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Bsqueda de Salmonella enterica en tortugas semiacuticas del Centro de Atencin y Valoracin de Fauna Silvestre del rea Metropolitana.

Sara Duque, Estudiante Veterinaria y Zootecnia CES Mara Adelaida Giraldo, Estudiante Veterinaria y Zootecnia CES

Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia- Universidad CES Instituto Colombiano de Medicina Tropical (ICMT-CES) Centro de Atencin y Valoracin de Fauna Silvestre del rea Metropolitana del Valle de Aburr (CAV)

Medelln, Noviembre de 2008

Bsqueda de Salmonella enterica en tortugas semiacuticas del Centro de Atencin y Valoracin de Fauna Silvestre del rea Metropolitana.

Sara Duque, Estudiante Veterinaria y Zootecnia CES Mara Adelaida Giraldo, Estudiante Veterinaria y Zootecnia CES

Trabajo de investigacin para optar al ttulo de Mdico veterinario- Zootecnista.

Tutoras: Diber Marcela Ramrez M., MV. CAV Miryan Margot Snchez, Bact. MSc. ICMT-CES.

Co- investigadoras: Paula Andrea Rincn, Estudiante Bacteriologa.CMA Gloria Jaramillo, Bact. CAV Nora Mara Cardona. MD. MSc. ICMT-CES

Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia- Universidad CES Instituto Colombiano de Medicina Tropical (ICMT-CES) Centro de Atencin y Valoracin de Fauna Silvestre del rea Metropolitana del Valle de Aburr (CAV)

Medelln, Noviembre de 2008 ii

Nota de aceptacin

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_________________________________

__________________________________ Jurado

__________________________________ Jurado.

Ciudad y fecha (da, mes, ao): _______________________________________

iii

AGRADECIMIENTOS

A la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia- Universidad CES

Al Instituto Colombiano de Medicina Tropical (ICMT-CES)

Al Centro de Atencin y Valoracin de Fauna Silvestre del rea Metropolitana del Valle de Aburr (CAV)

Al rea Metropolitana

Por la financiacin y apoyo en la realizacin de este proyecto.

INDICE DE CONTENIDO Pg. 1. Resumen 2. Abstract 3. Formulacin del problema 4. Planteamiento del problema 4.1.Justificacin de la propuesta 4.2. Pregunta(s) de investigacin 5. Marco terico 6. Objetivos 6.1. General 6.2. Especficos 7. Metodologa 7.1. Tipo de estudio 7.2. Poblacin 7.3. Diseo muestral 7.4. Descripcin de las variables 7.5. Tcnicas de recoleccin de la informacin 7.6. Tcnicas de procesamiento 7.6.1. Procedimientos 7.6.2. Tcnica de laboratorio para deteccin de S. enterica 7.6.2.1. Coprocultivo 7.6.2.2. Extraccin de DNA bacteriano 7.6.2.3. Deteccin de productos de amplificacin 8. Consideraciones ticas 7 9 11 13 13 14 15 21 21 21 22 22 22 22 23 24 24 24 27 27 29 31 34

Pg.

9. Resultados 10. Discusin 11. Conclusiones 12. Referencias bibliogrficas 13. Anexos

36 42 46 48 53

1. RESUMEN

Estudios previos realizados en otros pases, indican que las tortugas que conviven como mascotas con los humanos, pueden ser reservorios de Salmonella, bacteria que produce cuadros clnicos severos en los humanos y en las inmunosuprimidas. El objetivo de esta investigacin, fue buscar Salmonella enterica en tortugas semiacuticas recibidas en el Centro de Atencin y Valoracin de Fauna tortugas

Silvestre del rea Metropolitana del Valle de Aburra (CAV) producto de entregas voluntarias e incautaciones durante el periodo comprendido entre abril y noviembre de 2007, debido a que existe una alta probabilidad de que estos animales, se conviertan en fuente de infeccin para otras especies animales o inclusive el hombre. La bsqueda de Salmonella spp. se realiz en muestras de materia fecal utilizando cultivos bacteriolgicos y deteccin de ADN especfico con PCR para detectar gnero y serotipo. En este trabajo se detect por PCR en 38 de las 110 tortugas muestreadas (34.5%), la presencia de Salmonella enterica y por cultivo se obtuvo aislamiento de Salmonella en 30 de las 110 muestras (27,2%).

La tipificacin de las 38 muestras positivas utilizando PCR mltiple, identific S. Enteritidis en 26 (68.4%) muestras, S. Typhimurium en 1 (2.6%), ambos serotipos en 4 (10.5%) muestras y otros serotipos en 7 (18,4%) muestras. Estos resultados demuestran la necesidad de disear planes estratgicos para evitar el trfico y la comercializacin de animales silvestres, que contribuyan a prevenir as la extincin de una gran variedad de especies y el desarrollo de una posible zoonosis en los humanos.

Palabras claves: tortugas, semiacuticas, PCR mltiple, zoonosis, Salmonella.

