Vous êtes sur la page 1sur 181
Université de Reims-Champagne Ardenne Année 2011 Thèse de Doctorat de l’Université de Reims École Doctorale

Université de Reims-Champagne Ardenne

Année 2011

Thèse de Doctorat de l’Université de Reims

École Doctorale Sciences Technologie Santé N°358

Présentée et soutenue publiquement le 14 septembre 2011 par

Wendy CUCCUINI

Étude du Facteur Tissulaire par les progéniteurs endothéliaux :

conséquences phénotypiques en condition inflammatoire

Directeur :

Pr. NGUYEN Philippe

Rapporteurs :

Pr. AJZENBERG Nadine Dr. SUSEN Sophie

Examinateurs :

Pr. GAUSSEM Pascale Pr. LARGHERO Jérôme Pr. SABATIER MALATERRE Florence Dr. POITEVIN Stéphane

1

Remerciements

Je remercie le Professeur Philippe NGUYEN qui m'a fait l'honneur et la joie

d'accepter d’être mon directeur de thèse. Je tiens à lui exprimer ma profonde reconnaissance

pour ses conseils et son soutien au cours de mes études.

Je remercie très chaleureusement Stéphane POITEVIN qui m'a guidée et épaulée

durant tout ce travail de thèse, cela a été une chance et un plaisir.

Je tiens à remercier le Professeur Françoise DIGNAT–GEORGES et le Professeur

Florence SABATIER, pour leur aide et leur investissement dans notre projet.

Je remercie le Professeur Jérôme LARGHERO, ainsi que le Docteur Valérie

VANNEAUX pour m’avoir permis de participer à leur projet de thérapie cellulaire.

Je remercie tout particulièrement le Docteur Pascale CORNILLET-LEFEBVRE qui

a dirigé ce travail au niveau de la biologie moléculaire et qui m'a fait partager son goût pour

la biologie moléculaire et la recherche. Je lui témoigne toute ma reconnaissance pour son

enseignement.

Je tiens à remercier également

Le Docteur Karine LECOQ-LAFONT et Docteur Isabelle LUQUET pour leur

enseignement, leur conseil avisé et leur présence,

tous les membres du laboratoire central d’Hématologie de CHU ROBERT DEBRE

de REIMS, pour leur accueil et leur aide, particulièrement l’équipe de biologie moléculaire et

de biologie cellulaire.

2

Un

grand

merci

à

toute

l'équipe

de

Cytogénétique

du

laboratoire

central

d’hématologie

du

Professeur

SIGAUX,

ainsi

qu’à

l’équipe

"Génome

et

Cancer"

du

Professeur Jean SOULIER, unité INSERM U944, à l’Institut Universitaire d'Hématologie, à

l’hôpital Saint-Louis, pour leur aide, et leur encouragement tout au long de ma thèse.

Je souhaite remercier tout particulièrement le Professeur Jean SOULIER, pour sa

patience et son soutien inconditionnel pendant ces années de thèse.

Enfin, je tiens à exprimer ici toute ma gratitude envers mes proches : mon frère

Clément, ma sœur Clotilde, Camille, Pierre, Danielle, Philippe qui m'ont entourée et

encouragée tout au long de ma thèse. Je les remercie pour leur compréhension et leur soutien

inconditionnel dans tous mes choix.

Une pensée aussi pour mes amis, qui m’écoutent patiemment parler du « Facteur

Tissulaire

et

aujourd’hui.

des

progéniteurs

endothéliaux »

et

me

font

le

plaisir

de

leur

présence

J'exprime toute ma tendresse à Nicolas, pour sa patience, son aide de tous les instants

et lui adresse un grand merci pour avoir tant supporté et m’avoir soutenue.

Je remercie aussi Matthieu, mon fils, pour sa si grande patience avec sa mère.

3

Résumé :

Les cellules progénitrices endothéliales formant des colonies (EFCFs) sont issues de cellules CD34+ de la moelle osseuse humaine. Peu de données concernent l’expression du facteur tissulaire (FT) lors de cette différenciation endothéliale. Outre son rôle dans l’initiation de la génération de thrombine, le FT est impliqué dans l’angiogenèse. Nous montrons que les cellules CD34+ expriment le FT mais non ses isoformes. Les ECFCs expriment peu de FT à l’état basal. En revanche, leur stimulation par le TNF-α induit une augmentation de l’expression de FT, et la génération de microparticules pro-coagulantes. Nous avons analysé les modifications fonctionnelles induites par cette stimulation. Nos résultats montrent que l’expression de FT par les ECFCs est responsable d’une activité pro- coagulante majeure, alors que les propriétés angiogéniques ne semblent pas affectées. L’expression du tissue factor pathway inhibitor (TFPI) a été évaluée, ainsi que la capacité des microparticules issues de ECFCs à générer des métalloprotéinases (MMP2-, MMP-9). Une évaluation de la stabilité chromosomique des cb-ECFCs durant leur expansion a été réalisée, mettant en évidence des anomalies de nombre, mais pas d’anomalies de structures. Les conséquences de ces résultats en termes de thérapie cellulaire appliquées aux pathologies cardio-vasculaires sont discutées. Enfin, nous évoquons la possibilité de considérer l’expression de FT comme un marqueur de différenciation cellulaire.

Mots clés : Facteur tissulaire ; progéniteurs endothéliaux ; TNF-α, microparticules ; cellules CD34+

Abstract:

Endothelial colony-forming cells (ECFCs) can be obtained from human bone marrow

CD34+ cells. In spite of the essential role of the tissue factor (TF) in coagulation triggering and angiogenesis, its expression during endothelial differentiation is not established. We show that CD34+ cells express TF, but not TF splicing forms. ECFCs express a small amount of TF at baseline level. In contrast, ECFCs express TF high levels of TF on response to TNF-α and can generated highly pro-coagulant microparticles. We have examined the functional

stimulation. TF expression confers to ECFCs a strong thrombin

generation capacity without influencing their non-coagulant properties. We have examined the co-expression of the tissue factor pathway inhibitor (TFPI) and the ability of ECFCs to generate microparticles producing metalloproteins (MMP-2, MMP-9). We have performed an evaluation of cb-ECFCs chromosomal stability during their expansion. We found quantitative but no structural chromosomal abnormalities. The consequences of our observations in the use of cell therapy in cardiovascular diseases are discussed. We conclude that TF expression may be considered as cell differentiation marker.

properties induced by TNF-α

Key words: tissue factor; endothelial progenitor cells; TNF-α; microparticles; CD34 cells

4

Table des matières :

1.

INTRODUCTION…………………………………………………………………….5

1. Les progéniteurs endothéliaux……………………………………………….5

a.Description et fonction biologique de l’endothélium……………… 5

5

2. Caractérisation cellulaire…………………………………….6

a. Marqueurs cytoplasmiques……………………………6

b. Marqueurs membranaires…………………………… 6

3. Fonctions biologiques……………………………………………….9

a. Modulation de l’hémostase…………………………….9

b. Régulation du tonus vasomoteur…………………… 12

12

b.Origine des vaisseaux sanguins…………………………………….…13

1. Définition………………………………………………… ……….13

2. Vasculogenèse et angiogenèse……………………………………13

a. Vasculogenèse……………………………………… 14

b. Angiogenèse………………………………………….15

c.Le progéniteur endothélial circulant (PEC)………………………… 16

17

a. Concept de cellule souche hématopoïétique………….17

b. Concept d’hémangioblaste……………………………18

2. Caractérisation des PECs………………………………………21

a. Caractérisation phénotypique…………………………21

b. Caractérisation fonctionnelle…………………………22

3. Mobilisation des PECs…………………………………………….22

a. Hypothèses……………………………………………23

b. Stimuli……………………………………………… 24

4. Méthodes d’isolement et de culture des PECs………………….26

a. Les CFU-EC……………………………………….…26

…27

c. Les ECFCs……………………………………………27

5. Nomenclature des PECs……………………………… …… 28

a. PECs précoces et tardifs …………………………….28

b. Nomenclature…………………………………………29

32

2. Le facteur tissulaire (FT) et son rôle……………………………………….35

a.Le gène……………………………………………………………… 35

1. Structure du gène…………………………………………… ……35

2. Isoformes géniques dues à l’épissage alternatif………….……36

b.La protéine……………………………………………………………40

1. Structure du FT……………………………………………… ……40

a. Domaine extracellulaire………………………………40

b. Domaine intracytoplasmique…………………………42

c. Expression du FT………………………………… …42

2. Isoformes du FT……………………………………………….……44

a. L’AsFT………………………………………….…….45

1.

Structure

c. Rôle dans l’inflammation : diapédèse

1. Concept et origine des PECs……………………………………

b. Les CAC…………………………………………

6. PECs et thérapie cellulaire………………………………………

5

3.

Le FT membranaire…………………………………… ……49

c.Fonctions biologiques du FT…………………………………………51

1. Rôle dans la coagulation……………………………………….…51

a. Initiation de l’hémostase………………………… …51

b. Régulation de la coagulation………………………….52

2. Signalisation……………………………………… ……… 54

3. Migration cellulaire et angiogenèse………………………… …57

a. Migration cellulaire et FT………………………….…57

b. Angiogenèse et FT……………………………………57

4. FT associé aux microparticules 63

5. Régulation de l’expression du FT…………………………….….66

a. Régulation positive……………………… ………….66

b. Régulation négative……………………………… …68

2.

TRAVAUX……………………………………………………………………

….72

1. Objectif du travail

73

2. ECFCs, FT et inflammation

73

A. Article publié……………………………………………………….73

1. Résumé…………………………………………………… 73

74

3. Données supplémentaires……………………………… …86

4. Conclusions…………….……………………………… …94

2. Article………

……………………………………………

B. Données supplémentaires à l’article…………………….………

95

1. Potentiel procoagulant des cb-ECFCs ………

………

73

a.Génération de MPs……………………………… 73 1.Détection MPs………………….……….……96 2.Activité procoagulante MPs……… …….…98 3.Dosage du FT ………………….………… 100 b. Capacité d’expression TFPI…………………….102 1.Expression TFPI (RT-PCR)…….……….…103 2.Dosage du TFPI (Elisa)………………….105 3.Conclusions………… ………………………106

2. Recherche d’une activité métalloprotéinase ………….106

1.Méthode…………………………….……….…106

2.Résultat…………………………………………108

3.Conclusions………… …… …………………109

109

1.Méthode…………………………….……….…109

2.Résultat…………………………………………110

3.Conclusions………… …… …………………114 4. Discussion et perspectives…………………….…….… 114

3. FT et formation de pseudo-tubes en MARTIGEL

3. FT et différenciation endothéliale………………………………….119

1. Matériel et méthode…………………………………… 119 2. Résultat………………………………………………….120 3. Discussion………… …………… ………………… ………128

131 …

4. Analyse morphologique et caryotypique….………………

1. Morphologie des cb-ECFCs …………………………………… 131

a.Méthode………………………………….…………132

6

b.Résultats…………………………………………….133

c.Conclusions………… …… ………………………133 2. Caryotype des cb-ECFCs…………………………………… …134

a.Méthode………………………………….…………134

b.Résultats…………………………………………….135

c.Conclusions………… ……………… …………………138 3. Discussion ………… ……………………………….……… …138

3. DISCUSSION GENERALE ……………….………………………………… …140

4. CONCLUSION GENERALE…………………………………………………… 142

5. ANNEXES……………………………………………………………………… …143

6. BIBLIOGRAPHIE…………………………………………………………………161

7

1. INTRODUCTION

1. Les progéniteurs endothéliaux

a. Description et fonction biologique de l’endothélium

1.

Structure

L’endothélium vasculaire est situé à l’interface entre le sang et la paroi des vaisseaux et joue un rôle primordial dans le développement et le maintien des fonctions vasculaires. C’est un tissu de type épithélial qui tapisse la face interne de la paroi des vaisseaux sanguins et lymphatique (Figure 1).

la paroi des vaisseaux sanguins et lymphatique (Figure 1). Figure 1: Vue d’ensemble d’un vaisseau (Alberts

Figure 1: Vue d’ensemble d’un vaisseau (Alberts MJ 1995)

L’endothélium est constitué d’une monocouche de cellules endothéliales d’environ 100 µm de long, 10 µm de large et 0,3 à 0,5 µm d’épaisseur. Les cellules endothéliales ont une forme polygonale et leur juxtaposition forme un tapis en mosaïque. La face apicale des cellules est en contact avec la lumière des vaisseaux, la face basale est fixée sur une lame basale constituée de collagène et de glycoprotéines (Figure 2).

8

Figure 2: Observation en microscopie à contraste de phase (Objectif x20) (A) et coupe transversale

Figure 2: Observation en microscopie à contraste de phase (Objectif x20) (A) et coupe transversale d’une cellule endothéliale (B). m : mitochondrie, RE : réticulum endoplasmique, MB : membrane basale, n : noyau, WP : corps de Weibelpalade A : monocouche cultivée en condition statique (Whitfield P 1996)

Les cellules endothéliales ont une hétérogénéité structurale liée aux différents territoires vasculaires : elles s’orientent dans la direction du flux sanguin et elles présentent des variations d’épaisseur, de taille, de forme et de remaniement du cytosquelette. Les cellules des gros vaisseaux sont plus épaisses et polygonales (aorte), alors que celles qui tapissent les microvaisseaux sont plus aplaties et allongées. Par ailleurs, il existe plusieurs types d’endothéliums : continu, fenêtré et discontinu. Cette organisation est corrélée au degré de perméabilité vasculaire : le type continu est retrouvé plutôt dans les vaisseaux de gros calibre, tandis que les fenêtrés et discontinus sont présents dans les capillaires viscéraux (rein, intestin) pour favoriser les fonctions de sécrétion et de filtration. La monocouche cellulaire étanche formant l’endothélium est formée de cellules liées entre elles par des jonctions cellulaires (GAP, communicantes et serrées, adhérentes). L’intégrité de ces jonctions cellulaires est indispensable au maintien de l’homéostasie vasculaire. Elles permettent de réguler la perméabilité ainsi que la transmission de signaux intracellulaires qui modifient les fonctions de croissance par inhibition de contact, la polarité et la mort cellulaire (Lampugnani MG 1997).

2. Caractérisation cellulaire

Les cellules endothéliales présentent des marqueurs spécifiques exprimés à leur surface ou localisés dans leur cytoplasme :

a. Marqueurs intracytoplasmiques - les corps de Weibel-Palade(WPB) situés dans le cytoplasme, spécifiques des cellules endothéliales ; ils sont issus de l’appareil de GOLGI et se situent en péri-nucléaire.

9

Ce sont des granules sécrétoires qui forment des faisceaux fins contenant le Facteur Willebrand (vWF).

- Le Facteur Willebrand (vWF) est une glycoprotéine de structure multimérique

dont la masse moléculaire est de 500 kDa à plus de 10000 kDa. L’expression du gène du vWF est spécifique de certains tissus et reste confinée aux cellules endothéliales et aux mégacaryocytes (Denis CV 2002). Il est libéré à la fois dans le sous-endothélium et le plasma. Le vWF est présent dans le plasma, dans les corps denses de Weibel-Pallade des cellules endothéliales, dans les granules alpha des mégacaryocytes et des plaquettes qui en dérivent, ainsi que dans la matrice sub-endothéliale de la paroi des vaisseaux. Le vWF joue un rôle

dans l’adhésion plaquettaire et dans la formation du caillot de fibrine sur les sites des lésions vasculaires. Le vWF du sang circulant n'a pas la conformation requise pour se fixer à la plaquette : il circule lié au facteur VIII qu'il stabilise.

- La e-NOS (endothelial nitric oxide synthase) est une enzyme de 140k Da, exprimée

de façon constitutive dans les cellules endothéliales, responsable de la synthèse de NO (Stamler JS 1992). Cette enzyme contient un domaine oxygénase en position N-terminale et un domaine réductase en C-terminal. Le NO synthétisé est le principal agent vasodilatateur d’origine endothéliale (Furchgott RF 1980).

b. Marqueurs membranaires

- La VE-cadhérine (vascular endothelial cadherin ou CD144) est une protéine de 120

kDa appartenant à la famille des cadhérines qui comporte 5 domaines extracellulaires et qui est reliée dans le cytoplasme à l’actine du cytosquelette. La VE-cadhérine joue un rôle dans les liaisons homophiliques entre les cellules endothéliales et se trouve localisée principalement au niveau des jonctions cellulaires. Elle est exprimée de façon constitutive dans la cellule endothéliale et redistribuée temporairement en intracellulaire (Shaw SK 2001) notamment lors de la transmigration. Elle joue donc un rôle important dans la régulation de la diapédèse. - Le PECAM-1 (platelet-endothelium cell adhesion molecule ou CD31) est une protéine transmembranaire d’une masse moléculaire d’environ 135 kDa appartenant à la superfamille des immunoglobulines. Le CD31 est exprimé à l’état basal sur les monocytes, les polynucléaires neutrophiles, les plaquettes et les cellules endothéliales. Le CD31 est concentré dans les parois latérales des cellules endothéliales proches des jonctions cellulaires. Il est impliqué dans le processus de transmigration des leucocytes, son blocage impliquant un arrêt de la diapédèse leucocytaire (Muller WA 1993).

10

- Le VEGFR2 (KDR) est d’une masse moléculaire comprise entre 210 et 230 kDa. Il

s’agit d’un récepteur de type tyrosine kinase impliqué dans le développement de l’endothélium vasculaire. Il est exprimé au niveau des cellules endothéliales embryonnaires et adultes. La fixation du VEGF à son récepteur VEGF-R2 entraîne une dimérisation et une autophosphorylation de ce dernier. En conséquence, les voies de signalisation sont stimulées en aval. L’interaction du VEGF avec son récepteur nécessite la présence de protéoglycanes et notamment d’héparine. Le VEGR-2 est inducteur de la réponse proliférative des cellules endothéliales (Colavitti R 2002; Shalaby F 1995; Waltenberger J 1994).

- La E-sélectine (ou CD62E) est une protéine de 97 à 115 kDa appartenant à la

superfamille des sélectines. C’est une glycoprotéine membranaire de type I restreinte au système vasculaire et leucocytaire. Les sélectines sont des molécules d’adhésion impliquées dans l’étape initiale de contact des leucocytes avec l’endothélium, préalable à la transmigration. L’E-sélectine est exclusivement présente à la surface endothéliale. Elle joue

un rôle essentiel dans la fixation des leucocytes aux cellules endothéliales par liaison avec des protéines du cytosquelette qui, sous cette influence, se modifient, impliquant l’ouverture des jonctions cellulaires (Yoshida M 1996). - CD99 est une protéine membranaire de 32 kDa, fortement glycosilée. Elle est localisée sur les parties latérales des cellules endothéliales. Elle est impliquée dans la transmigration en aval de PECAM.

- les JAMS (Junctional Adhesion Molecules) sont des molécules transmembranaires

localisées dans les jonctions cellulaires endothéliales. Cette famille de récepteurs est constituée de trois membres tous impliqués dans la diapédèse (Weber C 2007). Lors de la transmigration, les JAMs engagent des interactions homo et hétérophiliques selon une séquence précise : les JAM-C leucocytaires interagissent avec les JAM-B endothéliales. Une fois le complexe jonctionnel ouvert sur l’endothélium, les JAM-C de l’endothélium renforcent l’adhérence et la diapédèse des leucocytes via une interaction avec des intégrines leucocytaires (notamment CD11b/ Integrin alpha M /ITGAM/Mac-1). Pendant la diapédèse, JAM-A est redistribuée sur la surface cellulaire endothéliale apicale et donne ainsi des indications directionnelles aux leucocytes en migration. La JAM-A leucocytaire participe à la polarisation du leucocyte. Les interactions de JAM-A leucocytaire et endothéliale facilitent la diapédèse (Dejana E 2006).

11

3. Fonction biologique

Situé à l’interface sang/tissus, l’endothélium vasculaire se comporte comme une barrière dynamique possédant de multiples fonctions.

a. Modulation de l’hémostase L’hémostase regroupe l’ensemble des phénomènes qui surviennent à la suite d’une lésion vasculaire et qui impliquent la formation d’un caillot plaquettaire (hémostase primaire), l’activation des protéines de la coagulation qui forme le caillot définitif (coagulation), puis la fibrinolyse. Rôle dans l’hémostase primaire Lors de la lésion vasculaire, il se produit une vasoconstriction réflexe impliquant une diminution du débit sanguin et une concentration des systèmes de réparation de la lésion. Dans un deuxième temps, les plaquettes adhèrent à la paroi vasculaire (Roth GJ 1992) via différentes glycoprotéines membranaires. L’endothélium détruit laisse apparaître une matrice riche en collagène où se dépose le facteur Willebrand produit par les cellules endothéliales locales (cf. chapitre « caractérisation », marqueurs intracytoplasmiques). Les plaquettes vont adhérer à la paroi endothéliale par différentes glycoprotéines : les glycoprotéines GPIa et VI se lient au collagène et le complexe GPIb-IX-V se lie au vWF (Savage B 1996). Le degré de polymérisation du vWF est fonction de sa localisation : les multimères de grande taille sont présents dans le sous-endothélium où ils ont la conformation nécessaire à leur fixation sur la plaquette ; le vWF des plaquettes, aussi sous forme de multimères, n'intervient qu'après l'activation plaquettaire ; le vWF circulant est dans une conformation compacte, et sous effet de forts cisaillements vasculaires, la protéine se déplie comme un ressort et fait apparaitre les domaines nécessaires à sa fixation avec de glycoprotéine. L’adhésion plaquettaire se fait grâce au vWF ancré dans le sous-endothélium. La fixation du vWF à la matrice sous-endothéliale induit un changement de conformation de ce dernier permettant sa fixation à la plaquette. Le vWF sert de colle entre le sous-endothélium et la plaquette à laquelle il se fixe par l'intermédiaire d'une glycoprotéine membranaire, la Glycoprotéine Ib (GPIb). Les conditions de fort cisaillement facilitent cette liaison au sein du complexe GPIb-IX-V. La liaison du vWF à la GPIb permet de ralentir le mouvement des plaquettes à la surface de la lésion vasculaire et déclenche l'activation des plaquettes, entre autres, de l'intégrine α2β3. L'intégrine α2β3 activée permet à son tour la liaison irréversible du vWF aux plaquettes. Dans les vaisseaux où la force de cisaillement est moins intense, les plaquettes adhèrent à l’endothélium par le biais

12

des intégrines α2β3 (Savage B 1996). Une fois adhérentes, les plaquettes sont activées. Elles changent de conformation en prenant une forme en étoile et expriment alors des récepteurs à leur surface, tel que la P-sélectine et les intégrines. Elles libèrent également le contenu des granules en extracellulaire, notamment l’ADP et la sérotonine, ainsi que de nombreuses protéines impliquées dans l’angiogenèse. Ces phénomènes causent l’attraction et l’activation des plaquettes circulantes et la formation d’un amas de plaquettes. A l’inverse, les cellules endothéliales peuvent synthétiser la prostacycline qui inhibe l’agrégation plaquettaire et les ADPases qui empêchent l’activation plaquettaire.

