INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS SECCIN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIN PROGRAMA DE BIOMEDICINA Y BIOTECNOLOGA MOLECULAR

DEPARTAMENTO DE MORFOLOGA

INFORME DE PRCTICAS

IBQ. HERNNDEZ MARN, MIGUEL ANGEL

MATERIA: CULTIVO DE CLULAS Y TEJIDOS (ANIMALES)

PROFESORA: BIL. MARA LUISA VEGA BARRITA (LABORATORIO DE CITOPATOLOGA AMBIENTAL)

FECHA DE ENTREGA: LUNES 26 DE SEPTIEMBRE DEL 2011

INFORME DE PRCTICAS
1. Introduccin
1.1 Cultivo de clulas 1 El cultivo de clulas se considera como la adaptacin y proliferacin de clulas dispersas tomadas de un tejido original, de un cultivo primario o de lneas celulares, por mecanismos enzimticos o disgregacin qumica y que sern capaces de crecer en suspensin en un medio lquido o como una monocapa adherente sobre un sustrato. Para el mantenimiento de un cultivo celular se requiere de subcultivos (tambin llamados pases), por lo que se requiere de la dispersin por tratamiento enzimtico de clulas (tripsinizacin) en un cultivo que presentan una confluencia del 100% (o monocapa) cuando crecen sobre un substrato, o un crecimiento significativo cuando estn en suspensin, requiriendo el cambio a una botella de cultivo nueva en ambos casos. 1.2 Condiciones requeridas para el cultivo de clulas 1 El crecimiento de clulas in vitro requiere lo siguiente: 1) Substrato. La naturaleza del substrato o fase sobre la cual crecen las clulas, puede ser slido como en el crecimiento de una monocapa sobre plstico, semislido como la colgena o agar y lquido como en el cultivo en suspensiones. 2) Fase gaseosa. Los constituyentes significativos de la fase gaseosa son el oxigeno y el bixido de carbono, los cultivos varan en sus requerimientos en base al tipo celular o al tipo de cultivo como pueden ser de tejidos, rganos o de clulas. 3) pH. La mayora de las clulas crecen bien a pH 7.4, aunque el pH ptimo varia relativamente entre las diferentes lneas celulares. Para realizar una valoracin subjetiva del pH mediante el color se usa comnmente el rojo de fenol como indicador (Figura 1), as el medio es rojo a pH 7.4, naranja a pH 7.0, amarillo a pH 6.5, ligeramente rojizo a pH 7.6 y prpura a 7.8.

Figura 1. Estructura qumica del Rojo de fenol.

4) Temperatura. La temperatura ptima del cultivo de clulas depende de: a) La temperatura del cuerpo del animal del cul se obtuvieron las clulas. b) La incorporacin de un factor de seguridad que permita minimizar los errores en la incubacin. c) La temperatura recomendada para la mayora de las clulas humanas y lneas celulares derivadas de animales de sangre caliente es de 36.5 C. 5) Medios de cultivo. Son una mezcla de sales inorgnicas y otros nutrientes capaces de ayudar a la clula a que sobreviva in vitro por 24 horas o ms, uno de los medios ms sencillo es el medio mnimo esencial (MEM) el cual contiene aminocidos esenciales, vitaminas y sales, otros medios se diferencian por contener adems de aminocidos y vitaminas, complementos como metabolitos extras (por ejemplo nucleosidos) y minerales. 1.3 Cultivo primario 1 El cultivo primario es el que se realiza tomando un tejido procedente de un animal vivo y que contiene varios tipos celulares. En general, se utiliza slo diseccin mecnica superficial y breve, se conoce tambin como cultivo de tejidos, y es el procedimiento inicial que se debe seguir para obtener un cultivo de clulas disociadas. El manejo del concepto de cultivo primario es til para referirse a la obtencin de clulas procedentes de un animal vivo mediante una diseccin mecnica o por el uso de enzimas (Figura 2). El cultivo primario tiene 3 etapas: 1) Aislamiento del tejido de inters. 2) Diseccin y/o disgregacin. 3) Obtencin de clulas disociadas y siembra de las mismas en botellas de cultivo.

Figura 2. Tipos de cultivo de tejidos. Etapas de cultivo primario.

