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Crystal
Structures
Explain
Func9onal
Dierences
in
the
Two
Ac9n
Depolymeriza9on
Factos
of
the
Bisha
K.
Singh,
et
al.
Malaria
Parasite
Laboratrio
de
Bio>sica
e
Bioqumica
2012/2013
|
Licenciatura
em
Bioqumica
Objec&vos
Comparar e iden9car as diferenas estruturais das duas isoformas de ADF presentes nos Plasmodium Perceber os diferentes comportamentos das duas isoformas Perceber de que modo essas diferenas esto relacionadas com a malria
Introduo
Muitas vezes associada ao mosquito Anopheles, mas na verdade um pequeno parasita protozorio (Gnero Plasmodium) Apresenta pequenos lamentos de ac9na localizados entre a membrana plasm9ca e a membrana interna do complexo paras9co. U9liza estes lamentos como motor para mo9lidade e invaso celular.
Introduo
Ac9n-depolymeriza9on factors (ADFs) pertencem famlia das ADF/Colina que regulam a dinmica dos lamentos de ac9na. Ligam-se aos lamentos de F-ac9na, quebrando as interaes monmero- monmero. Ligam-se G-ac9na, desestabilizando a troca de nucle9dos ADP por ATP.
ADF do Plasmodium falsiparum. Pormenor das hlices (vermelho). Estrutura ob9da a par9r do cheiro PDB 1XF1 e manipulao em Chimera.
Introduo
Os
protozorios
possuem
apenas
uma
ADF.
O
Plasmodium
possui
duas
isoformas:
ADF1
e
ADF2
A
ADF1
apenas
se
liga
G-ac9na
A
ADF2
liga-se
F-ac9na
e
G-ac9na
ADF
do
Plasmodium
falsiparum.
Pormenor
da
super>cie
da
protena.
Estrutura
ob9da
a
par9r
do
cheiro
PDB
1XF1
e
manipulao
em
Chimera.
Introduo PfADF1
Vdeo ADF1_Pf
Introduo PbADF2
Vdeo ADF2_Pb
Procedimento
gDNA
gDNA Amplicado
Procedimento
Clonagem
do
Gene
(GST)-PfADF1
Cultura
E. Coli; 12h; 291K; Expresso induzida por 0,6mM de -D-1-9ogalactopiranosdio de isopropil (GST)-PfADF2 Cultura
Procedimento
(GST)-PfADF1
Tampo de Lise
Sonicao
Filipa
Frana,
Henrique
Fernandes,
Joo
Rodrigues
e
Lisete
Mou9nho
Procedimento
(GST)-PbADF2
Tampo de Lise
Sonicao
Filipa
Frana,
Henrique
Fernandes,
Joo
Rodrigues
e
Lisete
Mou9nho
Procedimento
(GST)-PfADF1
(GST)-PbADF2
Cromatograa de Anidade
Cromatograa de Anidade
Remoo
do
vetor
GST
(4,5g/mL
Potease
C3;
24-36h;
277K)
Super>cie
da
ADF1
com
destaque
para
as
foras
de
Coulomb,
(vermelho)
-10;
(azul)
+10.
Manipulao
em
Chimera.
Procedimento
PfADF1
e
PbADF2
Procedimento
(GST)-PfADF1
(GST)-PbADF2
Para
determinar
o
folding
e
a
estrutura
secundria
foi
feita
Espectroscopia
de
Dicrosmo
Circular
com
radiao
de
sincrotro.
Coluna cromatogrca 10/300 Superdix 75pg (GE Healthcare) Imagem demonstra9va de um Sincrotro.
Procedimento
Cristalizao
PfADF1 e PbADF2
Cristal da PfADF1
Procedimento
Obteno
da
G-Ac9na
G
Tampo
ADP G-Ac9na
Procedimento
ac9na
ADPG-
Na9ve PAGE | Electroforese em gel de poliacrilamida a 7,5%; P=5W; t=60min; T=277K SDS-PAGE|Sistema tampo NuPAGE MES; Colorao com prata
Procedimento
Cosedimentao
c9na
a - P T A
4M
ADFs (difere n
1mM M gC
tes concent
l2 e 0,15 M KCl
raes)
SDS-Page
Filipa
Frana,
Henrique
Fernandes,
Joo
Rodrigues
e
Lisete
Mou9nho
Procedimento
360nm
407nm
PfADF1 e PbADF2
Procedimento
Resultados
Alinhamento
das
Sequncias
da
PfADF1
e
PbADF2
GPLGSMISGIRVNDNCVTEFNNMKIRKTCGWIIFVIQNC. GPLGSMVSGVNVSDECIYEFNRLKVKHLNKYIIYKIENLE EIIIHSKGA.S.T.....TLTELVQSIDKNNEIQCAYVVF KIVVDVLEHDMELTSLDNIIMRIKNNLK..N.TECRYIIA DAV.........SKIHFFMYARESSNSRDRMTYASSKQAI DMPIPTPEGVLRDRIYFIFWSPGLSKPKEKMLYAASKESL LKKIEGV.NVLTSVI..E..SAQDVADLK....! VRKINGIFKSL.E.ITCDINEFEEELKAIILNT!
