V IBEROLAB

GESTIN INTERNA DE LAS CEPAS UTILIZADAS COMO MATERIAL MICROBIOLGICO DE REFERENCIA EN UN LABORATORIO DE SERVICIOS ACREDITADO BAJO NORMA ISO/IEC 17025 R. J. Toselli1, M. Der Ohannesian1 y G. Cheminet1
1

Centro de Qumica Aplicada (CEQUIMAP) Facultad de Ciencias Qumicas. Universidad Nacional de Crdoba. Medina Allende y Haya de la Torre Ciudad Universitaria. 5000 Crdoba, Argentina; e-mails: rtoselli@mail.fcq.unc.edu.ar, martinder@mail.fcq.unc.edu.ar y gcheminet@mail.fcq.unc.edu.ar

RESUMEN. La validacin, verificacin e inclusin de controles positivos y negativos en las pruebas de tipificacin en los ensayos microbiolgicos requieren la utilizacin de cepas estndar de control de calidad que constituyen un material de referencia. El objetivo de este trabajo es presentar un modelo de gestin de dicho material que incluye su categorizacin en cultivos stock, semi-stock y de trabajo, los registros asociados y las pruebas de control de calidad que sobre ellos se efectan.

2.- Categorizacin de los cultivos de las cepas de referencia Cultivo stock: Representa el verdadero banco de cultivos. Se mantiene en un sistema cerrado de conservacin, minimizando su actividad gentica y fisiolgica para evitar su potencial mutacin. Uno de los mtodos empleados en la conservacin del cultivo stock es el ultracongelamiento a 80 C. En estas condiciones la cepa puede conservarse por largos perodos de tiempo. En el cultivo stock se definen dos grupos: -Cultivo Stock A: Es el cultivo stock de referencia. Este slo se utilizar en casos de extrema necesidad. -Cultivo Stock B: Cultivo que se utiliza para generar un cultivo intermedio o semi-stock. Cultivo semi-stock: Es un cultivo que se mantiene durante un perodo de tiempo intermedio entre el cultivo stock, relativamente permanente y el cultivo de trabajo. Entre los mtodos disponibles para preparar el cultivo semi-stock, el ms prctico es el de congelamiento a -20 C. Este mtodo permite la sobrevivencia de la cepa en algunos casos por aos y en la mayora de las veces por al menos 6 a 12 meses. En el cultivo semi-stock, al igual que en el stock, se definen dos grupos: -Cultivo Semi-stock A: Es el cultivo semistock de referencia que slo se utilizar en casos de suma necesidad, garantizando de este modo que la cepa sufra la menor cantidad de modificaciones genticas posibles. -Cultivo Semi-stock B: Cultivo que se utiliza para generar los cultivos de trabajo. Cultivo de trabajo: Es el cultivo control que se usa para el trabajo de rutina. El mtodo de conservacin empleado para este cultivo es el de refrigeracin entre 1 y 4 C. El cultivo de trabajo se conserva durante un tiempo variable segn el criterio de cada laboratorio.

1.- Introduccin La validacin y verificacin de los procedimientos microbiolgicos, como as tambin la inclusin de controles positivos y negativos en las pruebas de tipificacin de ensayos microbiolgicos de rutina, requieren la utilizacin de cepas estndar de control de calidad que constituyen un material de referencia. Existen varias colecciones internacionales de cepas utilizables como por ejemplo: ATCC (USA), NCIC (Inglaterra), JFCC (Japn), CCTM (Francia), RIA (Rusia), NCIB (Escocia) y DSM (Alemania). El procedimiento utilizado por un laboratorio para el mantenimiento y la conservacin de las cepas de referencia, debe garantizar la sobrevivencia de las mismas con un mnimo de mutaciones, para lo cual, el crecimiento de los microorganismos y el nmero de repiques efectuados con ellos deben ser mnimos. As, el proceso de gestin de las cepas estndar de referencia, que se utilizan en un contexto de control de la calidad en un laboratorio de microbiologa, debe asegurar que dichas cepas mantengan sus caractersticas tpicas y un comportamiento estable. El objetivo de este trabajo es presentar un modelo de gestin del material microbiolgico de referencia, tal como se lleva a cabo en el Laboratorio de Microbiologa de CEQUIMAP, Facultad de Ciencias Qumicas de la Universidad Nacional de Crdoba, Argentina. Esta institucin presta servicios a terceros desde hace ms de 25 aos y est acreditada bajo Norma IRAM 301:2005 (ISO/IEC 17025:2005).