2. ABSTRACT.

Recent studies in other countries show that turtles used as pets in human environments can transmit Salmonella. This type of bacteria can cause serious health problems in humans and to the turtles as well. The objective of the present research was to find Salmonella enterica among turtles that are received in the Centro de Atencin y Valoracin del Area Metropolitana del Valle del Aburr (CAV), these animals came after being in contact with humans, and being natural reservoirs for Salmonella could become the source of infection. Detection of Salmonella spp was carried out in feces samples using bacteriological cultures and PCR for specific DNA tests for genus and serotype. The results found in this research showed that 38/110 (34.5%) were positives for PCR for Salmonella enterica. For culture, was obtained isolates of Salmonella in 30 of 110 samples (27,2%).

The typing of the 38 positives samples using multiplex PCR, identified S. Enteritidis in 26 (68.4%) samples, S. Typhimurium in 1 (2.6%), both serotypes in 4 (10.5%) samples and other serotypes in 7 (18,4%) samples.

These results, show the urgency to develop strategic plans to halt the trafficking of wild animals and its commercialization to avoid their extinction and a possible zoonosis

Key Words: turtles, PCR multiple, zoonosis, Salmonella.

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3. FORMULACIN DEL PROBLEMA

Los rptiles, incluidas las tortugas, hacen parte de la fauna silvestre. En Colombia, diferentes especies se mantienen en cautiverio en un intento por adaptarlas a condiciones domsticas, trayendo como consecuencia un aumento en el riesgo de extincin y adems problemas de salubridad, ya que estos animales son reservorios importantes de microorganismos zoonticos como Salmonella, que puede impactar negativamente sobre la salud humana y de otros animales (1). En estudios realizados en otros pases, se ha reportado que la prevalencia de Salmonella en tortugas es de un 94% y en los ltimos aos se han incrementado los casos de infeccin por esta bacteria debido a la popularidad de tener reptiles como mascotas. Cada ao 93,000 personas son infectadas con Salmonella como resultado del contacto con reptiles, lo que implica miles de personas hospitalizadas anualmente debido a este tipo de infeccin (2). De lo anterior se deduce, que reptiles como las tortugas semiacuticas son reservorios de Salmonella enterica y el nmero de informes de casos de Salmonella asociados a estos reptiles ha aumentado (3, 4). Por lo mencionado anteriormente, se realiz la bsqueda de Salmonella en tortugas semiacuticas (Trachemys scripta, Rinoclemys sp., Kinosternum sp, Podomnemys unifilis, Podomnemys lewyana) recibidas en el Centro de Atencin y 11

Valoracin de

Fauna Silvestre del Valle de Aburra (CAV) durante el periodo

comprendido entre los meses de Abril y Noviembre del ao 2007, ya que estos animales son reservorios naturales, y adems se ha reportado que algunos serotipos de Salmonella especficos de tortugas como S. Java, S. Urbana y S. Hartford y otros serotipos como S. Arizonae, S. Enteritidis y S. Typhimurium son potencialmente patgenos para animales y humanos (5).

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4. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

4.1. Justificacin de la propuesta.

Los informes sobre la frecuencia de aislamientos de Salmonella sp. en tortugas que son mantenidas como mascotas, varan entre un 30 y un 70% en los diferentes pases en los cuales se ha estudiado esta asociacin (6). La presente investigacin pretendi determinar la presencia de Salmonella en las tortugas semiacuticas que ingresaron al CAV, producto de incautaciones o entregas voluntarias despus de ser mantenidas como mascotas. Se busc evaluar tambin, la asociacin entre la presencia de la bacteria con el estado de salud del animal. Adicionalmente, esta investigacin busc responder la pregunta de si las tortugas incautadas por el rea Metropolitana eran reservorios de Salmonella y constituyen en una posible fuente de contaminacin para el humano. Los resultados obtenidos podran servir como base para implementar campaas de informacin a la comunidad sobre el riesgo de extraer a estos animales de su hbitat natural y de tenerlas como mascotas, no solo por el efecto sobre el animal sino tambin sobre la salud humana, especialmente en nios que son los ms susceptibles a desarrollar infecciones por Salmonella spp. 13 se

4.2.

Pregunta (s) de Investigacin

Por lo anterior y ante la falta de datos en nuestro pas al respecto, con este trabajo se pretendi responder las siguientes preguntas:

1. Cul es la frecuencia de infeccin por Salmonella enterica de las tortugas semiacuticas recibidas en el CAV?

2. Si hay tortugas infectadas, los aislamientos pertenecen a los serotipos S. Enteritidis y/o S. Typhimurium causantes de enfermedad en el humano y otros animales?

