Universidad Autnoma de Chiriqu Facultad de Ciencias Naturales y Exactas Escuela de Qumica

Curso de Bioqumica II (QM 382-L)

Aislamiento de ARN

Estudiantes: Bejerano Daniel Castro Lidia P. Sobenis Eira M. 4-777-1401 4-759-375 4-758-271

Profesora: Albertina Montenegro

II Semestre 2012

Fecha de entrega: 15/10/2012

Aislamiento del ARN en la levadura

I-

Objetivos:

1- Aislar muestras de ARN provenientes de la levadura. 2- Determinar el mecanismo de extraccin del ARN.

II-

Introduccin:

Los cidos nuclecos codifican la informacin referentes la estructura y a la funcin de la clula. Las clulas tienen la capacidad de hacer copias exactas de su ADN y de pasar esta informacin a las clulas de la hija. El ADN tambin sirve como plantilla para la sntesis del ARN, o transcripcin. Los diversos tipos de ARN se conocen como ARN ribosomal (ARNr), ARN de la transferencia ARN t), y ARN del mensajero (ARNm). El ARNm se procesa y se traduce a las protenas. (El ARNm y el tARN) son componentes necesarios para la traduccin de la protena. La manipulacin y secuenciacin de los cidos nuclecos son a menudo un acercamiento ms fcil para estudiar la funcin de la protena y estructura que aislando y caracterizando las protenas. (Roca, P 2004) Aislamiento de cidos Nucleicos Tres tipos importantes de tcnicas, o combinaciones de ellas, se emplean en el aislamiento de cidos nucleicos: solubilidad diferenciada, mtodos de la absorcin, o centrifugacin del gradiente de densidad. La opcin del mtodo depender del tipo de ADN que sea aislado y del uso. Una meta importante del aislamiento del cido nucleicos es la remocin de protenas. La separacin de cidos nucleicos de las protenas es logrado fcilmente debido a sus diversas caractersticas qumicas. En particular, las estructuras de fosfato altamente cargadas hacen que los cidos nucleicos algo hidroflicos con respecto a las protenas que son ms hidrofbicas. La separacin de los diversos tipos de cidos nucleicos puede ser ms problemtica en aquellos que tienen qumicas similares. Por otra parte, aunque, esta

qumica similar da lugar a algunos procedimientos bsicos que sean comunes a muchos protocolos del aislamiento del cido nucleicos. (Aguilera, A 1996) La mayora de los protocolos de aislamiento del cido nucleico implican un paso de la lisis de la clula, tratamientos enzimticos, solubilidad diferenciada (eg., extraccin o absorcin del fenol a una ayuda slida), y precipitacin. La mayora de los protocolos del aislamiento del ARN tambin implican extracciones del fenol y son similares a los aislamientos del ADN. Sin embargo, hay algunas diferencias y consideraciones especiales. Las precauciones contra actividad del ARN se deben ser tomadas. El ARNes una enzima extremadamente estable y activa. Los guantes deben ser usados siempre y el quipo estril debe ser utilizado siempre que sea posible evitar la introduccin el ARN es exgeno a la muestra. La cristalera necesita tratado con el DEPCagua y esterilizado para hacer inactivo cualquier ARNse. Los buffer se deben preparar del DEPC-agua o de los inhibidores del ARN incluidos. (Bernadette F. 2005)

III-

Materiales y Reactivos: Instrumento Goteros Probetas Centrifugadora Varilla de vidrio Vasos Qumicos Filtro de papel Tubos de centrifugar Cantidad 2 2 1 2 4 2 3 Capacidad 100 mL 100, 250 mL. -

Reactivos: Solucin de fenol al 90 % Propiedades fsicas: Estado de agregacin: Slido Apariencia: Blanco-incoloro Densidad 1.070 kg/m3; 1.07 g/cm3 Masa molar: 94.11 g/mol Punto de fusin: 40,5 C (314 K)