Las enzimas ms utilizadas en el cultivo primario son: tripsina, colagenasa, elastasa, hialouronidasa, DNAasas, pronasa, dispasas, solas o en combinacin. Existen algunas condiciones generales para hacer un cultivo primario, los ms importantes se describen a continuacin: a) La grasa y el tejido necrosado debern ser retirados durante la diseccin. b) El tejido deber cortarse finamente (1 mm2) para evitar largos periodos de exposicin a las enzimas. c) Las enzimas utilizadas debern ser neutralizadas y removidas frecuentemente por centrifugacin. d) Para la siembra deber colocarse un nmero mucho ms alto de clulas que generalmente se coloca en una botella de cultivo, considerando que durante el proceso sobreviven pocas. e) Deber utilizarse un medio altamente enriquecido y complementado con suero fetal bovino y los requerimientos que tenga cada tipo celular (hormonas, aminocidos no esenciales, vitaminas y protenas especficas, etc.). Los sueros de ternera y de caballo son poco efectivos. f) Los tejidos embrionarios son preferidos, debido a su fcil disgregacin y proliferacin in vitro a diferencia de los tejidos adultos. El cultivo primario es til cuando se necesita un testigo diploide. En el rea de cultivo de tejidos, las clulas de un cultivo primario normalmente mantienen su cariotipo y es lo ms parecido al comportamiento del tejido en condiciones in vivo. Sin embargo es importante no olvidar tomar en consideracin lo siguiente: las clulas en cultivo estn aisladas de las interacciones complejas con el resto de los sistemas orgnicos, se propagan en una sola dimensin, hay inicio de un incremento de proliferacin y de movilidad celular, cambios en su metabolismo, generalmente las clulas en cultivo dependen de la gliclisis y en menor medida del ciclo de Krebs, Aun as en los ltimos aos organismos como la Food and Drug Administration (FDA) de los Estados Unidos de Norteamrica, ha autorizado el uso de cultivos primarios para determinar el efecto txico varios compuestos. 1.4 Ensayos de citotoxicidad in vitro 1,2 Las nuevas drogas, cosmticos, aditivos de alimentos y muchos compuestos ms deben ser probados antes de ser liberados al pblico. Estas pruebas usualmente involucran un gran nmero de animales de experimentacin as que actualmente existe presin para llevar a cabo gran parte de los ensayos de citotoxicidad en cultivos de clulas animales. As la introduccin de lneas celulares especializadas y el cultivo de rganos han sido una proposicin razonable. La toxicidad es un evento complejo in vivo, donde hay dao directo a las clulas como la citotoxicidad provocada por las drogas anticancerosas, efectos fisiolgicos como transporte de membrana en el rin o neurotoxicidad en el cerebro, efectos inflamatorios tanto en el sitio de aplicacin y otros sitios, y otros efectos sistemticos. Es difcil monitorear los efectos sistemticos y

fisiolgicos in vivo, sin embargo existen muchos ensayos in vitro para determinar efectos a nivel celular o de citotoxicidad. La definicin de citotoxicidad vara segn la naturaleza del estudio y si las clulas estn muertas o simplemente tienen su metabolismo alterado. Mientras un agente anticanceroso puede ser requerido para matar clulas, demostrar la falta de toxicidad de otros compuestos farmacuticos puede requerir un anlisis ms sutil de cambios en metabolismos menores o una alteracin entre clula y clula lo que puede llevar a una reaccin inflamatoria o respuesta alrgica. Todos estos ensayos son sumamente simples, fciles de cuantificar y reproducibles. La citotoxicidad celular se define como una alteracin de las funciones celulares bsicas que conlleva a que se produzca un dao que pueda ser detectado. A partir de aqu, diferentes autores han desarrollado bateras de pruebas in vitro para predecir los efectos txicos de las drogas y los compuestos qumicos, utilizando como modelos experimentales cultivos primarios y rganos aislados como lneas celulares establecidas. 1.5 Ensayo de capacidad metablica 1,2 Un ensayo de citotoxicidad depende del agente a estudiar, la naturaleza de la respuesta y las clulas blanco. Los ensayos de capacidad metablica, estn basados en la microtitulacin usualmente, de la duracin de intermediarios que pueden medir tanto una respuesta metablica, DNA, RNA o sntesis de protenas. El punto final de la microtitulacin se refiere a la estimacin del nmero de clulas sobrevivientes a una exposicin de un agente a estudiar. La viabilidad celular puede medirse por la reduccin del bromuro de 3 (4,5, dimetiazol 2 il) 2,5 bromo difeniltetrazolio (MTT) a formazan. Se ha utilizado esta tcnica para el estudio de drogas anticancerosas pero puede ser aplicable a ensayos citotxicos (Figura 3).

Figura 3. Ensayo de citotoxicidad por reduccin de MTT.

