NDICE

Introduccin Captulo I Problemtica Caracterizacin Problema Objetivos Captulo II Marco Terico Los actinomicetos Pectinas Anlisis fsico-qumico de la cscara de naranja

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9 11 13

Investigaciones referentes a la produccin de pectinasas 14 Biorreactores Enzimas pectinasas comerciales Situacin del mercado internacional de las enzimas Captulo III Materiales y mtodos Materiales Mtodos Captulo IV Resultados Conclusiones Bibliografa 35 43 44 22 26 18 19 20

Agradecimiento: A toda mi familia por su incondicional apoyo y porque me ensearon que gracias al trabajo con amor y voluntad se puede llegar al xito.

INTRODUCCIN
Las enzimas pectinasas son un conjunto de enzimas que hidrolizan la pectina. stas presentan una extensa aplicacin en la industria alimentaria,

principalmente en la obtencin y clarificacin de jugos, vinos y cervezas (Fogarty y Ward, 1974; Neubeck, 1975). Las enzimas pectinasas extracelulares que hidrolizan la pectina pueden ser producidas por diferentes microorganismos como hongos y bacterias; en esta investigacin trabajamos con una bacteria que en pruebas preliminares produjo enzimas pectinolticas. Siendo el Per un pas rico en productos agrcolas conviene desarrollar un bioproceso orientado al aprovechamiento integral de recursos provenientes de
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la produccin agrcola y agroindustrial, adems de evitar la contaminacin ambiental, por los residuos provenientes de estas actividades. Uno de estos residuos por aprovechar es la cscara de naranja que, por su volumen, resulta atractivo para la produccin industrial de enzimas pectinasas, por lo que, en el presente trabajo de investigacin, se desarrollo un bioproceso a nivel de laboratorio, para la produccin de pectinasas por Actinomyces naeslundii.

CAPTULO I PROBLEMTICA

CARACTERIZACIN: Hoy en da vivimos en una sociedad de consumo, trmino utilizado en la

economa y sociologa, para designar al tipo de sociedad que se corresponde con una etapa avanzada de desarrollo industrial capitalista y que se caracteriza por el consumo masivo de bienes y servicios, disponibles gracias a la produccin masiva de los mismos. Los agentes quimicos biolgicos no pueden estar ajeno a estas circunstancias, tal es asi que las enzimas que son generalmente usadas en la industria de
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procesamiento de jugos, frutas y vinos; estan diseadas para hidrolizar alguna parte de la molcula de la pectina. Para nadie es un secreto encontrar y comprar enzimas en nestra sociedad. El Per un pas rico en productos agrcolas; por lo tanto conviene desarrollar un bioproceso orientado al aprovechamiento integral de recursos provenientes de la produccin agrcola y agroindustrial, Uno de estos residuos por aprovechar es la cscara de naranja que, por su volumen, resulta atractivo para la produccin industrial. Razn por la cual nos vemos motivados a realizar un proyecto de innovacin POR denominado PRODUCCIN EN CULTIVO DE ENZIMAS

PECTINASAS

ACTINOMYCETOS

SUMERGIDO

UTILIZANDO PECTINA Y CSCARA DE NARANJA.

PROBLEMA: Problema general: Cmo producir enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cscara de naranja?.

Problema especfico: Cmo evaluar los niveles de produccin de pectinasas con los parmetros establecidos, utilizando un medio natural a base de cscara de naranja?.

OBJETIVOS: Objetivo general: Evaluar los parmetros pH, temperatura, concentracin de nutrientes, aireacin y agitacin para la produccin de enzimas pectinasas en un medio sinttico de laboratorio. Objetivo especfico: Evaluar los niveles de produccin de pectinasas con los parmetros establecidos, utilizando un medio natural a base de cscara de naranja.

CAPTULO II MARCO TERICO

2.1 LOS ACTINOMYCETOS: Los actinomycetos han despertado un gran inters para biotecnlogos, genetistas y ecologistas, por su habilidad para producir metabolitos

