. A pesar del tiempo transcurrido, la tincin apenas se ha modificado y es uno de los primeros pasos que se realiza para cualquier identificacin bacteriana. La tcnica es capaz de diferenciar dos grandes grupos de eubacterias: Gram positivas (G+) y Gram negativas (G-). FUNDAMENTO La tincin de Gram requiere cuatro soluciones: Primer colorante: Es un colorante bsico que en contacto con las clulas cargadas negativamente, reacciona con ellas colorendolas. El ms utilizado es el cristal violeta. Solucin mordiente: Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y las clulas. Los mordientes empleados suelen ser sales metlicas, cidos o bases, como, p.ej., el Lugol. Agente decolorante: es un disolvente orgnico, p.ej. alcoholacetona (1:1). Colorante de contraste: Es un colorante bsico de distinto color que el primer colorante, como, p.ej., la safranina o la fucsina. Los dos grupos bacterianos que distingue esta tcnica
de

difieren en el color con el que finalmente aparecen. ( foto

tincin mixta).

Las bacterias Gram+ se teirn de azul por el

de Bacillus)

cristal violeta (foto coloracin

Enterobacter).

y no perdern esta coloracin violeta en los siguientes

de

durante los pasos sucesivos. Las bacterias Gram- perdern la inicial del cristal pasos y se teirn de rosa debido a la safranina (foto

La diferencia est determinada por la composicin

de

su

envoltura

celular.

Las

Gram+

poseen

una

malla

de

peptidoglicano en su parte ms externa, mientras que las Gram-, recubriendo una fina capa de peptidoglicano, presentan una membrana externa que envuelve toda la clula. Una de las precauciones al realizar esta tincin es la de trabajar con cultivos en fase exponencial. De lo contrario se pueden obtener resultados falsos. P.ej. las bacterias Gram+ en fase estacionaria pueden aparecer como Gram-. OBJETIVOS

Diferenciar bacterias Gram positivas y Gram negativas. Comprobar las limitaciones que existen en la tincin cuando se utilizan a cultivos con bacterianos desenvoltura en con fase el estacionaria.

Contribuir microscopio.

manejarse

MATERIALES Y REACTIVOS

Portaobjetos preparados Colorantes:

o o o o

con

frotis

bacterianos

previamente

Solucin de cristal violeta al 1% Solucin de safranina al 0,5% Solucin diluida de yodo (Lugol) Alcohol-acetona (1:1) o bien alcohol al 95%

Microscopio y aceite de inmersin

REALIZACIN 1. Preparar los frotis bacterianos. 2. Teir con cristal violeta 1min. 3. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.

4. Cubrir con Lugol 1min. 5. Lavar con agua el exceso de Lugol. 6. Decolorar con alcohol-acetona o simplemente con alcohol hasta que la preparacin deje de perder color (30seg) 7. Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente. 8. Teir con safranina 1min. 9. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste. 10.Secar la preparacin. 11.Examinar al microscopio fijndose sobre todo en el

color de cada preparacin. Los tiempos de exposicin a los colorantes son orientativos. Cada vez que la se prepara Gram la batera de colorantes para realizar tincin presentan algunas diferencias

respecto a los preparados en otro momento, por lo que puede ser necesario ajustar los tiempos. En un laboratorio de Microbiologa, cada vez que se preparan los colorantes, se suelen hacer pruebas con cultivos patrn de los dos tipos (Gram+ y Gram-) para ajustar as los tiempos y tener la certeza de que el resultado de todas las tinciones que se hagan mientras duren esos colorantes son fiables. Otra posibilidad es adquirir el equipo completo de colorantes ya preparados, pero es mucho ms caro.

GRAM POSITIVOS Las eubacterias Gram positivas son clulas con una gruesa pared celular de peptidoglicano.

Ests

clulas y

poseen se una es

una

membrana Por la capa fuera pared de

citoplasmtica de la celular que

con est Este por

fosfolpidos citoplamtica compuesta por peptidoglicano

protenas. encuentra ancha una

membrana

peptidoglicano. gigante formada

macromolcula

cadenas de un dmero compuesto por N-acetilglucosamina y Nacetilmurmico. A su vez, estas cadenas se encuentran unidas entre s mediante pptidos, que son pequeas cadenas de aminocidos que se entrecruzan. Estos puentes peptdicos son caractersticos de las distintas bacterias y presentan mayor rigidez cuanto ms completo sea el entrecruzamiento. El peptidoglicano es una malla porosa que otorga forma y rigidez a la clula, y evita que la clula estalle en medios hipotnicos. Al ser porosa permite el paso de nutrientes desde el exterior y el movimiento de enzimas catalticas y productos de secrecin hacia el exterior de la clula. La pared celular Gram positiva tambin contien cidos

teicoicos y cidos lipoteicoicos. Los cidos teicoicos son cadenas de ribitol o glicerol unidas por fosfodisteres, y estn unidos covalentemente al peptidoglicano por medio de grupos fosfodister se y no en el oxihidrilo anclados al del en C6 la del Nacetilmurmico. Los cidos lipoteicoicos son polmeros de glicerofosfato citoplasmtica evidencias que encuentran estn que membrana La la unidos peptidoglicano. participaran en

funcin de estos compuestos sera estructural, pero existen indican tambin regulacin de las enzimas hidrolticas que renuevan la pared celular (autolisisnas) y que seran sitios de fijacin de fagos.