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5. MARCO TERICO

La salmonelosis es una enfermedad mundial que afecta a la poblacin en general, el agente etiolgico pertenece al gnero Salmonella que es un bacilo corto, Gram negativo, flagelado, anaerobio facultativo y que est estrechamente relacionado con los otros gneros de la familia Enterobacteriaceae a la cual pertenecen. Estos microorganismos crecen en un amplio rango de temperatura (7-48 C) a un pH entre 4 y 8 (7). Son bacterias mviles que producen sulfuro de hidrgeno (H2S) y fermentan glucosa pero no lactosa y que no desarrollan cpsula ni espora. Son causantes de un amplio nmero de manifestaciones clnicas en seres humanos y algunos animales (7, 8).

Su nomenclatura es compleja y ha variado continuamente, desde el concepto inicial serotipo-especie propuesto por Kaufmann en 1966 basado en la identificacin serolgica de los antgenos somticos (O) y flagelares (H), incluyendo otras propuestas taxonmicas fundamentadas en caractersticas clnicas o bioqumicas y ms recientemente en el establecimiento de relaciones genmicas. Un estudio sobre la taxonoma de Salmonella realizado en 1973 demostr mediante estudios de hibridizacin ADN-ADN que todos los serotipos de Salmonella se relacionaban altamente y se deban considerar como una especie 15

nica. Despus en 1989 con nuevos anlisis de hibridizacin describieron una segunda especie, Salmonella bongori, antes conocida como subespecie 1. Frecuentemente se utiliza la nomenclatura recomendada por el Centro de Referencia e Investigacin de Salmonella de la Organizacin Mundial de la Salud en el Instituto Pasteur (WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella) que acorde con los hallazgos genticos describe dos especies distintas: Salmonella bongori y Salmonella enterica (antes Salmonella

choleraesuis) dividida esta ltima en 6 subespecies que se diferencian por sus caractersticas bioqumicas y genticas (9). En la tabla 1 se observa la nomenclatura actualmente utilizada para Salmonella sp.

Tabla 1. Especies y subespecies del genero Salmonella

ESPECIE Salmonella enterica

SUBESPECIE enterica (I) salamae (II) arizonae (IIIa) diarizonae (IIIb) houtenae (IV) indica (VI)

Salmonella bongori

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Cada subespecie contiene a su vez varios serotipos definidos por su frmula antignica. En la especie S. enterica subespecie enterica estn la mayora de los serotipos que producen enfermedad en el humano como Salmonella Enteritidis y S. Typhimurium.

Salmonella puede causar diferentes sndromes clnicos, que se presentan en forma exclusiva o superpuesta y que corresponden a portador crnico, fiebre entrica, gastroenteritis, bacteremia e infecciones focales (meningitis,

osteomielitis o abscesos).

En el caso de las fiebres entricas, afectan especficamente a los humanos y se pueden clasificar como fiebre tifoidea si es producida por S. Typhi o paratifoidea si es producida por S. Paratyphi A, Paratyphi B o Paratyphi C,

De otro lado, la gastroenteritis es descrita en la literatura como el conjunto de enfermedades o sndromes gastrointestinales causados por serotipos zoonticos como S. Enteritidis y S. Typhimurium los cuales son los de mayor distribucin mundial y se adquieren mediante el consumo de aguas o alimentos contaminados o por manipulacin de animales que sean reservorios, pues estos serotipos tienen un amplio rango de hospederos y los animales la excretan por materia fecal (10).

Tambin se puede transmitir persona a persona mediante la ingestin de materia fecal de alguien infectado. 17

El cuadro clnico de la gastroenteritis producida por Salmonella puede incluir diarrea, cefalalgia, dolor abdominal, nusea, vmito, fiebre y deshidratacin.

Los sntomas duran aproximadamente de 4 a 7 das y la mayora se recuperan sin tratamiento; aunque en individuos inmunosuprimidos o en edades extremas como los bebes, adultos mayores y pacientes con enfermedades inmunodepresoras podra llegar a ser fatal si no se trata a tiempo.

Los animales que se han reportado como reservorios de Salmonella, son principalmente aves de corral y silvestres, vacas, cerdos y reptiles como las tortugas, las cuales se crean inofensivas, pero el nmero de informes de casos de Salmonella asociados a estos reptiles ha aumentado. Adems, la incidencia de Salmonella en tortugas ha sido el foco de investigaciones extensas en otros pases debido al uso comn de estos animales como supuestos animales domsticos (11).

En el caso especifico de las tortugas semiacuticas, estos son animales silvestres que pertenecen al orden de los quelonios y al igual que la mayora de los reptiles, dependen de la temperatura del medio ambiente para regular su temperatura corporal, poseen un caparazn, formado a partir de las costillas, columna vertebral y tejido escamoso y que consta de 2 partes, el caparazn dorsal, y el caparazn ventral, llamado tambin plastrn; presentan escamas en la piel, y tienen una cavidad llamada cloaca donde desembocan el sistema digestivo, el sistema 18

urinario y el sistema reproductor. Se distinguen fcilmente por su forma hidrodinmica, su caparazn poco prominente y presencia de membranas interdigitales en manos y patas (12).