secundarios. Muchos actinomycetos pueden crecer en los medios comunes usados en los laboratorios tales como agar nutricio, agar tripticasa soya, agar sangre y tambin en agar infusin cerebro corazn. Los actinomycetos crecern en caldos, pero necesitan ser cultivadas bajo condiciones especiales. El crecimiento en un tubo con caldo sin movimiento se
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da en la superficie, dejando el resto del caldo intacto. Los cultivos lquidos requieren considerable agitacin y aireacin. La agitacin puede estar entre 200 250 rpm. para dar la adecuada aireacin y homogenizacin del medio. De necesitar mayor mezclado, se puede colocar baffles en la parte interior del recipiente. Conforme avanza el tiempo de cultivo, el microorganismo crecer en forma de pellet (Cross, 1980). Los actinomycetos son un grupo de bacterias filamentosas, GRAM (+), las clulas que se van a formar son denominadas conidias, adems las encontramos participando en la degradacin de desechos orgnicos en los suelos como el compostaje. Vistos al microscopio tiene la forma de un hongo pequeo de tamao bacteriano; la pared celular est constituida por una serie de cidos murmicos y diaminopimricos, careciendo de pectidoglucanos, caracterstica que ayuda a reconocer a las bacterias. La composicin de la membrana ayud a excluir a los actinomycetos de la denominacin hongo, por encontrar esteroles en la membrana. En cuanto al citoplasma, se ha clasificado como microorganismo procariote debido a que no posee un ncleo y que su cromatina se encuentra libre en el citoplasma. Su informacin gentica posee una inestabilidad muy alta. Los actinomycetos generan metabolitos secundarios al final de la fase logartmica. En la naturaleza son los mayores productores de antibiticos, seguidos por los hongos. Tienen la capacidad de degradar pesticidas y
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derivados de petrleo. Se han encontrado actinomycetos termfilos que interviene en el proceso de compostaje, produciendo una serie de enzimas como las celulasas y amilasas. Los actinomycetos son considerados como los mdicos del suelo. En los actinomycetos podemos ver actualmente el gran potencial que tienen en el campo agrcola, biomdico, en la salud y en la biorremediacin (Franco, 2001).

2.2. PECTINAS: Las pectinas o sustancias pcticas son polisacridos que se componen principalmente de cidos poligalacturnicos coloides (poliur nidos derivados del cido galacturnico CHO(CHOH) 4COOH. Se hallan en los tejidos de las plantas. Las pectinas son tiles por su capacidad para formar geles o jaleas con compuestos polihidroxilados, como los azcares o con cantidades diminutas de iones polivalentes. En el presente estudio. El vocablo jalea se usar para designar al muy conocido producto semislido formado por pectina, azcar y cido en condiciones determinadas. La sustancia que se haba supuesto era la causa de que los jugos de fruta se convirtieran en jalea, fue aislada por Braconnot en 1824, quien la denomin pectina. Las extensas investigaciones realizadas en los cien aos siguientes esclarecieron las propiedades de las sustancias pcticas, pero poco hicieron
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para aclarar su naturaleza qumica. Entre 1920 y 1940 qued establecida la produccin de pectinas en escala comercial en cierto nmero de naciones y aqullas llegaron a formar parte importante en el comercio internacional (Kirk, 1961).

ESTRUCTURA DE LA MOLECULA DE PECTINA (CAMPOS D. 2001)

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2.3. ANLISIS FSICO-QUMICO DE LA CSCARA DE NARANJA CUADRO - 1 COMPOSICIN FSICO -QUMICA DE LA CSCARADE NARANJA (Demain A. Y Solomon N., 1986) Materia seca Protein Componentes principales (%) Carbohidratos Grasas Fibra Cenizas Calico Minerales (%) Magnesio Fsforo Potasio Azufre Colina Vitaminas (mg/Kg) Niacina ac. Pantotnico Riboflavin Arginina Aminocidos (%) Cistina Lisina Metionina Triptofano 90.00 6.00 62.70 3.40 13.00 6.90 2.00 0.16 0.10 0.62 0.06 770.00 22.00 14.96 22.20 0.28 0.11 0.20 0.11 0.06

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2.4.

INVESTIGACIONES

REFERENTES

LA

PRODUCCIN

DE

PECTINASAS: En la Fermentacin en Sustrato Slido (FSS), la concentracin del sustrato es mayor que en la Fermentacin en Cultivo Sumergido (FCS), debido a que contiene entre 1 a 10% de agua.(Laukevics, 1988). En otra investigacin, (Sols-Pereira & col., 1996), demostraron que en una concentracin de 5 g/L de glucosa en una FCS la produccin de pectinasas por Aspergillus niger fue reprimida, igualmente com o la produccin de otras enzimas hidrolticas, tales como poligalacturonasas, pectinesterasas y