Rôle dans la coagulation Une des principales fonctions de l’endothélium vasculaire réside dans son activité antithrombotique. Les cellules endothéliales exercent leur effet anticoagulant dû à l’inhibition électrostatique de l’attachement de cellules circulantes à la paroi vasculaire en raison de la forte charge négative généré par le glycocalyx présent à la surface (Legrand Y 1987). Ces glycosaminoglycanes potentialisent des enzymes anticoagulantes et l’antithrombine (Rosenberg RD 1989). Cependant, sous l’effet d’un certain nombre de phénomènes comme les infections, l’inflammation, et les lésions vasculaires, les cellules endothéliales sont capables de s’orienter vers un phénotype procoagulant. La première étape d’acquisition du phénotype procoagulant de la cellule passe par l’expression du FT. L’activité procoagulante du FT est accélérée en présence des phospholipides anioniques exposés par les cellules apoptotiques (Combes V 1999). Par ailleurs, le FT est induit in vitro par de nombreuses substances, comme la thrombine, les cytokines pro-inflammatoires, les endotoxines, et par l’hypoxie (Moore KL 1987). Le FT ainsi exprimé se lie au FVII puis l’active. Ce complexe active les facteurs X et IX. Cela déclenche la cascade de coagulation aboutissant à la génération de thrombine. La thrombine se lie en surface à un récepteur de type PAR (Protéase-Activing Factor) et amplifie la cascade de coagulation et la synthèse de fibrine. Le récepteur PAR-1 induit l’expression de différents gènes, notamment le FT, le NO, le PAF, et l’endothéline (Woolkalis MJ 1995). La synthèse des traces de thrombine via la génération de faibles quantités de FXa, permet d’une part de recruter les plaquettes en les activant et de générer des traces de fibrine, et d’autre part d’activer les facteurs V, VIII, XIII et XI. Cette rétro-activation par la thrombine permet alors d’amplifier considérablement les quantités de FIXa, FXa et de thrombine générées. Cette génération explosive de thrombine permet de cliver de grandes quantités de fibrinogène. Les monomères solubles de fibrine seront ensuite transformés en fibrine stable

13

par action du FXIIIa. Les phospholipides membranaires et le Ca2+ sont essentiels à l’activation de la coagulation à la surface cellulaire. L’activation de ces sérine-protéases peut alors s’auto-entretenir mais est étroitement régulée par les inhibiteurs physiologiques (AT, système PC-PS) qui évitent ainsi sa propagation à l’ensemble de l’arbre vasculaire (Figure 3). Cette réaction de coagulation a lieu en phase solide sur un support membranaire car les facteurs de la coagulation IX et X sont ancrés aux phospholipides membranaires des cellules endothéliales et des plaquettes. L’endothélium est capable de moduler cette réponse procoagulante. Il va produire du TFPI (Tissue Factor Pathway Inhibitor) qui va se lier au facteur X activé et provoquer l’inhibition du complexe FT-FVIIa (Broze GJ, Jr. 1995). Les cellules endothéliales sont capables par ailleurs de synthétiser de la thrombomuduline (TM) qui se lie à la protéine C en surface et augmente son activité anticoagulante en association avec son cofacteur, la protéine S (Dahlback B 1991). L’endothélium exprime un récepteur à la protéine C, l’Endothelial Protein C receptor, qui accélère l’activation de la protéine C (Fukudome K 1996). Une fois activée, la protéine C inhibe les facteurs V et VII, et donc la cascade de coagulation.

les facteurs V et VII, et donc la cascade de coagulation. Figure 3 : Voie de

Figure 3 : Voie de coagulation dépendant du FT : La flèche jaune indique le sens de la voie de la coagulation, tandis que les flèches bleues indiquent l’activation directe du facteur X par le FT (voie intrinsèque) et indirecte par l'activation des facteurs FX et FIX (voie extrinsèque). Les flèches rouges indiquent l’effet en aval de la thrombine (FIIa) (Daubie V 2007)

14

Rôle dans la fibrinolyse Les cellules endothéliales sécrètent une protéase, l’activateur tissulaire du plasminogène (t-PA), qui est un puissant activateur de fibrinolyse et permet la transformation de plasmine en plasminogène, dégradant ainsi la fibrine formée. Ce phénomène a lieu sur la surface endothéliale ou sur le « clou plaquettaire ». Ces phénomènes peuvent être modulés par la cellule endothéliale elle-même qui est capable de synthétiser un inhibiteur physiologique et spécifique du t-PA, le PAI-1.

b. Régulation du tonus vasomoteur

Les nombreuses fonctions de l’endothélium comprennent aussi un contrôle strict du tonus vasculaire. Ces cellules sont capables de synthétiser et de sécréter de nombreuses substances vasoactives qui diffusent vers le muscle sous-jacent et provoquent sa contraction ou sa relaxation : vasodilatatrices, comme le NO (monoxyde d’azote), la prostacycline (PGI2) et des médiateurs de la vasoconstriction, le PAF (platelet activating factor) et l’ET (endothéline). La e-NOS synthétisée par les cellules endothéliales est capable de produire du NO, suite à son activation par différents facteurs chimiques et physiques (force de cisaillement). Le NO produit va diffuser en profondeur, il est responsable de la formation de la GMPcyclique qui active une protéine Gkinase i, laquelle inhibe la contraction musculaire lisse, et diminue le stock de calcium libre cytosolique des cellules (Moncada S 1991). Le NO inhibe par ailleurs l’activation et l’adhésion plaquettaire à l’endothélium, ainsi que la désagrégation (Mendelsohn ME 1990). La PGI2, agit de manière paracrine, provoque une vasodilatation et inhibe l’agrégation plaquettaire. L’ET est produite par l’endothélium en réponse à certains stimuli, hypoxie et force de cisaillement. Il diffuse en profondeur et, via une protéine G, entraine l’effet inverse du NO, par libération de calcium (Ca), une vasoconstriction. Le PAF provoque une vasoconstriction et peut stimuler l’adhésion des leucocytes à l’endothélium (Imaizumi TA 1995).

c. Rôle dans l’inflammation : phénomène de diapédèse

De manière constitutive, les cellules endothéliales ont un « phénotype antiadhésif », afin d’éviter l’activation des différents acteurs de la coagulation. Cet état disparait lors d’une activation notamment inflammatoire, qui favorise le recrutement et l’adhérence leucocytaire. Ce phénomène peut être délétère s’il n’est pas contrôlé aboutissant à l’installation de désordres thrombotiques. Lors de la réaction inflammatoire, les leucocytes entrent en contact avec l’endothélium, roulent, puis s’arrêtent, se fixent à la surface de l’endothélium activé et le

15

traversent créant la diapédèse. L’attachement à la surface endothéliale par les leucocytes se fait par l’intermédiaire des Sélectine (E et P Sélectine), les interactions des ces dernières avec leurs ligands permettant aux leucocytes de rouler sur la surface endothéliale. Suite au roulement se produit une étape d’adhérence ferme, impliquant des intégrines leucocytaires et leurs ligands endothéliaux, les ICAM (Intercellular Cell Adhesion Molecule) et VCAM-1 (Vascular Cell Adhesion Molécule 1), aboutissant à une adhérence de haute affinité. Les molécules impliquées dans la transmigration des leucocytes sont situées dans les parois latérales des cellules endothéliales : PECAM-1, CD99, JAMs, VE-cadhérine (CD144).

b. Origine des vaisseaux sanguins :

1. Définition

Les vaisseaux sanguins se divisent en deux catégories : les artères et les veines. Quel que soit le territoire anatomique concerné, l’organisation caractéristique de la paroi vasculaire en trois tuniques est conservée, à l’exception de celle des capillaires qui ne comportent qu’une seule couche ; seules les proportions des constituants des couches varient pour répondre aux exigences fonctionnelles du vaisseau en question. La structure en trois couches concentriques de la paroi vasculaire comprend de l’extérieur vers l’intérieur : l’intima, la media, l’adventice.

2. Vasculogenèse et angiogenèse

Le développement du système vasculaire est un processus complexe. Deux mécanismes interviennent lors de la formation des vaisseaux sanguins : la vasculogenèse et l’angiogenèse. Il est important de faire la distinction entre ces deux termes qui ont la même

signification, la genèse de vaisseaux sanguins, mais qui sont cependant deux processus bien distincts (Sabin F 1920). La vasculogenèse fait appel à la différenciation des cellules endothéliales à partir de cellules progénitrices, les angioblastes, et à leur assemblage en réseau. L’angiogenèse est l’étape suivante qui permet l’expansion et le remodelage du réseau (Figure 4).

16

Figure 4 : genèse du système vasculaire . Schéma d’après (Lamalice L 2007) A. la

Figure 4 : genèse du système vasculaire. Schéma d’après (Lamalice L 2007) A. la vasculogenèse permet la vascularisation de l’embryon. Les cellules mésodermiques se différencient en hémangioblastes et forment des ilots sanguins primitifs. Les hémangioblastes vont alors se différencier en angioblastes, précurseurs des cellules endothéliales. Les ilots sanguins vont ensuite fusionner entre eux et former des structures tubulaires donnant naissance à un plexus vasculaire primitif. Ce plexus vasculaire est à l’origine des vaisseaux de plus gros calibre. B. L’angiogenèse diffère de la vasculogenèse, car c’est un processus de néovascularisation : les nouveaux vaisseaux se forment à partir de vaisseaux préexistants.

a. Vasculogenèse Les vaisseaux sanguins se forment à partir du mésoderme. Lors de la première phase, les cellules du mésoderme sont présentes dans le sac hyalin extra-embryonnaire et donnent naissance aux îlots sanguins. Les cellules centrales de ces îlots deviennent des cellules souches hématopoïétiques (HSC), tandis que des cellules externes deviendront les angioblastes qui donneront des cellules vasculaires. Dans un deuxième temps, les angioblastes se multiplient et se différencient en cellules endothéliales qui forment des tubes, se connectent en réseaux capillaires, et donnent naissance à un plexus vasculaire primitif à l’origine du système vasculaire présent chez l’adulte (Drake CJ 1998 ; Fleischmajer R 1998 ; Poole TJ 2001; Sabin F 1920 ). Au niveau moléculaire, l’endoderme produit du VEGF au moment où

17

des ilots sanguins se forment. Les cellules endothéliales qui en dérivent expriment le récepteur VEGFR-2 en réponse au VEGF. LeVEGFR2 régule négativement le VEGFR1 des mêmes cellules, probablement afin de limiter une surproduction d’hémangioblastes se différenciant en cellules endothéliales. En 1997, Asahara découvre les progéniteurs endothéliaux circulants dans le sang périphérique chez l’adulte. Son équipe a montré la formation de néovaisseaux par le mécanisme de « vasculogenèse ». La vasculogenèse n'est donc pas restreinte à l’embryogenèse (Asahara T 1997).

b. Angiogenèse Au cours de l’angiogenèse, le plexus vasculaire primitif issu de la vasculogenèse va donner naissance à un système circulatoire comprenant des vaisseaux sanguins de différents calibres afin d’obtenir un système circulatoire mature et fonctionnel (Flamme I 1997). L’angiogenèse aboutit, après une succession d’étapes complexes, à la formation de vaisseaux sanguins à partir des vaisseaux préexistants (Risau W 1997). L’angiogenèse se déroule en plusieurs étapes : 1/ la vasodilatation et la perméabilisation vasculaire de la zone destinée à former le nouveau vaisseau. Les cellules endothéliales vont alors libérer différentes protéases qui 2/ vont dégrader la membrane basale et la matrice extracellulaire, puis 3/ sous l’influence de différents stimuli angiogénique, les cellules endothéliales prolifèrent, migrent, et aboutissent à 4/ la formation et à la stabilisation des néovaisseaux. Par la suite se produit un recrutement et une différenciation de cellules péri- vasculaires afin de former un vaisseau sanguin avec une paroi perméable et fonctionnelle (Djonov V 2003; Folkman J 1982; Folkman J 1986). Au niveau moléculaire, les facteurs angiogéniques impliqués sont des cytokines dont le récepteur possède une activité tyrosine kinase ; c’est le cas par exemple du VEGF qui induit la phosphorylation du VEGFR2. Par ailleurs, l’activation de ce récepteur peut être augmentée par la stimulation d’un autre récepteur, lui-même activé par une autre cytokine, le TNFα, via son récepteur, le TNFR2. Cette synergie induit une phosphorylation en aval aboutissant à l’activation de voies de signalisation et notamment la voie PI3Kinase/AKT. Les vaisseaux préexistants se dilatent sous l’action, d’une part du NO et d’autre part du VEGF, ce qui implique une perméabilité vasculaire accrue, obtenue notamment par son action sur la redistribution des molécules d’adhésion intracellulaire : PECAM-1 et VE-cadhérine (Christopher GW 1998). La dégradation de la membrane basale et de la matrice extracellulaire est due à l’action combinée des métalloprotéinases MMP-2,-3, et -9 et à la

18

suppression des inhibiteurs de métalloprotéinase, TIMP-2 (Jain RK 2003). D’autres protéases participent à cette dégradation, comme l’activateur du plasminogène de type urokinase (u-PA) qui active la production de MMP. Pendant la migration, des cellules endothéliales présentent des intégrines (type αvβ3) à leur surface. L’invasion cellulaire dépend de la coopération entre le mécanisme d’adhésion et la protéolyse. Preuve a été faite que la métalloprotéinase MMP-2 peut être localisée sous forme activée protéolytique à la surface des cellules invasives. Cela repose sur sa capacité à se lier directement à l’intégrine αvβ3. Les MMP-2 et αvβ3 ont été spécifiquement co-localisées sur les vaisseaux sanguins angiogéniques et les cellules de mélanome in vivo. L’expression d’αvβ3 sur les cellules de mélanome en culture a permis leur liaison à la MMP-2 dans une forme active par protéolyse, ce qui facilite la dégradation du collagène. Ces résultats définissent un seul récepteur de surface cellulaire qui régule à la fois la dégradation de la matrice et la motilité, facilitant ainsi la digestion et l'invasion cellulaire (Brooks PC 1996). Une fois la barrière détruite, les cellules endothéliales peuvent migrer vers le site nécessitant l’angiogenèse, et ce sous l’influence de facteurs chimiotactiques et de facteurs tels que VEGF, FGF et IGF. L’angiogenèse est un phénomène embryonnaire et reste très peu fréquente chez l’adulte sain en dehors des phases de grossesse et du cycle menstruel utérin. Dans l’angiogenèse post-embryonnaire, on distingue plusieurs cas. D’une part, les cellules endothéliales adultes sont capables dans des conditions physiologiques exceptionnelles, comme la cicatrisation et la réparation tissulaire, de synthétiser des nouveaux vaisseaux fonctionnels (Goede V 1998). Et d’autre part, l’angiogenèse peut être pathologique car elle est impliquée dans les maladies inflammatoires comme le diabète (Carmeliet P 2005) et surtout la croissance tumorale (Carmeliet P 2000). L’artériogenèse consiste en la transformation d’artérioles préexistantes en réseau de vaisseaux collatéraux. L’artériogenèse est stimulée par l’activation de l’endothélium avec pour conséquence l’expression de molécules d’adhésions (type ICAM-1), ainsi que la sécrétion de PDGF, et de FGF (Lewis BS 1997).

c. Le progéniteur endothélial circulant (PEC)

Ces étapes de vasculogenèse et d’angiogenèse ont été considérées pendant longtemps comme exclusivement embryonnaires, et par conséquent, le phénomène de revascularisation devait se produire à partir de vaisseaux préexistants. La source hypothétique de remplacement

19

de l’endothélium agressé aurait été des cellules endothéliales matures circulantes, détachées de la paroi vasculaire et qui auraient adhéré aux vaisseaux lésés. Cette hypothèse découlait des travaux de Stump et al qui avaient démontré en 1963 qu’un patch de Dacron « suspendu » dans la circulation et n’ayant aucun contact avec l’endothélium, était recouvert d’îlots de cellules endothéliales matures en sept jours (Stump MM 1963). Bien que le dogme fût alors que la formation de cellules endothéliales à partir d’angioblastes provenant du mésoderme était limitée à la période du développement embryonnaire, la seule conclusion possible de Stump était qu’existaient des cellules endothéliales matures circulantes En 1997, Asahara et al révolutionnent ce concept d’angiogenèse post-natale. Cette équipe a mis en évidence l’existence d’une population de cellules immatures, précurseurs de cellules endothéliales, les progéniteurs endothéliaux circulants (PECs), isolés à partir du sang périphérique de l’adulte. Ces cellules ont la capacité de se différencier en cellules endothéliales matures in vitro (Asahara T 1997). Ces PECs sont isolés à partir de cellules mononucléées du sang. Ces cellules, isolées selon l’expression du marqueur CD34+ et du VEFGFR2, sont ensuite mises en culture sur un milieu fibronectine où elles prolifèrent et se différencient en cellules adhérentes comportant les caractéristiques et les marqueurs des cellules endothéliales : le récepteur de type 2 du Vascular Endothelial Growth Factor (VEGFR2), le CD31, la VE-cadhérine ou le facteur Willebrand. Elles ont la capacité de former des néovaisseaux non seulement in vitro mais aussi in vivo au niveau de tissus ischémiques (Asahara T 2005). De plus, il a été montré que chez le lapin, les PECs avaient la capacité de s’incorporer dans des sites ischémiques et d’y créer de nouveaux vaisseaux (Asahara T 1997). Depuis la publication d’Asahara et al, de nombreux travaux ont confirmé l’existence des PECs chez l’homme (Shi Q 1998), chez la souris, le rat et le lapin (Takahashi T 1999).

1. Concept et origine des PECs

Les cellules immatures souches circulantes pourraient être à l’origine de précurseurs endothéliaux. Il a en effet déjà été clairement démontré que des cellules immatures provenant de la moelle ou déjà présentes dans la circulation participaient très activement à la réparation vasculaire : les progéniteurs endothéliaux circulants (PECs) (Hwa C 2005 ; Masuda H 2000).

20

a. Concept de cellule souche hématopoïétique (CSH)

Il s’agit de cellules multipotentes capables de prolifération et d’auto-renouvellement. Sous l'influence de facteurs stimulants, une cellule souche multipotente va s'engager dans la différenciation d'une lignée cellulaire. Elle devient alors un progéniteur (= une cellule souche différenciée ou "engagée"). En culture, cette cellule souche n’est pas capable de prolifération illimitée, à la différence des cellules souches embryonnaires. Les CSH sont capables de générer différentes lignées hématopoïétiques (érythroïdes, monocytaires et granulocytaires) et tissulaires (neurones, cellules hépatiques, cellules cardiaques, cellules endothéliales, etc.). Les CSH représentent un « pool » de cellules exprimant les différents marqueurs c-kit+, CD34+, CD133+, CD45+, CD14+. Ces cellules manquent généralement de marqueurs de la lignée Lin, ou alors ces derniers ne sont présents qu’à de très faibles niveaux (Lin-/low). Les cellules souches de la moelle constituent la base indispensable à une hématopoïèse efficace. D’autres éléments jouent également un rôle important dans l’obtention d’une hématopoïèse correcte et régulée, notamment le microenvironnement médullaire et les facteurs de croissance. Le microenvironnement médullaire participe à l'organisation générale de la moelle. Il donne aux cellules souches les conditions anatomiques et intercellulaires satisfaisantes pour assurer l'hématopoïèse. Le stroma médullaire est formé de différents types de cellules : fibroblastes, cellules endothéliales, macrophages, cellules épithéliales et adipocytes. Ces cellules du stroma sont organisées au sein des logettes hématopoïétiques. Elles sécrètent des matrices extracellulaires et des facteurs de croissance. Les matrices extracellulaires permettent l'adhésion des cellules souches en particulier grâce au collagène. L’utilisation des CSH est plutôt rare du fait de la difficulté d’accroître le nombre des cellules, peu important dans le sang et la moelle osseuse, sans perdre leur potentiel de différenciation. Le sang placentaire est aussi riche en cellules souches CSH. Cette source de CSH issues de sang de cordon présente de nombreux avantages : son utilisation ne soulève aucun problème éthique, les cellules étant prélevées sur un tissu qui va être détruit et / ou issu d’un don par la patiente, son consentement éclairé étant donné lors de l’accouchement.

b. Concept d’hémangioblaste En 1998, une équipe a mis en évidence que les PECs exprimaient le CD34 et étaient mobilisables après administration de G-CSF ((Shi Q 1998).

21

Par la suite, des études ont montré que ces précurseurs endothéliaux -ou angioblastes-, exprimaient un marqueur commun avec les cellules souches hématopoïétiques, le CD133, et que ce marqueur disparaissait au fur et à mesure de la différenciation endothéliale (Peichev M 2000; Takahashi T 1999 ). Des études complémentaires chez l’animal et chez l’homme ont ensuite rapidement démontré que, suite à une lésion tissulaire, des progéniteurs endothéliaux pouvaient être recrutés à partir de la moelle, entrer dans la circulation puis migrer vers le tissu endommagé où elles se différencient, soit en cellules endothéliales, soit en cellules épithéliales (Blann AD 2006). De nombreuses études ont montré que les PECs dérivaient de la moelle osseuse hématopoïétique. Deux modèles de greffes de moelle ont permis de tracer les PECs et de confirmer leur origine médullaire. Dans le premier modèle in vivo, il a été pratiqué une greffe de CSH CD34+ isolées d’une moelle d’un chien donneur chez un chien receveur portant une prothèse endovasculaire aortique. L’équipe montrait la présence de ces cellules dans le compartiment sanguin et démontrait leur capacité à coloniser et recouvrir une prothèse endovasculaire, permettant d’expliquer l’observation de Strump. Les cellules endothéliales adhérentes à la prothèse avaient le même génotype que le chien donneur (Shi Q 1998). Une autre étude a consisté à pratiquer la transplantation chez une souris irradiée, de cellules de moelle de souris transgéniques chez lesquelles l’expression du gène Lac-Z est sous contrôle de promoteurs de gènes spécifiques du lignage endothélial comme le VEGFR2. La révélation par la β galactosidase permet de visualiser les cellules du donneur marquées en bleu dans la souris irradiée ; on voit ainsi les cellules endothéliales « bleues » apparaitre dans les foyers de néo angiogenèse (Asahara T 1999). La population de CSH médullaire CD34+ contient des progéniteurs qui ont la capacité de se différencier en cellules endothéliales fonctionnelles (Bhattacharya V 2000). Ces constatations ont été confirmées chez l’homme (Lin Y 2000). La preuve d’une origine hémangioblastique des PECs a été démontrée chez des patients ayant une LMC (leucémie myéloïde chronique). Cette maladie est caractérisée de manière spécifique par la translocation chromosomique acquise clonale t(9;22)(q34;q11) des cellules pathologiques, qui aboutissent au transcrit de fusion chimérique BCR-ABL. Cette anomalie a été retrouvée dans les cellules endothéliales circulantes des patients en proportion significative, indiquant que cellules endothéliales et hématopoïétiques ont un précurseur souche commun (Gunsilius E 2003). Une équipe a confirmé que la preuve ultime de l’origine médullaire des cellules réparatrices de l’endothélium a été apportée par des études qui s’intéressaient aux patientes ayant bénéficié d’une allogreffe de moelle avec un sex-mismatch, c’est-à-dire recevant une moelle d’un donneur masculin. Chez ces femmes, il est

22

constamment retrouvé entre 5 et 35 % de cellules XY au niveau de leur endothélium, prouvant qu’une partie des cellules hématopoïétiques greffées a la propriété de devenir des cellules progénitrices endothéliales puis des cellules endothéliales matures. (Boos CJ 2006; Seguin T 2007). Récemment, il a été montré qu’il existait une protéine, BMP2/4 (Bone morphogenetic proteins) impliquée dans l’engagement de la cellule souche embryonnaire vers l’hémangioblaste (Kennedy M 2007). Ces protéines induisent notamment in vitro l’engagement des cellules CD34+ souches vers les lignées endothéliales (Smadja DM 2008). Par ailleurs, des PECs non dérivés de la moelle osseuse ont été mis en évidence. La moelle osseuse contient des cellules multipotentes progénitrices adultes (MAPC) qui, comme leur nom l'indique, peuvent se différencier en un grand nombre de types cellulaires distincts. Ces MAPCs sont différentes des CSH et se différencient en cellules endothéliales qui expriment des marqueurs endothéliaux et contribuent à la néo angiogenèse in vivo au cours de l'angiogenèse tumorale et la guérison des plaies (Jackson KA 2001; Reyes M 2002). La moelle osseuse contient également des cellules souches mésenchymateuses (MSC). En 2002, le groupe Verfaillie (Reyes M 2002) a signalé que les MAPCs co-purifiées avec des cellules souches mésenchymateuses peuvent être isolées de la moelle osseuse adulte de l'homme. De même, les MSC se différencient en cellules endothéliales (Oswald J 2004) et améliorent la néovascularisation in vivo (Al-Khaldi A 2003). Une autre équipe a ensuite rapporté l’existence des cellules de phénotype LIN-, MDR-1+, SCa-1+, c-kit+, CD34-, CD45-, avec des propriétés de cellules souches cardiaques et ne comportant pas de marqueur hématopoïétique. Ces cellules s’auto-renouvellent, sont clonogéniques, multipotentes, et capables de se différencier partiellement en donnant des myocytes, du muscle lisse, et des cellules endothéliales. Ces cellules sont en expansion clonale à partir de la cellule primitive et sont localisées en « cluster » dans l’apex ventriculaire du myocarde. Lorsqu'elles sont injectées in vivo dans une cardiopathie ischémique, ces cellules se localisent au niveau de la zone ischémique du myocarde (Beltrami AP 2003). Pour étayer cette hypothèse, une autre équipe a mis en évidence une autre origine cellulaire des PECs. Il a ainsi été montré dans un modèle de greffe d’artères chez le rat que les cellules endothéliales qui apparaissaient dans le greffon étaient originaires du rat hôte mais pas de la moelle osseuse (Hillebrands JL 2002). Ces données suggèrent qu’il reste difficile de définir la «vraie» cellule progénitrice endothéliale (Figure 5).

23

2. Caractérisation des PECs (Smadja DM 2009)
2. Caractérisation des PECs (Smadja DM 2009)

Figure 5 : schéma résumant l’origine et la différenciation des progéniteurs endothéliaux à partir de cellules hématopoïétiques et non hématopoïétiques (Urbich C 2004)

a. Caractérisation phénotypique L’identification phénotypique des PECs est difficile du fait de l’absence de marqueur spécifique les différenciant des cellules endothéliales matures de type HUVEC (cellules endothéliales de la veine de cordon ombilical ou Human Umbilical Vein Endothelial Cells), ou des cellules endothéliales circulantes. Les marqueurs membranaires sont mis en évidence par immunohistochimie, immunofluorescence, ou par cytométrie de flux, sont la lectine UEA, le CD31 (PECAM1), le CD146, la VE-cadhérine (CD144), ou encore le VEGFR2 (KDR). Les PECs peuvent être également identifiés grâce à leur incorporation de LDL acétylés, propriété partagée par les monocytes/macrophages et les cellules endothéliales, où à leur expression intracellulaire de facteur Willebrand stocké dans les corps de Weibel Palade. Les seules différences observées entre les cellules progénitrices et les cellules endothéliales matures résident dans la coexistence de marqueurs hématopoïétiques de type CD133 ou CD34, et des marqueurs endothéliaux précédemment cités. Par ailleurs, ces marqueurs d’immaturité hématopoïétique ne sont plus exprimés après différenciation (Schmeisser A 2002; Walter DH 2002). Toutefois, il a été publié par deux équipes que les cellules souches CD133+ ne seraient pas à l’origine de la lignée endothéliale (Case J 2007; Timmermans F 2007), ce qui est en

24

contradiction avec d’autres travaux et avec le fait que les PECs, lors de leur émergence, expriment des taux non négligeables d’ARNm de CD133 (Bompais H 2004; Smadja DM

2005).

b. Caractérisation fonctionnelle

Les propriétés invasives des PECs sont également importantes, expliquant que ces dernières soient capables d’atteindre leur cible ischémique. Ainsi, l’équipe de S. Dimmeler a montré en 2005 que les PECs précoces exprimaient des taux importants de cathepsine L, protéase essentielle à l’invasion des tissus ischémiques par les PECs (Urbich C HC, Aicher A, Sasaki K, Bruhl T, Farhadi MR, Vajkoczy P, Hofmann WK, Peters C, Pennacchio LA, Abolmaali ND, Chavakis E, Reinheckel T, Zeiher AM, Dimmeler S. 2005). De plus, l’équipe de F. Dignat-George a mis en évidence le potentiel protéolytique de PECs isolés à partir de sang de cordon. Ces PECs ont un potentiel protéolytique supérieur à celui de cellules endothéliales matures, potentiel qui repose sur une activité u-PA cellulaire, et sur la surexpression de son récepteur u-PAR. Cela contribue à leur capacité de prolifération, de migration et d’organisation en réseau tubulaire in vitro. L’expression du système u-PA/u-PAR est augmentée sous l’effet de facteurs de croissance angiogéniques. Ces données suggèrent qu’un potentiel protéolytique élevé dépendant du système de l’urokinase contribue aux capacités angiogènes spécifiques des PECs. (Basire A 2006; Lacroix R 2007). Les intégrines jouent un rôle important dans le « homing » et la migration des leucocytes, mais également des PECs. En effet, plusieurs études ont mis en évidence le rôle des intégrines, notamment dans l’adhérence (Chavakis E 2005; Wu Y 2006). Enfin, les PECs, qu’ils soient précoces ou tardifs, montrent une résistance à l’apoptose et au stress oxydatif plus importante que les cellules endothéliales matures (Dernbach E 2004; He T 2004).