Las tortugas semiacuticas son animales silvestres que llegan a las personas por desconocimiento acerca del animal como tal y de los problemas que puede presentar un animal salvaje que se presta para la domesticacin por su comportamiento dcil y letrgico.

Se ha reportado que las tortugas albergan Salmonella en su tracto digestivo sin que esta cause ninguna patologa, la bacteria sale por materia fecal siendo ste el principal foco de transmisin (13). El contacto de seres humanos con las heces sin tomar precauciones, como no lavado de manos, ingesta de alimentos o agua contaminados, facilita que la bacteria puede ingresar va oral y producir enfermedad, siendo la ms frecuente la gastroenteritis, en la que el microorganismo llega a ileon e invade mucosas.

El diagnstico de la enfermedad se hace mediante el aislamiento de Salmonella en materia fecal. Para su cultivo se utilizan medios como el caldo de selenito (siembra inicial), agares como el S.S, Hektoen y MacConkey y son positivos en el 90% de los casos en la primera semana de infeccin (14).

19

Otros mtodos diagnsticos utilizados en la actualidad son la prueba de ELISA y PCR, que es altamente especfica y puede demostrar la presencia del gen hilA especfico de Salmonella enterica. Las pruebas realizadas en materia fecal de personas infectadas pueden dar positivas hasta 6 meses despus de la infeccin puesto que algunos pacientes quedan con estado de portador crnico (15).

20

6. OBJETIVOS 6.1. General

Determinar la presencia de Salmonella enterica en tortugas semiacuticas del Centro de Atencin y Valoracin de Fauna Silvestre del Valle de Aburra (CAV).

6.2. Especficos

1. Aplicar la prueba de PCR para la deteccin del gen hilA de Salmonella enterica en muestras de materia fecal de tortugas semiacuticas del CAV. 2. Detectar por mtodos bacteriolgicos convencionales (coprocultivo), Salmonella enterica a partir de muestras de materia fecal de tortugas semiacuticas del CAV. 3. Correlacionar las caractersticas morfolgicas y el estado de salud de las tortugas semiacuticas del CAV con los resultados obtenidos en las diferentes pruebas de laboratorio 4. Identificar si los aislamientos obtenidos de tortugas corresponden a Salmonella serotipos Enteritidis y Typhimurium.

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7. METODOLOGA

7.1. Tipo de estudio:

Fase 1. Estudio de corte, durante dos meses. Fase 2: Descriptivo experimental, durante 6 meses.

7.2. Poblacin: Tortugas semiacuticas que ingresaron al CAV entre los meses de marzo y noviembre de 2007.

7.3. Diseo muestral:

Fase 1: Las tortugas que ingresaron en un periodo de dos meses al CAV.

Fase 2: Se realiz la escogencia de una muestra representativa de 110 tortugas, calculada utilizando el software Epi Info-6, tomando como universo el nmero reportado de tortugas recibidas en el CAV durante un periodo de 6 meses del ao 2007 con una prevalencia del 10%, un intervalo de confianza del 95% y un error del 5%.

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7.4. Descripcin de las variables Tabla de variables Nombre Definicin Dimensin Tipo Escala de medicin Talla Medida en centmetros desde la cabeza hasta la cola Sexo 1 macho 2 hembra Peso Especie Medida en gramos Clasificacin taxonmica Condicin corporal Estado definido en marco terico Gramos Nombre cientfico Buena Regular Mala Edad De acuerdo a la Juveniles Cualitativa Nominal Cualitativa politmica Nominal Cualitativa dicotmica Cuantitativa Cualitativa Razn Nominal Nominal Centmetros Cuantitativa Razn

talla corresponda a Adultas las caracterstica de especie Cultivo bacteriolgico Crecimiento de Salmonella enterica. PCR de gnero Deteccin de Salmonella. PCR mltiple S. Enteritidis PCR mltiple S. Typhimurium Deteccin de S. Enteritidis Deteccin de S. Typhimurium Positiva Negativa Positiva Negativa Positiva Negativa Cualitativa Dicotmica Cualitativa Dicotmica Cualitativa Dicotmica Nominal Nominal Nominal Positivo Negativo Cualitativa Dicotmica Nominal

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7.5. Tcnicas de recoleccin de la informacin

Instrumento de recoleccin de la informacin: base de datos en excel consignando las variables mencionadas.

