Biossegurana Alimentar de Protenas Recombinantes

1. INTRODUO Atualmente, alm da avaliao da biossegurana alimentar de gros GM, maior ateno tem sido dada avaliao da segurana de novas protenas expressas em cultivares de importncia agrcola (PENG et al., 2007; JUBERG et al., 2009; XU et al., 2009). At mesmo indicado que uma avaliao de segurana pr-transformao vegetal deva ser realizada a fim de garantir previamente que o novo OGM expressa uma protena incua. Neste contexto, representantes de instituies pblicas e,

especialmente, das principais instituies privadas responsveis pelo desenvolvimento de plantas GM reuniram-se num comit para o estabelecimento de estratgias voltadas para a avaliao da segurana de protenas recombinantes (Delaney et al., 2008). As anlises e ensaios biolgicos propostos por este comit renem protocolos previamente estabelecidos por rgos competentes em segurana alimentar como o EFSA (European Food Safety Authority), FAO/WHO (Food and Agriculture Organization - Codex Alimentarius Comission), OECD (Organisation for Economic Co-operation and Development), U.S. EPA (Environmental Protection Agency) e o U.S. FDA (Food and Drug Administration). Contudo, esses protocolos foram otimizados em duas etapas de avaliao da segurana de protenas recombinantes, uma envolvendo a identificao de perigo potencial e a outra a partir da caracterizao do perigo. A etapa de identificao de perigo contempla os seguintes pontos: 1. Histrico de uso (History of safe use HOSU); 2. Anlises de bioinformtica; 3. Modo de ao e especificidade da protena; 4. Anlises de digestibilidade in vitro e testes de estabilidade a variaes de pH e temperatura; e, 5. Estimativa segura dos nveis de expresso e de ingesto diettica dos gros transformados. J a etapa de caracterizao do perigo preconiza um estudo caso-acaso para cada protena. No entanto, no caso de protenas incorporadas a plantas (PIPs, Plant-Incorporated Protectants) para conferir proteo, estudos de toxicidade aguda so recomendados e, consequentemente, ditaro a necessidade de outros ensaios toxicolgicos ou de alergenicidade (DELANEY et al., 2008). A aceitao desse sistema de avaliao vem se refletindo no grande nmero de trabalhos utilizando essa proposta (JUBERG et al., 2009; XU et al., 2009) e ser adotado no presente projeto para avaliao da segurana alimentar da entomotoxina mutante Cry8Ka5 de B. thuringienesis. Portanto, o presente projeto firma-se em protocolos reconhecidos pelas principais instituies reguladoras de novos produtos agrobiotecnolgicos, bem como

dos protocolos preconizados pelas instituies reguladoras nacionais, podendo subsidiar e garantir o uso dos produtos recombinantes produzidos no Brasil.

2. METODOLOGIA 2.1.Levantamento do histrico de segurana das protenas Cry Um levantamento bibliogrfico acerca do histrico de uso de protenas cristal de B. thuringiensis na sua forma isolada ou como componente de alimentos ser realizado no intuito de reunir relatos que contribuam para o estudo de segurana da protena Cry em teste. De acordo com Constable et al. (2007), alguns tpicos so imprescindveis para uma pesquisa conclusiva sobre o histrico de uso seguro de um alimento ou derivado alimentcio. Os principais tpicos a serem abordados so: (1) por quanto tempo seres humanos ou animais j estiveram expostos; (2) a forma pela qual o alimento ser processado ou preparado e seus provveis nveis de ingesto; (3) o perigo potencial associado ao consumo; (4) os relatos de exposio animal e humana e suas consequncias. Assim, todos estes pontos sero abordados neste projeto para o estudo com a nova protena Cry.