2. Antecedentes
2.1 El compuesto N (3 hidroxi 4 carboxi fenil) maleimida La preparacin de la N (3 hidroxi 4 carboxi fenil) maleimida se basa en estudios realizados a partir de compuestos anlogos del compuesto de Baker: cido 4 (yodoacetamido) saliclico (Figura 4), el cual puede actuar como agente alquilante al sitio activo de la enzima glutamato deshidrogenasa 3,4. Se haba postulado que el tejido tumoral muestra una actividad glicoltica elevada debido a la baja actividad de la glicerol fosfato deshidrogenasa y de la hidroxibutirato deshidrogenasa; al mismo tiempo se encuentra elavada la enzima deshidrogenasa lctica (LDH). Por lo tanto, la inhibicin especifica de la DL es un posible blanco terapetico para el tratamiento de cncer. Se diseo y sintetiz, de acuerdo a la idea de Baker de los antimetabolitos no clsicos, el compuesto N (4 carboxi 3 hidroxi fenil) maleimida. Es compuesto acta como inhibidor irreversible de la LDH, mostrando una constante de inhibicin (Ki) de 1 * 10 4 M 3. El oxamato (un inhibidor competitivo de la LDH protege a la enzima contra la inactivacin irreversible lo que parece ser una inhibicin del sitio activo. Cuando se dializa la LDH, inhibida por la maleimida, no se obtiene recuperacin de la actividad enzimtica, pero cuando la LDH inhibida por el oxamato, se dializa se obtiene una reactivacin total 3. El tejido tumoral muestra una concentracin elevada de la isoenzima M de la LDH y un inhibidor especfico de esta isoenzima M podra poseer actividad antitumoral. La maleimida es este inhibidor 3. El ensayo biolgico mostr los siguientes resultados: En ratas Sprangue Dawley portadora de carcinoma mamario provocado con 7, 12 dimetilbenzantranceno, la maleimida inhibi significativamente la aparicin y desarrollo del tumor. Por otra parte no se encontr actividad contra el tumor de ascitis y el sarcoma 180 3.

Figura 4. Estructura qumica del compuesto de Baker y de la N (3 hidroxi 4 carboxi fenil) maleimida.

3. Objetivos
Llevar a cabo los procedimientos de buenas prcticas de laboratorio y cuidar de mantener las condiciones de esterilidad en el cuarto de cultivo. Esterilizar el material de vidrio, instrumental quirrgico y soluciones salinas en autoclave. Preparar y esterilizar por filtracin la solucin del compuesto a evaluar y los medios de cultivo DMEM y F12 complementndoos con suero fetal bovino (SFB). Efectuar el cultivo primario de fibroblastos de embriones de ratn, as como su mantenimiento hasta la formacin de monocapa. Descongelar, propagar y congelar clulas de la lnea celular HeLa. Realizar el conteo de clulas del cultivo primario y de la lnea celular mediante un Hemocitmetro. Realizar el anlisis morfomtrico de los fibroblastos y de las clulas HeLa en placas de 6 pozos frente a una serie de concentraciones del compuesto N (3 hidroxi 4 carboxi fenil) maleimida, mediante tincin por la tcnica de Papanicolaou. Conocer el efecto citotxico del compuesto N (3 hidroxi 4 carboxi fenil) maleimida a diferentes concentraciones en fibroblastos de embrin de ratn y la lnea celular HeLa, en placas de 96 pozos.

4. Materiales, equipo y reactivos

4.1 Materiales Probeta de 1L. Matraces Erlenmeyer de 1 y 2 L. Sistema de filtracin Millipore estril con membrana de celulosa de 0.2 micras. Botella de plstico para cultivo de clulas de 25 y 75 cm2. Pipetas graduadas de 5 y 10 mL. Pipetas Pasteur. Bulbo de hule. Matraz Erlenmeyer con tapn de 50 mL. Agitadores magnticos. Embudos de filtracin de tallo corto con organza. Placas de Petri chicas y medianas. Tijera recta. Tijera curva. Bistur. Pinza punta roma. Pinza de diente de ratn. Probetas de 50 y 100 mL. Placas de siembra de 6 y 96 pozos.

Cubreobjetos redondos. Portaobjetos. Vasos de precipitados de 50 y 100 mL. Frascos Gerber. Mechero Bunsen. Frascos de vidrio de 500 mL con tapn de rosca. Tubos de ensaye para centrifuga con tapn de rosca. Tubos tipo falcn de 15 y 50 mL. Botellas de 500 mL para soluciones y medio. Puntas azules y amarillas. Micropipetas de 100 y 1000 L. Tubos Eppendorf. Hemocitmetro (Cmara de Neubauer) Frascos pequeos de 10 mL. Criotubos de 2 mL. Jeringa con aguja de 5 mL. Filtros para esterilizacin. Gasas estriles y algodn. Papel aluminio y kraft. Papel parafilm.