7.6. Tcnicas de procesamiento y anlisis de los datos

7.6.1. Procedimientos.

Manejo de tortugas y toma de muestra A los animales que ingresaron al CAV en el periodo de tiempo antes mencionado, se les registraron variables como tamao, sexo, condicin corporal y estado en el que ingresaron y se les identific de acuerdo a la clase taxonmica. El manejo de las tortugas y la toma de muestras lo realizaron las estudiantes de veterinaria y la estudiante de bacteriologa bajo la supervisin de la Medica Veterinaria, siguiendo todas las normas de bioseguridad para evitar la adquisicin de una zoonosis. Se realiz desinfeccin de la mesa donde se iban a colocar las tortugas con glutaldehido. Las tortugas se sostuvieron del plastrn y escudos marginales del caparazn y a travs de la desinfeccin de la zona cloacal y pericloacal con una solucin yodada al 5%, se disminuy la contaminacin de la muestra con agentes externos. A continuacin, se tom una muestra de materia fecal por medio de un hisopado impregnado con solucin salina al 0.9%, el cual se introdujo en la zona cloacal, se realizaron varios movimientos rotatorios para 24

luego retirar el hisopo y depositar la muestra en un tubo eppendorf de 1.5 ml tapa presin con solucin salina; dicho tubo fue refrigerado. La muestra recolectada se utiliz para realizar PCR y coprocultivo en los medios bacteriolgicos: caldo selenito, Agar MacConkey y Agar Hektoen. En las fotos 1, 2 y 3 se observa el procedimiento de toma de muestra.

Foto 1: Limpieza del sitio de toma de muestra.

Foto 2: Limpieza de la tortuga.

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Foto 3: Hisopado cloacal

En la grfica 1 se puede observar un esquema del mtodo de toma de muestras.

Grafica 1: Mtodo de toma de muestra de materia fecal de tortugas. 26

7.6.2. Tcnicas de laboratorio para deteccin de Salmonella enterica

7.6.2.1. Coprocultivo. Este procedimiento comprende los siguientes pasos:

Siembra en Caldo Selenito Entre 100 y 500 l de materia fecal fueron sembrados en caldo selenito por 18-24 horas a una temperatura de 35 a 37C en aerobiosis para permitir el crecimiento de Salmonella.

En las fotos 4 y 5 se puede observar este procedimiento.

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Fotos 4 y 5: Siembra en caldo selenito.

Repique a medios slidos El selenito fue repicado en los agares MacConkey y Hektoen y se incub por 1824 horas a 35-37C.

Identificacin de los aislamientos A partir de los medios slidos se realiz la identificacin bioqumica con la prueba API20E (Biomerieux) de los aislamientos compatibles con Salmonella enterica, estos son no fermentadores en agar MacConkey y no fermentadores punto negro en agar Hektoen.

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Prueba de PCR Se realiz PCR para la deteccin del gen hilA de Salmonella enterica de la muestra de materia fecal sembrada en el selenito y a las colonias no fermentadoras punto negro del Hektoen, de acuerdo al siguiente protocolo.

7.6.2.2. Extraccin del ADN bacteriano: Se utiliz el protocolo de buffer de lisis modificado descrito por Haque y colaboradores (16). Brevemente, se realiz extraccin de ADN a 500 l de selenito sembrados en materia fecal. Cada muestra fue centrifugada a 12,000 rpm por cinco minutos a temperatura ambiente para separar la muestra. Un ml de buffer de lisis (0.2% Triton X100 en Tris HCL mas EDTA pH 8.0) se adicion al sedimento. La mezcla se aspiro varias veces y se centrifug a 12,000 rpm a temperatura ambiente por seis minutos, el sobrenadante fue descartado y el procedimiento se repiti nuevamente. El sedimento fue lavado una vez con agua destilada y centrifugado a 12,000 rpm a temperatura ambiente 1 minuto. El sobrenadante se descarto y el sedimento fue resuspendido en 100 l de agua destilada ultra pura estril. Los tubos fueron sellados y se pusieron en agua en ebullicin por 20 minutos y se dejaron enfriar a temperatura ambiente antes de realizar la PCR.

Iniciadores: En la Tabla 2 se pueden observar las secuencias de los iniciadores que se utilizaron en el presente estudio y el peso de los productos de amplificacin.

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Tabla 2. Secuencias de los iniciadores para el gen hilA y tamao de los productos de amplificacin.

Iniciador

Secuencia

Producto de Amplificacin

hilA US hilA DS

5-GCATGGATCCCCGCCGGCGAGATTGTG-3 5-CGGAAGCTTATTTGCGCCATGCTGAGGTAG-3

854 pb

Condiciones de amplificacin: En las Tablas 3 y 4 se observan las condiciones de la PCR.

Tabla 3. Reactivos y condiciones de la prueba de PCR.

Reactivo y concentracin Super mix Invitrogen Iniciador forward 10 M Iniciador reverse 10 M ADN Volumen final de la reaccin

Volumen 15 ul 0,5 l 0,5 l 4 20 l

30

Tabla 4. Programa de PCR. Temperatura (oC) 94 94 65 72 72 4

Paso Desnaturalizacin Desnaturalizacin Alineamiento Extensin Extensin final

Tiempo (min) 5 1 1 1 7 Indefinido

No. de Ciclos 1

30

1 1

Cada muestra se amplific por duplicado. Se procesaron un control positivo (Salmonella enterica ATCC 14028) y dos controles negativos (uno sin DNA bacteriano, reemplazado con 4 l de agua destilada estril y el otro con 4 l de DNA de Escherichia coli)

7.6.2.3. Deteccin de productos de amplificacin En un gel de agarosa al 1% teido con SYBR SAFE, 10 l del producto de amplificacin fueron fraccionados electroforticamente a 100 voltios por una hora. En cada gel se corrieron adicionalmente el control positivo y los dos controles negativos. Como resultado a las muestras positivas para la presencia del gen hilA se

procedi a realizar la PCR para identificar si el aislamiento corresponda a los serotipos S. Enteritidis o S. Typhimurium, siguiendo el mismo protocolo de

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amplificacin y electroforesis pero realizando una PCR mltiple utilizando los cebadores descritos en la tabla 5.