Esquema de las Envolturas de una Eubacteria Gram Positiva

GRAM NEGATIVOS Las eubacterias Gram negativas son clulas con una delgada capa de peptidoglicano y una segunda envoltura denominada membrana externa. Las clulas se encuentran por envueltas una bicapa por una membrana y

citoplasmtica

formada

fosfolipdica

protenas. Por encima de esta membrana se encuentra una fina capa de peptidoglicano que se halla unida covalentemente a unas lipoprotenas de anclaje que fijan la membrana externa por medio de porciones y la es lipoflicas. externa espacio es Entre queda es la membrana el el al los por citoplasmtica espacio periplasma citoplasma, que membrana Este una que delimitado respecto mediante

periplsmico.

ocupado

matriz

isotnica mantenida

isotonicidad

oligosacridos derivados de membrana (MDO), y en la que se

hallan componentes catalticos de suma importancia para la viabilidad celular. La membrana externa tiene una estructura de bicapa asimtrica en donde la cara externa esta compuesta por el lipopolisacarido (LPS) y la cara interna por fosfolpidos. Adems, esta membrana es rica en protenas, algunas de las cuales se denominan porinas. La membrana externa funciona como una barrera de permeabilidad para ciertas sustancias como antimicrobianos y enlentece el pasaje de otros que son inactivados en el periplasma. El LPS est formado por tres regiones: el polisacrido O (Antgeno O), el polisacrido del centro (KDO) y el lpido A (Endotoxina). La presencia del LPS en la membrana externa le confiere a la clula una efectiva proteccin contra enzimas digestivas y detergentes como las sales biliares, y dota a la superficie bacteriana con una fuerte hidrofilicidad que le permite a la clula evadir la fagocitosis, tener cierta resistencia al complemento, evitar la respuesta inmune especfica y adherirse por a alteracin ciertas de la del superficie hospedador. Las porinas son poros o canales proteicos no especficos que pueden ser atravesados por pequeas molculas hidroflicas. En la membrana externa se encuentran otras protenas que funcionan como canales de difusin especficos y facilitan el paso de di, tri y oligosacridos. antignica clulas

Esquema de las Envolturas de una Eubacteria Gram Negativa

GRAM KIT PARA COLORACIN El descubrimiento emprico y fortuito hecho por Gram de que la secuencia Violeta-Lugol-Alcohol- Safranina, intercalando breves lavados con agua entre reactivos, daba como resultado un mtodo de coloracin altamente diferencial para grmenes constituy -y constituye actualmenteuno de los pilares fundamentales de la Bacteriologa en varios aspectos adems del taxonmico. USO Coloracin diferencial para bacterias. CARACTERSTICAS Combinacin estandarizada de colorantes y decolorante - Violeta Cristal - Solucin de Iodo - Decolorante - Safranina

Optima

definicin:

Gram-positivos a travs

y de

Gram-negativos una tcnica

perfectamente

diferenciados

estandarizada mediante el empleo de cepas tpicas. MODO DE EMPLEO Usar portaobjetos limpios, desengrasados y secos. Se recomienda lavarlos con Detergente BIOPUR, enjuagarlos con abundante agua y mantenerlos en alcohol. No usar portaobjetos hmedos pues alteran notablemente los resultados. Desechar los 12portaobjetos rayados y percudidos pues dificultan la observacin. Dejar secar el extendido sobre el piso de la estufa de cultivo. Fijar al calor, pasando sobre la llama azulada del mechero, rpidamente, por tres veces, la cara opuesta a la que se extendi el material. Dejar enfriar. 345Cubrir Lavar Cubrir con con con Violeta pequeo Solucin Cristal: chorro de dejar de agua dejar actuar (3-5 actuar 1 minuto. Escurrir. segundos). 1 minuto. Escurrir. Iodo: Escurrir. Lavar con pequeo chorro de agua. Escurrir. 6Cubrir con Decolorante: dejar actuar entre 30 segundos y 1 minuto. Escurrir. Lavar con pequeo chorro de agua. Escurrir. 7Cubrir con Safranina: dejar actuar entre 1 minuto y 1 minuto y medio. Escurrir. Lavar con pequeo chorro de agua. Escurrir. 8Secar. Observar con objetivo de inmersin.

(*)

Cada

vez

que

se

indique el

la

maniobra lquido

escurrir, inclinando

debe el

interpretarse: portaobjetos. IMPORTANTE -

derramar

Si se fijan directamente a la llama preparados que no han sido secados excesivos previamente, con pueden estallar las clulas y cuerpos bacterianos.

Lavados

agua

pueden

afectar

significativamente los resultados. No debe interrumpirse la secuencia de pasos en ningn momento. A fin de cumplir con el paso anterior, debe asegurarse que los frascos goteros contengan suficiente cantidad de reactivo antes de iniciar el proceso de tincin. PRESENTACIN Equipo con frascos x 100 mL. ACEITE DE INMERSION USO Observacin de Extendidos con objetivo de inmersin 100X. Cuando se utiliza objetivo 100X el aire que se encuentra entre el objetivo y el cubreobjeto provoca distorsin de la imagen dada la diferencia de los ndices de refraccin entre el del vidrio y el del aire. Para solucionar ste problema se utilizan objetivos que contienen aceite para la transmisin de la luz. El sistema se complementa con el uso de una gota de aceite de inmersin que se coloca entre el objetivo y el cubreobjeto de manera de igualar los ndices de refraccin.

CARACTERSTICAS Aceite sinttico utilizado para la observacin microscpica bajo objetivo de inmersin (100X). Medio excelente para la observacin ndice de microscpica refraccin, bajo inmersin homognea. Optimo en adecuada viscosidad, pobre

fluorescencia, no secante. til an en preparaciones frescas con cubreobjetos. MODO DE EMPLEO Colocar una gota pequea sobre el preparado o sobre el cubreobjeto segn corresponda. Acercar el objetivo de inmersin del microscopio hasta que toque la gota. Ajustar con el micromtrico del microscopio hasta que la imagen sea ntida. PRESENTACIN 100 mL