3. Mobilisation des PECs

La mobilisation des PECs à partir de la moelle osseuse vers la circulation sanguine est régulée par plusieurs facteurs de croissance, enzymes et ligands et/ou récepteur membranaire, ou encore par des situations pathogènes influant aussi sur la mobilisation des CSH. Cette mobilisation est un mécanisme commun au CSH et PECs, ce qui est en faveur de l’hypothèse d’un précurseur commun.

a. Hypothèse de mobilisation des PECs

25

La mobilisation des PECs dans la moelle osseuse est un processus complexe, régi par une grande variété de facteurs. La première étape du processus est l’activation de la métalloprotéinase-9 (MMP-9) qui favorise la transformation du ligand membranaire Kit lié (mKitL) en un Kit ligand soluble (sKitL). Par la suite, les cellules souches CSH et progénitrices c-KIT+, incluant les hémangioblastes, passent dans la zone vasculaire du microenvironnement de la moelle osseuse (Heissig B 2002). Cette translocation active les cellules qui passent d'un état de repos à un état de prolifération. Les PECs précoces (Early EPC) dans la moelle osseuse sont positifs pour les CD133/CD34/VEGFR-2. Les PECs circulants perdent le CD133 et restent positifs pour CD34/VEGFR-2/CD31/VE- cadhérine/facteur Willebrand (VWF) (Hristov M 2003).

cadhérine/facteur Willebrand (VWF) (Hristov M 2003). Figure 6 : représentation schématique de la mobilisation

Figure 6 : représentation schématique de la mobilisation des PECs depuis la moelle osseuse vers la circulation sanguine, d’après (Hristov M 2003).

b. Stimuli impliquant le recrutement de PECs Les stimulations endogènes Le nombre d’EPC semble dépendant de facteurs tels que l’âge, le diabète, l’activité physique et le tabagisme (Kondo T 2004; Laufs U 2004; Tepper OM 2002; Van Craenenbroeck EM 2008). Des stimulations endogènes pathologiques conduisent à la

26

mobilisation des PECs, comme l’ischémie, les blessures, les brûlures etc. Des études ont montré que des patients souffrant d’infarctus du myocarde avaient un nombre de PECs circulants beaucoup plus important que des patients sains (Gill M 2001). Ces situations pathogènes sont notamment associées à des taux élevés de cytokines, hormones, et facteur de croissance. Le développement d’une région ischémique chez la souris augmente la mobilisation des PECs dans le sang périphérique (Takahashi T 1999).

Les stimulations exogènes Différents facteurs de croissance sont capables d’induire la mobilisation des PECs (Tableau 1)

Cytokines

Granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM- CSF)

Médicament

AMD3100 (antagoniste de SDF1-α)

Statine

Antagoniste du récepteur de l'angiotensine 2

Facteurs de croissance

VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) bFGF (basic Fibroblast growth Factor) PIGF (Placenta Growth Factor) SDF-1 (StromalDerived Factor-1) EPO (Erythropoiétine)

Tableau 1 : liste non exhaustive des stimuli exogènes influençant la mobilisation des PECs d’après (Roncalli JG 2008).

Cette augmentation des PECs circulants a été a été mise en relation avec la concentration importante de VEGF présente dans le plasma des malades (Shintani S 2001). En effet, plusieurs auteurs ont montré que le VEGF était capable d’induire la mobilisation des PECs depuis la moelle osseuse et de favoriser leur incorporation au niveau des sites de néovascularisation (Asahara T 1999; Hattori K 2001; Kalka C 2000). Dans des modèles murins, il a été montré qu’une surexpression génique de SDF-1 était capable d’induire une augmentation des PECs à partir de la moelle osseuse (Moore MA 2001). L’AMD3100 est un

27

antagoniste du récepteur CXCR-4. La liaison entre SDF-1 et CXCR4 joue un rôle majeur dans la mobilisation et l’incorporation des PECs au niveau des sites de néovascularisation. En effet, l’interaction du SDF-1 à son récepteur confine les EPC dans la moelle osseuse. L’administration de AMD3100 en sous-cutané permet de rompre la liaison entre SDF-1et CXCR4, ce qui permet la mobilisation des PECs de la moelle osseuse vers la circulation sanguine (Aiuti A 1997; Liles WC 2003). D’autres cytokines sont impliquées dans ce phénomène de mobilisation des PECs à partir de la moelle osseuse, comme le G-CSF (Honold J 2006), l’angiopoiétine (Hattori K 2001), et l’EPO (Bahlmann FH 2004). L’EPO est capable de stimuler la néovascularisation postnatale, en permettant notamment la mobilisation des EPC à partir de la moelle osseuse (Heeschen C 2003). En clinique, la mesure du taux d’EPO dans le sérum permet de détecter les patients dont la capacité de mobilisation des EPC est diminuée. Des études réalisées chez des animaux souffrant d’infarctus du myocarde ont montré qu’une simple injection d’EPO permettait d’améliorer la fonction cardiaque (Prunier F

2007).

Ce même phénomène de mobilisation des PECs a été mis en évidence dans un modèle d’ischémie du membre inférieur chez le lapin, suite à un prétraitement par GM-CSF (Granulocyte Macrophage growth factor) (Takahashi T 1999). Les études menées chez l’animal ont montré que les injections de G-CSF améliorent la fonction cardiaque en permettant le remodelage du ventricule gauche et diminuent le taux de mortalité après un infarctus du myocarde (Minatoguchi S 2004; Orlic D 2001; Orlic D 2001) Chez l’homme, une étude a montré que l’injection de G-CSF augmentait d’un facteur 8 le taux de PECs dans le sang et la mobilisation des PECs, par rapport au sujet contrôle non injecté (Allan DS 2007; Korbling M 2006). D’autres substances peuvent augmenter le nombre de PECs et les mobiliser, comme les statines qui induisent une mobilisation dépendante du eNOS (Landmesser U 2004). Les patients ayant des risques cardiovasculaires élevés, (diabète, tabac, sédentarité) ou souffrant d’ischémie, présentent un faible taux d’EPC dans la circulation sanguine. Afin d’améliorer leur mobilisation dans la circulation, ces différents agents exogènes peuvent alors être administrés.

4. Méthode d’isolement et de culture des PECs

Les PECs ont été identifiés et isolés à partir de la moelle osseuse (Shi Q 1998) (Quirici N 2001) du sang périphérique (Asahara T 1997), du sang de cordon humain (Bompais H

28

2004; Murohara T 2000; Nieda M 1997; Smadja DM 2006; Smadja DM 2005), du foie fœtal (Peichev M 2000), et des adipocytes (Planat-Benard V 2004). (Tableau 2).

(Planat-Benard V 2004). ( T a b l e a u 2 ) . Tableau 2

Tableau 2 : sources des PECs humains d’après (Smadja DM 2007)

Classiquement, les méthodes d’isolement comprennent la mise en culture des cellules mononucléées totales après séparation sur gradient de densité (FICOLL), ou après une sélection positive par l’utilisation de microbilles recouvertes d’anticorps spécifiques de marqueurs d’immaturité cellulaire (CD133, CD34), endothéliaux (CD146) ou monocytaires (CD14) (Smadja DM 2009). Les PECs représentent moins de 1% de l'ensemble des cellules de la moelle osseuse et moins de 0,01% des cellules mononucléées du sang périphérique (Smadja DM 2007). Trois méthodes différentes de culture des PECs ont été décrites (Prater DN 2007), aboutissant à trois différents types de PECs :

a. Les CFU-EC (Colony-forming Unit-EC) Les cellules sont issues de cellules mononucléées du sang (PBMC) ou du sang de cordon ombilical, et sont cultivées dans une plaque « précoatée » avec de la gélatine. On procède ensuite à l’éviction des cellules adhérentes après 48 heures de culture afin d’éliminer les macrophages et les cellules endothéliales matures. Les colonies poussent en 1 semaine sous forme de cellules rondes non adhérentes, encadrées par des cellules prolifératives en périphérie (Hill JM 2003). Ces cellules peuvent aussi être obtenues à partir de PBMC, après

29

tri sélectif CD34+ et/ou VEGFR2+. Elles expriment des marqueurs phénotypiques endothéliaux spécifiques : CD34, CD31, VEGFR2, et la E-sélectine (Asahara T 1997)

b. Les CAC (Circulating Angiogenic Cells)

Cette méthode consiste à mettre les PBMC en culture dans un milieu à fort potentiel endothélial comportant notamment du VEGF. Les cellules adhérentes sont ensuite éliminées comme précédemment décrit. (Dimmeler S 2001; Kalka C MH, Takahashi T, Kalka-Moll WM, Silver M, Kearney M, Li T, Isner JM, Asahara T 2000). Ces cellules cultivées se différencient en cellules adhérentes et ne forment pas de colonies. Elles possèdent des caractéristiques phénotypiques endothéliales : CD31 (PECAM-1), VEGRF2, vWF, CD144 (VE-cadhérine), Tie-2 (angiopoietin-1 receptor precursor). Elles ont aussi des fonctions endothéliales telles que la capacité de liaison à certaines lectines (UEA-1) et l’absorption de LDL acétylées (Asahara T 1999; Gehling UM 2000; Kalka C MH, Takahashi T, Kalka-Moll WM, Silver M, Kearney M, Li T, Isner JM, Asahara T 2000). Par ailleurs, il a été démontré qu’elles sont impliquées dans l’angiogenèse via des modèles animaux d’ischémie (membre inférieur et/ou myocarde) (Kawamoto A 2001; Rehman J 2003).

c. Les ECFCs (Endothelial Colony Forming Cells)

Ce sont les cellules que nous avons employées dans nos différentes études. Les PBMC issues de sang total et/ou de sang cordon ombilical humain sont cultivées à la fois en milieu « endothélial » et sur des plaques « précoatées » avec de la gélatine. Les cellules non- adhérentes sont éliminées par une « phase d’adhésion » en préculture et lors des remplacements successifs de milieu. Ces cellules forment des colonies en « cobblestone » après 7 et 21 jours. Elles ont un phénotype endothélial et sont capables de former des pseudo- vaisseaux en milieu Matrigel® (Ingram DA 2004; Lin Y 2000; Yoder MC 2007). Par ailleurs, l’équipe de D. Ingram a isolé au sein d’un endothélium mature une sous- population qui exercerait des propriétés clonogéniques et prolifératives de progéniteurs endothéliaux tardifs. Ceci a permis de soulever l’hypothèse d’une niche vasculaire dans l’endothélium (Ingram DA 2005; Ingram DA 2005). Ainsi, le mur vasculaire pourrait être un réservoir de PECs et une activation de l’endothélium pourrait générer d’autres PECs qui seraient mobilisés vers la circulation.

5. Nomenclature des PECs

30

a. Notion de PECs « précoces et tardifs » Les nombreux travaux consacrés à la biologie des PECs au cours des dernières années font apparaître une hétérogénéité phénotypique, à cause de l’obtention en culture d’au moins deux types de cellules (Gulati R 2003; Yoon CH 2005) : des cellules adhérentes dites précoces (early) et des cellules tardives (late). Cette distinction entre cellules précoces et tardives, évoquée par Hur et al, a permis de clarifier la dénomination des PECs (Hur J 2004). Les ECFCs correspondraient aux EPC dénommées « late ECP » (aussi appelées OECs ou BOECs (Lin Y 2000) (Gulati R 2003) en référence à leur apparition tardive en culture, et les CFU-EC et CAC seraient à l’opposé des « Early EPC » (Hur J 2004; Prater DN 2007; Smadja DM 2007; Yoon CH 2005) (Figure 7).

Prater DN 2007; Smadja DM 2007; Yoon CH 2005) (Figure 7). Figure 7 : Image au

Figure 7 : Image au microscope inversé montrant des colonies en culture : CFU-EC, CAC et ECFC. Microscope Zeiss Axiovert 2 inverted microscope avec 10/0.25Ph1, logiciel d’exploitation d’image SPOT RT color camera (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI, USA). D’après (Prater DN 2007) (Hur J 2004; Smadja DM 2007)

Une des propriétés fonctionnelles qui permet de différencier les PECs précoces des tardifs est leur aptitude à proliférer et s’épandre in vitro. Ainsi, les PECs précoces sont dépourvus de capacité de prolifération tandis que les PECs tardifs peuvent se multiplier dans un milieu adéquat pendant plus de 5 semaines, ce qui en fait une population intéressante dans le cadre de la mise au point d’un produit de thérapie cellulaire (Hur J 2004). De plus, ces

31

PECs tardifs ont des propriétés de prolifération et d’expansion différentes selon les sources à partir desquelles ils sont isolés. Ainsi, l’équipe de Ingram a suggéré l’existence d’une hiérarchie dans les PECs selon que les colonies proviennent de sang adulte ou de sang de cordon (Ingram DA 2004). Les PECs tardifs ont également montré une capacité plus importante que les cellules endothéliales matures à proliférer in vitro (Hur J 2004) ainsi qu’une meilleure réactivité aux facteurs de croissance (Bompais H 2004). Par ailleurs, il a été montré qu’il existait une expression sélective de BMP2/4 (Bone morphogenetic proteins) dans les PECs tardifs en comparaison aux PECs précoces, ces protéines induisent in vitro l’engagement des cellules CD34+ vers les lignées endothéliales, et augmentent le potentiel pro-angiogénique des PECs tardifs en augmentant la formation de pseudo-tubes de ces cellules (Smadja DM 2008).

b. Nomenclature des PECs Jusqu’à présent, les PECs englobaient un ensemble de cellules très hétérogènes comprises dans une variété d’étapes allant de l’hémangioblastes aux cellules endothéliales matures différenciées. Ces différents types cellulaires étaient tous dénommés progéniteurs endothéliaux avec quelques variantes. Il n’existait donc pas de définition spécifique du PEC. Les résultats contradictoires rapportés dans le domaine, et l'identification, la caractérisation et le rôle exact des PECs en biologie vasculaire restent encore le sujet de beaucoup de discussions. Une revue faite par Timmermans et al, en 2009, a cherché à identifier les différentes sortes de PECs afin de répondre aux questions controversées dans le domaine de la nomenclature des PECs, qui sont, notamment, liés à l'absence d'un marqueur unique de PECs, à la rareté des PECs dans la circulation, et à l'importance du chevauchement phénotypique et fonctionnel entre les PECs (Timmermans F 2009). Cette nomenclature permet de repositionner les différentes cellules dénommées progéniteurs endothéliaux (Tableau 3).

32

Tableau 3 : caractéristiques des cellules endothéliales progénitrices (EPCs) (Timmermans F 2009): EC like cells

Tableau 3 : caractéristiques des cellules endothéliales progénitrices (EPCs) (Timmermans F

2009): EC like cells (cellules « ressemblant »aux cellules endothéliales), EOCs (endothelial outgrowth cells) et

CECs (cellules endotheliales circulantes).

CFU-ECs : colony forming unit of endothelial cells (Hill JM 2003) (Gehling UM 2007) (Silvestre JS 2003) ATs: attaching cells (Murohara T 2000) CACs: circulating angiogenic cells; CACs(Rehman J 2003) CE-EPCs: culture expanded endothelial progenitor cells; (Sharpe EE, 3rd 2006) CMMCs: culture modified mononuclear cells (Gulati R 2003) EOCs: endothelial outgrowth cells; (Timmermans F 2007) BOEC: blood EOCs; (Lin 2002) ECFCs: endothelial colony forming cells(Ingram DA 2004) EPDCs: endothelial progenitor-derived cells; (Bompais H 2004) CECs: circulating endothelial cells (Lin YC, L. Solovey,A. Healey, JF. Lollar, P. Hebbel, RP. 2002) (*): progéniteurs adultes multipotents issus de moelle osseuse (MAPCs), proposés comme étant les premiers EOC. (Reyes M 2002)

La majorité des PECs n’exprime pas de marqueurs monocytaires. Cependant, certaines études montrent que des cellules mononucléées CD14+CD15+CD11b+ peuvent aboutir à la formation de cellules endothéliales in vitro et in vivo (Rehman J 2003; Urbich C 2004). Les PECs précoces, qui expriment le CD14, sont les cellules identifiées par Asahara et al. en 1997, et sur lesquelles la majorité des travaux ont été publiés. Cependant, leur origine et leur réelle appartenance aux cellules progénitrices sont encore discutées. Plus récemment, une

33

autre équipe (Elsheikh E 2005) a tenté d’isoler la sous-population qui possédait des propriétés de cellules endothéliales progénitrices au sein des cellules mononucléées du sang circulant. La population CD14+VEGFR2+ semble être la population cellulaire à l’origine de la revascularisation observée avec des cellules CD14+. Une sous-population de cellules CD14+VEGFR2+ présente une expression faible de CD34, ainsi qu’une expression de marqueurs d’immaturité qui suggèrent qu’il s’agit bien de cellules progénitrices à phénotype endothélial (Romagnani P 2005). Enfin, il a été mis en évidence l’origine myéloïde des PECs précoces obtenus ex vivo dans un modèle d’angiogenèse tumorale (Sharpe EE, 3rd 2006). Ces différentes données suggèrent que les PECs sont issus de deux voies distinctes de différenciation, dont une au moins fait intervenir un progéniteur myélo-monocytaire. Ainsi, s’il est actuellement prouvé qu’il existe une population cellulaire circulante ayant la capacité de réparation endothéliale, cette population est certainement hétérogène, comprenant des cellules CD45+CD14+CD34+ dérivées des monocytes (environ 15% d’entre eux) et des cellules CD45-CD34+CD133+VEGFR2+ qui proviennent directement de la moelle et représentent les « vrais » progéniteurs endothéliaux circulants (Figure 8) (Boos CJ 2006)

endothéliaux circulants (Figure 8) (Boos CJ 2006) Figure 8 : voies de différentiation hypothétiques des PECs

Figure 8 : voies de différentiation hypothétiques des PECs bi phénotypiques détectés dans le sang (Smadja DM 2007).

34

6. PECs et thérapie cellulaire

Les PECs sont des cellules intéressantes sur le plan de la thérapie cellulaire, en raison de leur potentiel de colonisation des sites de néoangiogenèse. Pour cette raison, ils pourraient être très intéressants en tant qu’outil thérapeutique dans les maladies cardiovasculaires et les grandes ischémies. Ainsi, les PECs administrés en intraveineuse peuvent restaurer la structure et la fonction microvasculaire dans les artérioles pulmonaires chez le chien (Nagaya N 2003; Takahashi MN, T. Toba, T. Kajiwara, N. Kato, H. Shimizu, Y. 2004). Par ailleurs, il a été montré que la transplantation de PECs d’origine médullaire avait un rôle protecteur vis-à-vis de l’hypertension artérielle pulmonaire (Zhao YD 2003). L’existence de PECs dans le sang périphérique de l’homme adulte a rapidement suscité des perspectives en thérapie cellulaire. En effet, la preuve du concept réalisé dans un premier temps chez le petit animal a permis de valider l’efficacité de ces cellules. Il est à noter que les PECs précoces et tardifs ont un effet similaire et synergique dans ces modèles (Hur J 2004; Yoon CH 2005). Depuis la mise en évidence de l’origine médullaire des PECs, de nombreux essais cliniques ont évalué l’intérêt de l’injection de cellules mononuclées autologues d’origine médullaire dans l’ischémie myocardique, l’insuffisance cardiaque et l’ischémie critique. Dans l’ischémie myocardique, près de la moitié des études montrent un effet globalement positif (Martin-Rendon E 2008). D’autres essais cliniques montrent également que l’injection de cellules mononuclées médullaires chez des patients ayant une ischémie des membres inférieurs ou cardiaques, améliore la reperfusion des tissus ischémiques. Chez des patients atteints de cardiopathie ischémique chronique, notamment, la transplantation de PECs a induit une amélioration de la fonction cardiaque et de la taille de la zone infarcie (Erbs S 2005). L’injection de cellules mononuclées originaires de la moelle osseuse directement dans la paroi du myocarde provoque une amélioration de la perfusion chez des patients insuffisants cardiaques d’origine ischémique en échappement thérapeutique, et inaccessibles à des traitements conventionnels (Boyle AJ 2006; Perin EC 2004). Certains de ces essais ont même utilisé des cellules triées CD34+ ou CD133+ ; l’injection de cellules CD133 positives provenant de la moelle osseuse chez les patients subissant un pontage coronarien semble être une technique prometteuse chez ces insuffisants cardiaques sévères (Ma N 2006; Patel AN

2005).

Dans des essais cliniques sur ischémie des membres inférieurs, des progéniteurs endothéliaux obtenus à partir de la moelle osseuse ou du sang périphérique ont été injectés dans les jambes des patients. Il semblerait que cela induise une réduction importante, voire

35

une disparition, de la douleur à la marche, et une nette amélioration des ulcères avec une augmentation de la perfusion mesurée en doppler et du nombre de vaisseaux sanguins (Huang

P 2005; Tateishi-Yuyama E 2002). Par ailleurs, l’équipe de P. Gaussem a montré un

processus actif de néovascularisation sur des pièces d’amputation de patients ayant reçu une injection locale de cellules médullaires (Duong Van Huyen JP 2008; Smadja DM 2008). Une des stratégies de développement d’un produit de thérapie cellulaire pourrait être d’augmenter les propriétés angiogènes des PECs par un conditionnement in vitro. Ainsi, le traitement des PECs par le VEGF (Smadja DM 2007) induit une augmentation de la synthèse d’intégrine α6. Le prétraitement des PECs avec du SDF-1 permettrait la surexpression des intégrines (sous unités α4 ; αM) impliquées dans le homing des cellules immatures vers le site d’ischémie et renforcerait l’adhérence des PECs à l’endothélium mature (Zemani F 2008).

L’extrapolation de données précliniques chez la souris a permis d’estimer la quantité de sang nécessaire à prélever chez l’homme pour obtenir un produit de thérapie cellulaire endothéliale à environ 19 litres. Il faut donc forcément trouver un moyen d’augmenter le nombre de PECs par une mobilisation in vivo ou une méthode d’expansion in vitro adéquate. Les inhibiteurs de

la réductase de l’HMG-CoA, les statines, ont été les premières molécules ayant la capacité de

mobiliser les PECs chez des patients coronariens ainsi que dans des modèles expérimentaux (Dimmeler S 2001; Vasa M 2001). Un traitement par statines s’accompagne d’une augmentation des capacités migratrices des PECs in vitro et in vivo. Les mécanismes par lesquels les statines agissent sur les PECs ne sont pas clairs mais pourraient impliquer l’activation de la PI3-kinase, d’Akt et l’activation de la NO synthase endothéliale (eNOS)

(Dimmeler S 2001; Landmesser U 2004). Le NO joue un rôle crucial dans les PECs et son expression est indispensable pour la mobilisation des cellules médullaires et des PECs (Aicher

A 2003; Laufs U 2005). De plus, des composés activateurs du NO induisent la différenciation

de cellules souches en cellules hématopoïétiques et endothéliales et pourraient être utilisés dans le prétraitement des cellules des patients présentant un infarctus du myocarde (Sasaki K

2006).

L’ensemble de ces données indique que les cellules progénitrices endothéliales pourraient constituer un outil thérapeutique intéressant pour revasculariser les tissus ischémiques. Le fort tropisme de ces cellules pour les sites de néoangiogenèse les rend particulièrement intéressantes. L’expérience acquise suggère que la possibilité d’amplifier les PECs circulants de l’adulte reste actuellement modeste, et, dans ce contexte, la place de cellules endothéliales allogéniques issues de banques de sang de cordon ombilical reste à

36

définir. Ces cellules pourraient constituer un enjeu clinique considérable dans les pathologies cardiovasculaires.

37

2. Le Facteur Tissulaire et son rôle

Le Facteur Tissulaire (FT) est une glycoprotéine transmembranaire impliquée dans l’initiation de la coagulation sanguine ainsi que dans la migration cellulaire et l’angiogenèse. FT est encore appelé Thromboplastine, facteur de la coagulation III ou CD142, est le principal initiateur de la génération de la thrombine via la fixation avec une très forte affinité aux facteurs VII(FVII) et VII activé (FVIIa).

a. Le gène

1. Structure du gène Le clonage du gène du FT a été effectué par 4 équipes différentes en même temps en 1987 (Fisher KL 1987) (Morrissey JH 1987; Scarpati EM 1987; Spicer EK 1987). Le gène codant le FT est situé sur le chromosome 1 en position 1p21-p22 (Carson SD 1985). Il est constitué de 12.400 paires de bases (pb) et comprend 6 exons séparés par 5 introns (Figure 9).