Tabla 5. Secuencias de los iniciadores de la PCR mltiple y tamao de los productos de amplificacin.

Iniciador

Secuencia

Producto de Amplificacin

Sef 167 Fw Sef 478 Rv Fli15 Tym

5-AGGTTCAGGCAGCGGTTACT-3 5-GGGACATTTAGCGTTTCTTG-3 5-CGGGTGTGCCCAGGTTGGTAAT-3 5-ACTCTTGCTGGCGGTGCGACTT-3

312

559

En la figura 2 se observa la metodologa empleada para la realizacin del coprocultivo y de PCR.

32

Figura 2: Metodologa empleada para la realizacin del coprocultivo y de PCR.

33

8. CONSIDERACIONES TICAS

Se siguieron las consideraciones ticas expuestas en la ley 84 de 1989, que reglamenta la proteccin de los animales. Teniendo en cuenta los decretos de dicha ley se aclara lo siguiente: - Como se mencion en la justificacin, Salmonella enterica es una bacteria de alto riesgo zoontico y hasta la fecha no se cuenta con proyectos de investigacin a nivel nacional, que descarte la posibilidad de esta fuente de transmisin hacia los humanos u otras especies animales - La manipulacin fue de acuerdo a los protocolos establecidos para la especie, de manera que se evit cualquier tipo de lesin o dao corporal de los animales muestreados. - Adicionalmente a esto, la revisin bibliogrfica realizada report que el mtodo a utilizar en el presente proyecto es el nico que garantizaba la determinacin de Salmonella, en vista de las caractersticas de la bacteria. - El procedimiento utilizado para la toma de la muestra no requiri ningn tipo de anestesia, ya que los hisopos utilizados estn directamente relacionados con el tamao promedio del bolo fecal y no se extrajo ninguna otra muestra diferente a la materia fecal.

34

- Dentro de la seleccin de animales a muestrear nicamente se tuvo en cuenta aquellos que por tamao y estado sanitario, as lo permitieron, evitando siempre el sufrimiento, anteriormente. dolor y estrs provocado por los procedimientos descritos

35

9. RESULTADOS

Se realiz una prueba piloto con 236 muestras en la cual se observ inhibicin del crecimiento bacteriano cuando se almacenaron en solucin salina y se sometieron a congelacin, por lo cual se decidi cambiar el almacenaje por caldo selenito y dejar las muestras a temperatura ambiente hasta ser procesadas para cultivo y PCR.

En total se analizaron 110 tortugas, la especie ms representativa fue la especie Kinosternum dunni ( tortuga caja) con 39 (35,45%), le sigue la especie Trachemys scripta ( icotea ) con 36 (32,7%), la especie Rinochlemys melanosterna (tortuga palmera) con 23 (20,9%), la especie Podocnemis unifilis ( tortuga brasilera) con 8 (7,3%) , la especie Podocnemis lewyana, nombre comn (charapa o de ro) con 2 (1.8%), 1 tortuga Chelus fimbriata (mata mata) que le corresponde un (0.9%) y 1 Chelidra serpentina ( tortuga mordedora) que le corresponde el otro (0.9%).

Por gnero se muestrearon 50 (45.5%) machos y 60 (54.5%) hembras.

Por condicin corporal, 91 (82.7%) presentaron buena condicin, 12 (10.9%) regular condicin y 7 (6.4%) mostraron una condicin corporal relativamente mala. 36

Por coprocultivo 30 (27.3%) de las 110 muestras estudiadas fueron positivas para Salmonella sp.

Se identificaron 8 especies de enterobacterias pertenecientes a la flora intestinal normal de las tortugas, las cuales estn listadas en la tabla 6. De estas Enterobacter sakazaki es patgeno para humanos.

Enterobacterias Serratia odorifera. Serratia liquefaciens Providencia rettgeri. Raoutella ornithinolytica. Enterobacter sakazaki Citrobacter braakii Kluyvera sp. Enterobacter cloacae Total

No. de aislamientos 13 1 2 4 7 1 2 2 32

% 40.6 3.1 6.3 12.5 21.8 3.1 6.3 6.3 100

Tabla 6. Otras enterobacterias encontradas por API. Por PCR, 38 (34.5%) de las 110 muestras analizadas fueron positivas para Salmonella enterica, de estas 30 lo fueron tambin por cultivo. Las otras 8

37

muestras presentaron cultivos positivos para otras enterobacterias y no para Salmonella.