celulasas; pero en una FSS con concentracin de glucosa de 5 g/L la sntesis de pectinasas no es afectada. En la FCS el medio es completamente simple, consistiendo en un producto de la agricultura no refinado, el cual contiene todos los nutrientes necesarios para el crecimiento microbiano. Los sustratos ms empleados en FSS son productos agrcolas (soya, arroz, trigo, maz, etc), o subproductos agro industriales (salvado de trigo, bagazo de caa, residuos de remolacha, bagazo de ctricos, bagazo de manzana, cscaras de diversos vegetales, etc.). stos,

generalmente, empleados en combinacin y/o, complementados con fuentes de carbono y energa fcilmente metabolizables (almidn, maltodextrinas, melazas, etc.) y otros nutrientes (rea, calcio, fosfatos, etc) (Agosin, 1995).
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Estos sustratos son colocados en agua, aunque pueden requerir de algn pretratamiento. El pretratamiento de estos sustratos (trmico principalmente) tiene un doble propsito; esterilizacin del sustrato y cambios en las propiedades fisicoqumicas del sustrato (gelatinizacin del almidn, aumento de la porosidad, etc.), que influye favorablemente en la degradabilidad y accesibilidad de los componentes polimricos (polisacridos y protenas) y estructurales del sustrato (Milstein y Flowers, 1986). Una produccin de pectinasa usando cscara de limn con diferentes pretratamientos, fue realizada determinndose pectin esterasa y

poligalacturonasa. Los resultados menos favorables fueron obtenidos usando cscara de limn seca; usando cscara de limn lavada y no lavada los resultados fueron similares para la poligalacturonasa, en tanto que el nivel de pectin esterasa fue particularmente alto con cscara de limn no lavada. Los bajos niveles de actividad fueron obtenidos cuando las cscaras se secaron a una temperatura final de 120 C, lo cual indica claramente la importancia de este tratamiento con las cscaras, cuando es usado para la produccin de pectinasas (Maldonado, 1986). Por otro lado, se ha probado sulfato de amonio para suplir la fuente de nitrgeno, debido al menor costo que el fosfato de amonio. El ensayo dio lugar a una reduccin del 20% de actividad pectinasa (Saval y Huitron, 1983). El pH ptimo de la enzima poligalacturonasa fue probada usando buffer acetato
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para pH 2.5 - 4.5 obtenindose una actividad pectinoltica mxima a un pH de 3.5 (El Sayed, 1994). Las bacterias anaerbicas productoras de pectinasas presentan un buen crecimiento a pH 7.0 y una temperatura de 45 C. La mxima actividad poligalacturonasa fue de 4.7 U.I./mL hallada en un caldo de fermentacin (Shivakuman, 1995). En otra investigacin (Abdel - Fattah y Ismail, 1996) trabajaron sobre el efecto de las reacciones al variar valores de pH y Temperatura de las preparaciones enzimticas, hallando valores ptimos de 4.5 y 50 C, respectivamente. La produccin de pectinasa extracelular es inducida por sustancias pcticas o por desechos agroindustriales tales como pulpa de limn o naranja, los cuales tienen apreciables cantidades de pectina ,(Aguilar y Huitron, 1986). Pectina y glucosa fueron usadas como comparacin de fuente de carbono, los resultados obtenidos con glucosa fueron pobres, considerando la naturaleza inducible de las enzimas pectinolticas (Kilara, 1982). (Sincere, 1989), seleccionaron tres cepas productoras de pcticas (Talaromyces flavus, Penicillium charlessi enzimas

y Tubercularia vulgaris),

utilizando pellets de pulpa de ctricos se obtuvieron actividades pectinolticas ms altas que las producidas por Aspergillus nger. En otro estudio de produccin de pectinasas bacterianas, utilizando pulpa de caf como sustrato, se encontr 0.76 U (unidades de actividad enzimtica) para
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pulpa de caf hmedo (Cabello y col.,1982). La presencia de pectina en la composicin del medio de cultivo es un factor importante, ya que influye sobre la diversidad y cantidad de enzimas pcticas, sabiendo adems que la produccin de enzimas pectinasas es inducible y no constitutivo (Trejo y col., 1991). Moreno y col.,(1995) reportan un estudio de produccin de pectinasa a partir de fermentacin en sustrato slido utilizando cscara de yuca y limn con Aspergillus niger ATCC 10864 obtenindose una productividad volumtrica de 434.4 U.I./(L*h), mayor que otros autores, 39 U.I./(L*h) ( Abdel-Fattah y col., 1977). Con respecto a las desventajas que pueden haber en una FSS tenemos que es un proceso ms lento que una FCS, debido a la gruesa barrera de slido; tambin presenta problemas de disipacin de calor limitado por la transferencia de masa intrapartcula (Trejo y col.,1991).