4.2 Equipo Campana de flujo laminar. Campana de extraccin. Autoclave. Incubadora de CO2 (5% CO2 95% Aire, 37 C). Microscopio de luz visible. Microscopio invertido. Centrfuga.

Balanza analtica. Potencimetro. Pipeteros automticos Parrilla de agitador magntico. Refrigerador ( 4 C). Congelador ( 20 C). Congelador Revco ( 70 C). Espectrofotmetro lector de Elisa.

4.3 Material biolgico Clulas HeLa (Clulas epiteliales de cncer cervicouterino). Embriones extrados de ratonas preadas con 13 das de gestacin.

4.4 Reactivos Medio mnimo esencial por Dubelco (DMEM 1X). Medio F12 de Gibco. Glucosa. Bicarbonato de sodio. Solucin de anestesia Fenobarbital. Antibitico (Penicilina Estreptomicina). Suero fetal bovino (SFB). Solucin Tripsina Verseno (0.05% 0.05%). Solucin de Tripsina 0.25%. Solucin salina de fosfatos PBS A. Azul de tripano al 0.02%. Solucin de MTT (7 mg / mL).

Alcohol etlico absoluto. Xileno. Solucin Xileno Etanol absoluto. Soluciones de alcohol etlico al 96, 80, 70 y 50. Hematoxilina. Colorante OG 6 Colorante EA 50. Hidrxido de amonio concentrado. Resina sintetca. Agua tipo I. Agua bidestilada. Compuesto N (3 hidroxi 4 carboxi fenil) maleimida. Isopropanol cido (pH = 4).

5. Desarrollo experimental 1
5.1 Limpieza, esterilizacin del material y asepsia del rea de cultivo La preparacin del material de vidrio empleado en el cultivo de clulas implica un protocolo de limpieza, el cual a continuacin se expone en el siguiente diagrama de bloques:

Preparar la solucin desinfectante detergente y la solucin de detergente 7X.

Sumergir el material en la solucin desinfectante detergente durante 10 minutos.

Sumergir el material en la solucin de detergente 7X durante una noche.

Secar al aire y posteriormente con calor (en horno) durante 1 hora a 100 C.

Enjuagar con agua bidestilada en 3 cambios.

Enjuagar con agua corriente mnimo 4 veces.

Las soluciones de lavado se preparan de la siguiente forma: Solucin desinfectante detergente: Se realiza una solucin de hipoclorito de sodio a 300 ppm y detergente 7X al 2% en agua corriente. Solucin de detergente 7X: Se realiza una solucin del detergente 7X al 2% en agua corriente. El procedimiento de esterilizacin del material de vidrio limpio, cajas con puntas para micropipeta, gasas, agua para la preparacin de los medios y la solucin de PBS, se describe en el siguiente diagrama de bloques.

Empaquetar el material con papel aluminio, papel kraft, ligas y algodn (pipetas).

Esterilizar en autoclave a una presin de 15 lb/in2 (121 C) por 15 minutos .

Guardar el material esteril en una gaveta del cuarto de cultivo.

Para mantener las condiciones de asepsia del cuarto de cultivo, y as disminuir el riesgo de contaminacin en los cultivos es necesario efectuar los siguientes procedimientos. El cuarto de cultivo debe ser irradiado con luz ultravioleta antes de trabajar dentro de l. El piso del cuarto de cultivo debe ser limpiado con una solucin de germicida. La campana de flujo laminar, as como las mesas de trabajo y dems accesorios a emplear (gradillas, pipeteros automticos y botellas de cultivo), deben ser limpiados con gasa estril y una solucin de alcohol etlico al 70%. Limpieza de la incubadora de CO2 peridicamente, as como el cambio de la solucin de sulfato de cobre que se encuentra dentro de esta. Es tambin importante realizar pruebas de esterilidad del suero fetal bovino y de los medios de cultivo. 5.2 Preparacin de medios de cultivo El procedimiento para la preparacin de los medios de cultivo DMEM y F12, se realiza dentro del cuarto de cultivo en la campana de flujo laminar como se describe a continuacin:

Medir 950 mL de agua esteril en matraz Erlenmeyer con agitador magntico.