En la figura 3 se observa la PCR para Salmonella enterica con muestras positivas y negativas.

10 11 12 13

14

15 16 17

18

19

1000 pb 500 pb 854 pb

Figura 3.

Gel para el gen hilA con muestras positivas y negativas. Lnea 1:

Marcador de peso molecular de 100 pb (Fermentas); lnea 2: Control negativo; lneas 3, 5, 6,10,12,16 muestras positivas para el gen hilA; lneas 4, 7, 8,9,11,13,14,15, 17 y 18 muestras negativas para el gen hilA; lnea 19: control positivo Salmonella Typhimurium ATCC 14028.

Al realizar la PCR mltiple para identificar los serotipos S. Enteritidis y S. Typhimurium, productores de diarreas en humanos, se detect la presencia de S. 38

Enteritidis en 26 (68.4%) muestras, S. Typhimurium en 1 (2.6%), ambos serotipos en 4 (10.5%) muestras y se identific solo gnero en 7 (18,4%) muestras.

En la tabla 7 se pueden observar los porcentajes de los serotipos obtenidos por PCR mltiple.

Serotipo S. Enteritidis S. Typhimurium Ambos serotipos Solo gnero Total PCR Positivas

No 26 1 4 7 38/110

Porcentaje (%) 68.4 2.6 10.5 18.4 34.5

Tabla 7. PCR mltiple de las muestras positivas para el gen hilA.

En la Figura 4 se puede observar la PCR mltiple para la serotipificacin de las muestras positivas para el gen hilA.

39

10

11 12

13 14 15 16 17 18

19

20

1000 pb 500 pb 559 pb 312 pb

Figura 4. PCR mltiple para la serotipificacin de las muestras positivas para el gen hilA. Lnea 1: Marcador de peso molecular de 100 pb (Fermentas); lneas 2, 4, 9, 11 y 17 muestras positivas para S. Enteritidis y S. Typhimurium; lneas 3, 5, 6, 7, 8, 13, 14, 15, 16 y 18 muestras positivas para S. Enteritidis; lneas 10 y 12 negativas para estos dos serotipos; lnea 19: control positivo para S. Enteritidis; lnea 20: control positivo para S. Typhimurium.

La distribucin por especie de tortugas en las 38 muestras positivas se puede observar en la tabla 8. ,

40

Especie de tortuga

Nmero (%) de muestras positivas

Kinosternon dunni Trachemys scripta Rinochlemmys melanosterna Podocnemis unifilis Chelydra serpentina Total

20 (52.6%) 13 (34.2%) 2 (5,3%) 2 (5,3%) 1 (2,6%) 38 (100%)

Tabla 8. Distribucin por especie de las muestras positivas.

En cuanto a la positividad de la PCR de gnero frente a la condicin corporal de la tortuga: 32 (84,2%) presentaron una condicin buena, 5 (13,15%) una condicin regular y 1 (2,63%) present una condicin mala.

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10. DISCUSION.

En este estudio se detect la presencia de Salmonella enterica por PCR en 38 tortugas del CAV, correspondientes al 34.5% del total de la poblacin estudiada. Por coprocultivo se detect en 30 (27.3%) de las muestras estudiadas. La diferencia de 8 (21.05%) muestras positivas que se obtuvieron solamente por PCR y no por coprocultivo, probablemente se deba a que el inculo de

Salmonella era muy bajo para ser detectado por cultivo y/o las otras bacterias de la flora intestinal de estas tortugas inhibieron el crecimiento de Salmonella a partir de esta muestra, pero no afect el resultado de la PCR pues esta es ms sensible que el cultivo al no requerir bacterias enteras sino ADN. Lo anterior coincide con lo reportado por Gaertner (17) en Estados Unidos quien detect por PCR la presencia de Salmonella en tortugas de diferentes ecosistemas, por medio de una PCR para la deteccin del gen invA que al igual que el hilA, gen blanco del presente trabajo, es especifico de Salmonella y est ubicado en la isla de patogenicidad 1, y ambos genes son necesarios para el proceso de invasin de la bacteria en las clulas intestinales.