2.5. BIORREACTORES: El cultivo de bacterias, levaduras y hongos en un cultivo sumergido es una prctica universal en la industria de fermentaciones, desde la dcada de los 40s. La aplicacin de energa a los sistemas de fermentacin hace que los procesos de transporte convectivos sean rdenes de magnitud ms rpidos que los procesos difusionales que controlan el transporte en el cultivo slido. Esto
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ha permitido el desarrollo de procesos de alta productividad que han hecho del cultivo sumergido la tcnica de ms uso en la industria de las fermentaciones. Aunque la agitacin mecnica sigue siendo la forma ms usada de aplicar energa. Independientemente del tipo de cultivo, existen tres consideraciones, adems de la homogenizacin y la transferencia de oxgeno, que son de importancia en el diseo de biorreactores: La primera tiene que ver con la esterilidad. Llevar a cabo un proceso en ausencia de contaminacin es un requisito fundamental. El diseo de tomas de muestras y sellos mecnicos, el acabado de la superficie del tanque, as como de la conexin de vlvulas y aditamentos, juega un rol importante en un diseo exitoso. Un segundo aspecto de importancia es la remocin de calor. En vista de que las temperaturas de fermentacin son moderadas (25 a 40 C) y que el cultivo de clulas es un proceso exotrmico, el control de la temperatura en un biorreactor requiere de la remocin de cantidades importantes de calor. Un tercer punto de fundamental importancia son los aspectos mecnicos, la seleccin de reductores de velocidad y el diseo de la flecha de agitacin (Miranda y col., 1996).

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2.6. ENZIMAS PECTINASAS COMERCIALES: La moderna tecnologa de los zumos de frutas exige una degradacin rpida e intensa de la pectina, con el fin de que el prensado, la clarificacin y la filtracin puedan realizarse de una manera segura y econmica. PECTINEX es una preparacin purificada, producida por una cepa de

Aspergillus nger. El producto contiene principalmente pectin-transeliminasa, poligalacturonasa, pectinesterasa y hemicelulasas, siendo capaz de romper sustancias pcticas vegetales.

PECTINEX y ULTRAZYM son productos que han sido obtenidos como resultado de una investigacin y un desarrollo de varios aos. Por su amplio espectro de accin, satisfacen de manera ideal las diversas exigencias que se imponen a su sistema ptimo de enzima en cada una de las etapas individuales de produccin. Por lo tanto, PECTINEX y ULTRAZYM permiten asegurar

buenos resultados en todo el mundo, bajo las ms diversas condiciones tecnolgicas. Ventajas: La utilizacin de PECTINEX y de ULTRAZYM garantizan: Durante la accin de la enzima sobre la pulpa: La mejora en la extraccin del zumo, aumentando con ello el rendimiento global del zumo.
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 La reduccin de los tiempos de prensado, con incremento subsiguiente de la produccin. La liberacin de componentes fundamentales como color, aroma, etc., por descomposicin especfica de la pulpa. Durante el tratamiento enzimtico de los zumos: El desdoblamiento rpido y completo de la pectina. La floculacin rpida y la sedimentacin compacta de las sustancias enturbiadoras, con un mnimo de clarificantes. La filtracin ptima, con menor gasto de material filtrante. La estabilidad segura de los zumos completamente claros, concentrados y de sus diluidos. (Andersen, 1991). de sus

2.7. SITUACIN DEL MERCADO INTERNACIONAL DE LAS ENZIMAS: En el cuadro siguiente, se muestra la situacin del mercado internacional, de acuerdo con los datos publicados por (Eveleigh y col.,1990). Es impactante, por un lado, el hecho de que ms de 2000 enzimas registradas slo 60 sean producidas comercialmente y de stas slo cinco cubran ms del 80% del mercado (Garca y col., 1993). Es innegable que la expansin del mercado de enzimas observado en los ltimos aos en los pases de latinoamericana, es un aliciente para la creacin
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de nuevas empresas nacionales o mixtas que produzcan enzimas a nivel nacional o subregional (Illanes, 1994).