Punto de ebullicin: 181,7 C (455 K) Riesgos para la salud: Es un veneno protoplasmtico general y es corrosivo por contacto con cualquier tejido. Principalmente ingresa al organismo por la piel o por ingestin, la absorcin por la piel es rpida. En forma lquida o en polvo es extremadamente corrosivo, el contacto con los ojos puede causar grandes daos, incluso llegar a la ceguera y la ingestin de 1g puede ser fatal. Acetato de potasio Propiedades fsicas: Apariencia: polvo cristalino Densidad: 1570 kg/m3; 1,57 g/cm3 Masa molar: 98.15 g/mol Propiedades qumicas: Acidez 9.7 (0.1 M solution) pKa Solubilidad en agua, Solubilidad en metanol, etanol Riesgo Inhalacin: irritacin suave en las vas respiratorias. Ingestin: grandes dosificaciones puede producir disturbios gastrointestinales. Contacto con la piel: Irritacin y enrojecimiento. Contacto visual: enrojecimiento e irritacin. Alcohol etlico C2H6O Apariencia: Lquido incoloro voltil de olor caracterstico y agradable. Punto de Ebullicin (C): 78 - 79 Punto de Fusin (C): -114 Presin de Vapor (mm Hg): 44.0 / 20C Solubilidad: Soluble en agua, alcohol metlico, ter, cloroformo, acetona y benceno. Riesgos para la salud Inhalacin: Altas concentraciones del vapor pueden causar somnolencia, tos, irritacin. Ingestin: Sensacin de quemadura. Acta al principio como estimulante seguido de depresin, dolor de cabeza, visin borrosa, somnolencia e inconsciencia. Piel: Resequedad. Contacto con los ojos: Irritacin, enrojecimiento, dolor, sensacin de quemadura. ter etlico Estado de agregacin: Lquido Apariencia: Incoloro 3 Densidad; 0.7134 g/cm Solubilidad: 6.9 g/100 ml H2O (20 C) Punto de fusin: 116,3 C (156,85 K) Punto de ebullicin: 34,6 C (307,75 K) Viscosidad: 0,224 cP a 25 C (298 K) Momento dipolar: 1,15 D Riesgo para la salud Inhalacin: causa nuseas, vmito, dolor de cabeza y perdida de la conciencia , irritacin del tracto respiratorio Contacto con los ojos: Irritacin levemente

Contacto con la piel: Produce resequedad y dermatitis Ingestin: produce sntomas narcticos Levadura Propiedades Fsico-QumicasTOXICOLOGA: Nada Estado fsico : granulado friable Peligro de explosin : ninguno IVProcedimiento

1- Se disolvi 30 g de levadura seca en 150

de agua Y se coloc la solucin en

un bao a 37 C.

2- Luego se adicion 150

de fenol y se agit durante 30 minutos a temperatura

ambiente.

3- Luego se coloc la solucin en un bao de hielo y se procedi a centrifugar por 5 minutos, para romper la emulsin.

4- Se procedi a decantar la capa superior acuosa y se coloc a enfriar en un bao de hielo durante 5 minutos, donde esto ayuda a separar la protena desnaturalizada.

5- Se adicion 12

de acetato de potasio fro al sobrenadante acuoso este permite

eliminar el ARN que haya quedado adherido en la fase acuosa.

6- Luego se adicion dos volmenes de etanol, para precipitar el ARN, se coloc nuevamente en un bao de hielo durante 1 hora.

7- Se coloc la muestra en la centrifugadora durante 5 minutos y se procedi a recoger el precipitado.

8- Luego de la recoleccin del precipitado de ARN, se adicion 10

de etanol -

agua (3-1), luego de etanol y finalmente con 10

de ter, se dej secar al aire.

V-

Resultados:

Tabla.1.Extraccin de ARN de Levadura. Imagen Descripcin Precipitacin del ARN despus de la adicin de los dos volmenes de Etanol y tras enfriamiento por 1hora.

Centrifugacina 3000 rpm por 5 min para recoger el precipitado (ARN).

Lavado del ARN con una mezcla de etanolagua (3:1), luego con etanol. La muestra se guard para su debida caracterizacin.