2.2.Realizao dos estudos in silico 2.2.1. Anlise de homologia na seqncia de aminocidos da entomotoxina Cry8Ka5 com protenas alergnicas, txicas e/ou antinutricionais Uma pesquisa in silico ser conduzida para avaliar o grau similaridade da entomotoxina Cry8Ka5 e da entomotoxina controle Cry1Ac com qualquer protena reconhecidamente alergnica, txica e/ou antinutricional, sendo desconsiderada uma similaridade < 35%, em uma janela de 80 aminocidos. As sequncias de aminocidos da Cry1Ac e da Cry8Ka5 sero comparadas com as seqncias proteicas presentes em seis grandes bases de dados pblicas de referncia: NR, Refseq_Protein, SwissProt, Pat, APO e Env_nr. O algoritmo utilizado ser BLASTP 2.2.18+ e a matriz de pontuao BLOSUM62. Com o mesmo programa de bioinformtica, um estudo ser realizado atravs da comparao de ambas as protenas, cada uma subdividida em blocos de oito de aminocidos, com os eptopos de todos os provveis alrgenos presentes na base de dados Allergen (Hrouet et al., 2005).

2.2.2. Avaliao da presena de stios de N-glicosilao nas entomotoxinas

A sequncia completa de aminocidos de Cry8Ka5 e da entomotoxina controle Cry1Ac sero analisadas quanto presena de stios de N-glicosilao atravs da base de dados NetNGlyc 1.0 Server (http://cn.expasy.org). 2.3.Determinao da digestibilidade in vitro e estabilidade temperatura das entomotoxinas 2.3.1. Digestibilidade in vitro As concentraes das entomotoxinas Cry1Ac e Cry8Ka5 em fluido gstrico simulado (FGS) ou fluido intestinal simulado (FIS) (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, EEUU) sero de 0,25 mg/mL e 0,1 mg/mL para cada protena, respectivamente. A mistura ser incubada a 37 C e as amostras sero retiradas em intervalos de 0 s, 15 s, 30 s, 60 s, 2 min, 5 min, 10 min, 20 min e 30 min. A digestibilidade da protena no FGS e no FIS ser monitorada por SDS-PAGE, como descrito no item B.1.3., e por Western Blot, como ser descrito no item B.2.2. Os mesmos experimentos sero tambm efetuados para um controle positivo, inibidor tripsina de soja (SBTI), e para um controle negativo, albumina srica bovina (BSA) ou casena, em FGS e FIS, conforme descrito por LU et al. (2007).

2.3.2. Determinao de estabilidade temperatura A entomotoxina Cry8Ka5 e a entomotoxina controle Cry1Ac sero colocadas em tubos de ensaio e dissolvidas em 1,5 mL de soluo tampo Tris-HCl 20 mM com EDTA 5 mM. As protenas sero submetidas temperatura de 100 C por perodos de 10, 30 e 60 min, sendo realizadas triplicatas para cada entomotoxina e para cada tempo de exposio. O ensaio ser encerrado pela imerso dos tubos com as amostras em gelo e adicionando-se tampo de amostra (Tris-HCl 50 mM, sacarose 8%, SDS 2%, 2mercaptoetanol 5% e azul de bromofenol 0,02%). As amostras controle com 0 min de incubao da protena (mantidas a 4 C) tambm sero preparadas (Hrouet et al., 2005). As amostras sero analisadas por SDS-PAGE, como descrito no item B.1.3., e por Western Blot, como descrito a seguir. 2.3.3. Imunodeteco Western Blot Os ensaios de imunodeteco (Western Blot) sero realizados utilizando o anticorpo monoclonal Anti-HIS Histidina (Invitrogen) para a deteco da protena Cry8Ka5 expressa com cauda de histidina em bactria. J para os ensaios de imunodeteco de