CUADRO - 2 PRODUCCIN MUNDIAL DE ENZIMAS (Garca y col.,1993) Enzima Proteasa fungal Pectinasa Amilasa fungal Cuajo microbiano Glucosa isomerasa Amilasa bacteriana Amiloglucosidasa Proteasa bacteriana TOTAL Tonelas / Ao % del Total 13 0.95 25 1.83 25 1.83 25 1.83 75 5.5 325 23.85 350 25.70 525 38.51 1363 100.00

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CAPTULO III MATERIALES Y MTODOS

3.1.

MATERIALES:

3.1.1. Material Biolgico: En el presente trabajo, se utiliz el microorganismo Actinomyces naeslundii, el cual fue aislado en el laboratorio de Farmacia del I.E.S.T.P. Santa Luca, a partir de una muestra de suelos naranjales del valle de Chanchamayo.

3.1.2. Medios de Cultivo: a). Medios de cultivo complejos:

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- Cultivo en slido: Constituido por Agar Trypticasa Soya y Agar Trypticasa Soya, suplementado con 1% de pectina ctrica. - Cultivo en lquido: Constituido por Caldo Trypticasa Soya y Caldo Trypticasa. Soya suplementado con 1% de pectina ctrica. b). Medio de cultivo experimental: Constituido por sales minerales y cscara de naranja como nica fuente de carbono, variando sus concentraciones de acuerdo al siguiente cuadro:

COMPOSICIN DEL MEDIO DE CULTIVO EXPERIMENTAL NUTRIENTES CONCENTRACIN CONCENTRACIN MNIMA (g/L) X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 Cscara de naranja (NH4)2 SO4 rea FeSO4.7H2O CaC12 NaC1 MgSO4.7H2O NaCO3 1.000 0.700 0.013 0.020 1.000 0.200 0.800 5.000 5.000 0.080 0.083 5.000 1.00 4.000 2.000 MXIMA (g/L) 16.700

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3.1.3. Accesorios: Mechero Asa de Kolle Termmetro Cronmetro Erlenmeyers de 250 mL Beakers de 150, 250, 500, 1000 mL Pipetas de 1, 2, 5, 10, 25 mL Probetas de 100, 250, 500, 1000 mL Baguetas Tubos de ensayo de 15 * 150 mm. Placas petri Embudos de vidrio Kitasato Tips de 50, 1000, 5000 L. Parafilm Algodn Pinzas Gradillas Filtro gelman 0.2 M Bomba de aire de 500 mL / min (URANUS)

Reactivos: Medio Agar Trypticasa Soya (TSA) Medio Caldo Trypticasa Soya (TSB) rea Sulfato de magnesio Cloruro de calcio Solucin amortiguadora (buffer) de fosfato 0.05 M, pH 7 cido sulfrico q.p. Hidrxido de sodio Alcohol etlico de 96 Agar-agar Solucin amortiguadora (buffer) de acetato 0.05 M, pH 4.8 Solucin de pectina al 1%
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Reactivo de cido 3,5- dinitrosalicilico (DNS) (Miller, 1959) Estndar de cido D-galacturnico para anlisis (SIGMA)1 mg /mL Sulfato de amonio

Tartrato de sodio y potasio Estndar de Albmina srica de bovino 10 mg / mL Pectina (sigma) Pectina ctrica de grado alimentario Cscaras de naranja Sulfato ferroso Cloruro de sodio Rojo de rutenio

3.1.4. Equipos: Autoclave Biorreactor de 1 litro Espectrofotmetro de rango visible SPECTRONIC 20 Estufa con temperatura controlada a 37 C MEMMERT S 30 Bao mara con temperatura controlada a 37 C INSTRUMENTAL. Horno a 180 C Centrfuga Agitador a 200 r.p.m. Cocinilla Refrigeradora Balanza analtica Balanza de platillos Bomba de vaco Vortex Equipo de destilacin Micro pipetas de 50, 1000, 5000 L

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3.2. MTODOS: 3.2.1. Acondicionamiento del microorganismo (Cabello y col.,1982). El microorganismo que utilizamos en esta investigacin fue sembrado peridicamente, tanto en un medio slido como en el lquido, de la siguiente manera: -Se sembr una colonia de Actinomyces naeslundii en un tubo con Caldo Trypticasa Soya, suplementado con 1% pectina ctrica, y luego se incub durante 5 das a 37 C. -A continuacin, se realiz una siembra del medio lquido en Agar Trypticasa Soya, suplementado con 1% pectina ctrica, y se realiz la incubacin durante 3 das a 37 C. -Posteriormente, se repitieron los pasos anteriores por 60 das.