VI-

Discusin:

El ARN es un cido nucleico formado por una cadena de ribonucletidos. Est presente tanto en las clulas procariotas como en las eucariotas y es la molcula que dirige las etapas intermedias de la sntesis proteica; el ADN no puede actuar solo, y se vale del ARN para transferir esta informacin vital durante la sntesis de protenas (produccin de las protenas que necesita la clula para sus actividades y su desarrollo). Varios tipos de ARN regulan la expresin gnica, mientras que otros tienen actividad cataltica. El ARN es, pues, mucho ms verstil que el ADN y se distribuye en toda la clula, mayormenteen citoplasma en forma soluble o formando parte de los ribosomas (C.K. Mathews). La levadura es un hongo microscpico unicelular y diminuto que existe alrededor nuestro, en la tierra, en las plantas e incluso en el aire. Es importante por su capacidad para producir la fermentacin de hidratos de carbono, generando distintas sustancias. Existen diferentes tipos de levadura, pero la mayora de las levaduras que se cultivan pertenecen al gnero Saccharomyces. Su ARN se puede obtener extrayendo un homogenizado de clulas con disolvente orgnico como el fenol, cloroformo o ambos. En esta experiencia de laboratorio utilizamos como disolvente orgnico el fenol, elcual en soluciones concentradasproduce el rompimiento de los enlaces de hidrogeno de las macromolculas, causando desnaturalizacin de las protenas.Esta suspensin turbia con fenol se centrifugdurante cinco minutos para romper la emulsin y se presentaron dos fases: la fase inferior de fenol que contena ADN y la fase superior acuosa contena glcidos y el ARN, esta fase se enfri por cinco minutos para evitar la ruptura de las ribonucleoproteinas. La protena desnaturalizada se halla presente en ambas fases y pudo removerse por centrifugacin. Luego de la centrifugacin se utiliz el sobrenadante al cual se le agreg el acetato de potasio que permite eliminar el ARN que haya quedado en la fase acuosay el doble del volumen de etanol para que el mismo precipitara.La fase lquida se centrifuga para obtener un precipitado que contena el ARN que era lo que ms nos interesaba, este precipitado se lav con una mezcla de etanol/agua 3:1 para extraer completamente ARN.

El producto obtenido no contiene ADN pero generalmente est contaminado con polisacrido que se puede tratar con amilasa para mejorar la purificacin. Para evidenciar la presencia de cidos nucleicos en extractos celulares vegetales se requiere clulas en cantidad suficiente y en medio libre de interferencias que puedan causar lisis celular o hidrlisis de los cidos nucleicos por nucleasas. Una completa extraccin de cidos nucleicos es fundamental para la determinacin indirecta.

VII-

Conclusin:

El ARN de la levadura se obtiene extrayendo un homogenizado de clulas con disolvente orgnico como el fenolque tiene la funcin de romper los enlaces de hidrogeno de la macromolcula presente en la levadura.

El acetato de potasio sirvi para eliminar el ARN que se encontraba presente en la fase acuosa y el etanol paraprecipitar el ARN presente en la mezcla.. La centrifugacin fue utilizada para separar el ARN de la protena desnaturalizada y glcidos presentes en la solucin.

Debemos saber que la mayora del ARN en una muestra, se encuentra en el citoplasma como ARN soluble y ARN ribosomal, pero aproximadamente el 10% se encuentra en el ncleo y otro tanto se halla en las mitocondrias.

VIII- Bibliografa:

Bioqumica 3 Edicin. (2002) C.K. Mathews, K.E. van Holde, K.G. Ahern. Pearson Educacin S.A.

 Pilar Roca, et al Bioqumica Tcnicas y mtodos Espaa 2004, editorial Helice,

pg 294.

R. L. P. Adams et al Bioqumica de los cidos nucleicos de Davidson Editorial Revert, Espaa 1980 Pgina 51.

Benjamin Lewin, et al Genes, Editorial Revert, Espaa 1996 pg. 627.