-Hlices
Folhas
HOMOLOGIA:
25,6198%
Sequncia,
emparelhamento
e
homologia
ob9dos
por
Chimera
Filipa
Frana,
Henrique
Fernandes,
Joo
Rodrigues
e
Lisete
Mou9nho
Resultados
Resultados
Resultados
ADF do Plasmodium falsiparum (cinzento) e ADF do Plasmodiom Berghei (amareloEstrutura ob9da a par9r do cheiro PDB 1XF1 e 2XFA com manipulao em Chimera.
Resultados
N-Terminal
F-loop
C-Terminal
ADF
do
Plasmodium
falsiparum
(cinzento)
e
ADF
do
Plasmodiom
Berghei
(amareloEstrutura
ob9da
a
par9r
do
cheiro
PDB
1XF1
e
2XFA
com
manipulao
em
Chimera.
Filipa
Frana,
Henrique
Fernandes,
Joo
Rodrigues
e
Lisete
Mou9nho
Resultados
ADF
do
Plasmodium
falsiparum
(cinzento);
pormenor
das
Cys
24
e
34.
Estrutura
ob9da
a
par9r
do
cheiro
PDB
1XF1
com
manipulao
em
Chimera.
Filipa
Frana,
Henrique
Fernandes,
Joo
Rodrigues
e
Lisete
Mou9nho
Resultados
N-Terminal
ADF
do
Plasmodium
falsiparum
(cinzento)
e
ADF
do
Plasmodiom
Berghei
(amareloEstrutura
ob9da
a
par9r
do
cheiro
PDB
1XF1
e
2XFA
com
manipulao
em
Chimera.
Pormenor
do
N-terminal
de
ambas
as
estruturas.
Filipa
Frana,
Henrique
Fernandes,
Joo
Rodrigues
e
Lisete
Mou9nho
Resultados
ADF do Plasmodium falsiparum (cinzento) e ADF do Plasmodiom Berghei (amareloEstrutura ob9da a par9r do cheiro PDB 1XF1 e 2XFA com manipulao em Chimera. Pormenor da hlice #3.
Resultados
-Hlice 4
ADF do Plasmodium falsiparum (cinzento) e ADF do Plasmodiom Berghei (amareloEstrutura ob9da a par9r do cheiro PDB 1XF1 e 2XFA com manipulao em Chimera. Pormenor da hlice #4 e das sequncias antecedentes N-Terminal. Filipa Frana, Henrique Fernandes, Joo Rodrigues e Lisete Mou9nho
Resultados
ADF do Plasmodiom Berghei (amareloEstrutura ob9da a par9r do cheiro 2XFA com manipulao em Chimera. Destacada a Leu-96 e a Pro-94.
Resultados
ADF
do
Plasmodium
falsiparum
(cinzento)
e
ADF
do
Plasmodiom
Berghei
(amareloEstrutura
ob9da
a
par9r
do
cheiro
PDB
1XF1
e
2XFA
com
manipulao
em
Chimera.
Pormenor
da
ligao
a
um
lamento
de
F-ac9na.
Filipa
Frana,
Henrique
Fernandes,
Joo
Rodrigues
e
Lisete
Mou9nho
Resultados
ADF
do
Plasmodium
falsiparum
(cinzento)
e
ADF
do
Plasmodiom
Berghei
(amareloEstrutura
ob9da
a
par9r
do
cheiro
PDB
1XF1
e
2XFA
com
manipulao
em
Chimera.
Pormenor
da
ligao
a
um
lamento
de
F-ac9na.
Filipa
Frana,
Henrique
Fernandes,
Joo
Rodrigues
e
Lisete
Mou9nho