3.2.2. Evaluacin preliminar de los parmetros pH, temperatura y aireacin-agitacin en un medio sinttico, para la produccin de pectinasas: a) DETERMINACIN DEL pH PTIMO ( Becker y col.,1999). En primer lugar, el microorganismo fue Inoculado en caldos de TSB, amortiguados a tres pH (5, 7 y 8.5); a continuacin, se incub en estufa a 37C por 72 horas; y, finalmente, se midi la masa celular por espectrofotometra a 600 nm.
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b) DETERMINACIN DE LA TEMPERATURA PTIMA (Becker y col.,1999). En el presente caso, se sigui el siguiente procedimiento: -Inoculacin del microorganismo en caldos de TSB -Incubacin de los tubos los tubos a temperaturas de 28C, 37C y 45 C durante 72 horas -Medicin de la masa celular, por espectrofotometra a 600 nm. c) DETERMINACIN DE LA AIREACIN-AGITACIN (Becker y col., 1999). La aireacin-agitacin se evalu a las 72 horas de incubacin, a 37 C, comparando el aumento de la masa microbiana por espectrofotometra, a 600 nm de los tubos con caldo control de TSB, en dos condiciones experimentales: -Tubos con sello de parafina estril y sin agitacin (SIN aireacin-agitacin) -Tubos sin sello de parafina estril y con agitacin (CON aireacin-agitacin)

3.2.3. Condiciones del proceso de biotransformacin: a) ACONDICIONAMIENTO DEL SUSTRATO: Se utiliz cscara de naranja como sustrato para la biotransformacin, la cual tuvo el siguiente tratamiento: La cscara de naranja fue recolectada de comerciantes de jugo de naranja cercanos a la UNMSM. Enseguida, se extrajo el aceite de la cscara de naranja utilizando un equipo de arrastre al vapor; a continuacin, la cscara fue secada a 80 C por 24 horas en estufa. Posteriormente, la cscara de naranja fue triturada en un molino manual de tornillo sin fin y tamizada a un tamao de
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partcula menor a 0.5 mm de dimetro. b) MANTENIMIENTO DEL MICROORGANISMO: El microorganismo

Actinomyces naeslundii se mantuvo por resiembras peridicas en el medio Agar Trypticasa Soya (TSA), suplementado con 1 % de pectina ctrica. Las condiciones de crecimiento del microorganismo fueron de 37C durante 24 horas. c) PREPARACIN DEL INCULO: El inculo se prepar a partir de un cultivo de 24 horas, haciendo diluciones de ste en solucin fisiolgica estril, hasta obtener una suspensin de clulas de 3 x 10
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u.f.c./mL. De aqu, se tomaron

alcuotas de 45 mL, que se transfirieron a matraces erlenmeyer cuyos contenidos fueron de 150 mL. d) DISEO DEL MEDIO DE CULTIVO EXPERIMENTAL : El medio de cultivo estuvo representado por nutrientes ubicados dentro de un rango mnimomximo:

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CUADRO - 3 COMPOSICIN DEL MEDIO DE CULTIVO EXPERIMENTAL: NUTRIENTES CONCENTRACIN CONCENTRACIN MNIMA (g/L) X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 Cscara de naranja (NH4)2 SO4 rea FeSO4.7H2O CaC12 NaC1 MgSO4.7H2O NaCO3 1.000 0.700 0.013 0.020 1.000 0.200 0.800 5.000 5.000 0.080 0.083 5.000 1.00 4.000 2.000 MXIMA (g/L) 16.700