3.- Reconstitucin y multiplicacin de las cepas de referencia Cuando el laboratorio adquiere una cepa de referencia, el ingreso de la misma se asienta en un registro especfico del Sistema de Calidad cuyo formato se presenta en la Fig. 1.

R. Toselli et. al. Gestin interna de las cepas utilizadas como material microbiolgico de referencia en un laboratorio de servicios acreditado bajo Norma ISO/IEC 17025.

Fig.1. Formato del registro de ingreso de cepas de referencia

Tambin se archivan los certificados e instructivos que acompaan a la cepa de referencia. De este modo, la eleccin del medio de cultivo y las condiciones de trabajo que se utilizan para reconstituir una cepa y obtener a partir de ella un cultivo stock, se realiza segn las especificaciones que brinda el proveedor de la misma. La centralizacin de toda esta informacin correspondiente a cada microorganismo adquirido por el laboratorio, tiende a garantizar la trazabilidad de las cepas de referencia.

4.- Preparacin de los cultivos stock, semi-stock y de trabajo 4.1 Cultivo stock La preparacin de este cultivo debe asentarse en el registro especfico, correspondiente al Sistema de Calidad (Fig. 2) En condiciones aspticas y con un ansa estril se toman varias colonias de las obtenidas en el proceso de reconstitucin y se suspenden en 50 mL de caldo de cultivo apropiado (caldo cerebro corazn, caldo triptena soya, etc.) con glicerol al 20%, estril, hasta obtener una suspensin visiblemente turbia. Esta suspensin se homogeniza bien y se dispensa aspticamente en tubos Eppendorf o tubos para crioconservacin estriles. Estos deben llenarse hasta dos tercios de su capacidad para minimizar los riesgos de contaminacin cuando sean manipulados. La mitad de los tubos se rotula con la letra Stock A y la otra mitad con la letra Stock B. Los tubos Stock A constituyen un banco de cepas de reserva las cuales se conservan durante aos bajo condiciones de ultracongelamiento. Los tubos Stock B se utilizan para preparar los cultivos semi-stock. En los rtulos deben especificarse los siguientes datos: identificacin de la cepa, tipo y nmero de coleccin, nmero de lote, fecha de realizacin de cultivo stock y la fecha prevista para la disposicin final. Los tubos que constituyen el cultivo stock se guardan en freezer a -80 C. 4.2 Cultivo semi-stock La preparacin de este cultivo debe asentarse en el registro especfico, correspondiente al Sistema de Calidad (Fig. 2).

De un cultivo Stock B se toma en condiciones aspticas una ansada y se estra en un tubo en pico de flauta con agar nutritivo, agar triptena soya agar cerebro corazn y se incuba 24-48 h a 37 C. A partir de este tubo se hace una suspensin en 50 mL de un caldo de cultivo apropiado (caldo cerebro corazn, caldo triptena soya, etc.) con glicerol al 20%, estril, hasta obtener una suspensin visiblemente turbia. La suspensin se homogeniza bien y se dispensa aspticamente en tubos Eppendorf o tubos de crioconservacin estriles. Estos deben llenarse hasta dos tercios de su capacidad para minimizar los riesgos de contaminacin durante la manipulacin. La mitad de los tubos se rotula con la letra Semi-stock A y la otra mitad con la letra Semi-stock B. Los tubos rotulados como Semi-stock A constituyen el material de reserva. Los tubos que constituyen el Semi-stock B se utilizan para generar los cultivos de trabajo. En los rtulos deben especificarse los siguientes datos: identificacin de la cepa, tipo y nmero de coleccin, nmero de lote, fecha de realizacin de cultivo semi-stock y fecha prevista para la disposicin final. El cultivo semi-stock se guarda en freezer a -20 C durante un tiempo mximo de un ao. 4.3 Cultivo de trabajo La preparacin de este cultivo debe asentarse en el registro correspondiente al Sistema de Calidad (Fig. 2) De un cultivo Semistock B se toma en condiciones aspticas una ansada y se estra en un tubo en pico de flauta con agar nutritivo, agar triptena soya o agar cerebro corazn y se rotula con los siguientes datos: identificacin de la cepa, tipo y nmero de coleccin, nmero de lote, fecha de realizacin del cultivo de trabajo y fecha prevista para su disposicin final. Los tubos inoculados se incuban durante 24-48 h a 37 C, y al cabo de ese tiempo se guardan en el refrigerador. El cultivo de trabajo se conserva durante el perodo que el laboratorio crea conveniente, dependiendo de la frecuencia de uso del mismo.