Agregar el polvo de medio (DMEM o F12), 3.7 g de NaHCO3 y 3.5 g de glucosa.

Agitar suavemente, hasta disolucin total.

Guardar en refrigeracin y realizar pruebas de esterilidad.

Aforar a 1 L y esterilizar por filtracin en el sistema Millipore.

Ajustar el pH con HCl concentrado entre 6.8 y 6.9.

Se preparan 100 mL de cada medio de cultivo y se complementa cada uno con SFB al 7%, de acuerdo con la siguiente relacin: Reactivo Medio DMEM o F12 Suero fetal bovino (SFB) Antibitico (Penicilina Estreptomicina) Volumen (mL) 92 7 1

Durante la preparacin de los medios se debe de evitar la formacin de burbujas y derrame de estos. El uso de antibitico en el medio es para mantener en condiciones de esterilidad al medio, sin embargo la concentracin de este debe ser cuidadosamente considerada, ya que puede afectar la integridad mitocondrial de las clulas. 5.3 Prueba de esterilidad Una vez preparado el medio complementado, se procede a realizar pruebas de esterilidad, que consisten en depositar 3 mL de medio (complementado y sin complementar) en tubos de ensaye con tapn de rosca, incubados por 24 horas. Transcurrido el tiempo, se observa el estado del medio. Se puede permitir ocupar el medio para el cultivo de clulas una vez que se aprecia inocuidad en este. 5.4 Descongelacin de clulas HeLa Las clulas HeLa se descongelan de un criotubo mantenido en nitrgeno liqudo, y se transfieren a un bao de agua a 37 C, donde se agita hasta que se descongela. Se limpia con gasa estril y alcohol etlico y es llevado a la campana de flujo laminar. Se abre el criotubo que contiene a las clulas (aproximadamente 2 mL), y con ayuda de una pipeta Pasteur y bulbo se transfiere el contenido a una botella de cultivo de 75 cm2, dejando que la suspensin celular resbale por las paredes del recipiente, evitando as que las clulas sufran el menor dao fsico. Se adiciona por la pared de la botella en 3 porciones con ayuda de una pipeta graduada 2, 4 y 8 mL de medio complementado DMEM seguido de una suave agitacin por cada adicin de medio. La adicin del medio a la botella se realiza tambin por la pared del recipiente, para evitar la menor desgasificacin de este. Se observa al microscopio el cultivo y se verifica la viabilidad de las clulas, diferenciando por morfologa, a aquellas que su membrana esta integra y por lo tanto vivas de aquellas que han sufrido algn dao en su cubierta. Se incuba el cultivo a 37 C a una tensin de CO 2 de 5% durante 4 horas. Transcurridas las 4 horas se evala al microscopio la viabilidad celular, y se procede a realizar un cambio de medio de cultivo por medio fresco, debido a la variacin de pH neutro a alcalino (rojo rosa intenso) provocado por la salida del citosol de las clulas muertas al medio. Se sigue llevando el cultivo en incubacin, hasta que se obtiene el 100% de confluencia. La botella de cultivo se mantiene parcialmente abierta dentro de la incubadora para favorecer la transferencia de CO 2 al medio, y as mantener el valor de pH requerido durante la incubacin.

5.5 Mantenimiento y propagacin de la lnea celular El mantenimiento de una lnea celular que procede de un subcultivo de una lnea celular, requiere un cambio peridico de medio de cultivo. El mantenimiento de las lneas celulares comprende 4 factores por lo cual es necesario realizar cambio de medio: 1) 2) 3) 4) Variacin de pH. Concentracin celular. Tipo celular. Morfologa celular.

En este caso el mantenimiento de la lnea de clulas HeLa de acuerdo con el catalogo de la ATCC, requiere de medio de cultivo complementado con suero fetal bovino a una concentracin final de 10% (para esta prctica el complementar con SFB al 7%, las condiciones de cultivo se mantienen idneas); tener una atmsfera de incubacin con una tensin de dixido de carbono al 5% y de aire al 95%. La temperatura ptima de incubacin es de 37 C 5.

Figura 5. Vista en microscopio de clulas adherentes de tejido epitelial de cncer cervicouterino (HeLa) (ATCC Catalog).