Estos componentes fueron evaluados en una plantilla estadstica de PlacKettBurman, de donde se obtuvo los nutrientes ms significativos para la produccin de enzimas pectinasas. e) OBTENCIN DE PECTINASAS: La obtencin del extracto enzimtico crudo fue realizada por centrifugacin, a 5000 rpm por 20 minutos de las muestras constituidas por 5mL de cultivo, tomadas cada 8 horas, durante 7 das. 3.2.4. Mtodos de anlisis: a) DETERMINACIN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD PECTINOLTICA: La Actividad enzimtica del extracto obtenido luego de la biotransformacin, fue
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evaluada por la liberacin de azcares reductores de la pectina (1% p/v pectina sigma); la cual fue medida colorimtricamente, con el reactivo cido 3,5 dinitrosaliclico (DNS). Se realiz una curva estndar de cido D-galacturnico al 1% preparado en solucin amortiguadora de acetato 0.1M y pH 4.8 (Miller y col., 1959) teniendo en cuenta que una unidad enzimtica se defini como la cantidad de enzima que liber 1M de cido D-galacturnico por minuto a 50C. b) DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE BIOMASA: Fue utilizada la tcnica de recuento en placa de clulas viables, para lo cual se tomaron alcuotas del cultivo cada 8 horas (1 mL);luego, se realiz diluciones seriadas, para colocar 0.1 mL de clulas diluidas en la superficie de una placa TSA, extendindose stas, con una asa de Drigalski, e incubadas, finalmente, a 37C. 3.2.5. Anlisis estadstico: a) ANLISIS Y SELECCIN DE NUTRIENTES MS INFLUYENTES EN LA PRODUCCIN DE PECTINASAS: En una primera etapa de anlisis se utiliz el diseo experimental de Plackett-Burman para identificar los nutrientes de mayor influencia en la produccin de pectinasas, esto permiti evaluar 8 variables en 12 experimentos con 2 rplicas, teniendo en cuenta una concentracin alta (+1) y una baja (-1) de cada uno de los nutrientes. La evaluacin de los mismos, se realiz en frascos erlenmeyers de 250 mL de capacidad, que contenan 150 mL de medio experimental.
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CUADRO - 4 PLANTILLA DE PLACKETT BURMAN ( Ayala y Pardo,1995 )

VARIABLE N X1 1 1 2 1 3 4 1 5 1 6 1 7 8 9 10 1 11 12 X2 1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 X3 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 X4 -1 1 1 -1 -1 -1 -1 -1 1 -1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 -1 X5 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 -1 X6 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 1 -1 X7 X8 -1 -1 1 1 -1 1 1 -1 1 1 -1 1 1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 -1 1 -1 -1

-1 1 -1 1 1 -1 -1

Donde: X1= Cscara de naranja. X2= (NH4)2SO4 X3= (NH2)2CO X4= FeSO4*7H2O X5= CaCl2 X6= NaCl X7= MgSO4 X8= Na2CO3

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A. OPTIMIZACIN DE LA CONCENTRACIN DE NUTRIENTES PARA LA MXIMA PRODUCCIN DE PECTINASAS: Se utiliz el Diseo de Box Benhken, el cual sirvi para determinar las concentraciones ptimas de cada variable independiente (X1= Cscara de naranja; X2= (NH4)2 SO4 y X4= FeSO4. 7H2O ), para la mxima produccin de pectinasas, diseo que fue complementado con la tcnica de anlisis de respuesta superficial a las variables independientes anteriores, para luego ajustarlas al modelo polinomial cuadrtico siguiente:

Donde: Z = Variable dependiente (Produccin de enzima) X1= Cscara de naranja. X2= (NH4)2SO4. X4= FeSO4*7H2O. b0 = Constante por determinar b1, b2, b3 = Coeficientes lineales por determinar b4, b5, b6, b7, b8, b9 = Coeficientes cuadrticos por determinar.

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CUADRO - 5 PLANTILLA DE BOX BENHKEN (Robles y Col. 1995) VARIABLES N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 X1 1 -1 1 0 0 -1 1 1 0 0 0 1 1 -1 0 0 X2 1 -1 0 -1 -1 0 1 -1 0 -1 1 0 -1 -1 0 0 X4

1 1 1 1 1 1 -1 -1 -1 10 -1 11 -1 12 -1 13 0 14 -1 15 0 16 0

Para la identificacin de un valor ptimo, fue necesario estimar la curvatura de las variables ensayadas, determinndose los coeficientes del modelo

polinomial, usando la tcnica de regresin mltiple, cuyos valores fueron asignados a las ecuaciones XY polinomiales, para generar respuestas predictivas (representadas en los grficos de respuesta en superficie y de lneas de contorno).

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b. Biotransformacin final en biorreactor. Con las concentraciones ptimas obtenidas del experimento anterior, se realiz un ltimo experimento, en el cual fueron evaluados el crecimiento microbiano y la actividad enzimtica, utilizando para ello un inculo en fase logartmica con la finalidad de aprovechar la fuente de carbono en el mantenimiento del microorganismo.