(pb) et comprend 6 exons séparés par 5 introns (Figure 9). Figure N°9 : structure exon-intron

Figure N°9 : structure exon-intron du FT humain localisé sur le chromosome 1p12-22

(Szotowski B 2006)

La partie codante du gène comprends 885 pb. Le promoteur du gène se situe en 5’, en amont de la partie non codante. L’expression du gène du FT est très complexe et régulée par de nombreux facteurs, notamment l’hypoxie : AP-1 (Activator Protein-1), NFkB (Nuclear Factor Kappa B), Sp-1 (Stimulating Protein1) et Egr-1 (Early Growth Region-1) (Mackman N 1997). La région promotrice du FT comprend, outre une séquence TATAbox, une séquence enhancer proximale : SRR (Serum Response Region) (Mackman N 1997), qui est responsable de l’expression constitutive du FT (Figure N°10). L’expression constitutive de FT a été mise en évidence dans plusieurs lignées cellulaires, et met en jeu des séquences d’interactions avec les facteurs de transcription de la famille Sp-1 (Cui MZ 1996). La région SRR participe

38

également à l’expression inductible du FT en réponse à des stimuli tels que le stress oxydatif ou le LPS (lipopolysaccharide), et ce via 3 sites de fixation des facteurs de transcription de type ERG-1 (Guha M 2001; Houston P 1999). La région promotrice comprend également une séquence LRE (Lipopolysaccharide Responsive Element), située entre -227 et -172pb. Elle comporte deux sites de types AP-1 et un site NFKB (Mackman N 1997). Le site NFKB chevauche une région NFAT (Nuclear Factor of Activated T Cells) (Armesilla AL 1999). La séquence LRE régule l’expression inductible du FT après activation par le LSP, et la PMA (Phorbol 12-Myrisate 13-Acetate), l’IL1β et le TNFα (Mackman N 1991; Oeth P 1997).

l’IL1 β et le TNF α (Mackman N 1991; Oeth P 1997) . Figure N°10 :

Figure N°10 : Représentation schématique du promoteur du gène du facteur tissulaire. Le promoteur du gène du FT comprend deux régions cruciales pour la régulation de l’expression du FT :

- la région SRR, comprenant 3 des 5 sites spécifiques des facteurs de transcription Sp-1

du promoteur, impliqués dans l’expression constitutive du FT, et 3 sites de fixation des facteurs de transcription de type Egr-1, probablement impliqués dans l’expression inductible du FT

- la région LRE, comprenant 2 sites de type AP-1 et un site NFKB chevauchant une région NFAT ; la région LRE est responsable de l’expression inductible du FT.

2. Isoformes géniques dues à l’épissage alternatif

En général, les

5 introns

du

FT sont

exclus lors de la transcription par une

macromolécule enzymatique appelé le spliceosome (Figure 11).

39

Figure 11: épissage du FT (Mackman N 2007) Lors de l’épissage normal, le spliceosome supprime

Figure 11: épissage du FT (Mackman N 2007)

Lors de l’épissage normal, le spliceosome supprime tous les introns, mais lors de la formation de l’ARN messager mature, des évènements d’épissage peuvent se faire pour un même gène à des points de jonctions différents. Ce phénomène peut aboutir à la persistance de certains introns (entiers ou non), et supprimer tout ou partie de certains exons. C’est ce que l’on appelle l’épissage alternatif. L’ARN pré-messager du FT contient plusieurs exons qui peuvent être inclus ou exclus lors de la réaction d’épissage. Le processus d’épissage alternatif permet une recombinaison génétique et la genèse d’un grand nombre de protéines différentes, sans augmenter le nombre total de gène. Il concerne 40 à 60% des gènes humains. Cet épissage alternatif est soumis à un contrôle spécifique : régulation négative et positive d’épissage complexe, signaux forts ou faibles d’épissage. Actuellement, on dénombre 3 isoformes du gène du FT: AsFT, FT-A, et FT-B. On peut cependant extrapoler qu’il existe les formes slicées de ces FT-A et B, ASFT-A, ASFT-B, de manière comparable à ce qu’il se produit pour le FT et l’ASFT (Figure 12).

40

Figure 12 : isoformes du FT faisant suite à l’épissage des introns et des exons,

Figure 12 : isoformes du FT faisant suite à l’épissage des introns et des exons, schéma adapté de (Chand HS 2006)

L’AsFT est la forme épissée la plus fréquente et la mieux connue. L’ARN messager qui en découle est plus court. Cette forme comporte les 4 premiers exons du FT, le cinquième ayant été exclu lors de l’épissage alternatif. L’exon 6 persiste mais est modifié. Au niveau protéique, cela aboutit à une forme tronquée qui n’a plus de domaine transmembranaire (Figure 13).

41

Figure 13 : épissage alternatif du FT (Mackman N 2007) Le FT-A est une autre

Figure 13 : épissage alternatif du FT (Mackman N 2007)

Le FT-A est une autre forme issue de l’épissage alternatif du FT. Elle garde tous les exons du FT, l’intron Ia persiste dans l’ARN messager final. Cette forme a été décrite notamment dans des cellules normales et tumorales. Les lignées tumorales humaines étudiées (Capan-2, adénocarcinome pancréatique ; HepG-2, adénocarcinome hépatocellulaire ; HL-60, leucémie aiguë promyélocytaire) montraient une expression élevée de transcrit de FT-A par rapport aux cellules normales (Chand HS 2007; Chand HS 2006). On ne sait pas encore si le FT-A transcrit est traduit, ni s’il possède une activité fonctionnelle. En effet, il existe un codon «stop» dans l’ORF (open reading frame/cadre de lecture ouvert) qui arrête la traduction. Cependant, il est à noter qu’il existe d’autres mécanismes non conventionnels capables de réaliser une traduction, et notamment l’initiation de la traduction par un codon « non-AUG » (Touriol C 2003). Cela a été démontré comme étant un moyen pour l’ARNm de donner naissance à plusieurs protéines. Cela fut d'abord découvert en 1988 pour les virus comme le virus de Sendai (Curran J 1988) et le virus de leucémie murine de Moloney (Prats

42

AC 1989), le virus parainfluenzae (hPIV1) (Boeck R 1994) Dans tous les cas, l'initiation alternative s'est produite à un codon non-AUG situé en amont du codon AUG connu. D’autres équipes ont confirmés le potentiel d'initiation des codons non-AUG par le ribosome de mammifère (Dasso MC 1989; Kozak M 1989). Il est maintenant connu qu’un grand nombre d’ARNm de mammifère (humain, souris) peuvent initier la traduction à partir d’un codon non-AUG (Touriol C 2003). La pertinence biologique de l’initiation alternative de la traduction, « non –AUG » dépendante, est démontré par des localisations subcellulaires différentes et/ou des fonctions biologiques distinctes pour les isoformes traduit de l'ARNm unique (Touriol C 2003) L’isoforme FT-B comporte un intron supplémentaire par rapport à la forme FT-A, situé en amont de l’intron IA, et appelé intron IB. L’existence du FT-B a été confirmée par la publication de Chand (Chand HS 2006). Fait intéressant, Chand et al mettent en évidence 2 produits de PCR de taille différente. L’analyse par séquençage des nucléotides a révélé que le produit de plus grande taille moléculaire (~1100 pb) est une forme supplémentaire alternativement épissée, comportant l'inclusion de 955 pb dans l'intron A, et venant immédiatement après la 221 pb de l’exon 1. Ce transcrit a déjà été signalé par Van Der Logt et al en 1992 et s'étend du nucléotide 2428 au nucléotide 3616 (van der Logt CP 1992). Enfin, 2 transcrits supplémentaires, ASFT-A et ASFT-B, peuvent être extrapolés de la même manière que l’épissage existant entre FT et l’ASFT.

b. La protéine

1. Structure du FT Le FT est une glycoprotéine transmembranaire de 47 kDa. Elle appartient à la classe II de la superfamille des récepteurs des cytokines. La protéine mature est constituée de 263 acides aminés (AA) et est organisée en trois domaines :

- un domaine extracellulaire de 219 AA,

- un domaine transmembranaire de 23 AA,

- un domaine intercellulaire très court de 21 AA (Spicer EK 1987) (Morrissey JH 1987)

a. Domaine extracellulaire Le domaine extracellulaire du FT a été cristallisé par deux équipes différentes (Muller YA 1996) (Harlos K 1994). Il est constitué de deux domaines, N- et C- terminal, reliés par un

43

pont polypeptidique Proline 102-Asparagine 107 (Pro102-Asp107), permettant une angulation de 125° entre les deux domaines. Chaque domaine est constitué de 7 brins β repartis en feuillets antiparallèles. Le FT est sujet aux modifications post-traductionnelles : le domaine extracellulaire contient 3 des 4 sites de N-glycosylation que compte le FT (Asn11, Asn 124, Asn 137) (Boys CW 1993; Paborsky LR 1990). La glycosylation protège le FT de sa dégradation protéolytique (Paborsky LR 1990) et augmente son activité procoagulante (Krudysz-Amblo J 2010). Le domaine extracellulaire contient également 2 domaines fibronectines de type III possédant chacun un pont disulfure. Le pont disulfure en N-terminal, Cystéine49- Cystéine57 (Cys49-Cys57), est un pont de structure. En revanche, le pont disulfure en C-terminal, Cys186-Cys209, est un pont fonctionnel de type allostérique (Figure 14) (RHStaple) (Hogg PJ 2009). Des études de mutagenèse dirigée ont démontré le rôle du pont disulfure Cys186- Cys209 dans l’affinité du FT pour son ligand, le FVIIa (Rehemtulla A 1991) (Kothari H 2010). Il est également démontré que la suppression de ce pont disulfure modifie la structure conformationelle du FT, avec une double conséquence fonctionnelle : la perte de l’activité pro-coagulante du FT et un « switch » vers une fonction de signalisation (Ahamed J 2006). L’implication du pont disulfure Cys186-Cys209 dans la dé-encryption du FT reste controversée.

dans la dé-encryption du FT reste controversée. Figure N°14 : Structure du domaine extracellulaire du FT

Figure N°14 : Structure du domaine extracellulaire du FT. (Daubie V 2007). Les feuillets β sont

annotés de β1A à β7G et de β8 A à β6G. La flèche noire désigne le pont polypeptidique Pro102- Asp107 qui permet l’angulation de 125°. Les items 2a, 2b, 2c désignent les sites de N-

44

glycosylation (Asn11, Asn124, Asn137). Les 2 ponts disulfures N et C terminaux sont représentés en bleu.

b. Domaine intracytoplasmique

Le domaine intracytoplasmique du FT est très court (21 AA). Il contient deux sites de phosphorylation : le site sérine 253(Ser253), site consensus qui implique la protéine kinase C (PKC), et le site Ser258, indépendant de la PKC (Sen M 2009). La Ser258 joue un rôle majeur dans la signalisation induite par le complexe FT-FVIIa (Sen M 2009). Sa phosphorylation fait l’objet d’une régulation complexe : régulation positive dépendante de la phosphorylation de la Ser253, et régulation négative dépendante de la palmitoylation de la Cys245 du domaine intra cytoplasmique.

Des études ont montré que le domaine transmembranaire du FT, riche en AA hydrophobes, joue un rôle important dans l’ancrage du complexe FT /FVIIa à la surface cellulaire et donc dans l’expression de l’activité procoagulante du FT. En effet, une molécule de FT soluble privée de domaine transmembranaire est incapable de lier et d’activer le FVII (Ruf W 1991) (Morrissey JH 1997). De plus, ce domaine transmembranaire est requis pour l’autoactivation du FVII (Fiore MM 1994).

c. Expression du FT

L’expression du FT est variable selon les tissus ou les organes et résulte probablement d’une régulation transcriptionnelle différente selon les types cellulaires. La régulation très fine de l’expression du FT, encore largement méconnue, est probablement la conséquence d’une coopération entre plusieurs facteurs de transcription spécifiques du type cellulaire incriminé. Le FT est retrouvé en grande quantité dans des organes richement vascularisés tels que le poumon, le cerveau, le placenta et dans la capsule de différents organes comme le foie, le rein et la rate ; son expression y est constitutive (Drake TA 1989). Les muscles squelettiques et les articulations en contiennent très peu. Le FT peut être assimilé à une « enveloppe hémostatique » qui protège chacun de ces organes d’une brèche vasculaire accidentelle. Certaines tumeurs en contiennent aussi beaucoup (épithéliomas, adénocarcinomes et promyélocytes de la LAM3) (Bauer KA 1984) (Contrino J 1994). Dans les vaisseaux sanguins, le FT est retrouvé au niveau de l’adventice des artères saines. Il est indétectable dans l’endothélium et l’intima et n’est présent qu’à de très faibles quantités dans la média

45

d’artères musculaires comme les coronaires ou les artères mammaires internes (Weiss HJ 1994) (Wilcox JN 1989). Les cellules en contact direct avec les facteurs de la coagulation n’expriment pas, en majorité, de FT (lignées érythroblastiques, mégacaryocytaires). Cependant, il a été montré que certaines cellules sanguines exprimaient le FT. Notre équipe a notamment mis en évidence que les lymphocytes B (CD19+) étaient capables d’exprimer le FT, en protéine et en ARNm, après stimulation par le PMA (Mechiche H 2005). Plusieurs équipes ont également montré le FT était exprimé dans les polynucléaires neutrophiles (Giesen PL 1999; Imamura T 2002) et les monocytes (par immunohistochimie), et que ces leucocytes étaient la principale source de FT dans le sang (Giesen PL 1999). Enfin, il a été

aussi montré (par immunohistochimie), qu’un antagoniste du PAF (Platelet Activating Factor) inhibait l’expression du FT dans les polynucléaires neutrophiles infiltrant les sinusoïdes du foie, en réduisant cette infiltration par les leucocytes. (Todoroki H 1998). L'analyse par cytométrie de plaquettes non stimulées a montré qu’une petite quantité de FT était présente à la membrane dans le sang total, dans le plasma riche en plaquettes, et dans des plaquettes lavées isolées chez des sujets sains. (Camera M 2003). Une autre équipe a parallèlement montré par l'analyse en cytométrie de flux de plaquettes lavées issues d’adultes sains la

à la fois sur les plaquettes au repos, mais aussi sur les plaquettes activées par

la thrombine (Siddiqui FA 2002). En revanche, dans certaines lésions inflammatoires, les neutrophiles semblent peu exprimer le FT (Gazdy E 1981; Lerner RG 1977; Todoroki H 2000). Au total, la synthèse de FT par les granulocytes et les plaquettes fait encore l’objet de controverses. L’expression du FT est constitutive dans les cellules épithéliales pulmonaires, les cellules de Schwann, les cellules glomérulaires rénales, les cellules stromales de l’endomètre, les cellules épithéliales cutanées, les cardiomyocytes, les hépatocytes, les fibroblastes de l’adventice des vaisseaux et les adipocytes. Le FT n’est synthétisé qu’en très faibles quantités dans les cellules musculaires lisses (CML) de la média d’artères saines (Tableau 4).

présence de FT,

46

Tableau 4 : Expression du FT dans les cellules et les organes. (Daubie V 2007)

Tableau 4 : Expression du FT dans les cellules et les organes. (Daubie V 2007)

2. Isoformes du FT Depuis plus de 20 ans, le FT a été isolé pour identifier, cloner, et exprimer les protéines recombinantes (rTF) dans des cellules 293 de rein humain et chez E. coli. (Bach R 1981; Paborsky LR 1989; Spicer EK 1987). Par la suite, diverses formes de rTF - allant de la protéine totale au domaine extracellulaire du FT avec différents niveaux de modifications post-traductionnelles - ont été exprimées dans une variété de vecteurs, y compris des levures et des cellules d'insectes (Figure 15). Des études mutationnelles ont été réalisées (Kittur FS 2004), et la structure aux rayons X (Harlos K 1994) a été obtenue en utilisant ces rTF. Bien que ces rTF aient été largement utilisés comme substituts de la protéine naturelle, la disponibilité limitée des ressources naturelles purifiées en FT n'a pas permis la conformation des résultats obtenus avec le format rTF.

47

Figure 15 : structure des différentes espèces de FT. Les masses moléculaires indiquées ont été

Figure 15 : structure des différentes espèces de FT. Les masses moléculaires indiquées ont été déterminées à partir de la composition en AA, des électrophorèses sur gel (SDS) et par spectroscopie de masse (MALDI-TOF) (Butenas S 2007).

a. L’AsFT Comme décrit précédemment, il existe une forme épissée du FT, comportant les 4 premiers exons du FT, mais dont le cinquième a été exclu et le sixième modifié. Il s’agit de l’AsFT (Alternatively spliced FT). Cet ARN messager modifié aboutit à une protéine traduite tronquée de 206 AA (au lieu de 263 pour le FT). Dépourvu des domaines transmembranaire et intracytoplasmique, le AsFT circule librement. L’expression protéique de l’AsFT a été décrite pour la première fois par Bogdanov et al en 2003. Cette équipe a montré qu’il existait in vivo une synthèse d’une forme alternative du FT chez l’homme (Bogdanov VY 2003).et chez la souris (Bogdanov VY 2006). Dans l’AsFT, les résidus de 1 à 166 sont identiques au FT, et les résidus 167 à 206 constituent la partie C-terminale. De manière intéressante, le doublet Lys165-Lys166, dont l’implication dans l’interaction FT/FVIIa est connue, est conservé (Figure 16) (Kelley RF 1995).

48

Figure 16 : localisation des introns par une flèche et un I, Site potentiel de

Figure 16 : localisation des introns par une flèche et un I, Site potentiel de glycosylation indique

en diamants (schéma de GREENBERG et DAVIE)

L’AsFT a été détecté dans les poumons, le placenta, le pancréas, le plasma (Bogdanov VY 2003) mais surtout dans les tumeurs : glioblastome, mélanome, adénocarcinome de l'estomac et colorectal, et dans des cellules squameuses issues de lignées carcinomateuses (Tableau 5) (Yu JL 2004)

issues de lignées carcinomateuses (Tableau 5) (Yu JL 2004) Tableau 5 : expression de l’AsFT (Daubie

Tableau 5 : expression de l’AsFT (Daubie V 2007)

49

L’expression de l’AsTF a été également été détectée dans les cellules endothéliales et les cardiomyocytes (Szotowski B 2005) ainsi qu’après stimulation par le TNFα et IL-6 dans les cellules endothéliales (Szotowski B 2005).

L’AsTF a-t-il une fonction procoagulante ? En dépit de l’absence du domaine transmembranaire et de la queue intracytoplasmique, l’AsFT aurait encore une activité procoagulante. Cette propriété a été montrée en présence de phospholipides : l’AsFT est alors capable de s’incorporer au thrombus généré in vitro et pourrait ainsi stimuler la croissance du caillot de fibrine (Bogdanov VY 2003). D’autre part, plus récemment, il a été montré qu’après libération de l’AsFT par des HUVECs en réponse à une cytokine pro-inflammatoire, le TNFα, il existait une forte génération de facteur Xa (Szotowski B 2005). Des expériences mises en place pour comprendre la physiopathologie des complications thromboemboliques en chirurgie cardiaque en dépit du traitement à l'héparine ont montré que les monocytes exprimant AsFT activent les facteurs de VIIa et Xa, qui vont à leur tour activer la thrombine (Hattori T 2005). Cela a été récemment confirmé par une autre étude montrant que les cellules mononucléées stimulées fournissent une surface appropriée pour l’activation du facteur VIIa par l’AsTF (Khan MM

2006).

Cependant, d’autres travaux ont montré que cette forme de FT n'a pas d’activité procoagulante mais pourrait en revanche favoriser la croissance tumorale et l’angiogenèse. Pour certaines équipes, le mécanisme pro-angiogénique de l’AsTF semble être indépendant de la génération de thrombine (Censarek P 2007; Signaevsky M 2008). En effet, elles ont comparé l’activité procoagulante de lignées cellulaires qui hyper expriment le FT et l’AsFT, HEK293. Les deux formes de FT ont été exprimées à des niveaux similaires et sont toutes deux glycosylées. Censarek et al ont montré une activité procoagulante importante des lysats cellulaires et des surnageants des cellules exprimant le FT, mais pas d’activité procoagulante dans les lysats des cellules exprimant l’AsFT. Les auteurs ont émis la conclusion que l’AsFT n’avait pas d’activité procoagulante. L’AsFT est-il procoagulant ou non? La réponse semble dépendre de la source de la protéine et du test utilisé pour mesurer l'activité procoagulante. Les AsFT recombinants humains et murins réalisés chez E.coli ont un faible niveau d’activité procoagulante dans un test utilisant du FVIIa et du FX humains purifiés (Bogdanov VY 2006).Toutefois, des concentrations élevées de FVIIa peuvent activer le FX en l'absence de FT, ce qui correspond à la base de l'utilisation thérapeutique de NovoSeven® (Facteur VII humain recombinant

50

activé) pour traiter les patients atteints d'hémophilie (Hedner U 2000). Un problème avec l'étude de Censarek et al est que la protéine AsFT exprimée dans les cellules HEK293 n’a pas été sécrétée dans le surnageant de culture. Cela soulève la possibilité que cet AsFT soit dans une conformation différente de celui issu d’E Coli. Enfin, une autre équipe (Butenas S 2005) a proposé une nouvelle hypothèse de départ, provocatrice et totalement opposée : le FT soluble agirait comme un inhibiteur de la cascade de la coagulation par liaison au FVIIa. Ce FT soluble formerait un complexe enzymatique inactif et la quantité de FVIIa disponible pour le FT diminuerait de manière spectaculaire.

AsFT versus FT soluble ? L’hypothèse précédente reste discutable dans la mesure où l’appellation « forme soluble » du FT reste encore mal définie. Est-il possible de faire la distinction entre AsFT protéique et le « vrai » FT soluble ? L’AsFT et le FT soluble présentent le domaine extracellulaire du FT, mais ne comportent pas les domaines transmembranaire et intracytoplasmique du FT. Ce dernier domaine est remplacé dans la protéine AsFT par un domaine C-terminal spécifique. Le FT soluble recombinant utilisé dans l’étude ci-avant comprend les résidus 1 à 242, qui sont de longueur supérieure à l’AsFT (206AA). Il reste néanmoins difficile de mettre en évidence des différences d’activité entre le FT soluble et l’AsFT, car la plus grande partie commune de ces deux formes reste la partie extracellulaire. Comme le rôle majeur du domaine cytoplasmique du FT est lié à la transduction du signal (Ahamed J 2004), il a été admis qu’un FT dépourvu du domaine cytoplasmique est fonctionnellement identique à la protéine totale en ce qui concerne l’initiation de la génération de thrombine. D'autre part le FT recombinant, dépourvu des domaines cytoplasmiques et transmembranaire, ne peut pas se lier à la membrane, et donc, tout en formant un complexe avec le facteur VIIa, ne pas activer le facteur VII et diminue l'efficacité catalytique vers les facteurs IX et X. (Fiore MM 1994; Ruf W 1991).

L’AsFT a-t-il une fonction proangiogénique ? Hobbs et al ont montré que les cellules de tumeurs pancréatiques exprimant l'AsFT produisent plus de vaisseaux sanguins (Hobbs JE 2007). Ces résultats suggèrent que l’AsFT présente un effet proangiogénique. Cependant, le mécanisme n'est pas encore connu. Une des possibilités est que l’AsFT stimule les cellules cancéreuses pour produire des facteurs d’angiogenèse. Il pourrait aussi s’agir d’une stimulation des cellules endothéliales par voie paracrine. Van den Berg et al ont montré que l’AsFT induit une angiogenèse in vivo et in

51

vitro, indépendamment des facteurs de coagulation en aval et de la voie PAR-2, à la différence du FT. Cette angiogenèse reposerait sur la liaison aux intégrines (β1 et β3) (van den Berg YW 2009). Leur conclusion est la suivante : l’adhérence des cellules endothéliales à l’AsFT et la formation de capillaires AsFT-induits ont été inhibés par les anticorps bloquant les intégrines ; un anticorps qui inhiberait l’interaction FT-intégrine inhiberait le « bourgeonnement » et l’angiogenèse in vivo. Le mécanisme pro-angiogénique de l’AsFT semble être indépendant de la génération de thrombine. Cependant, à cause de sa découverte récente, les mécanismes d’action de l’AsFT sont encore mal documentés

3. Le FT membranaire : formes encryptées et dé-encryptées

Il est connu depuis de nombreuses années que la lyse des cellules FT-positive est

associée à une augmentation significative de l'activité du FT. Cela a conduit à l’idée que le FT

peut exister dans deux états : un de faible activité (encrypté) et un de haute activité (dé- encrypté). Ces deux formes se lient au FVII et au FVIIa (Bach RR 2006).

A la surface cellulaire, le FT est présent sous les deux formes : encryptée et dé-

encryptée. La forme encryptées est majoritaire, tandis que la forme dé-encryptée correspond à

la portion fonctionnellement active du FT. Ces deux formes fixent le FVIIa avec la même affinité, mais seul le complexe FT dé-encrypté-FVIIa est capable d’initier la coagulation. La dé-encryption est classiquement évaluée en termes d’activité procoagulante du FT, par génération du FXa et/ou de la thrombine. Plusieurs observations suggèrent que les lipides anioniques, particulièrement les phosphatidylsérines (PS), contribuent à la dé-encryption du FT.

Ce phospholipide anionique réside normalement dans le feuillet interne de la membrane, mais semble apparaître sur la surface cellulaire après la perturbation de l'asymétrie membranaire. En effet, la stimulation du monocyte par un inducteur puissant de l’externalisation de la PS, l’ionophore calcique, induit une augmentation de l’activité procoagulante du FT (Henriksson CE 2007; Wolberg AS 1999). Cette implication de la PS dans la dé-encryption du FT a été confirmée par un modèle de bicouche phospholipidique reconstituée (Morrissey JH 2008). Selon Hathcock, les PS représenteraient simplement une surface phospholipidique disponible autour du complexe FT-FVIIa pour l’activation d’autres molécules de facteur X(FX) (Hathcock JJ 2006). L’autre hypothèse expliquant la dé-encryption du FT fait appel à la protéine disulfide isomérase (PDI). Des controverses entourent les publications récentes liées au rôle putatif de

52

la PDI dans l’activité du FT. Ahamed et al pose le postulat que la PDI perturbe le lien Cys186-Cys209 et, en conséquence, supprime l'activité procoagulante du FT (Chen VM 2006). Il a aussi été rapporté que la PDI ne joue aucun rôle dans l'activité du FT, et que l'augmentation observée serait liée à la contamination du PDI par des phospholipides. (Kothari H 2008; Persson E 2008). Des travaux récents montrent que la PDI favoriserait la dé- encryption, augmenterait l’activité procoagulante du FT in vitro (Reinhardt C 2008) (Versteeg HH 2007) et qu’elle favorise la formation du thrombus plaquettaire et l’accumulation de fibrine in vivo (Reinhardt C 2008). Les théories proposées pour expliquer le mécanisme d’action de la PDI sur la dé- encryption du FT sont très aussi très débattues. Une hypothèse est qu’il existerait une activité oxydo-réductrice de la PDI sur le pont disulfure allostérique Cys186-Cys209 du FT, la forme encryptée correspondant aux cystéines réduites, et la forme dé-encryptée aux cystéines oxydées (Chen VM 2006). Cependant, d’autres travaux montrent l’absence de corrélation entre les formes oxydoréduites, les ponts disulfures Cys186-Cys209 et les formes cryptées/dé- encryptées du FT (Kothari H 2010; Wolberg AS 2000). Ceci est conforté par une équipe qui montre que la PDI améliore l’activité procoagulante du FT indépendamment de son activité oxydoréductase, et qu’elle participe à l’activation du FT cryptique grâce à l’activité de protéines chaperons (Versteeg HH 2007).