5.6 Subcultivo y tripsinizacin de la lnea celular (Pase) Una vez que se obtuvo un 100% de confluencia celular se procede a eliminar el medio de cultivo de la botella de incubacin, decantando el lquido por la pared contraria a la de la monocapa formada. Se agrega 2 mL de una solucin de tripsina verseno (0.05% 0.05%) por el lado opuesto a la monocapa y se lava la monocapa con la solucin enzimtica. Se retira la solucin enzimtica con ayuda de una pipeta Pasteur, y se agrega nuevamente 2 mL de la solucin de tripsina verseno. Se incuba el cultivo a 37C por un periodo mximo de 10 15 min, observando al microscopio cada 5 minutos la evolucin de la tripsinizacin. La solucin de tripsina verseno se neutraliza por la adicin de 4 mL de medio DMEM / SFB, colocado con una pipeta graduada de 10 mL por la cara opuesta de la botella a la de la monocapa. Se golpea suavemente la botella de cultivo para recuperar el mayor nmero de clulas y transferirlas a un tubo estril para centrifuga. La suspensin celular se centrifuga a 1000 rpm durante 10 minutos. Se retira el medio de cultivo sobrenadante por decantacin o con ayuda de pipeta Pasteur, y se adiciona 4 mL de medio DMEM complementado fresco. El paquete celular se resuspende con ayuda de una pipeta de 5 mL, y la suspensin obtenida se reparte en 2 botellas de cultivo de 75 cm 2 dejando caer el lquido por las paredes de esta. 5.7 Congelacin celular Se requiere preparar 10 mL medio de cultivo complementado con SFB al 15% para la congelacin de las clulas: Reactivo Medio DMEM Suero fetal bovino (SFB) Antibitico (Penicilina Estreptomicina) Volumen (mL) 8.4 1.5 0.1

La congelacin celular se realiza tripsinizando la monocapa formada en la botella de cultivo, hasta observar al microscopio disgregacin celular. Se neutraliza la tripsina con 3 mL de medio DMEM complementado al 15%. Con ayuda de la pipeta de 5 mL, se homogeniza la suspensin celular, y se transfiere a un tubo estril para centrifuga. Se centrifuga a 800 rpm por 10 min. Se elimina el sobrenadante por decantacin. El botn celular formado es resuspendido y homogenizado en 1.7 mL de medio DMEM / SFB al 15%, y se coloca en hielo ( 4 C) por un periodo de 30 minutos, homogenizando la suspensin suavemente cada 5 minutos para evitar la formacin de cristales grandes que puedan daar las clulas . Transcurrido el tiempo de incubacin, se adiciona 127.5 L de DMSO (dimetilsulfxido) a una concentracin final de 7.5%. La solucin celular es homogenizada con una pipeta de 5 mL y transportada a los criotubos estriles necesarios (previamente etiquetados). El criotubo es llevado en bao de hielo al congelador revco ( 70 C). Los criotubos son mantenidos en congelacin durante 3 das, y posteriormente almacenados en tanque de nitrgeno

5.8 Cultivo primario El cultivo primario de fibroblastos de ratn se realiza en las ms estrictas condiciones de asepsia, de acuerdo al siguiente diagrama de bloques:

Anestesiar con una solucin de Fenobarbital a las ratonas preadas.

Llevar al animal a la campana de extraccin provista de un mechero Bunsen.

Limpiar el rea de diseccin con una solucin de etanol al 70%.

En la campana de flujo laminar extraer los embriones con las tijeras rectas.

Lavar el tero en 2 cajas de petri con la solucin de PBS y antibitico.

Disecar el tero haciendo un corte a nivel de la lnea media del abdomen.

Los embriones se colocan en una caja petri con Tripsina al 0.25%, y se cortan.

Los fragmentos se transfieren a un matraz de 50 mL y agitador magntico.

La solucin se agita durante 15 minutos a 150 rpm

Los tubos se centrifugan a 1000 rpm durante 10 minutos.

La solucin se filtra en tubos de centrifuga con ayuda de embudos con organza.

Se adiciona al matraz un volumen igual de medio de cultivo DMEM - F12 comp.

El sobrenadante se separa del botn celular con ayuda de pipeta Pasteur.

El botn celular se resuspende en 4 mL de medio DMEM - F12 comp.

Los fibroblastos son sembrados en una botella de cultivo de 25 cm2 en incubacin

La siembra de fibroblastos se efecta a alta densidad considerando que existe una etapa de adaptacin de ellos a las nuevas condiciones, y que mueren alrededor de un 25%. Se llevan las condiciones de incubacin para los fibroblastos de embrin de ratn a 37 C y con una tensin de CO2 del 5% y 95% de aire. El medio que se emplea para detener la accin de la Tripsina en la disgregacin del tejido y el mantenimiento de los fibroblastos es la mezcla de los medios F12 y DMEM (ambos complementados) al 50 % cada uno. La incubacin de los fibroblastos se lleva hasta la formacin de una monopaca sobre la superficie de la botella de cultivo (Figura 6) para llevar a cabo el conteo de clulas y poder realizar la tcnica de Papanicolaou junto con los ensayos de citotoxicidad.