33

CAPTULO IV RESULTADOS

4.1. EVALUACIN PRELIMINAR DE LOS PARMETROS CINTICOS pH, TEMPERATURA Y AIREACIN-AGITACIN EN UN MEDIO SINTTICO, PARA LA PRODUCCIN DE PECTINASAS. 4.1.1 DETERMINACIN DEL Ph PTIMO:

FIGURA

1.

EFECTO

DEL

pH

SOBRE

EL

CRECIMIENTO

DEL

MICROORGANISMO:

34

FIGURA 2. CRECIMIENTO DEL MICROORGANISMO A DIFERENTES pH

35

4.1.2 DETERMINACIN DE LA TEMPERATURA PTIMA: La evaluacin del crecimiento del microorganismo vs. Temperatura en caldo TSB, determin que la temperatura ptima fue de 37 C, luego de 72 horas de incubacin (Figura 3).

4.1.3. DETERMINACIN DE LA AIREACIN-AGITACIN: En experimentos previos se determin que la mayor concentracin de biomasa (D.O. 0.65) se obtuvo en un medio control con aireacin-agitacin a 300 rpm. Estos resultados, presentaron la necesidad de fijar valores de agitacin 300 rpm
36

y aireacin 0.5 vvm, para el proceso de biotransformacin sobre medio natural. (Figura 4).

CRECIMIENTO DEL MICROORGANISMO Y PRODUCCIN DE PECTINASAS: En la Figura 5, se observa que la mxima produccin de pectinasas es alcanzada en la etapa estacionaria del crecimiento microbiano, es decir, a las 64 horas.

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4.2. PROCESO DE BIOTRANSFORMACIN: ANLISIS Y SELECCIN DE NUTRIENTES MS INFLUYENTES EN LA PRODUCCIN DE ENZIMAS PECTINASAS: El anlisis del diseo de Plackett Burman demostr que los nutrientes que ms influyeron sobre la produccin de pectinasas fueron: Cscara de naranja , (NH4)2SO4 y FeSO4*7H2O, seleccionndose stos, para un anlisis posterior de optimizacin

4.2.1. OPTIMIZACIN DE LOS 3 NUTRIENTES SELECCIONADOS EN LA ETAPA ANTERIOR: Mediante la optimizacin de los 3 nutrientes ms influyentes, utilizando el diseo de Box Benhken, obtuvimos los siguientes resultados:
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Cscara de naranja ( 16.7 g/ L ), (NH 4)2SO4 (5 g/ L ), FeSO4*7H2O (0.013 g/ L ) y una produccin mxima predictiva de pectinasas de 0.71 U.I./mL

4.2.2. BIOTRANSFORMACIN FINAL EN BIORREACTOR: La cintica microbiana, llevada a cabo con los resultados obtenidos del diseo de Box Benhken, maximiz la respuesta entre las 60 y 80 horas, tiempo en el que se logr una produccin de 0.65 U.I./mL de la enzima.

CUADRO 6: CONCENTRACIONES PTIMAS A TRABAJAR EN BIORREACTOR

Volumen del medio experimental Concentracin celular del inculo Tiempo de biotransformacin Volumen de inculo

: 1000 mL : 3 x 10 9 u.f.c / mL

: 120 horas : 100 mL

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Temperatura Aireacin Agitacin pH

: 37 C : 0.5 vvm. : 300 rpm. : 7.0

En el resultado del crecimiento de la poblacin microbiana que se muestra en la Figura 6, podemos notar que ste obtuvo un mximo valor entre las 60 y 80 horas de transcurrido el proceso de biotransformacin. En la misma figura, se muestra la produccin de pectinasas, durante el proceso de biotransformacin, registrndose una alta produccin de 0.65 U.I./mL a las 72 horas, valor muy cercano a lo pronosticado en las Curvas de Superficie Respuesta 0.71 U.I./mL

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FIGURA - 7 CINTICA DE CRECIMIENTO Y PRODUCCIN DE PECTINASAS POR ACTIONOMYCES NAESLUNDII EN UN BIORREACTOR DE 1 LITRO

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CONCLUSIONES

Se obtuvo una actividad enzimtica de 0.65 U.I./mL en cultivo sumergido en medio ptimizado, compuesto por cscara de naranja 16.5 g/L, (NH4) 2SO4 5 g/L y FeSO4*7H2O 0.013 g/L.

Las condiciones de crecimiento y produccin de pectinasas por Actinomyces naeslundii son: pH 7.0, 37 C, 300 rpm y 0.5 vvm de aireacin.

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