à l’activité de protéines chaperons (Versteeg HH 2007). Figure N°17 : m odèle d'activation de la

Figure N°17 : modèle d'activation de la coagulation TF-dépendante par PDI (Reinhardt C

2008)

53

c. Fonctions biologiques du FT

1. Rôle dans la coagulation

a. Initiation de l’hémostase Le FT joue un rôle clé dans l’initiation de la coagulation. D’une part, il participe à l’activation du FVII en FVIIa, et d’autre part, il agit comme cofacteur dans l’activation des facteurs FX et FIX par le FVIIa. Lorsqu’il n’est pas lié au FT, le FVII se présente dans la circulation sous deux formes : le FVII, une forme monocaténaire majoritaire non active (zymogène) et le FVIIa (sous forme de traces), une forme bi-caténaire partiellement activée (zymogène-like). En effet, l’activation du FVIIa nécessite :

- le clivage protéolytique de la liaison Arg152-Ile153 du domaine catalytique du FVII

- la formation comme pour les autres sérines protéases de type trypsine, d’un pont salin entre la nouvelle extrémité N-terminale Ile153 et le résidu Asp343 du site actif (Mueller BM 1998). Cependant, ce pont salin serait absent dans la forme FVIIa présente dans la circulation. Le FT est capable de lier les deux formes du FVII et FVIIa (Kelley RF 2004). Cette liaison est de très haute affinité et se fait avec un rapport stœchiométrique d’1/1. Par des études de mutagenèse dirigée et en comparaison de structure du FVIIa libre et de FVIIa présent dans le complexe FT-FVIIa, il a été démontré que la liaison du FVIIa au FT entraine des changements conformationnels du FVIIa et favorise la formation du pont salin et donc l’activation allostérique complète du FVIIa (Mueller BM 1998; Olsen OH 2007). Le FVIIa ainsi complétement activé permettrait la protéolyse de son zymogène, le FVII, au sein du complexe FT-FVII (auto-activation) ; cette auto activation est dépendante du FT (Waters EK 2006). Le FT joue également un rôle de cofacteur pour le FVIIa dans l’activation des FX et FIX, augmentant considérablement son activité protéolytique vis-à-vis de ses substrats (Bom VJ 1990). En effet le FT permet de stabiliser le site actif du FVIIa, particulièrement le résidu catalytique Ser344, et de le positionner à une distance d’environ 75Å de la membrane (McCallum CD 1997) (Khan AR 1998). L’activation des FX et FIX par le complexe FT- FVIIa est dépendante des ions Ca 2+ et des phospholipides (Bom VJ 1990). Par ailleurs, le FT participe indirectement à l’activation de FVII, les facteurs FXa et FIXa exerçant une rétro- activation du FVII au sein du complexe FT-FVII (Ndonwi M 2005).

54

Ainsi, par son rôle clé dans l’activation du FVII et la co-activation du FX et FIX, le FT est considéré comme l’initiateur de la cascade enzymatique de la coagulation aboutissant à la génération de thrombine.

b. Régulation de la coagulation L’activation de la coagulation par la voie du FT-FVIIa est régulée par 2 systèmes inhibiteurs agissant sur l’activité du complexe FT-FVIIa : l’antithrombine (AT) et le TFPI. L’AT est le principal inhibiteur des sérines-protéases de la coagulation (Serpine). Cette glycoprotéine de synthèse hépatique inhibe le FT par 2 mécanismes indirects. D’une part, la formation du complexe AT-FT-FVIIa rend le FVIIa incapable de lier un nouveau site du FT ; d’autre part, la liaison de l’AT au FVIIa entraine des modifications conformationelles du FVIIa qui accélèrent alors la dissociation des complexes FT-FVIIa (Rao LV 1995). Une étude récente a montré que l’AT s’opposait au développement de métastases hépatiques d’origine colorectale chez la souris (Kurata M 2006). Le TFPI est l’inhibiteur spécifique du FT (Broze GJ, Jr. 1991) (Osterud B 1995). Plusieurs isoformes du TFPI ont été isolées : TFPIα, TFPIβ, et TFPIδ chez les humains et TFPIα, TFPIβ, et TFPIγ chez la souris. Elles diffèrent dans leur structure de domaine et leur méthode d’ancrage à la surface cellulaire, mais il n’a pas encore été décrit in vivo de différence significative fonctionnelle entre ces isoformes. Les tissus humains et murins produisent, en moyenne, environ 10 fois plus d’ARNm de TFPIα que de TFPIβ. Plusieurs éléments indiquent que le TFPIα est l'isoforme prédominant chez l'homme. En revanche, des travaux récents montrent que l’isoforme TFPIβ est la principale protéine isoforme produite chez la souris adulte. Les isoformes gardent les deux premiers domaines de Kunitz présents dans le TFPI, et seraient donc théoriquement capables d'inhiber à la fois le facteur Xa et le facteur VIIa/FT (Maroney SA 2010). Toutefois, il n’a pas été formellement démontré que les cellules endothéliales humaines produisent du TFPIβ. Les plaquettes produisent du TFPI, mais pas du TFPIβ (Maroney SA 2008). Le TFPI, comporte 276 AA (~43 kDa) est polyvalent de type Kunitz, inhibiteur de la protéase, et est codé sur le chromosome 2 (Girard TJ 1991). Sur sa longueur, TFPI (TFPIα) contient trois domaines de Kunitz inhibiteurs de la protéase, et une base carboxy-terminale (Wun TC 1988). Le premier (K1) et le deuxième (K2) domaines de Kunitz inhibent le complexe TF / FVIIa et le facteur Xa, formant un complexe quaternaire, TFPI-TF/FVIIa-FXa (Girard TJ 1989). La fonction d'inhibition du troisième (K3) domaine de Kunitz n'a pas encore été identifié.

55

Le TFPI inhibe non seulement l’activité du complexe FT-FVIIa, mais aussi celle du FXa. Cette inhibition se déroule en 2 étapes : dans un premier temps, le TFPI se lie par son domaine K2 au FXa qu’il inhibe en formant un complexe TFPI-FXa. Dans un second temps, le complexe TFPI-FXa se lie par le domaine K1 au complexe FT-VIIa, formant un complexe quadri-moléculaire FT-FVIIa-TFPI-FXa inactif (Broze GJ, Jr. 1995). Ce mécanisme d’action n’est possible qu’à partir du moment où un peu de FXa a été généré. L’inhibition directe du complexe FT-FVIIa -FXa par le TFPI est accessoire. Le mécanisme unique pour l’inhibition des FXa et FVIIa/FT fait du TFPI le seul inhibiteur physiologique actif de l’initiation de la cascade de coagulation. Le TFPI se trouve dans un certain nombre de sites vasculaires. Il est principalement (85%) associé à des cellules endothéliales microvasculaires (Novotny WF 1989) (Mast AE 2002). Le TFPI soluble au sein du plasma humain est variable, tronqué en C-terminal, et a une activité anticoagulante diminuée. (Broze GJ, Jr. 1994; Lindahl AK 1991). Une petite quantité de TFPI est présente sur la surface des monocytes (Ott I 2001) et a été détectée dans les macrophages des lésions d'athérosclérose (Crawley J 2000) et dans les cellules musculaires lisses. (Caplice NM 1998; Pendurthi UR 1999). La production de TFPI par les plaquettes contribue à environ 8-10% du TFPI total. (Maroney SA 2007; Novotny WF 1988). Il est intéressant de voir que le TFPI n'est pas exprimé sur la surface des plaquettes au repos, mais après stimulation double avec le collagène et la thrombine (Maroney SA 2007). Le TFPI est produit constitutivement par les cellules endothéliales (HUVECs) (Maroney SA 2008; Zhang J 2003). En dehors de son rôle dans la régulation de la coagulation, le TFPI est impliqué dans l’inhibition de l’angiogenèse. Il est fortement exprimé (ARNm et protéine) dans les cellules des tumeurs du sein et du colon, ainsi que dans les cellules endothéliales proches de ces tumeurs (Sierko E 2010). Des études récentes ont montré que le TFPI s’opposait à la croissance et à l’invasion tumorale (Kondraganti S 2006). Récemment, il a été montré que le TFPI interfère avec la migration des cellules endothéliales par inhibition de la voie à la fois Erk et des protéines d'adhésion focale (Provencal M 2008). Une deuxième forme de TFPI a été mise en évidence récemment, leTFPI-2, également appelé protéine placentaire 5 (PP5), car isolée à partir du placenta humain. Elle est synthétisée par les cellules endothéliales, les cellules mésenchymateuses et épithéliales, les monocytes/macrophages et le trophoblaste villeux. Cette glycoprotéine de 32 kDa, membre de la famille des inhibiteurs de protéases à sérine de type Kunitz, est majoritairement sécrétée vers la matrice extracellulaire où elle joue un rôle dans la migration cellulaire et l'invasion

56

Le TFPI-2 est, en effet, faiblement synthétisé par les cellules

tumorales particulièrement invasives alors que les cellules peu invasives expriment beaucoup de TFPI-2 De plus, la régulation négative de son expression favorise l'invasion (Wojtukiewicz MZ 2003). En dépit des analogies de séquence et de structure avec le TFPI-1, inhibiteur majeur du complexe FT/FVlla, le TFPI-2 n'inhibe pas le FXa et régule donc faiblement la coagulation dépendante du facteur tissulaire. En revanche, le TFPI-2 est un important inhibiteur de la plasmine et réduit donc l'activation de plusieurs métalloprotéinases, limitant ainsi l'invasion tumorale et les métastases. De plus, en inhibant plusieurs métalloprotéinases (MMP-1, -2, -9 et -13), il pourrait également moduler la dégradation des matrices extracellulaires au sein des plaques athéromateuses (Reveridau P 2003).

tumorale (Reveridau P 2003)

2.

Signalisation

En dehors de son rôle, reconnu dans la coagulation, le FT est associé à plusieurs réponses cellulaires. En effet, il peut induire plusieurs phénomènes :

- l’activation de la phospholipase C et l’augmentation des flux calciques intracellulaires (Cunningham MA 1999)

- l’activation de certaines tyrosines kinases, JAK2, Src-kinases (Ott I 2005; Versteeg HH 2000; Versteeg HH 2004) et de plusieurs voies de signalisation : ERK1/2, JNK MAPKs et AKT (Cirillo P 2004; Ott I

2005).

- l’activation de la voie des caspases impliquées dans la régulation de l’apoptose via le FVIIa. Notamment, il existe un effet anti-apoptotique du FVIIa, confirmé par l'observation que le FVIIa atténue l’activation des caspases 3. Cet effet est dépendant de son activité protéolytique et du FT, mais indépendante du facteur Xa et de la thrombine (Sorensen BB 2003). Le complexe FT/FVIIa induit la survie des cellules à travers la production de BCLXL via STAT5 et l’activation de la protéine anti- apoptotique PBK via JAK2 (Versteeg HH 2004).

- l’activation de plusieurs facteurs de transcription tels que Erg-1, AP-1, STAT5 (Signal Transducer and Activator of Transcription) (Camerer E 1999; Poulsen LK 1998; Versteeg HH 2004).

57

- la liaison FT/FVIIa provoque une expression accrue de la polymérase A dans les fibroblastes humains (Pendurthi UR 1997).

- l’expression des gènes impliqués dans l’inflammation (IL-6, IL-8, TNFα) (Muth H 2005), l’adhésion et la migration cellulaire (VCAM-1), l’angiogenèse, la croissance des tumeurs et le développement des métastases (Abe K 1999; Belting M 2004; Ryden L 2010) .

Le rôle du FT dans la signalisation est ainsi bien confirmé. Cependant, son mécanisme d’action est très complexe. Le FT agirait par au moins deux voies différentes : la signalisation dépendante de l’activité catalytique du complexe FT-FVIIa ou FT-FVIIa-FXa, et celle médiée par son domaine intracytoplasmique.

Plusieurs réponses cellulaires induites par le FT (activation de la voie ERK1/2, expression des gènes des cytokines, et angiogenèse) sont dépendantes de l’activité catalytique du FVIIa-FT. L’inhibition du domaine catalytique inhibe ces réponses cellulaires (Belting M 2004; Cirillo P 2004; Muth H 2005; Poulsen LK 1998). Cette voie impliquerait l’activation des récepteurs PAR-2 (Protéase Activated Receptors) par le FVIIa au sein du complexe FT- FVIIa. Ainsi, dans des lignées cellulaires cancéreuses, tous les gènes activés par le complexe FT-FVIIa le seraient via par PAR-2 et l’inhibition de PAR-2 empêcherait la signalisation induite par le FT-FVIIa (Albrektsen T 2007) (Hjortoe GM 2004). PAR-2 serait également activé par le complexe ternaire FT-FVIIa-FXa. L’activation de PAR-2 par les complexe FT- FVIIa ou FT-FVIIA-FXa déclencherait une signalisation qui pourrait activer en retour la phosphorylation du domaine intracytoplasmique du FT (Belting M 2004) (Ahamed J 2004). Une étude récente rapporte que la première preuve in vitro de l’implication de la voie PAR-2- FT dans la croissance des tumeurs et démontre la phosphorylation du FT induite par PAR-2 (Ryden L 2010).

Un autre mécanisme d’action du FT serait la voie initiée par le domaine intracytoplasmique du FT (Ott I 2005). L’implication du domaine intracytoplasmique dans la régulation de la signalisation semble dépendante de sa phosphorylation. Ainsi, Sen et al, démontrent par une méthode spectroscopique que la phosphorylation de la Ser258 du FT favorise une conformation structurale particulière du domaine intracytoplasmique (formation d’une hélice II de poly-proline entre les résidus Ser258,Pro259,Leu260) (Sen M 2009) et régule potentiellement son association avec la membrane cellulaire et ses partenaires de signalisation. C’est l’expression de PAR-2 et les modifications de « palmitoylation » du FT

58

(Dorfleutner A 2003) qui sont les clés de régulation de la phosphorylation du domaine intracytoplasmique du FT. La liaison FT-FVIIa implique un clivage protéolytique de PAR-2 et la phosphorylation du domaine intracytoplasmique du FT via la Phospholipase C et la PCKα (Ahamed J 2004). Les cellules tumorales transfectées avec le FT sans queue cytoplasmique produisent un niveau accru de FT et peu de VEGF. Ainsi la partie intracytoplasmique du FT jouerait un rôle dans la régulation de l'expression du VEGF dans certaines cellules tumorales (Abe K 1999). Il est à noter que la phosphorylation du domaine intracytoplasmique du FT régule à la baisse les antigènes de surface et les molécules adhérentes (type VCAM-1 et ICAM-1) dans les cellules tumorales (Li C 2008). Selon l’équipe de Ruf, il existe une régulation négative exercée par le domaine intracytoplasmique du FT, contrôlant la signalisation induite par la protéase PAR-2. En effet le domaine cytoplasmique délété chez la souris montre une augmentation de l’angiogenèse PAR-2 dépendante (Belting M 2004).

En conclusion, on peut proposer le modèle décrit sur la Figure 18.

on peut proposer le modèle décrit sur la Figure 18. Figure 18 : Schéma de l’implication

Figure 18 : Schéma de l’implication du FT dans la signalisation. Schéma effectué d’après (Belting M 2004) (Ahamed J 2004) (Ott I 2005) (Ryden L 2010) (Sen M 2009) 1-les complexes FT-FVIIa ou FT-FVIIa-FXa activent PAR-2, 2- parmi les voies de signalisation déclenchées par PAR-2, il y a celle activant la PCKα, 3-la PCKα active la phosphorylation de la Ser253, 4-la Ser253 active la phosphorylation de la Ser258, 5- le domaine intracytoplasmique phosphorylé régule négativement la signalisation induite par

PAR-2,

6- ou déclenche une autre voie indépendante de PAR-2.

59

3. Migration cellulaire et angiogenèse

L’hémostase et l’angiogénèse sont étroitement liées par l’intermédiaire de la fibrine qui joue un rôle dans la migration cellulaire et la libération de facteurs pro et anti-angiogéniques (Carmeliet P 2000). Par définition, l’angiogenèse implique des propriétés migratoires cellulaires.

a. Migration cellulaire et FT

Il a été mis en évidence que le FT stimule la migration via une voie de signalisation incluant l'activation de p38 et Rac1 et indépendante de l'activité protéolytique du FVIIa, mais dépendante du domaine intracytoplasmique du FT. La liaison du site actif FVIIa au TF inhibé peut stimuler la paroi du vaisseau par remodelage et améliorer la migration à travers l'activation de Rac1 et p38. Ce nouveau lien peut fournir un aperçu de la compréhension des fonctions non-hémostatiques du FT. (Ott I 2005). Il a également été montré que le FT est un puissant facteur de chimiotactisme pour les cellules musculaires lisses vasculaires (SCMs). La capacité d’induction de la migration par le FT est comparable à celle induite par un facteur hautement chimiotactique : le PDGF (Platelet-Derived Growth Factor). L’usage de l’anticorps monoclonal anti-FT implique une inhibition de migration des SCMs (Sato Y 1996). Etayant cette fonction du FT dans la migration, il a également été montré que le complexe FT/FVIIa stimule la migration des fibroblastes humains sans passer par la voie de la coagulation, indépendamment du FXa et de la thrombine (Siegbahn A 2000). Cette dernière équipe a montré que la liaison du FVIIa au FT conduisait à un hyper-chimiotactisme des fibroblastes humains en réponse au PDGF (Platelet-Derived Growth Factor). Cette propriété du FT pourrait jouer un rôle important dans l’artériogenèse ou la thrombose. Récemment, il a été montré que l’expression constitutive de FVIIa favoriserait l’invasion et la migration d’une lignée tumorale de cellules ovariennes. La motilité accrue bloquée par des anticorps anti-FT monoclonaux et par des anti-PAR-1 confirme que le complexe TF/FVIIa stimule la migration en déclenchant la signalisation cellulaire (Koizume S 2006).

b. Angiogenèse et FT

Modèles animaux

60

Un déficit total en FT n’est pas viable. Plusieurs équipes ont créé une souris délétée pour le gène du FT (Bugge TH 1996; Carmeliet P 1996). Les embryons mFT-/- meurent in utero à 10,5 jours de développement par hémorragie et désorganisation importante de la vascularisation du sac vitellin. Le mécanisme est un défaut du développement de la couche musculaire entourant les tubes de cellules endothéliales du vaisseau primitif. L’absence de FT semble affecter la structure des vaisseaux plutôt que la régulation de la différenciation des cellules endothéliales (Carmeliet P 2000). Les mécanismes par lesquels le système FT-FVII modifie l’angiogénèse semblent dépendants de la signalisation intracellulaire du FT (Bromberg ME 1995) (Zhang Y 1994). Les embryons mFT-/-, hTF+ chez qui une petite activité FT est restaurée par un petit gène contenant le promoteur et l’ADNc humains du FT, ce qui permet ainsi de retrouver 1% d’activité FT, survivent sans hémorragie du sac vitellin (Parry GC 1998). Par contre, le système précédent une fois délété du domaine extracellulaire, ne permet pas la survie de ces embryons (Parry GC 2000). Ces travaux mettent en évidence le rôle clé du FT dans l’embryogénèse et le développement vasculaire. La partie extracellulaire du FT, qui lie le FVII, est absolument nécessaire à l’embryogénèse des vaisseaux, comme l’ont montré différents modèles de souris génétiquement modifiées pour les parties extra ou intracellulaires du FT (Parry GC 2000) Par ailleurs, des inhibiteurs spécifiques du complexe FT-FVIIa-FXa et du FXa seul ont montré que le processus angiogénique est dépendant du FVIIa mais pas du FXa (Hembrough TA

2003).

Angiogenèse, FT et cancer Le FT est exprimé par tous les types de cancers. L’activation FT-dépendante de la coagulation a été mise en évidence dans les thromboses associées aux cancers et aux métastases. La croissance de la tumeur et l'angiogenèse sont, entre autre, liés à l'expression du FT par les cellules tumorales. Il a été montré que le FT pouvait être exprimé –ou pas- sur les cellules endothéliales dans les vaisseaux sanguins des tumeurs (Contrino J 1996; Luther T 1996). L’angiogenèse tumorale débuterait par l’expression de FT par les cellules endothéliales (Shoji M 1998). Des modèles d’angiogénèse tumorale, dans des modèles de cancer de l’ovaire et de mélanome chez la souris, ont montré le rôle du système FT-FVII dans la majoration du potentiel métastatique des tumeurs (Bromberg ME 1995) et de leur vascularisation (Abe K 1999; Zhang Y 1994).

61

L’inhibition du FT dans un modèle de sarcome de l’ovaire murin inhibe la croissance et la vascularisation tumorale. Le FT favorise l’angiogénèse tumorale par l’induction de facteurs angiogéniques tel que le VEGF et l’inhibition de facteurs antiangiogéniques tels que la thrombospondine (Zhang Y 1994). Le FT permet aussi, par son domaine intracytoplasmique, la prolifération et la dissémination métastasique de cellules de mélanome humain (Bromberg

phosphorylation

intracytoplasmique du FT dans le cancer du sein humain. La voie de signalisation FT-PAR-2 semble favoriser l'angiogenèse tumorale. (Ryden L 2010).

ME

1995).

Il

existe

lien

entre

l’expression

PAR-2

2010) . ME 1995). Il existe lien entre l’expression PAR-2 et un de la Par ailleurs,

et

un

de

la

Par ailleurs, récemment, il a été montré que l’interaction FT/FVIIa active plusieurs voies de signalisation qui facilite l’angiogenèse (Kasthuri RS 2009; Rao LV 2005; van den Berg YW 2009). Cet argument est principalement soutenu par des expériences réalisées dans les cellules tumorales exprimant de grandes quantités de FT de manière constitutives, notamment par transfection du gène de FT exposée à de très grande concentration de FVIIa.

L’implication du FT dans l’amplification du processus angiogénique tumoral semble donc être aujourd’hui admise.

Mécanismes moléculaires et/ou cellulaires

Implication du complexe FT/FVIIa L’angiogenèse semble être largement dépendante du complexe FT/ FVIIa mais plutôt en relation avec sa fonction intracellulaire qu’avec celle d’activateur de la cascade de la coagulation. L’utilisation des formes recombinantes de TFPI a montré que l'activité coagulante est bloquée plus efficacement que la signalisation cellulaire, ce qui suggère que même après la fin du processus de coagulation, le FT peut conserver des fonctions de signalisation (Ollivier V 2000). Ce fait a été étayé par Hembourough et al en 2003 (Hembrough TA 2003), qui ont conclu que le complexe TF-FVIIa pouvait médier l’angiogenèse sans la contribution des protéases en aval. Le complexe TF-FVIIa seul n'induit pas d’augmentation de l’ion Ca 2+ dans les cellules endothéliales, cela qui requiert de passer par le FXa et la thrombine. (Daubie V 2006). En outre, le FXa est un plus puissant stimulateur de libération de cytokines tel que l’IL-6 et l’IL-8, pro-angiogéniques et pro-inflammatoires, alors que la thrombine induit la libération d'IL-8 seulement. Ces données renforcent le concept selon lequel le FT, par la voie des protéases activées en aval, est un inducteur plus

62

puissant de la diversité biologique des activités pro-angiogéniques que la thrombine seule. De même, le TF jouerait un rôle important en tant que récepteur et activateur des cellules dans l'inflammation et l’angiogenèse. Des expériences conduites par Zhang et al en 1994 ont mis en évidence pour la première fois in vivo chez la souris que le FT pouvait réguler l’angiogenèse en alternant

l’expression de molécules angiogéniques par un mécanisme distinct de l’activation du système de coagulation. (Zhang Y 1994). Il existe d’étroites interactions entre le système FT- FVII et les facteurs angiogéniques. L’hyperexpression du FT dans différentes tumeurs :

fibrosarcome (Zhang Y 1994), adénocarcinome gastrique (Zhang J 2005), et mélanome (Abe

K 1999), initie la croissance tumorale en diminuant la transcription des thrombospondines

anti-angiogéniques et en augmentant le VEGF proangiogénique.