Fig. 2.. Formato del registro de generacin de cultivos stock, semistock y de trabajo para las cepas de referencia

5.- Controles de pureza y viabilidad. Los controles de pureza y viabilidad en el material microbiolgico de referencia se llevan a cabo cada vez que

R. Toselli et. al. Gestin interna de las cepas utilizadas como material microbiolgico de referencia en un laboratorio de servicios acreditado bajo Norma ISO/IEC 17025.

se genera un cultivo semi-stock y de trabajo. Del cultivo a ser evaluado se toma en condiciones aspticas una ansada, se estra sobre una placa con agar nutritivo, agar cerebro-corazn o agar triptena soya y se incuba 24-48 h a 37 C. Con el cultivo obtenido se evalan los siguientes parmetros: -Viabilidad: se determina observando si hay crecimiento o no en la placa al cabo del tiempo de incubacin. -Pureza: se observa si las colonias que desarrollaron en la placa tienen las mismas caractersticas macroscpicas. -Caractersticas de las colonias en medios selectivos y/o diferenciales: de la placa con agar nutritivo, agar cerebrocorazn o agar triptena soya se toman con el ansa en condiciones aspticas colonias aisladas y se estran en distintos medios selectivos y/o diferenciales apropiados para cada cepa. Se incuba a la temperatura y durante el tiempo especfico para cada medio y se observan las caractersticas de las colonias. -Tincin de Gram: Esta se realiza no slo para verificar el comportamiento la cepa frente a esta tcnica de tincin, sino tambin para detectar una eventual contaminacin. Los resultados obtenidos en los controles de pureza y viabilidad de cada una de las cepas se asientan en un registro diseado para tal fin. Las Fig. 3 y 4 muestran a modo de ejemplo el formato del registro de las pruebas de pureza y viabilidad para dos bacterias representativas, como son Escherichia coli y Salmonella enteritidis, respectivamente.

En funcin de todo lo expuesto anteriormente, la gestin de los microorganismos de referencia utilizados en el laboratorio de microbiologa, puede sintetizarse en el diagrama de flujo presentado en la Fig. 5.
Adquisicin CEPA DE REFERENCIA

Reconstitucin segn instruccin proveedor Suspensin cultivo en caldo con glicerol al 20% Cultivo Cultivo STOCK B -80 C Cultivo SEMI-STOCK B -20 C

B STOCK A
-80 C

Cultivo SEMI-STOCK A B -20 C

Pruebas viabilidad y pureza

Cultivo DE TRABAJO 1 - 4 C

: Registros
Fig. 5. Modelo de gestin de cepas de referencia en un laboratorio de microbiologa.

6.- Disposicin final de los cultivos de referencia Los tubos que contienen los cultivos stock, semistock y de trabajo deben descartarse, previa inactivacin en autoclave, en la fecha de disposicin final prevista en cada caso. La fecha de descarte de los cultivos debe asentarse en el registro especfico, correspondiente al Sistema de Calidad (Fig. 2).

Fig. 3. Formato del registro de control de pureza y viabilidad de una cepa de E. coli

Bibliografa
CGA-OAE-LE-MICRO. Rev. 0. 2004. Gua para la acreditacin de laboratorios que realizan anlisis microbiolgicos. IRAM 301:2005 (ISO/IEC 17025: 2005): Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y de calibracin. SMW&W-APHA-AWWA-WEF: 2005. Part 9000: Microbiological Examination. Section 9020: Quality assurance/Quality control.

Fig. 4. Formato del registro de control de pureza y viabilidad de una cepa de Salmonella enteritidis.