Cry1Ac ser utilizado o anticorpo policlonal anti-Cry1Ac produzido em coelho pelo nosso grupo como descrito por Oliveira (2008). Para o ensaio, 5g de cada protena sero aplicadas em gel de poliacrilamida 12,5% (SDS-PAGE). Aps a eletroforese (ver item B.1.3), ser realizada a transferncia das protenas do gel para uma membrana de nitrocelulose Hybond-C Extra. Para tanto, ser utilizado o equipamento Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell (Bio-Rad Laboratories) e o tampo de transferncia (192 mM de Glicina; 25 mM de Tris-Base; 20% de Metanol). A transferncia ocorrer a 100 mA, com durao de 30 min. Em seguida, a membrana com as amostras de protena ser bloqueada com soluo salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 3% de BSA, durante 2 h, temperatura ambiente. Aps o bloqueio, a membrana ser rapidamente lavada com PBS-Tween (PBS-T) a 0,05% e incubada com os anticorpos conjugado com Fosfatase alcalina (1:2000, v/v, em PBS) durante 2 h, temperatura ambiente. Aps a incubao, a membrana ser lavada trs vezes com 10 mL de PBS-T e revelada com o uso do Kit AP Conjugate Substrate (Bio-Rad Laboratories), seguindo os procedimentos descritos pelo fabricante. A reao ser interrompida com a adio de gua.

2.4.Ensaio de toxicidade aguda via oral O estudo de toxicidade oral aguda ser realizado de acordo com o protocolo 420 da Organization of Economic Cooperation and Development OECD (OECD, 1995). Para cada toxina avaliada ser utilizado o protocolo mencionado a seguir. Sero utilizados 5 camundongos fmeas da linhagem Swiss com 6 semanas de idade e com peso variando de 18 a 22 g obtidos do Biocen-UFC. A toxina ser suspensa em gua destilada e administrada oralmente na doses de 2000 mg/kg de peso corpreo por gavagem para cada camundongo. Todos os camundongos sero observados nas primeiras horas aps a administrao das toxinas e, depois, duas vezes ao dia durante 14 dias. A possvel interveno das toxinas sobre o comportamento natural dos camundongos ser observada, bem como indcios de toxicidade a partir de mudanas do aspecto normal da pele, das mucosas, dos olhos, dos movimentos respiratrios e de comportamento inerente a danos causados ao sistema nervoso central e autnomo. O peso de todos os camundongos ser registrado nos dias 0, 4, 7, 10 e 14. No 14 dia, os animais sero anestesiados e exsanguinados para determinao de parmetros hematolgicos e bioqumicos do soro. Em seguida, os animais sero sacrificados por overdose com halotano (Fluothane, Zeneca, So Paulo, Brasil) e dissecados para

observao monitorada por um patologista de rgos vitais e pesados para obteno de seu peso mido relativo.

2.4.1. Determinao de parmetros hematolgicos e bioqumicos Ao final de ambos os experimentos de toxicidade, os animais recebero uma leve anestesia por inalao de ter etlico e, posteriormente, ser coletado sangue via plexo-retro-orbital com o auxlio de uma pipeta Pasteur de vidro. Uma parte do sangue ser coletada em tubos heparinizados para a determinao dos parmetros hematolgicos e outra parte ser coletada para obteno de soro para a dosagem de parmetros bioqumicos. Quanto aos parmetros hematolgicos de todos os camundongos, sero verificados: hematcrito, concentrao de hemoglobina, contagem de eritrcitos, volume corpuscular mdio, reticulcitos, contagem total e diferencial de leuccitos, contagem de plaquetas e o tempo de coagulao sangunea. Os parmetros bioqumicos analisados sero: aspartato aminotransferase (AST), alanina

aminotransferase (ALT), fosfatase alcalina, uria, protena total, albumina, globulina, colesterol total, creatinina e glucose. As anlises hematolgicas sero realizadas utilizando um analisador hematolgico automatizado e as anlises sorolgicas sero feitas atravs de um analisador bioqumico automatizado.