Le VEGF induit une augmentation de l’expression du FT (indirectement mesurée par

la génération de thrombine) dans des cellules endothéliales en culture (HUVEC), une

augmentation de la production des métalloprotéinases MMP-1 et 2, et une dégradation de la membranaire basale sous-jacente, première étape de l’angiogenèse tumorale (Zucker S 1998). Ollivier, Chen, (Chen J 2001; Ollivier V 2000) et leurs équipes, ont montré que les fibroblastes humains sécrètent plus de VEGF en réponse à la stimulation par le complexe FT- FVIIa. De manière intéressante, le VEGF peut aussi stimuler l’expression de FT dans les cellules endothéliales, via Egr-1 (Mechtcheriakova D 1999). Il est connu que le VEGF et le TNFα agissent de manière synergique sur l’hyperexpression de FT dans les HUVECs. La liaison du VEGF au récepteur VEGFR2 est nécessaire et suffisante pour potentialiser l’hyperexpression du FT induite par le TNFα (Shen BQ 2001). Par ailleurs, il a été mis en évidence, au niveau de cellules endothéliales provenant

d’aortes bovines, que le FT induisait directement l’angiogenèse, et ce sans passer par les voies

de la coagulation (Watanabe T 1999). D’autre part, et en cohérence avec cette hypothèse, il a

été montré que la partie intracytoplasmique du FT jouait un rôle clé dans la régulation de l’angiogenèse et de la production de VEGF (Abe K 1999). Des données récentes montrent que l’interaction FT/FVIIa est connue pour être impliquer dans la migration cellulaire (Carmeliet P 1996) et l’angiogenèse, de manière dépendante des vois PARs (Kasthuri RS 2009; Rao LV 2005) ou indépendamment des facteurs de coagulation en aval et de la voie PAR-2 (van den Berg YW 2009).

63

Implication des récepteur PARs Il a récemment été suggéré que les effets cellulaires du FT pouvaient être indirects et dus à l’activation des PARs. Les protéines plasmatiques de la coagulation tels que le facteur VIIa, le facteur Xa, et la thrombine (FIIa) appartiennent à la famille des sérines protéases. Leurs actions biologiques sont exercées par le biais de récepteurs spécifiques appelés PARs (Protease Activated Receptors). Les PARs sont des récepteurs cellulaires composés de 7 domaines transmembranaires couplés aux protéines G et activés de manière irréversible par des sérines-protéases, par clivage de leur extrémité N-terminale. Quatre PARs ont été identifiés à ce jour dont 3 (PAR-1, PAR-3 et PAR-4) sont des récepteurs de la thrombine (Coughlin SR 2000; Major CD 2003). Le complexe FT-FVIIa active PAR-2, le FXa active PAR-1 et -2, et la thrombine active PAR-1, -3 et -4 (Mackman N 2004). Les PARs -1, -2 et -4 sont exprimés par de nombreuses cellules vasculaires comme la cellule endothéliale (Coughlin SR 2000). Les PAR-1 et -4 sont exprimés par les plaquettes (Kahn ML 1998; Nakanishi-Matsui M 2000). Le complexe FT-FVIIa peut agir par l'intermédiaire des récepteurs PAR-2 ; sa liaison en aval avec le FXa permet également l'activation de PAR-1 (Figure 19).

FXa permet également l'activation de PAR-1 (Figure 19). Figure 19 : Effets en aval connus de

Figure 19 : Effets en aval connus de l’activation des PARs par le complexe FT/FVIIa, la protéase de coagulation FXa et la thrombine (Daubie V 2007).

Ahamed, Ruf, et leurs équipes ont montré que la voie de signalisation passant par PAR-2 cible spécifiquement le domaine cytoplasmique du FT (Ahamed J 2004). C’est par la voie de PAR-2, non par celle de PAR-1, que se fait l’activation de la PCKα via la phospholipase C et la phosphorylation en aval du domaine cytoplasmique du FT (Ahamed J 2004). Le domaine intracytoplasmique ainsi phosphorylé active une voie de signalisation

64

différente de PAR-2 et régule négativement la signalisation induite par ce dernier. Il a en effet été montré chez un modèle murin présentant un FT dépourvu du domaine intracellulaire que

le domaine intracytoplasmique inhibait l’angiogénèse et la tumorogénèse induites par PAR-2.

La phosphorylation du domaine intracytoplasmique lève cette inhibition chez la souris (Belting M 2004). Par ailleurs, comme nous l’avons vu précédemment, la queue

intracytoplasmique du FT est essentielle à la production de VEGF dans les cellules de cancer gastrique et de mélanome (Zhang J 2005). Il a aussi récemment été montré pour la première fois le lien entre expression de PAR-2 et phosphorylation du FT dans le cancer du sein humain. La voie de signalisation FT-PAR-2 semble favoriser l'angiogenèse tumorale (Ryden

L 2010).

Par ailleurs, il a été montré que l’angiogenèse médiée par le complexe FT-FVIIa était régulée par la voie PAR-2 et contrôlait le domaine cytoplasmique du FT (Uusitalo-Jarvinen HK, T. Mueller, BM. Andrade-Gordon, P. 2007) (Belting M 2004). Le FT possède un récepteur aux cytokines de classe II et présente une sérine phosphorylable dans son domaine intracytoplasmique (Bazan JF 1990). Le FT intracytoplasmique a été impliqué dans l’angiogenèse (Versteeg HH 2003; Versteeg HH 2004). Ces éléments étayent le fait que l’angiogenèse est à la fois dépendante de la fonction intracellulaire FT-FVIIa, mais également peut-être d’une voie directe intracytoplasmique. La fixation FVII/ FT permet d’induire des variations du calcium intracytosolique dans différents types cellulaires (cellule endothéliale notamment), de moduler l’expression de différents transcrits dans les fibroblastes humains, et d’induire la synthèse de VEGF qui peut en retour

induire la synthèse de FT (Ollivier V 1998) (Clauss M 1990; Rottingen JA 1995). Ces mécanismes

transductionnels font intervenir la phosphorylation de différentes protéines kinases comme la

PKC, les MAP-kinases (Camerer E 1999; Ott I 1998; Poulsen LK 1998).

L’activation de la coagulation via le FT peut aussi indirectement être le support de l’angiogenèse en relâchant des facteurs proangiogéniques via les granulations α des plaquettes activées et des voies angiogéniques supplémentaires dépendantes de l’activation du facteur Xa, de la thrombine, et de la protéine G liée au PARs (voie de signalisation via la thrombine par PAR1 dans les cellules endothéliales). Il a été montré que la cascade de coagulation et PAR-1 modulent les fonctions de développement des vaisseaux sanguins et l’action de la thrombine dans les cellules endothéliales. Ils contribuent également au développement vasculaire dans l’embryon de souris (Griffin CT 2001). Le rôle d’activation cellulaire du FT est complexe, peut-être médié par son domaine extracellulaire et son rôle activateur des PARs via les FVIIa, FXa et la thrombine dont il a permis la génération. Le complexe ternaire

65

FVIIa/FT/FXa par les voies PAR-1 et PAR-2 est capable d’activer la voie MAPkinase. Le FT participe ainsi à l’angiogénèse indirectement par l’intermédiaire de sa voie protéolytique (thrombine) ou directement par le complexe FT-FVIIa. Ces effets sont médiés par le clivage et l’activation de protéines G couplées avec les récepteurs PARs (Protease-Activated Receptors).

avec les récepteurs PARs (Protease-Activated Receptors). Figure 20 : . Le complexe FT/FVIIa induit un signal

Figure 20 : .Le complexe FT/FVIIa induit un signal de transduction (Versteeg HH 2004) 1/ Sur le complexe FT/FVIIa PAR-2 ou PAR inconnu sont activés par protéolyse. Par la suite, selon le type cellulaire, des événements tels que la signalisation calcique, l'activation de la kinase MAP, et la translocation nucléaire de facteurs de transcription ont lieu, aboutissant à une modification de la régulation des ARNm 2/ Le complexe FT/FVIIa peut également servir d'échafaudage pour FXa, ciblant PAR-1 et PAR-2. Cela conduira à nouveau à l'activation des voies des MAP kinases et de transcription.

4. FT associé aux Microparticules Le FT a d’abord été détecté dans le plasma humain, libéré par les plaquettes (Misumi K 1998). L’existence d’un FT circulant a été étudiée par Chou et al en 2004 (Chou J 2004) qui ont conclu (chez la souris) que le FT sanguin était associé à des microparticules (Mps) dérivant de cellules hématopoïétiques, et contribuant à la propagation du thrombus dans le système microvasculaire. Ces Mps sont de petits fragments de membrane libérés par des cellules d’origine vasculaire activées ou apoptotiques (Morel O 2006). Ce sont des structures lipoprotéiques de 0,1 à 1,5 µm de diamètre, produites par la vésiculation des membranes

66

cellulaires des cellules endothéliales et de cellules circulant dans le sang périphérique (monocytes, plaquettes, érythrocytes) (Kushak RI 2005). Les Mps expriment à leur surface les antigènes membranaires spécifiques du type cellulaires dont elles sont issues. Elles constituent une population très hétérogène en terme de taille et de composition lipido- protéique (Weerheim AM 2002). Elles sont riches en phosphatidylsérine dans le feuillet externe et peuvent soutenir la voie de la coagulation médiée par le FT, qui nécessite des surfaces phospholipidiques. La production de Mps endothéliales a été documentée in vitro en réponse à de nombreux inducteurs, tels que le complément, la thrombine, le LPS et les cytokines pro inflammatoires (TNFα et IL1) (Combes V 1999) (Sabatier F 2002). Une élévation de leur nombre a été rapportée dans différentes pathologies vasculaires : diabète, athérosclérose, complication de l’insuffisance rénale chronique, et dysgravidies. Parmi les marqueurs les plus utilisés, le CD146 et le CD144 sont les plus spécifiques. La nature des stimuli inducteurs conditionne la composition des Mps en phospholipides et en antigènes cibles (Weerheim AM 2002). Ces différences de composition dépendantes des cellules émettrices et des conditions de stimulation ont un rôle dans les effets biologiques des Mps. Elles vectorisent l’activité procoagulante (Sabatier F 2002) expliquant leur implication dans les processus thrombotiques (Morel O 2006) et expriment des facteurs de croissance leur conférant une implication dans le contrôle de l’angiogenèse et la croissance tumorale (Dignat-George FS, F.Camoin- Jau,L.Robert,S.Lacroix,R.Sampol,J. 2008). L’expression du FT sur les Mps originaires des cellules l'endothélium vasculaire a été mise en évidence en 1998 (Kagawa H 1998), puis confirmée sur les cellules endothéliales, les monocytes (Shet AS 2003), et sur celles de muscles lisses (Stampfuss JJ 2006). D’autres types cellulaires peuvent générer des Mps liées au FT, comme par exemple les leucocytes et les plaquettes (Moosbauer C 2007; Siddiqui FA 2002). Les Mps liées au FT ont montré des capacités procoagulantes (Sturk-Maquelin KN 2003) et leur capacité à générer de la thrombine a été confirmée (origine endothéliale, érythrocytaire, plaquettaire, monocytaire) (Berckmans RJ 2001; Poitevin S 2007). Il a également été montré que les Mps non liées au FT peuvent être procoagulantes : dans un modèle murin d’hémophilie, l’interaction P- sélectine/ PSGL-1 aboutit à la génération de Mps qui corrigent le déficit de coagulation (Hrachovinova I 2003). Les Mps liées aux cellules endothéliales (HMEC-1) sont capables de favoriser la génération de plasmine et sa dissémination, ce qui implique une probable action indirecte sur l’angiogenèse (Lacroix R 2007). La stimulation in vitro des HUVECs par un facteur

67

proangiogénique (VEGF) aboutit à la formation de Mps dérivées de cellules endothéliales riches en métalloprotéinases (MMP-1, 2, et 9) ; ces Mps sont capables d’induire des pseudo- tubes et sont sans doute impliquées dans la régulation de l’activité protéolytique indispensable à l’invasion vasculaire de l’angiogenèse (Taraboletti G 2002). Il a de plus été montré que les Mps issues de cellules endothéliales produisent des MMP de type MMP-1, MMP-2, MMP-9, MT1-MMP, toutes impliquées dans la régulation de l'angiogenèse. (Mignatti P 1989; Unemori EN 1990) . L’importance de ces enzymes a été mise en évidence dans l’angiogenèse par l’usage d’inhibiteurs des MMP qui bloquent le processus d’angiogenèse, et chez les souris déficientes en MMP (Giavazzi R 2001; Hidalgo M 2001). La fonction précise des MMP dans l’angiogenèse reste encore incomprise. Cependant, l’interaction des Mps d’origine monocytaire avec les cellules endothéliales et les fibroblastes entraine la production par ces cellules de cytokines pro inflammatoires (IL-6 et IL-8) et de métalloprotéinases (MMP-1, MMP-3, MMP-9) (Distler JH 2005). Une étude utilisant la migration cellulaire, la méthode de cicatrisation (wound-healing), et la formation de pseudo- tubes sur Matrigel®, a montré que le FT recombinant « soluble » (correspondant au FT circulant) favorisait significativement la migration et la différenciation des cellules endothéliales, mais sans effet sur la prolifération cellulaire endothéliale (He Y 2008). L'importance des Mps associées au FT est encore discutée. En effet, des résultats contradictoires ont parfois été obtenus. Ainsi, une première expérience in vitro (Breimo ES 2005) a étudié l'expression du FT dans le sang total stimulé par un lipopolysaccharide (LPS), avec ou sans addition de phorbolmyristylacétate (PMA) qui est un activateur direct des PKC mais pas un agoniste physiologique. L’équipe a montré que les inducteurs des Mps riches en FT différaient de ceux des cellules sanguines exprimant le FT. En effet, si le LPS peut induire l'expression du FT sur les plaquettes et les monocytes, une combinaison de LPS et de PMA a été nécessaire pour induire la formation de microparticules portant le FT. Ces résultats sur sang total sont en faveur d’une séparation entre 1) expression du FT induit par le LPS et 2) processus de microvésiculation directement dépendant de la PKC. A l’inverse, dans un modèle in vivo, Gross et al en 2005 ont montré que l’accumulation rapide de FT dans un thrombus correspond à l’accumulation de Mps (Gross PL 2005). Effectivement, de nombreuses études cliniques ont montré que les taux de FT circulant sous forme de Mps sont augmentés dans diverses pathologies, notamment les maladies cardio- vasculaires, la septicémie, le diabète, et le cancer (Aras O 2004; Hron G 2007; Misumi K 1998; Nieuwland R 2000). Dans ces travaux, les patients atteints d’une forme disséminée de cancer du sein et du pancréas avaient des niveaux d'activité des Mps associées au FT

68

significativement plus élevés que ceux de patients non métastatiques (Tesselaar ME 2007). Ceci suggère que les Mps liées au FT contribuent positivement à la thrombose chez ces patients. Par conséquent, l’inhibition pharmacologique de la libération des MPS-FT pourrait offrir une nouvelle cible thérapeutique dans le but de réduire le risque thrombotique.

dans le but de réduire le risque thrombotique. D’aprèsD’après HugelHugel B,B, 20052005 Figure 21 :

D’aprèsD’après HugelHugel B,B, 20052005

Figure 21 : microparticule cellulaire. Les microparticules membranaires (Mps) sont libérées dans le plasma par les membranes des cellules stimulées. Elles comprennent de la membrane cellulaire et des protéines cytoplasmiques, ainsi que les lipides bioactifs impliqués dans une grande variété de processus fondamentaux (Hugel B 2005).

5. Régulation de l’expression du FT par les inducteurs variables

a. Régulation positive En condition physiologique et en dehors des organes richement vascularisés, le FT est peu exprimé dans les cellules au repos. L’expression monocytaire du FT est induite par de nombreux agents stimulants :

complexes immuns, fragments activés du complément, cytokines pro-inflammatoires (IL1α et β, TNFα, IL-8, IL-6) (Carlsen E 1988; Conkling PR 1988; Herbert JM 1992; Neumann FJ 1997; Osnes LT 1996; Osterud B 1984). L’INFγ peut induire une synthèse de FT dans les macrophages, mais ne serait qu’un co-stimulateur du monocyte (Miserez R 1992; Scheibenbogen C 1992). De nombreux métabolites lipidiques sont aussi capables d’induire la

69

synthèse de FT. Ainsi, le cholestérol libre ou estérifié, les VLDL ou les LDL peuvent induire une activité procoagulante monocytaire in vitro (Lesnik P 1992). L’hypoxie ou l’acidose peuvent induire l’expression du FT dans les cellules mononucléées de tissus pulmonaires murins (Lawson CA 1997). L’endotoxine bactérienne (LPS) des bacilles Gram négatif reste le plus puissant inducteur direct de l’activité FT (Oeth P 1997; Prydz H 1978). En condition normale, le FT n’est pas exprimé par l’endothélium à l’état basal (Drake TA 1989) mais peut être induit in vitro par différents stimulateurs : TNF-α, LPS, IL-1β, CRP, et histamine (Cirillo P 2005; Eto M 2005; Steffel J 2005; Wu SQ 2005). Le TNFα et l’IL-1β induisent la synthèse de FT tout en diminuant l’activité de la thrombomoduline (Archipoff G 1991; Bevilacqua MP 1986). D’autres molécules comme l’hémoglobine libre ou la fibrine seraient capables d’augmenter l’expression du FT par la cellule endothéliale préalablement stimulée par l’endotoxine, et pourraient ainsi avoir un effet d’amplification de la coagulation dans certaines pathologies comme le sepsis ou l’athérosclérose (Contrino J 1997; Roth RI 1994). L’apoptose des cellules endothéliales ne modifie pas la synthèse de FT mais favorise le démasquage du FT encrypté au niveau des cavéoles, petites micro-invaginations membranaires, et sa dissémination sanguine par libération de microvésicules membranaires (Eilertsen KE 2004). In vivo, l’induction de la synthèse de FT dans les cellules endothéliales reste sujette à controverse. Quelques publications ont rapporté la présence de FT dans l’endothélium, notamment dans un modèle simiesque de sepsis à Escherichia coli ((Lupu C 2005) et chez des patients atteints de drépanocytose (Shet AS 2003). Cette dernière équipe soutient que la drépanocytose serait une sorte d’état inflammatoire impliquant l’« activation pathologique » du FT par les cellules endothéliales et les monocytes. Or, il a été rapporté qu’il existait bien une régulation positive de l’expression de FT par les acteurs de la coagulation : FXa et FIIa dans les modèles monocytaires et endothéliaux (Akahane K 2001; Jiang R 2010; Liu Y 2004). Récemment, notre équipe a confirmé sur un modèle de monocyte élutrié que le FXa induisait l’expression de FT, et que l’AT inhibait cet effet (Ben Hadj Khalifa SH, N. Almawi, WY. Lakbakbi,S.Mace,C.Cornillet-Lefebvre,P .Mahjoub,T and Nguyen,P. 2011). Il a été montré que cellules endothéliales et monocytes expriment un FT pleinement fonctionnel, procoagulant, suite à l’activation par de nombreux agonistes, notamment le LPS

(Poitevin S 2007) (Colucci M 1983; Semeraro N 1983) et le TNFα (Bevilacqua MP 1986;

Le TNFα induit l’expression de protéines procoagulantes (comme le FT)

Conkling PR 1988).

dans les cellules cardiovasculaires (Kirchhofer D 1994; Salom RN 1998; Schecter AD 2000). Il pourrait jouer un rôle dans l’expression du FT au sein de cultures de cellules endothéliales

70

(Liu Y 2004; Speiser W 2001) et dans l’angiogenèse (Naldini A 2005). Le VEGF induit à lui seul une augmentation modérée de l’expression de FT dans les HUVECs, expression considérablement améliorée par la stimulation par le TNFα (Camera M 1999; Clauss M 1996). Par ailleurs, des niveaux élevés de TNFα dans le plasma sont associés à un FT protéique sanguin augmenté (Furumoto T 2002). Enfin, il a récemment été mis en évidence que les progeniteurs endothéliaux issus de cellules mononucléées du sang périphérique pouvaient exprimer le FT en réponse au TNF-α (Di Stefano R 2009). Au total, on peut conclure que la stimulation par le TNF-α induit l’expression du FT dans un certain nombre de types cellulaires où il n’est pas, par ailleurs, exprimé de manière constitutive dans le cadre de la lutte contre une hypercoagulabilité pathologique.

b. Régulation négative Les cytokines pro-inflammatoires comme l’IL-4, l’IL-13, l’IL-10 et le TGFβ sont des inhibiteurs de l’expression et de l’activité procoagulante monocytaire du FT (Ernofsson M 1996; Kamimura M 2005; Osnes LT 1996; Poitevin S 2007). Dans certains modèles, l’IL10 a un effet inhibiteur nettement supérieur à celui de l’IL- 4 et de l’IL-13 (Ernofsson M 1996). Les acides gras polyinsaturés impliqués dans la protection contre l’athérome sont capables d’inhiber l’expression du FT monocytaire in vitro (Norris LA 2006). Cet effet inhibiteur pourrait être de mécanisme indirect via l’inhibition des cytokines pro inflammatoires, du TNF-α, de l’IL-1 (Chu AJ 1999) et du thromboxane A2 (Sanigorski AJ 1994). Alors que la vitamine E et ses dérivés inhibent l’expression du FT (Ferro D 1999; Luyendyk JP 2007), la vitamine A semble également capable de cette inhibition mais cela n’a jusqu’à présent été démontré que dans un modèle murin (Austenaa LM). Parmi les anticoagulants physiologiques, la protéine C activée (PCa) inhibe également le FT et son activité procoagulante, via la production d’IL-10 (Toltl LJ 2008).

71

2. TRAVAUX

1. OBJECTIF du TRAVAIL

Les cellules endothéliales progénitrices sont des candidats potentiels en thérapie cellulaire dans la réparation vasculaire. Dans ce contexte, il nous est apparu important d’évaluer le potentiel procoagulant de ces cellules progénitrices endothéliales, notamment en termes de capacité d’expression du FT. Le FT joue un rôle dans l’angiogenèse. L’objectif du travail est donc d’analyser le FT au cours de la différenciation endothéliale et d’autres part, d’évaluer la capacité pour ce FT de modifier les propriétés biologiques et notamment, les fonctions angiogéniques des progéniteurs endothéliaux. Par ailleurs, nous avons également voulu évaluer si le FT était impliqué dans les fonctions angiogéniques de ces progéniteurs endothéliaux. Enfin, nous avons analysé la stabilité génétique de ces progéniteurs endothéliaux en

culture.

Cette approche fondamentale s’intègre dans un programme de thérapie cellulaire utilisant des cellules hématopoïétiques circulantes ou médullaires dans la revascularisation chez des patients atteints d’artériopathies des membres inférieures. Lors d’une première étude réalisée chez 40 patients, nous avons pu démontrer la bonne tolérance des produits de thérapie cellulaire, qu’ils soient d’origine sanguine ou médullaire. Néanmoins un patient traité a présenté une thrombose veineuse dans le territoire d’injection, nous suggérant d’évaluer le potentiel pro-thrombotique de ce type de produit cellulaire incluant les cellules progénitrices endothéliales. Nos données expérimentales seront comparées aux résultats de l’analyse biologique des produits de thérapie cellulaire utilisés dans cette étude (Abstract soumis à l’ASH 2011, Annexe 1bis).

72

2. ECFCs, FT et inflammation A. Article publié

1. Résumé

Cette étude a été réalisée afin, 1/ d’évaluer la capacité des cellules endothéliales formant des colonies (ECFCs), à exprimer le FT, à l’état de base et dans des conditions pro- inflammatoires (stimulation par la cytokine TNF-α), 2/ d’examiner l’effet de l’interaction du complexe FT/FVIIa sur les propriétés fonctionnelles des ECFCs in vitro. Nous avons analysé deux types d’ECFCs issues soit de sang de cordon (cb), soit de sang périphérique adulte (ab). Différentes méthodes d’études du FT ont été utilisées, et les propriétés fonctionnelles des ECFCs ont été analysées in vitro par les tests suivants : RT- PCR, cryométrie de flux, western blot et par test de génération de thrombine. Les propriétés «non pro-coagulantes» (angiogéniques) du FT dans les ECFCs ont été étudiées in vitro en utilisant des tests de : 1/ cicatrisation ou méthode de wound healing, 2/ prolifération cellulaire, 3/ formation de tubes en Matrigel® et 4/ des tests à base de sphéroïdes. Les ECFCs expriment le FT en réponse au TNF-α. L’augmentation du FT en réponse au TNF-α confère aux ECFCs une importante activité de génération de thrombine, dépendante du FVIIa. Les ab-ECFCs ont un niveau plus élevé d’expression et d’activité du FT constitutif par rapport aux cb-ECFCs, mais il existe une très grande hétérogénéité entre les différents donneurs. L’interaction FT/FVIIa ne modifie pas les propriétés « non pro-coagulantes » des ECFCs, qu’elles soient stimulées ou non par le TNF-α. Les conditions inflammatoires aboutissent à une expression notable du FT dans les ECFCs. Cette expression de FT confère aux ECFCs une forte capacité à générer de la thrombine mais ne modifie pas les propriétés «non pro-coagulantes». Ces résultats suggèrent que la thérapie cellulaire basée sur les ECFCs peut être associée à un risque thrombotique.

2. Article

Tissue factor up-regulation in pro-inflammatory conditions confers thrombin generation capacity to endothelial colony-forming cells without influencing non-coagulant properties in vitro. Cuccuini W, Poitevin S, Poitevin G, Dignat-George F, Cornillet-Lefebvre P, Sabatier F, Nguyen P. J Thromb Haemost. 2010 Sep;8(9):2042-5

73

Journal of Thrombosis and Haemostasis, 8: 2042–2052

DOI: 10.1111/j.1538-7836.2010.03936.x

ORIGINAL ARTICLE

ORIGINAL ARTICLE

Tissue factor up-regulation in proinflammatory conditions confers thrombin generation capacity to endothelial colony-forming cells without influencing non-coagulant properties in vitro

W.

CUCC UINI,* 1 S. P O I T E V I N , t 1 G. POITEVIN,* F. DIGNAT-GEORGE,t P. CORNILLET-LEFEBVRE,*

F.

S A B AT I ER t H

and P.

N G U Y E N*

*Laboratoire d'He´matologie, CHU Robert Debre´ and EA-3801, Faculte´ de Me´decine, IFR-53 ‘‘Interactions Cellules MicroEnvironnement’’, Universite´ de Reims Champagne-Ardenne, Reims; t INSERM UMR-S 608, Universite´ de la Me´diterrane´e, UFR Pharmacie, Marseille; and HLaboratoire de Culture et The´ rapie Cellulaire, CIC BT510 Hoˆ pital Conception, Assistance Publique Hoˆ pitaux de Marseille, France

To cite this article: Cuccuini W, Poitevin S, Poitevin G, Dignat-George F, Cornillet-Lefebvre P, Sabatier F, Nguyen P. Tissue factor up-regulation in proinflammatory conditions confers thrombin generation capacity to endothelial colony-forming cells without influencing non-coagulant properties in vitro. J Thromb Haemost 2010; 8: 2042–52.