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Otros estudios como el realizado por Ebani y colaboradores (18) reportan Salmonella enterica en 73 de 305 (23.93%) muestras fecales. De igual manera Jang y colaboradores (19) utilizando mtodos bacteriolgicos convencionales detectaron Salmonella sp. en 14 de 46 reptiles (30.4%) incluyendo tortugas, en un zoolgico de Seul (Corea). Hidalgo y colaboradores (20) utilizaron mtodos bioqumicos y serolgicos para detectar la infeccin, pero en un porcentaje que solo fue de 5.1% pues solo utilizaron mtodos bioqumicos y no moleculares. En el presente estudio se detect la presencia de Salmonella en el 34.8% de las tortugas estudiadas a diferencia del estudio realizado por Saelinger y colaboradores (21) quienes no detectaron la presencia de esta bacteria en 94 tortugas analizadas en Estados Unidos, posiblemente porque utilizaron mtodos microbiolgicos convencionales y no la reaccin en cadena de polimerasa. Los resultados del presente trabajo son los primeros en nuestro medio aunque el nmero de muestras analizadas fue de 110, es un indicador de la frecuencia de infeccin por Salmonella en estos reptiles. Este resultado indica que un nmero significativo de tortugas que ingresaron al centro de atencin y valoracin de fauna silvestre del rea metropolitana presentaron Salmonella enterica, pero adicionalmente el total de tortugas muestreadas presentaron algn tipo de microorganismo que puede provocar enfermedades en humanos.

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Adems es un indicador del riesgo zoontico en nuestro pas y se asemeja con lo reportado por Pasmans y colaboradores (22) en Estados Unidos ya que el uso de estos animales es preferido mundialmente por los humanos como mascotas. Mitchell y colaboradores (23) reporta la infeccin por Salmonella como causal de muerte en animales en cautiverio, lo cual no se observ en el presente trabajo pues de las tortugas positivas solo una presentaba mala condicin corporal y se debi principalmente al mal manejo por parte de los traficantes que la tenan en su poder y no a la infeccin por Salmonella. La deteccin de Salmonella en las tortugas confirma que esta especie es un reservorio y potencial diseminador de la bacteria. Llama la atencin el alto porcentaje de S. Enteritidis encontrado en las Tortugas de este estudio, lo cual evidencia su potencial zoonotico, pues este serotipo es uno de los principales productores de diarrea en humanos en Colombia. De igual manera Geue y colaboradores (24), concluyen sobre el peligro que genera este tipo de tortugas acuticas y recomienda un buen cuidado de la salud del animal para reducir el stress, lo cual puede generar la excrecin de organismos patgenos. Con los resultados obtenidos se concluye que las tortugas son reservorios de S. Enteritidis y/o S. Typhimurium ya sea por el contacto con estas bacterias en su ambiente silvestre o por el contacto con los humanos, pues estos serotipos presentan amplio rango de hospederos y son los principales causantes de diarrea humana en nuestro pas.

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Se deben llevar a cabo estudios adicionales que analicen un mayor nmero de muestras y tratar de establecer el origen geogrfico de las tortugas. En el presente estudio no fue posible realizarlo debido a que las tortugas venan de diferentes lugares y no se tena conocimiento exacto de su procedencia para tomar este dato como una variable ms del trabajo. En un futuro se pretende desarrollar a partir de estos resultados estrategias de educacin a la comunidad para dar a conocer que las tortugas son animales silvestres y por esta razn no deben ser sacados de su hbitat para ser utilizados como mascotas o para consumo, pues se altera su ciclo de vida, se ponen en riesgo de extincin y presentan un riesgo zoontico para el ser humano.

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11. CONCLUSIONES

1. Un 34.5% de las tortugas semiacuticas del CAV estudiadas, presentan Salmonella enterica y/o enterobacterias causantes de enfermedades en humanos. 2. Las tortugas semiacuaticas del CAV son portadoras y no padecen la enfermedad causada por Salmonella y las diferentes bacterias antes mencionadas 3. La mala condicin corporal de algunas tortugas se debi a las condiciones inadecuadas de manejo a las que eran sometidas por los traficantes, en donde pasaban horas y das sin tomar ni comer ningn tipo de alimento. 4. No todas las muestras positivas a Salmonella por PCR lo fueron tambin en el coprocultivo, esto quiere decir que no todos los cultivos bacterianos son precisos y que para tener un mejor diagnstico se deben realizar otro tipo de procedimientos con mayor exactitud como fue el caso de la PCR convencional y PCR mltiple. 5. Segn los primeros resultados de las muestras que fueron refrigeradas, Salmonella y otras bacterias presentes en la flora normal, no sobrevivieron a las bajas temperaturas.

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6. De acuerdo a los resultados obtenidos se concluy que la tenencia de tortugas semiacuaticas como mascotas y su consumo presenta un riesgo alto para la salud humana debido al potencial zoonotico con el que cuentan estos animales. 7. Debido a los resultados obtenidos para las tortugas semiacuticas, es probable que otras especies de reptiles que tambin son utilizadas como mascotas y para consumo humano sean reservorios de Salmonella enterica, lo que dara pie para la realizacin en el futuro de nuevos trabajos de investigacin sobre el tema.

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12. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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13. ANEXOS

1. Resumen congreso colombiano de investigadores en enfermedades infecciosas. Revista Infectio 2008.

2. Poster Simposio Zoonosis 2008. Universidad CES

3. Presentacin en Jornadas de Investigacin CES

4. Presentacin En congreso Latinoamericano de Herpetologa. Noviembre de 2008. La Habana- Cuba.

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