2.4.2. Determinao do peso mido relativo dos rgos e anlises histopatolgicas No final de ambos os experimentos de toxicidade, agudo e subcrnico, os camundongos recebero overdose do anestsico inalatrio Halotano (Fluothane, Zeneca, So Paulo, Brasil). Os animais sero dissecados e cuidadosamente os rgos/tecidos sero verificados quanto ao seu aspecto (cor, presena de manchas e/ou irregularidades anatmicas etc) por um histopatologista e, em seguida, pesados. Posteriormente, sero fixados com formalina 10% tamponada. Os rgos/tecidos estudados, em machos e fmeas, sero: crebro, timo, corao, pulmes, fgado, bao, pncreas, estmago, intestino delgado, intestino grosso, rins, glndulas supra-renais, bexiga, gnadas (testculos e ovrios) e rgos sexuais acessrios (tero e epiddimo). Todos os rgos/tecidos fixados de acordo com o item anterior sero processados em vrias etapas para ento serem embebidos em parafina. Em seguida, sero feitos cortes em um micrtomo com lmina de diamante e, ento, corados com hematoxilina e eosina. As lminas de cada estrutura analisada no experimento sero examinadas por um histopatologista.

2.4.3. Anlise dos dados dos ensaios de toxicidade Os dados tais como peso corpreo, parmetros hematolgicos e bioqumicos e o peso relativo dos rgos sero processados atravs de uma anlise de varincia, dados pr- e ps-tratamento sero analisados utilizando t-teste para comparao entre amostras. Mortalidade, sinais clnicos e leses histopatolgicas sero comparativamente analisados usando o Teste de Fisher.

3. REFERNCIAS CONSTABLE, A.; JONAS, D.; COCKBURN, A.; DAVI, A.; EDWARDS, G.; HEPBURN, P.; HEROUET-GUICHENEY, C.; KNOWLES, M.; MOSELEY, B.; OBERDRFER, R.; SAMUELS, F. History of safe use as applied to the safety assessment of novel foods and foods derived from genetically modified organisms. Food Chem. Toxicol., v. 45, n. 12, p. 2513-2525, 2007.

DELANEY, B., ASTWOOD, J. D., CUNNY, H., CONN, R. E., HEROUETGUICHENEY, C., MACINTOSH, S., MEYER, L. S., PRIVALLE, L., GAO, Y., MATTSSON, J., LEVINE, M., ILSI International Food Biotechnology Committee Task Force on Protein Safety. Evaluation of protein safety in the context of agricultural biotechnology. Food Chem. Toxicol., v. 46, n. 2, p. S71-S97, 2008.

HROUET, C.; ESDAILE, D.J.; MALLYON, B.A.; DEBRUYNE, E.; SCHULZ, A.; CURRIER, T.; HENDRICKX, K.; KLIS, R.J.; ROUAN, D. Safety evaluation of the phosphinothricin acetyltransferase proteins encoded by the pat and bar sequences that confer tolerance to glufosinateammonium herbicide in transgenic plants. Regul. Toxicol. Pharmacol., v.41, p. 134149, 2005.

JUBERG, D. R.; HERMAN, R.A.; THOMAS, J.; BROOKS, K. J.; DELANEY, B. Acute and repeated dose (28 day) mouse oral toxicology studies with Cry34Ab1 and Cry35Ab1 Bt proteins used in coleopteran resistant DAS-59122-7 corn. Regul. Toxicol. Pharmacol., v. 54, n. 2, p. 154-163, 2009.

LU, Y.; XU, W.T.; KANG, A.; LUO, Y.B.; GUO, F.; YANG, R.; ZHANG, J.; HUANG, K.L. Prokaryotic expression and allergenicity assessment of hygromycin B

phosphotransferase protein derived from genetically modified plants. J. Food Sci., v.27, p. 232288, 2007. OECD, 1995. Guideline No. 420. Acute Oral ToxicityFixed Dose Method.

PENG, D.; CHEN, S.; RUAN, L.; LI, L.; YU, Z.; SUN, M. Safety assessment of transgenic Bacillus thuringiensis with VIP insecticidal protein gene by feeding studies. Food Chem. Toxicol., v. 45, p. 11791185, 2007.

XU, W.; CAO, S.; HE, X.; LUO, Y.; GUO, X.; YUAN, Y.; HUANG, K. Safety assessment of Cry1Ab/Ac fusion protein. Food Chem. Toxicol., v. 47, n. 7, p. 1459-65, 2009.