Summary. Background: Endothelial progenitor cells (EPC) are good candidates for cell-based therapy in cardiovascular diseases. However, concerns have been raised about the potential risks of EPC-based cell therapy, in terms of thromb- ogenicity particularly in inflammatory conditions, currently observed in such patients. Tissue factor (TF) can trigger coagulation and may support thrombogenicity. TF is also a key receptor in angiogenesis. Objective: The present study was designed to (i) evaluate the capacity of resting and tumour necrosis factor-alpha (TNF)-a-stimulated late-outgrowth endo- thelial colony-forming cells (ECFCs) to express TF and (ii) investigate the effect of TF/FVII(a) interaction on procoagulant and non-procoagulant activities of ECFCs in vitro. Methods:

ECFCs from cord blood (cb) and adult peripheral blood (ab) were analyzed for TF expression and activity using reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), flow cytometry, Western blot and a thrombin generation assay. Non-procoagulant properties of TF-expressing ECFCs were investigated in vitro using wound-healing, cell proliferation, tube formation and spheroid-based assays. Results: ECFCs expressed TF in response to TNF-a. The up-regulation of TF conferred to ECFCs a FVII(a)-dependent thrombin generation activity. Compared with cb-ECFC, ab-ECFCs can display a higher level of constitutive TF expression and activity, with a notable heterogeneity among donors. TF/FVIIa interaction did not modify non-procoagulant properties of TNF-a stimulated

Correspondence: Philippe Nguyen, Laboratoire d'Hematologie, Hopital Robert Debre, Avenue du General Koenig, 51092 Reims Cedex, France. Tel.: +33 326783871; fax: +33 326788171. E-mail: pnguyen@chu-reims.fr

1 These authors contributed equally to the work.

Received 7 July 2009, accepted 24 May 2010

cb-ECFCs in vitro. Conclusions: Proinflammatory conditions up-regulate TF expression in ECFCs. This expression confers to ECFCs a strong thrombin generation capacity without influ- encing their non-coagulant properties. Our results suggest that EPC-based cell therapy may be associated with prothrombotic risk which could be limited by inhibiting TF without affecting the proangiogenic capacity of the cells.

Keywords: endothelial progenitor cells, factor VII, thrombin, tissue factor, TNF-a, vasculogenesis.

Introduction

Endothelial progenitor cells (EPC) are defined by their ability to differentiate into cells with an endothelial-like phenotype and facilitate generation of new blood vessels, in areas of ischemia or infarction. Based on convincing preclinical studies and emerging clinical trials, EPC-based cell therapy is becom- ing a promising novel approach in favor of vasculogenesis and tissue repair in cardiovascular diseases. The feasibility of therapeutic angiogenesis by regional implantation of bone marrow-derived mononuclear cells was demonstrated in chronic limb ischemia [1]. Thereafter, intracoronary infusion of EPC have been shown to be effective in patients with acute myocardial infarction [2,3]. However, concerns have been raised about the potential risks of EPC, in terms of thrombosis and restenosis, after coronary stenting [4]. EPC can be obtained from many different sources, including bone marrow, peripheral blood and umbilical cord blood [5]. Detailed characterizations of these cells have resulted in the term EPC encompassing different circulating cell populations referred as 'early' EPCs and late-outgrowth endothelial colony- forming cells (ECFCs) with critical differences in lineage origin and functionality [6]. Early EPC are isolated after short-term culture of circulating mononuclear cells. They display func-

74 © 2010 International Society on Thrombosis and Haemostasis

tional and phenotypic properties of myeloid cells and mainly stimulate angiogenesis through paracrine mechanisms. In contrast, ECFC are isolated after long-term culture. They differentiate from non-hematopoietic immature cells, exhibit specific endothelial features and ability for de novo vessel formation in vivo. As a result of their specific features and well-established vasculogenic capacity, ECFCs have more recently been proposed as candidate cells for therapeutic use in patients with ischemic diseases. Such patients usually present with a chronic inflammatory syndrome secondary to underlying diseases such diabetes or other cardiovascular risk factors. In addition, in situations such as acute coronary syndrome or critical periph- eral ischemia higher levels of inflammatory cytokines are further expected in the vicinity of infused cells for example ischemic muscles or blood [7]. However, the procoagulant activity of ECFCs and its modulation by tumor necrosis factor- alpha (TNF-a) have never been investigated. Assessment of these procoagulant properties may therefore have clinical implications in the definition of ECFCs associated thrombo- genic risk and delineation of possible strategies aimed at preventing adverse effects. Tissue factor (TF), a 47-kDa transmembrane glycoprotein, functions as a high affinity receptor for coagulation factor (F)VII/VIIa that triggers thrombin generation. Besides its role in coagulation, TF is involved in the regulation of angiogenesis [8] and stimulates cell migration in different type of cells using FVIIa-dependent signaling pathways [9,10]. In addition, the alternatively spliced form of TF (asTF) has also been shown to play a role in tumoral angiogenesis [11]. TF is not constitutively expressed by vessel wall endothelial cells but it can be transiently up-regulated in response to various agonists such as inflammatory cytokines or growth factors [12]. The path- ophysiological role of TF expression by endothelial cells in vivo is not completely understood. Recently, Pawlinski et al. [13] showed that the specific deletion of the TF gene in endothelial cells had no effect on coagulation activation in a mouse model of endotexemia. Besides, it possibly contributes to atheroscle- rosis and related thrombotic complications [14,15]. It was recently reported that the myeloid sub-population of EPCs, for example early EPC, could express functionally active TF in response to lipopolysaccharide (LPS) [16]. This prompted us to perform a study to (i) evaluate the capacity of ECFCs derived from cord or peripheral blood to express TF in basal and inflammatory conditions and (ii) investigate the effect of TF/FVII(a) interaction on procoagu- lant and non-procoagulant activities of ECFCs in vitro.

Materials and methods

Isolation and culture of ECFCs from umbilical cord and adult blood

Human umbilical cord blood (cb) and adult peripheral blood (ab) were obtained from healthy donors in compliance with French legislation. Cb- and ab-ECFCs were obtained from

75

TNF-a induces ECFC tissue factor expression 2043

culture of mononuclear cells isolated by density gradient centrifugation as previously described [17–19]. Cells were maintained in endothelial basal medium-2 (EBM-2) supple- mented with EGM-2 SingleQuots (EGM-2/MV medium; Lonza, Verviers, Belgium) and used at passage 3 or 4. Isolation and culture of HUVEC used for control experiments were performed as previously described [17]. Cells were maintained under standard conditions (humidified atmosphere, 5% CO 2 , 37 °C). In stimulation experiments, ECFCs and human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were starved overnight (0.1% FCS), washed in phosphate-buffered saline (PBS) 1· and stimulated with TNF-a (10 ng mL )1 ; Immunotools, Friesoy-

the, Germany) in EBM2/0.1% FCS.

TNF-a (1 0 ng mL )1 ) was chosen according to that usually used in the literature which mimics inflammatory conditions and is consistent with the expected higher amount of inflam- matory factors in ischemic tissues compared with peripheral blood [7].

The concentration of

Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR)

Total mRNA from 2.5 · 10 6 cells was extracted using the RNeasy Mini kit ® (Qiagen, Courtaboeuf, France) and 1 l g of RNA was reversely transcribed into cDNA with the iScript cDNA synthesis Kit ® (Biorad, Marnes-la-Coquette, France) according to the manufacturer's instructions. The following primers and Taqman probes were used: total TF (full-length and alternatively spliced TF, asTF), TNFR-1, TNFR-2 and b2 microglobulin. Primers and MGB-Taqman probes were purchased at Assay-on-demand Product for gene Expression (Applied Biosystems, Courtaboeuf, France):

Hs00175225_m1, Hs01042313_m1, Hs00961748_m1 and Hs00187842_m1. Full-length TF, asTF and GAPDH house- keeping genes were used as described by Szotowki et al. [20]. The PCR reaction mixture was prepared using a TaqMan PCR Master reagent Kit ® (Applied Biosystems, Perkin-Elmer) according to the manufacturer's instructions. Conventional PCR was performed under standard conditions and analyzed on the ABI Prism 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems). Data were acquired and analyzed with the 7000 System SDS software. Results are presented as 'normalized mRNA levels' and classified in three expression levels: low (£ 10), medium (10–100) and high (100) according to Smadja et al. [18]. In some experiments studying full-length TF and asTF (alternatively spliced TF) expression in response to TNF-a, results were normalized using the following formula:

2 (DCt1 -DCt2) corresponding to: DCt1 =

Ct

DCt2 =

Ct target (TNF-alpha) Ct target (control).

target Ct home-gene,

Detection of TF by Western blot and flow cytometry

Western blot was performed using a monoclonal antibody anti-

human TF

directed to amino acid 1–25

in the common

TNF-a induces ECFC tissue factor expression 1

extracellular domain of both full-length and asTF forms (ref. 4509, American Diagnostica, Neuvile-sur-Oise, France) and a b-actin rabbit antibody (Cell Signaling, Ozyme, Saint Quentin Yvelines, France) as described in detail in the Supplementary Material. For membrane-bound TF determination by flow cytometry,

an indirect labeling method was used. Cells (1.10 5 in 100 l L of

PBS/0.1% BSA) were labeled at 4 °C for 45 min with 50 l L

of

monoclonal Ab against human TF (n ° 4503; American Diagnostica) or isotype-matched mouse IgG 1 (Beckman Coul-

ter, Miami FL, USA), each at 20 l g mL )1 . ECFCs were washed

in PBS/0.1% bovine serum albumin (BSA) then incubated for 30 min with a secondary antibody anti-mouse Fab phycoery- thrin (PE)-conjugated (Beckman Coulter). After two washings,

samples were analyzed on a Gallios TM flow cytometer (Beck- man Coulter). Data were analyzed using Kaluza TM software.

Fluorogenic measurement of thrombin generation

A thrombin generation assay was performed as previously

described [21] in platelet-free plasma (PFP), in the absence of synthetic anionic phospholipids. PFP was prepared as

described in detail in the Supplementary Material. In some experiments, thrombin generation was performed in the

presence of a specific antibody blocking the coagulant activity

of TF (ref. 4509, American Diagnostica) or in FVII-deficient

plasma (Stago Diagnostica, France). The assay was performed

using 15 l L of cell suspension (1.10 4 cells) and 80 l L of thawed PFP. Lag time (LT, min), thrombin peak (nmol L )1 ) and

endogenous thrombin potential (ETP, nmol

mean values calculated from the replicates using the Throm-

binoscope TM software

lands). The rate index of the propagation phase of thrombin

generation (Rmax, nmol L )1 min )1 ) was calculated according

to the following formula: peak/(time to peak–lag time). This

parameter represents the mean rate of thrombin generation during the propagation phase.

(Synapse BV, Maastricht, The Nether-

L )1 min) were the

Analysis of cb-ECFCs migration and proliferation

Cb-ECFCs were primed by TNF-a for 5 h, washed with PBS

then incubated with 0.1, 1 and 10 nmol

FVIIa (Novo Nordisk, Paris La Defense, France), in the absence of TNF-a. Cell migration and proliferation were determined as described in detail in the Supplementary Mate- rial. Briefly, cb-ECFCs migration was determined by a wound healing assay and results were expressed as the percentage of wound repair from the area of the original wound after 4 and 6 h of incubation. For inhibition experiments, cells were incubated for 30 min with anti-TF antibodies (clones B5C3 and B4C9, kindly provided by Philippe Poncelet (Biocytex, Marseille, France), or isotype-matched control antibodies. The blockade was done before the addition of FVIIa. The proliferation level was assayed by 5-bromo-2'-deoxy- uridine (BrdU) incorporation into cellular DNA using the BrdU Labeling and Detection Kit III from Roche Corpora-

L ) 1 of recombinant

76

tion. Results were expressed as a percentage of the absorbance obtained with non-stimulated cells considered as 100%.

Analysis of cb-ECFCs vasculogenic properties in vitro

Cb-ECFCs were primed by TNF-a for 5 h, washed with PBS

recombinant FVIIa, in the

absence of TNF-a. Capillary-like tube formation was evaluated in a Matrigel ® (BD Biosciences, Le Pont de Claix, France) matrix as described in detail in the Supplementary Material. The network of the capillary tubes was evaluated after 4 to 6 h on Matrigel ® and was quantified by the ImageJ software and Neuron-J plug-in tool. Spheroid-based vasculogenesis assay was performed using ECFC spheroids of a defined cell number generated as described previously [22,23]. In vitro vasculogenesis was quantified by taking micrographs at 200 · magnification (Olympus inverted microscope) and measuring the number and the cumulative length of all sprouts grown out of each spheroid using ImageJ software analyzing at least 10 spheroids per group.

then incubated with 10 nmol L )1 of

Statistical analysis

Data were expressed as mean ± SEM or box plots of the indicated number of experiments. Statistical analysis was performed with Prism software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Significant differences were determined using non-parametric tests (Mann–Whitney or Wilcoxon's paired test). A P-value of < 0.05 was considered as significant.

Results

Characterization of ECFCs

Cb-ECFCs and ab-ECFCs, analyzed by flow cytometry, strongly expressed the hematopoietic stem cell marker CD34 and the endothelial markers VEGFR-2/KDR, CD144 and CD146. Cells were negative for CD45 (pan-leukocyte marker) and CD14 (monocytic marker) (Supplemental Fig. S1). ECFCs spontaneously organized into tubular-like structures

(Supplemental Fig. S2). These data are consistent with previ- ously reported features of ECFC that distinguish them from early EPC and mature endothelial cells [17–19]. As our objective was to analyze the expression of TF in inflammatory conditions, we also evaluated the expression of TNF receptors TNF-R1 and TNF-R2. ECFCs from both origins constitutively expressed membrane TNF receptors. Ab- ECFCs expressed TNFR-1 and TNFR-2 mRNA at a similar and high level. Cb-ECFCs expressed both TNF receptors but at medium levels. The TNFR-1 expression was significantly

lower in cb-ECFCs

than in ab-ECFCs (Supplemental Fig. S3).

TNF-a up-regulates TF mRNA expression in ECFCs

In resting conditions, total TF mRNA

low levels in cb-ECFCs whereas it was expressed at high levels

was expressed at very

TNF-a induces ECFC tissue factor expression 1

in ab-ECFCs. This difference was significant between the two types of ECFC (Fig. 1A). TNF-a induced a dramatic increase in total TF mRNA in cb-ECFCs at 1 and 5 h compared with

unstimulated cells (Fig. 1 B).

TNF-a was less pronounced in ab-ECFCs. As endothelial cells

express not only full-length TF but also an alternatively spliced TF form [24], the kinetics of both TF forms were examined in cb- ECFCs. At 10 min of TNF-a stimulation, full-length TF and asTF mRNA were increased in cb-ECFCs compared with control cells (Fig. 1C). The maximum mRNA levels for full-

TNF-a

stimulation. Full-length TF mRNA levels decreased slightly () 22%) at 180 min whereas the decrease of asTF mRNA was more pronounced () 63%). We next compared peak levels (1 h) of full-length TF and asTF mRNA in both types of ECFC. In cb-ECFCs and ab-ECFCs, full-length TF mRNA was signif- icantly increased to similar levels after TNF-a stimulation (Fig. 1D). AsTF was also up-regulated to similar levels by TNF- a in both types of ECFC. Full-length TF levels were higher than asTF levels in both types of ECFC in response to TNF-a (18- fold and 28-fold, respectively, for cb-ECFCs and ab-ECFCs). Altogether, these data indicate that, compared with cb- ECFCs, ab-ECFCs express high levels of TF mRNA in basal conditions and that full-length TF mRNA is the main form expressed by both ECFC types in inflammatory condition.

length TF and asTF

Induction of total TF mRNA by

were reached 60 min after

TNF-a up-regulates the expression of the full-length TF protein in ECFCs

Western blot analysis revealed that cb-ECFCs and ab-ECFCs expressed high levels of full-length TF after TNF-a stimulation,

in comparison with untreated cells. A significant amount of full-length TF could be detected in some non-stimulated ab- ECFCs (Fig. 2A). In ECFCs, asTF was not detected in both resting and stimulating conditions. Membrane-bound TF expression, assessed by flow cytom- etry, was upregulated on ECFCs after a 5 h-TNF-a stimula- tion, with similar TF levels on stimulated-cb-ECFCs and -ab- ECFCs as well as on HUVECs (used as positive controls) (Fig. 2B,C). However, whereas expression of TF was not detected in resting cb-ECFCs, a constitutive membrane expression of TF could be detected in some ab-ECFCs as shown by the shift of fluorescence signal after TF labeling compared with control IgG labeling (Fig. 2B upper left). Quantification of membrane-bound TF indicated that the mean value of the basal protein level tended to be higher in ab than in cb-ECFC (Fig. 2C) although statistical significance was not reached. Altogether, these data indicate that ab-ECFCs may display higher constitutive levels of TF protein, with heterogeneity among donors, compared with cb-ECFCs. TNF-a induces TF membrane expression at a similar high level in both cell types.

TNF-a increases TF/FVII dependent thrombin generation by ECFC

To investigate whether TF expressed by ECFCs was func- tional, we determined the time course of thrombin generation in a calibrated fluorogenic assay. As shown in Fig. 3, the kinetics of thrombin generation was clearly modified after TNF-a stimulation. Indeed, a significant decrease of the lag time and an increase of the thrombin peak, and of the ETP

cb-ECFC A C asTF Total TF 1000 1000 ** Full length TF Control TNF-α ersus
cb-ECFC
A
C
asTF
Total TF
1000
1000
**
Full length TF
Control
TNF-α
ersus (log)
100
v
100
min
10
induction
10
1
80
control
B
D
10
300
250
ld
200
o
1
F
cb-ECFC
ab-ECFC
0
30
60
90
120
150
1
150
Time (min)
100
Control 1 h
TNF-α
1 h
Full length TF
50
Control 5 h
TNF-α
5 h
10 000
*
* *
0
cb-ECFC TF
ab-ECFC TF
1 h
1 h
1 h
1 h
Find induction versus
control 1 h
Normalized mRNA
levels (log)

(total)

(total)

cb-ECFC

ab-ECFC

Fig. 1. Expression of tissue factor (TF) mRNA in endothelial colony-forming cells (ECFCs) obtained from cord blood and adult blood. (A) Constitutive mRNA expression of total TF in ECFCs. (B) Effect of tumor necrosis factor-alpha (TNF-a) (10 ng mL )1 ) on total TF mRNA expression at 1 and 5 h. Results are expressed in comparison to non-stimulated cells (control) at 1 h. (C) Kinetics of full-length TF and asTF mRNA expression in TNF-a- stimulated cord blood (cb)-ECFCs. Cells were incubated in the presence of vehicle (control) or TNF-a 10 ng mL ) 1 for 10, 40, 60 or 180 min. Results are expressed in comparison to non-stimulated cells (control), at 10 min. (D) Normalized expression of full-length TF and the alternatively spliced form of TF (asTF) mRNA in cb-ECFCs and adult peripheral blood (ab)-ECFCs in non-stimulated cells (control) and TNF-a-stimulated at 1 h. Results are given as mean ± 1 SEM of at least 3 to 5 independent experiments. NS, not significant; *P < 0.05, **P < 0.01.

77

TNF-a induces ECFC tissue factor expression 1

55

43

34

A

kDa

kDa

kDa

B

cb-ECFC ab-ECFC (A) ab-ECFC (B) 55 Full-length TF 43 34 asTF β-actin 50 ab-ECFC (A)
cb-ECFC
ab-ECFC (A) ab-ECFC (B)
55
Full-length TF
43
34
asTF
β-actin
50
ab-ECFC (A)
25
ab-ECFC (B)
40
20
30
15
20
10
10
5
lgG control
0
0
10 0
10 1
10 2
10 3
10 0
10 1
10 2
10 3
40
Non stimulated
cb-ECFC
HUVEC
30
30
TNF-α
20
20
10
10
0
0
10 0
10 1
10 2
10 3
10 0
10 1
10 2
10 3

Tissue factor

C

100 P = 0.057 * 10 1 Membrane bound (MFI
100
P = 0.057
*
10
1
Membrane bound
(MFI

cb-ECFC (n = 4)

ab-ECFC (n = 4)

HUVEC (n = 3)

Non stimulated

TNF-α 10 ng mL 1

kDa

kDa

kDa

Fig. 2. Full-length tissue factor (TF) protein expression in tumor necrosis factor-alpha (TNF-a)-stimulated endothelial colony-forming cells (ECFCs) and human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Cells were incubated for 5 h in the presence of vehicle (control) or TNF-a 10 ng mL )1 . (A) Western blot analysis of ECFC lysates detected with a monoclonal antibody directed against TF. To confirm equal protein loading, membranes were reprobed with a b- actin rabbit antibody. (B) Representatives histograms of TF expressed at the surface of ECFCs and HUVECs determined by flow cytometry. (C) Membrane-bound TF is expressed as described in the Material and methods. Results are given as mean ± 1 SEM of independent experiments (n = 3 to 4). *P < 0.05.

were observed in TNF-a stimulating cb- and ab-ECFCs compared with controls (Table 1). Consistent with TF mRNA and protein analysis, thrombin generation triggered by non-stimulated cells occurred more rapidly with ab-ECFCs in comparison to cb-ECFCs. Throm- bin generation parameters (Table 1) indicated that mean lag time tended to be reduced and mean peak and rate index tended to be increased with control ab- vs. cb- ECFC. This difference did not reach statistical significance as a result of the wide heterogeneity of values among donors as illustrated in the thrombin generation curves from donor A and B (Fig. 3B). The involvement of TF in thrombin generation associated with ECFCs was next analyzed in the presence of a specific TF

78

blocking antibody and in FVII-deficient plasma. In these conditions, the velocity of thrombin generation triggered by TNF-a-stimulated cb-ECFCs was significantly reduced, as shown by prolongation of the lag time (Fig. 4A). The thrombin peak, the ETP and the rate index were also altered by the TF antibody and in FVII-deficient plasma (Fig. 4B–D). Similar results were obtained with ab-ECFCs used in conditions described above (data not shown). It was also noted that thrombin generation triggered by non-stimulated cells was delayed in the presence of TF antibody or in FVII-deficient plasma. Of note inhibition of thrombin generation by FVII deficiency was more complete than that of TF blocking antibody. This observation is consistent with previous reports on other models [25] and indicates that the residual TF/FVII

TNF-a induces ECFC tissue factor expression 1

Thrombin (nmol

A cb-ECFC 0 cell Control TNF-α 0 10 20 30 40 50 60 Thrombin (nmol
A
cb-ECFC
0 cell
Control
TNF-α
0
10
20
30
40
50
60
Thrombin (nmol
 

Time (min)

B

ab-ECFC

120

Control Donor A TNF-α Control Donor B TNF-α
Control
Donor A
TNF-α
Control
Donor B
TNF-α

100

80

60

40

20

0 0

10

20

30

40

50

properties related to their vascular repair potential, we evaluated the effect of FVIIa binding on TF expressing cb-ECFCs migration, proliferation and vasculogenic activity in vitro. When cb-ECFCs were pre-stimulated by TNF-a for 5 h, no significant modification of cell migration was observed com- pared with control cells using a wound healing assay (supple- mental Fig. S4). In the presence of FVIIa 10 nmol L )1 (Fig. 5A), the migratory activity of control ECFCs was not altered. In contrast, FVIIa caused a significant reduction in 6- h-migratory activity of ECFCs pre-stimulated by TNF-a. This effect was not observed with lower concentrations of FVIIa (0.1 and 1 nmol L )1 , data not shown). In the presence of FVIIa and neutralizing anti-TF antibodies, the migratory capacity of TNF-a pre-stimulated cb-ECFCs was restored, indicating the involvement of the TF/FVIIa interaction (Fig. 5B). In the absence of FVIIa, a significant decrease in cell proliferation was observed with cb-ECFCs primed by TNF-a, in comparison with control cells (Table 2). FVIIa 10 nmol L ) 1 had no significant effect on cb-ECFC proliferation both in resting and TNF-a priming conditions. Similar results were observed when FVIIa 0.1 and 1 nmol L ) 1 were used (data not shown). We verified that cell viability of ECFC was not affected by TNF-a stimulation for 5 h (Supplemental Fig. S5).

60 ECFCs were constitutively able to form pseudo-tubes in an

Time (min)

Fig. 3. Effect of tumor necrosis factor-alpha (TNF-a) on thrombin

generation supported by endothelial colony-forming cells (ECFCs). Cells were incubated for 5 h in the presence of vehicle (control) or TNF-a

10 ng mL )1 . Thrombin was measured

(cb)-ECFCs (A) or adult peripheral blood (ab)-ECFCs (B). Endogenous thrombin potential (ETP) curves (thrombograms) were obtained from three replicates for each condition and are representative of four inde-

pendent experiments. Thrombograms obtained with ECFCs expanded from two adult donors are shown.

in the presence of cord blood

interaction and subsequent FVII activation may occur in the presence of blocking antibody. Taken together, these results indicate that TF expressed by ECFCs is functional and that thrombin generation supported by ECFCs is mainly TF dependent.

in vitro endothelial tube formation assay (Matrigel ® assay). A 5-h pre-stimulation of cb-ECFCs by TNF-a did not modify their ability for pseudo-tube formation compared with untreated cells (Fig. 6A and Table 2). As observed for cb-

EPC proliferation, FVIIa

tube formation by cb-ECFC in both resting and TNF-a priming conditions (Table 2). Similar results were observed using spheroid-based vasculogenic assays. Sprout formation by ECFCs was not significantly modified in response to FVIIa in both control and TNF-a primed cb-ECFC. As expected, sprout formation was dramatically enhanced by vascular endothelial growth factor (VEGF) used as a positive control (Fig. 6B and Table 2). These data indicate that, in inflammatory conditions induc-

(10 nmol L )1 ) did not affect pseudo-

ing TF expression by ECFC, the TF/FVII interaction slightly impairs ECFCs migration but did not impact on their proliferation and vasculogenic capacity in vitro.