Figura 6. Fibroblastos de embrin de ratn, adheridos a la superficie de la botella de cultivo.

5.9 Cuenta celular La cuenta celular de las clulas HeLa o de los fibroblastos, se realiza mediante observacin de la Cmara de Neubauer al microscopio. Se emplea azul de tripano (Figura 7) para determinar la viabilidad celular por exclusin de colorante, ya que las clulas vivas son impermeables a este, mientras que las muertas son teidas (ruptura de membrana) 6.

Figura 7. Estructura qumica de Azul de tripano.

Se toma una alcuota de 10 L de la suspensin celular (HeLa o de fibroblastos) en un tubo Eppendorf con 90 L de azul de tripano. La solucin es resuspendida y homogenizada de forma suave. Se carga la micropipeta c on 30 L (2 veces) y se coloca la solucin en la cuadricula del Hemocitmetro (Cmara de Neubauer). Se realiza el conteo de nmero de clulas (tomando en cuenta solo las clulas encontradas en las 4 esquinas de la cuadricula, y se calcula el promedio. La concentracin celular (nmero de clulas por mililitro) se calcula mediante la siguiente ecuacin:

Donde: C = Concentracin de clulas = [N Clulas / mL] n = Promedio de clulas contadas en los 4 cuadrantes de las esquinas. F.D. = Factor de dilucin = 10 (10 L de suspensin celular en 90 L de azul de tripano). Factor de cmara = 10,000. Conocida la cantidad de clulas viables por unidad de volumen, se procede a realizar el cultivo de estas en una microplaca de 6 pozos para la tcnica de Papanicoloaou y en placa de 96 pozos para el ensayo de capacidad metablica.

5.10 Anlisis Morfomtrico de fibroblastos y de las clulas HeLa (Tincin de Papanicoloaou) En 2 placas de 6 pozos provistas de cubreobjetos redondos, se siembran 1*10 6 clulas por pozo de fibroblastos o de la lnea HeLa, y se incuban a 37 C hasta la formacin de monocapa sobre el cubreobjeto. Se prepara una solucin de 10.6 mM del compuesto N (3 acetoxi 4 carboxi fenil) maleimida en agua tipo I y medio complementado (Depende el medio complementado, si el ensayo es sobre fibroblastos o clulas HeLa). La solucin del compuesto es esterilizada por filtracin. Se realiza una serie de 6 diluciones en frascos pequeos de 10 mL a partir de la solucin madre del compuesto a evaluar con medio de cultivo a una relacin 1:2 consecutiva. Teniendo la confluencia deseada de las clulas sembradas sobre los cubreobjetos, se retira de cada pozo el medio adicionado inicialmente. Para el pozo testigo se recambia el medio por medio fresco. Las clulas adheridas en los otros pozos son expuestas a las 6 diferentes concentraciones del compuesto. Las placas son de nuevo incubadas a 37 C y 5% de CO2 durante 24 horas. Testigo Conc. I Conc. II Conc. VI

Conc.III

Conc. IV

Conc. V Concentracin de la N (3 acetoxi 4 carboxi fenil) maleimida en Medio DMEM / SFB o DMEM F12 / SFB (mM) 10.6 5.3 2.65 1.325 0.6625 0.33125

Pozo Testigo Concentracin I Concentracin II Concentracin III Concentracin IV Concentracin V Concentracin VI

Clulas HeLa o Fibroblastos de ratn + + + + + + +

Transcurrido el periodo de exposicin, se retira totalmente de cada pozo el medio de cultivo y se recambia por etanol del 96. Las clulas son fijadas en el alcohol por aproximadamente 3 das.

Las laminillas fijadas se tien, en la misma placa, mediante la tcnica de Papanicoloaou como a continuacin se describe en el siguiente diagrama de bloques.

