ETAPAS DA TERAPIA GNICA As etapas envolvidas em um experimento de terapia gnica so: o isolamento do gene, a construo de um vetor, a transferncia para

clulas no tecido-alvo, e a produo da protena codicada e expressa pelo gene teraputico nessas clulas. - Isolamento do gene: Um gene uma poro de DNA que contm a informao necessria para sintetizar uma protena. O primeiro passo para a terapia gnica, identificar o gene responsvel pela enfermidade. Depois, atravs de tcnicas de biologia molecular possvel adquirir um pedao de DNA que contm este gene. - Construo de um vetor: vetores funcionam como veculos carreadores de genes para o interior das clulas. Eles podem ser de natureza biolgica, como por exemplo, os vrus, ou ainda de natureza qumica ou fsica. O vetor ideal deve ser de fcil produo, no deve gerar resposta imunolgica ao vrus ou ao transgene pelo paciente e deve promover a expresso do transgene de modo eciente e por longo tempo. Vetores virais: so vrus manipulados geneticamente, para que se reduza a sua patogenicidade, sem anular totalmente o seu poder de infectar as clulas do hospedeiro. Com as tcnicas da engenharia gentica, possvel somar ao DNA do vrus o gene que se quer transferir a determinada clula. Retrovrus - possuem a habilidade de integrar o seu DNA dentro dos cromossomos da clula infectada (sendo transmitidos a todas as clulas-filhas das infectadas); infectam somente as clulas que esto em diviso, limitando seu uso em clulas que no sofrem diviso, como os neurnios; outra desvantagem que como eles se integram preferencialmente prximo a sequncias promotoras, os retrovrus podem alocar-se prximo a um protooncogene, ativando-o e, assim, causando a formao de um tumor. Adenovrus - no so capazes de integrar o seu DNA ao cromossomo da clula hospedeira; podem transportar genes de grandes dimenses; apesar de apresentarem alta eficincia, induzem uma elevada resposta imunolgica que reduz o tempo de expresso do transgene; necessitariam de repetidas reinfeces do tecido acometido; a pesquisa atual est se concentrando em adenovrus do tipo gutless em que quase todo o genoma viral removido para reduzir a resposta imune e aumentar o tamanho potencial de insero. Adenoassociados (precisam da presena de um adenovrus para a sua replicao) integram o seu DNA ao cromossomo da clula hospedeira; podem transduzir clulas que no esto em diviso; no so capazes de transportar genes de dimenses grandes; so relativamente fceis de se obter; produzem pouca resposta imune e tm pouco efeito patognico; so capazes de manter a expresso teraputica de meses a anos. Eles se tornaram muito mais populares como vetores de terapia gnica durante os ltimos anos. Lentivrus: so retrovrus RNA complexos que, diferente dos retrovrus simples, podem transduzir clulas que no esto em diviso atravs de poros na membrana nuclear. Os lentivrus podem se integrar com estabilidade ao genoma, e podem aceitar inseres razoavelmente grandes. Eles so atualmente o foco de muita pesquisa e desenvolvimento.

Vetores no-virais: um dos mais extensamente estudados o lipossomo, um corpo adiposo que pode aceitar grandes inseres de DNA. Os lipossomos s vezes se fundem com clulas, permitindo que a insero de DNA entre na clula. Como o lipossomo no tem peptdeos, ele no provoca uma resposta imune. Sua principal desvantagem que ele carece da eficincia de transferncia dos vrus: a maioria dos lipossomos degradada no citoplasma. Tambm possvel inserir plasmdeos contendo DNA humano diretamente em clulas sem o uso de absolutamente nenhum vetor de transferncia. Embora a maior parte do DNA nu seja repelida pela membrana celular, o DNA ocasionalmente entra na clula, escapa da degradao e codifica protenas temporariamente. Ainda esto sendo feitas tentativas para usar o DNA nu como vacina. Est em desenvolvimento a sntese de cromossomos humanos artificiais. Como esses cromossomos sinteticamente construdos contem centrmeros e telmeros funcionais, eles devem ser capazes de se integrar e se replicar em ncleos de clulas humanas.

- Transferncia para clulas: Procedimentos in vivo: consistem em transferir o DNA diretamente para as clulas ou para os tecidos do paciente. Procedimentos ex-vivo: o DNA primeiramente transferido para clulas isoladas de um organismo, previamente crescidas em laboratrio. As clulas isoladas so modificadas e podem ser introduzidas no paciente. Este mtodo apesar de mais demorado, mais eficaz e oferece a possibilidade de selecionar e ampliar as clulas modificadas antes da reintroduo. Os procedimentos de transferncia do DNA in vivo ou em ex-vivo tm o mesmo propsito: o gene deve ser transferido para dentro das clulas, e uma vez inserido, tem que resistir bastante tempo. Neste tempo, o gene tem que produzir grandes quantidades de protena para reparar o defeito gentico.