TF/VIIa interaction does not modify non-procoagulant properties of TNF-a stimulated ECFCs in vitro

To analyze whether TF expression by ECFCs could, besides conferring procoagulant activity, impact on other functional

Discussion

The study evidences for the first time that ECFCs express high levels of TF in response to TNF-a. Up regulation of TF confers

Table 1 Parameters of thrombin generation triggered by tumor necrosis factor-alpha (TNF-a) or non-stimulated endothelial colony-forming cells (EC- FCs)

 

Lagtime (min)

Peak (nmol L )1 )

Rate index (nmol L ) 1 min )1 )

ETP (nmol L )1 .min)

cb-ECFCs

(mean ± SEM, n = 5)

Control

11.2 ± 1.5

89

± 1 3

11 ±

5

1366 ± 182

 

TNF-a

5.4

± 0.8*

117

± 26

18

± 6

1624

± 292

ab-ECFCs (mean ± SEM, n = 4)

Control

8.8

± 3

101

± 36

16

± 8

1304

± 223

TNF-a

5.2 ± 0.4*

110 ± 25

16 ±

5

1629 ± 159

TNF-a induces ECFC tissue factor expression 1

Lagtime

* 25 20 15 * 10 5 0 Control IgG1 Ab TF FVII control deficient
*
25
20
15
*
10
5
0
Control
IgG1
Ab TF
FVII
control
deficient
ETP
*
2500
*
2000
1500
1000
500
0
nmol L –1
Thrombin peak 250 * * 200 150 100 50 0 Control IgG1 Ab TF FVII
Thrombin peak
250
*
*
200
150
100
50
0
Control
IgG1
Ab TF
FVII
control
deficient
Rate index
50
*
40
30
20
10
0
nmol L –1
nmol

Control

IgG1

Ab TF

FVII

Control

IgG1

Ab TF

FVII

control

deficient

control

deficient

Fig. 4. Effect of a neutralizing antibody to tissue factor (TF) and of a factor (F)VII-deficient plasma (VII deficient) on thrombin generation. Cord blood (Cb)-endothelial colony-forming cells (ECFCs) were stimulated for 5 h with tumor necrosis factor-alpha (TNF-a) 10 ng mL )1 . Thrombin was measured in normal plasma in the presence of control IgG1 or ab anti TF 10 l g mL )1 . In parallel, thrombin generation was measured using a FVII-deficient plasma. Thrombin generation parameters are expressed as box plots obtained from four independent experiments. *P < 0.05.

factor VII/VIIa-dependent thrombin generation activity to ECFCs whereas it does not significantly modify the non- procoagulant functions of ECFC that may be related to their vascular repair potential. Considering the recognized promises of using endothelial progenitor transplantation in vascular regenerative medicine, the identification of TF as mediator of ECFC-associated thrombogenicity is of relevance to evaluate safety of such a therapy and prevent potential adverse effects. Similar concerns have been raised by various cell-based therapeutic approaches. Reports implicate TF expression by transplanted cells or tissues (like pancreatic islet cells, bone marrow stem cells) in the pathogenesis of graft failure or complications [26,27] that lead to the development of TF antagonists as therapeutic agents limiting thrombotic events and promote graft survival. In the field of EPC-based proangiogenic therapy, we observed in a clinical trial including a series of 40 consecutive patients treated for acute ischaemia of the lower limbs with local injections of autologous cell preparations containing EPC, one deep vein thrombosis (unpublished data, from the group of P. Nguyen, Reims, France). The question of thrombogenicity is therefore clearly raised by this observation. Even although upregulation of TF has been previously described in cultured mature endothelial cells, the specific assessment of TF procoagulant activity and its modulation by TNF-a in isolated ECFC is worth exploring as different studies have pointed out relevant differences between endothelial progenitor cells and mature endothelial cells related to their differentiation state or origin

80

These differences included responses to cytokines or growth factors, proteolytic functions, angiogenic potential and resis- tance to stress conditions [17,28,29]. In addition, engineering procedures aimed at isolated and expanded cells for therapeutic purposes may introduce significant cell perturbations that could impact on TF regulation ex vivo. We observed that ECFCs expanded from cord blood invariably express low basal TF. On the contrary, we noticed a large heterogeneity of ab-ECFCs expanded from healthy subjects in terms of both basal TF expression and activity. Recently, Zhang et al. [30] demonstrated that ab- and cb- ECFCs secreted low but comparable levels of TF in their soluble forms. It is known that soluble TF is mainly associated with microparticles shed during apoptosis and/or endothelial cell activation in vitro [31]. That may explain why these authors have measured low amounts of TF in culture media from both resting cell types. Here, the measurement of mRNA, mem- brane-bound TF and TF activity in a thrombin generation assay allowed us to analyze more accurately differences between non-stimulated cb- and ab-ECFCs. In response to TNF-a, we observed a dramatic increase in TF expression in cb-ECFCs whereas the magnitude of induction was less pronounced in ab-ECFCs. It is unlikely that such a different response to TNF-a relates to differences in expression of TNF receptors as ab-ECFCs expressed high levels of both TNFR-1 and TNFR-2. Our observations are more consistent with the hypothesis that the lower ab-ECFCs response to TNF-a is a consequence of the higher constitutive TF expression. This is in

TNF-a induces ECFC tissue factor expression 1

A

Migration (% of wound repair)

Migration (% of wound repair)
Migration (% of wound repair)
Migration (% of wound repair)
Migration (% of wound repair)

50

40

30

20

10

0

line with a previous report showing a higher constitutive

expression of various pro-inflammatory molecules in ab- ECFCs compared with cb-ECFCs with comparable TNF-a- induced levels [30]. We also evidenced that ECFCs can trigger and support TF-dependent thrombin generation which is dramatically increased after TNF-a exposure. It was previously shown that early EPCs exhibit a procoagulant activity in response to LPS [16] but not in response to TNF-a. These results demonstrate that a response to inflammatory mediators is another aspect of the increasingly recognized differences between early EPC and ECFC. Beside in initiating coagulation, we also investigated whether inflammation-induced upregulation of TF by ECFC could affect non-coagulant functions. Indeed, the TF/FVIIa interaction has been shown to activate multiple signaling pathways facilitating cell migration and angiogenesis

[11,32–34]. This is mostly supported by experiments per- formed using tumor cells constitutively expressing large

P = 0.07 NS amounts of TF or TF gene transfected cells exposed to high

concentrations of FVIIa (10–100 nmol L )1 ). Under our conditions, FVIIa had a minor effect on the non-procoagulant functions of TF expressing ECFC. We observed that

* Control TNF-α priming
*
Control
TNF-α priming
FVIIa (nmol L –1 ) 0 10 0 10 0 10 0 10 4 h
FVIIa
(nmol L –1 )
0
10
0
10
0
10
0
10
4 h
6 h
B
TNF-α priming
40
*
*
**
30
20
10
0
Migration (% of wound repair)

FVIIa

(nmol L

1 )

0

10

10

10

10

 

IgG

Ab TF

Ab TF

control

B5C3

B4C9

Fig. 5. Factor (F)VIIa decreases wound repair potential of cord blood (cb)-endothelial colony-forming cells (ECFCs) after tumor necrosis factor- alpha (TNF-a) stimulation. (A) Cb-ECFC repair capacity was measured in the presence of FVIIa 10 nmol L ) 1 (B) Neutralization of tissue (TF)

restores cb-ECFC repair capacity

after TNF-a stimulation. Cells were incubated with ab anti-TF (clones

in the presence of FVIIa 10 nmol L )1

B5C3 or B4C9) and IgG control at 10 l g mL for 30 min before

addition. Results are expressed as box plots obtained from four (A) and

three (B) independent experiments. NS, not significant, *P < 0.05; **P < 0.01.

)1

10 nmol L ) 1 FVIIa

migration

(0.1 nmol L )1 ) had no effect. In addition, neither ECFC proliferation nor vasculogenic activities in vitro were modified whatever the FVIIa concentration, indicating that the TF/ VIIa interaction may not induce proangiogenic signals in ECFCs. These results are consistent with data from HUVEC models [35]. Discrepancies between ECFC and other cells models can be related to the lower level of membrane-bound TF that may not have reached the threshold required for direct activation of PAR-2 by TF/FVIIa. Alternatively, tissue factor pathway inhibitor (TFPI) 1, expressed by endothelial cells, may interfere with TF-mediated signaling in ECFCs [36,37]. Another hypothesis is that signaling cross-talk

concentration

slightly decreased TF expressing ECFC

the

physiological

whereas

FVIIa between TNF-a, used in our model to mimick inflammatory

conditions, and TF/VII pathways could affect responsiveness of TF expressing ECFC to FVIIa.

Table 2 Factor (F)VIIa had no significant effect on proliferation and vasculogenic potential in vitro of cord blood (cb)-endothelial colony-forming cells (cb-ECFC) primed by tumor necrosis factor-alpha (TNF-a)

Non-stimulated FVIIa (nmol L )1 )

TNF-a priming FVIIa (nmol L )1 )

 

0

10

0

10

Positive control (VEGF 50 ng mL )1 )

Proliferation

 

(%

of non-stimulated cells without FVIIa)

100 ±

3

102 ±

4

71

±

4 **

81

±

4

162 ± 5**

Tube formation assay in Matrigel Length of capillary-like structures (l m) Spheroid-based assay Total length of sprouts/spheroid (arbitrary unit) Nb of sprouts/spheroid

25579 ± 2718

24386 ± 3290

24450 ± 3349

23889 ± 3962

ND

375 ± 63 3.6 ± 0.9

335 ± 29

261 ± 29 3.0 ± 0.4

209 ± 28 2.3 ± 0.4

1335 ± 193** 10.9 ± 0.9***

3.1

± 0.3

TNF-a induces ECFC tissue factor expression 1

A Non-stimulated TNF-α priming FVIIa 0 ×40 ×40 FVIIa 10 nmol L –1 ×40 ×40
A
Non-stimulated
TNF-α priming
FVIIa 0
×40
×40
FVIIa 10
nmol L –1
×40
×40
B
Non-stimulated
Control
FVIIa 10 nmol L –1
VEGF 50 ng mL –1
(positive control)
×200 ×200 ×200 TNF-α priming Control FVIIa 10 nmol L –1 ×200 ×200
×200
×200
×200
TNF-α priming
Control
FVIIa 10 nmol L –1
×200
×200

Fig. 6. Factor (F)VIIa has no effect on vasculogenic potential of cord blood (cb)-endothelial colony-forming cells (ECFCs) regardless of tumor necrosis factor-alpha (TNF-a) stimulation. Cb-ECFC were primed for 5 h with TNF-a then washed. Capillary-like formation (A) and sprouts formation (B) was evaluated, respectively, in Matrigel ® and in spheroid-based assays in the presence of FVIIa. Vascular endothelial growth factor (VEGF) (50 ng mL )1 ) was used as a positive control in the spheroid-based vasculogenesis assay.

Taken together, our data evidenced that the most striking functional consequence of TF upregulation by ECFC occur- ring in inflammatory condition is to confer procoagulant activity. Cell therapies based on ECFC injections may therefore be associated with a potential thrombotic risk. Although a non- significant statistical difference could be established between cb and ab-ECFC, the wide donor related variability in ab-ECFC constitutive TF expression suggested that in some situations, the use of ab-ECFC may be associated to a more pronounced risk. Furthermore, one can speculate that ab-ECFCs obtained from a patient presenting with cardio-vascular disease would express even more TF compared with the ECFCs from healthy donors. Together with known advantages of cb-ECFCs

82

compared with ab-ECFC in terms of clonogenic potential and proliferation rate ex vivo, and ability to support de novo formation of long-lasting vessel in vivo, these data bring arguments in favor of the development of cord blood-derived ECFCs for vascular therapy. In addition, our results indicate that the safety of EPC-based therapy may benefit from peri- treatment strategies aimed to evaluate and diminish the thombotic risk. Such strategies may include the monitoring and the possible modulation of inflammation in candidate patients, TF measurement as a quality control criteria for cells prior to injection, monitoring of coagulation activation in recipients, and implementation of TF targeting peri-transplan- tation treatments.

TNF-a induces ECFC tissue factor expression 1

In conclusion, our study demonstrated that proinflammato- ry conditions up-regulate TF expression in ECFC. Through binding to FVII(a), TF confers elevated thrombin generation capacity without influencing non-procoagulant activity of ECFC. These data may have clinical implications towards optimization of EPC-based cell therapy.

Acknowledgements

We are grateful to P. Poncelet, from Biocytex (Marseille, France), who generously provided the anti-TF antibodies. We thank P. Stellmann, S. Simoncini, E. Tellier and F. Anfosso for their technical assistance and skill. This study received the Institution's Ethics Committee Approval.

Disclosure of Conflict of Interests

The authors state that they have no conflict of interest.

Supporting Information

Additional Supporting Information may be found in the online version of this article:

Data S1. Material and Methods. Fig. S1. Characterization of ECFC obtained from cord blood (A) and from adult blood (B) by flow cytometry as described in the supplementary material. Fig. S2. Characterization of ECFC obtained from cord blood and from adult blood by in vitro endothelial tube formation assay as described in the supplementary material. Fig. S3. Constitutive expression of TNF receptors mRNA in ECFC obtained from cord blood and adult blood. Expression of TNFR-1, TNFR-2 in ECFC was normalized as described in

the Material and Methods. *P

Fig. S4. TNF-a priming did not increase the wound repair potential of cb-ECFC. Cells were non-stimulated (control) or stimulated for 5 h with TNF-a 10 ng mL )1 , washed with PBS then cb-ECFC repair capacity was measured after wounding of monolayers. (A) Representative fields before (T0) and after a 4- and 6-h incubation in EBM2 0.1% FCS. (B) Results are expressed as a percentage of reparation of the original wound area (mean ± SEM, n = 12 from four independent experiments performed in triplicate). *P < 0.05. Fig. S5. Analysis of ECFC viability by flow cytometry. (A) Cells were non-stimulated or TNF-a stimulated for 5h. H 2 O 2 was used as a positive control of cell apoptosis. Cell death was determined by annexin V-FITC/7-AAD binding assay. We identified viable cells as negative for annexin V and 7AAD binding (lower-left quadrant) and two subsets of cells: Annexin V+/7AAD- (early apoptotic cells, lower-right quadrant) and Annexin V+/7AAD+ (late apotototic and necrotic cells, upper-right quadrant). The proportion of viable cells (lower- left quadrant) is done (mean ± SD, from 3 independent experiments).

< 0.05.

83

Please note: Wiley-Blackwell are not responsible for the content or functionality of any supporting materials supplied by the authors. Any queries (other than missing material) should be directed to the corresponding author for the article.

References

1 Tateishi-Yuyama E, Matsubara H, Murohara T, Ikeda U, Shintani S, Masaki H, Amano K, Kishimoto Y, Yoshimoto K, Akashi H, Shimada K, Iwasaka T, Imaizumi T. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone- marrow cells: a pilot study and a randomised controlled trial. Lancet 2002; 360: 427–35.

2 Assmus B, Schachinger V, Teupe C, Britten M, Lehmann R, Dobert N, Grunwald F, Aicher A, Urbich C, Martin H, Hoelzer D, Dimmeler S, Zeiher AM. Transplantation of Progenitor Cells and Regeneration Enhancement in Acute Myocardial Infarction (TOPCARE-AMI). Circulation 2002; 106: 3009–17.

3 Strauer BE, Brehm M, Zeus T, Kostering M, Hernandez A, Sorg RV, Kogler G, Wernet P. Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in

humans. Circulation 2002; 106: 1913–8.

4 Kang HJ, Kim HS, Zhang SY, Park KW, Cho HJ, Koo BK, Kim YJ, Soo Lee D, Sohn DW, Han KS, Oh BH, Lee MM, Park YB. Effects of intracoronary infusion of peripheral blood stem-cells mobilised with granulocyte-colony stimulating factor on left ventricular systolic function and restenosis after coronary stenting in myocardial infarc- tion: the MAGIC cell randomised clinical trial. Lancet 2004; 363: 751–

6.

5 Asahara T, Murohara T, Sullivan A, Silver M, van der Zee R, Li T, Witzenbichler B, Schatteman G, Isner JM. Isolation of putative pro- genitor endothelial cells for angiogenesis. Science 1997; 275: 964–7.

6 Timmermans F, Plum J, Yoder MC, Ingram DA, Vandekerckhove B, Case J. Endothelial progenitor cells: Identity defined? J Cell Mol Med 2009; 13: 87–102.

7 Marfella R, Luongo C, Coppola A, Luongo M, Capodanno P, Rug-

giero R, Mascolo L, Ambrosino I, Sardu C, Boccardi V, Lettieri B, Paolisso G Use of a non-specific immunomodulation therapy as a therapeutic vasculogenesis strategy in no-option critical limb ischemia patients. Atherosclerosis 2010; 208: 473–9.

8 Chen J, Bierhaus A, Schiekofer S, Andrassy M, Chen B, Stern DM, Nawroth PP. Tissue factor–a receptor involved in the control of cel- lular properties, including angiogenesis. Thromb Haemost 2001; 86:

334–45.

9 Marutsuka K, Hatakeyama K, Sato Y, Y amashita A, Sumiyoshi A, Asada Y. Protease-activated receptor 2 (PAR2) mediates vascular smooth muscle cell migration induced by tissue factor/factor VIIa complex. Thromb Res 2002; 107: 271–6.

10 Morris DR, Ding Y, Ricks TK, Gullapalli A, Wolfe BL, Trejo J. Protease-activated receptor-2 is essential for factor VIIa and Xa-in- duced signaling, migration, and invasion of breast cancer cells. Cancer Res 2006; 66: 307–14.

11 van den Berg YW, van den Hengel LG, Myers HR, Ayachi O, Jor- danova E, Ruf W, Spek CA, Reitsma PH, Bogdanov VY, Versteeg HH. Alternatively spliced tissue factor induces angiogenesis through integrin ligation. Proc Natl Acad Sci U S A 2009; 106: 19497–502. 1 2 Speiser W, Kapiotis S, Kopp CW, Simonitsch I, Jilma B, Jansen B, Exner M, Chott A. Effect of intradermal tumor necrosis factor-alpha- induced inflammation on coagulation factors in dermal vessel endo- thelium. An in vivo study of human skin biopsies. Thromb Haemost 2001; 85: 362–7.

13 Pawlinski R, Wang JG, Owens AP III, Williams J, Antoniak S, Tencati M, Luther T, Rowley JW, Low EN, Weyrich AS, Mackman N Hematopoietic and non-hematopoietic cell tissue factor activates the coagulation cascade in endotoxemic mice. Blood 2010; 116: 806–14.

TNF-a induces ECFC tissue factor expression 1

1 4 Kaikita K, Takeya M, Ogawa H, Suefuji H, Yasue H, Takahashi K. Co-localization of tissue factor and tissue factor pathway inhibitor in coronary atherosclerosis. J Pathol 1999; 188: 180–8.

15 Thiruvikraman SV, Roboz J, Wang T, Ma L, Seaman G, Guha A.

Characterization of digoxigenin derivatives of human coagulation factors VIIa and X by electrospray mass spectrometry and enzyme kinetics. Rapid Commun Mass Spectrom 1996; 10: 1 367–70. 1 6 Di Stefano R, Barsotti MC, Armani C, Santoni T, Lorenzet R, Bal- barini A, Celi A. Human peripheral blood endothelial progenitor cells

synthesize and express functionally active tissue factor. Thromb Res 2009; 123: 925–30. 1 7 Basire A, Sabatier F, Ravet S, Lamy E, Mialhe A, Zabouo G, Paul P, Gurewich V, Sampol J, Dignat-George F. High urokinase expression contributes to the angiogenic properties of endothelial cells derived from circulating progenitors. Thromb Haemost 2006; 95: 678–88.

18 Smadja DM, Bieche I, Helley D, Laurendeau I, Simonin G, Muller L,

Aiach M, Gaussem P. Increased VEGFR2 expression during human late endothelial progenitor cells expansion enhances in vitro angio- genesis with up-regulation of integrin alpha(6). J Cell Mol Med 2007; 11: 1149–61. 1 9 Smadja DM, Bieche I, Silvestre JS, Germain S, Cornet A, Laurendeau I, Duong-Van-Huyen JP, Emmerich J, Vidaud M, Aiach M, Gaussem P. Bone morphogenetic proteins 2 and 4 are selectively expressed by late outgrowth endothelial progenitor cells and promote neoangio- genesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2008; 28: 2137–43.

20 Szotowski B, Goldin-Lang P, Antoniak S, Bogdanov VY, Pathirana D, Pauschinger M, Dorner A, Kuehl U, Coupland S, Nemerson Y, Hummel M, Poller W, Hetzer R, Schultheiss HP, Rauch U. Altera- tions in myocardial tissue factor expression and cellular localization in dilated cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol 2005; 45: 1081–9.

21 Poitevin S, Cochery-Nouvellon E, Dupont A, Nguyen P. Monocyte IL-10 produced in response to lipopolysaccharide modulates thrombin generation by inhibiting tissue factor expression and release of active

tissue factor-bound microparticles. Thromb Haemost

607.

2007; 97: 598–

22 Diehl F, Rossig L, Zeiher AM, Dimmeler S, Urbich C. The histone methyltransferase MLL is an upstream regulator of endothelial-cell sprout formation. Blood 2007; 109: 1472–8.

23 Korff T, Augustin HG. Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation. J cell biol 1998; 143: 1341–52.

24 Szotowski B, Antoniak S, Poller W, Schultheiss HP, Rauch U. Procoagulant soluble tissue factor is released from endothelial cells in

response to inflammatory cytokines. Circ Res 2005; 96: 1233–9.

25 Lechner D, Kollars M, Gleiss A, Kyrle PA, Weltermann A. Chemo- therapy-induced thrombin generation via procoagulant endothelial

84

microparticles is independent of tissue factor activity. J Thromb Hae- most 2007; 5: 2445–52.

26 Kojouri K, George JN. Thrombotic microangiopathy following allo- geneic hematopoietic stem cell transplantation. Curr Opin Oncol 2007; 19: 148–54.

27 Moberg L, Johansson H, Lukinius A, Berne C, Foss A, Kallen R, Ostraat O, Salmela K, Tibell A, Tufveson G, Elgue G, Nilsson Ekdahl K, Korsgren O, Nilsson B. Production of tissue factor by pancreatic islet cells as a trigger of detrimental thrombotic reactions in clinical islet transplantation. Lancet 2002; 360: 2039–45.

28 Bompais H, Chagraoui J, Canron X, Crisan M, Liu XH, Anjo A, Tolla-Le Port C, Leboeuf M, Charbord P, Bikfalvi A, Uzan G. Hu- man endothelial cells derived from circulating progenitors display specific functional properties compared with mature vessel wall endothelial cells. Blood 2004; 103: 2577–84.

29 He T, Peterson TE, Holmuhamedov EL, Terzic A, Caplice NM, Oberley LW, Katusic ZS. Human endothelial progenitor cells tolerate oxidative stress due to intrinsically high expression of manganese superoxide dismutase. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2004; 24: 2021–7.

30 Zhang Y, Ingram DA, Murphy MP, Saadatzadeh MR, Mead LE, Prater DN, Rehman J. Release of proinflammatory mediators and expression of proinflammatory adhesion molecules by endothelial progenitor cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2009; 296: H1675–82.

31 Simoncini S, Njock MS, Robert S, Camoin-Jau L, Sampol J, Harle JR, Nguyen C, Dignat-George F, Anfosso F. TRAIL/Apo2L mediates the release of procoagulant endothelial microparticles induced by throm- bin in vitro: a potential mechanism linking inflammation and coagu- lation. Circ Res 2009; 104: 943–51.

32 Kasthuri RS, Taubman MB, Mackman N. Role of tissue factor in cancer. J Clin Oncol 2009; 27: 4834–8.

33 Carmeliet P, Mackman N, Moons L, Luther T, Gressens P, Van Vlaenderen I, Demunck H, Kasper M, Breier G, Evrard P, Muller M, Risau W, Edgington T, Collen D. Role of tissue factor in embryonic blood vessel development. Nature 1996; 383: 73–5.

34 Rao LV, Pendurthi UR. Tissue factor-factor VIIa signaling. Arte- rioscler Thromb Vasc Biol 2005; 25: 47–56.

35 Camerer E, Huang W, Coughlin SR. Tissue factor- and factor X- dependent activation of protease-activated receptor 2 by factor VIIa. Proc Natl Acad Sci U S A 2000; 97: 5255–60.

36 Ahamed J, Belting M, Ruf W. Regulation of tissue factor-induced signaling by endogenous and recombinant tissue factor pathway inhibitor 1. Blood 2005; 105: 2384–91.

37 Provencal M, Michaud M, Beaulieu E, Ratel D, Rivard GE, Gingras D, Beliveau R. Tissue factor pathway inhibitor (TFPI) interferes with endothelial cell migration by inhibition of both the Erk pathway and focal adhesion proteins. Thromb Haemost 2008; 99: 576–85.

c. Données supplémentaires (article)

Données Supplémentaires-Méthode

Characterisation of ECFC by Flow cytometry analysis and in vitro endothelial tube

formation

ECFC expanded from umbilical cord or adult blood were labelled for 25 min at room

temperature

with

the

following

monoclonal

antibodies:

phycoerythrin

(PE)-conjugated

CD144, CD14, CD34 (Immunotech, Marseille, France), CD146 (Biocytex) KDR/VEGFR2,

(R&D

Systems,

Minneapolis,

USA)

TNFR-I

and