Alcohol 96 1 minuto

Alcohol 80 1 minuto

Alcohol 70 1 minuto

Alcohol 50 1 minuto

Agua amoniacal Hasta el vire de color

Lavado rpido con agua corriente

Tincin con Hematoxilina 4 minutos

Agua destilada 3 minutos

Lavado rpido con agua destilada

Alcohol 50

Alcohol 70

Alcohol 80

1 minuto

1 minuto

1 minuto

Tincin con EA 50 3 minutos

Lavado rpido con alcohol del 96

Tincin con OG 6 4 minutos

Alcohol 96 1 minuto

Lavado rpido con alcohol del 96

Alcohol absoluto
5 minutos

Alcohol absoluto - Xilol 10 minutos

Xilol
10 minutos

Los cubreobjetos teidos se montan con resina sinttica en portaobjetos previamente desengrasados con etanol del 96. Se espera sequen las muestras durante algunos das, para su posterior observacin al microscopio de fluorescencia y la toma de imgenes digitales.

5.11 Exposicin de clulas HeLa y fibroblastos al compuesto N (3 acetoxi 4 carboxi fenil) maleimida En una placa de 96 pozos, se siembran 10,000 clulas por pozo de fibroblastos o de la lnea HeLa, y se incuban a 37 C por 24 horas. Se prepara una solucin de 10.6 mM del compuesto N (3 acetoxi 4 carboxi fenil) maleimida en agua tipo I y medio complementado (Depende el medio complementado, si el ensayo es sobre fibroblastos o clulas HeLa). La solucin del compuesto es esterilizada por filtracin. Se realiza una serie de 6 diluciones en frascos pequeos de 10 mL a partir de la solucin madre del compuesto a evaluar con medio de cultivo a una relacin 1:2 consecutiva. Transcurrido el periodo de incubacin, se retira de cada pozo el medio adicionado inicialmente y se recambia por medio fresco en las columnas correspondientes al blanco y al testigo, en las siguientes 6 columnas se adiciona las diluciones correspondientes de medio con el compuesto a evaluar. La placa es de nuevo incubada a 37 C y 5% de CO2 durante 24 horas. Se coloca por cuadriplicado un blanco, un testigo, y 6 concentraciones conocidas del compuesto del cual se determinara su citotoxicidad.

Blanco

Testigo

Conc. I 10.6 mM

Conc. II 5.3 mM

Conc. III 2.65 mM

Conc. IV 1.325 mM

Conc. V 0.6625 mM

Conc. VI 0.33125 mM

Pozo Blanco Testigo Concentracin I Concentracin II Concentracin III Concentracin IV Concentracin V Concentracin VI

Clulas HeLa o Fibroblastos de ratn + + + + + + + +

Concentracin de la N (3 acetoxi 4 carboxi fenil) maleimida en Medio DMEM / SFB o DMEM F12 / SFB (mM) 10.6 5.3 2.65 1.325 0.6625 0.33125

5.12

Ensayo de citotoxicidad por capacidad metablica (Mtodo de MTT)

El ensayo de citotoxicidad, se realiz por un mtodo de viabilidad celular mediante la reduccin de una sal de tetrazolio (MTT). Se puede estimar el nmero de clulas sobrevivientes a una exposicin de un agente o compuesto a estudiar. La viabilidad celular puede medirse a partir de la reduccin de 3 (4,5, dimetiazol 2 il) 2,5 bromo difeniltetrazolio a formazan. El MTT es un colorante de tetrazolio de color amarillo soluble en agua, que es reducido por clulas vivas pero no por muertas. Las clulas forman un producto de formazan de color prpura que es insoluble en agua (Figura 8) 7.
O O
-

O O

Lactato deshidrogenasa

OH

Piruvato NADH + H+ NAD+

L - lactato

N N N N N
Br
-

Reductasa mitocondrial

NH N N N

N S

3-(4,5,-dimetiazol-2-il)-2,5bromo difeniltetrazolio (MTT)

Formazan (sal reducida de MTT)

Figura 8. Reaccin de reduccin del MTT a Formazan.

Se ha utilizado esta tcnica para el estudio de drogas anticancerosas pero puede ser aplicable a ensayos citotxicos. En el desarrollo de la prctica, se empleo el mtodo de la sal de MTT para evaluar la viabilidad de las clulas HeLa y de los fibroblastos. Se retira de los pozos el medio con el compuesto con las cuales fueron incubadas las clulas, y se recambia por una solucin de MTT en una concentracin de 100 g / mL en medio DMEM / SFB o DMEM F12 / SFB (dependiendo si el ensayo es con los fibroblastos o con las clulas HeLa), a excepcin del blanco que solo es cambiado por medio fresco. La solucin de MTT se prepara con 50 L de una solucin inicial de 7 m g / mL en 3.45 mL de medio complementado. Se deja en incubacin por 4 horas a 37 C. Despus de este periodo de incubacin se retira el medio del blanco y el medio con MTT de los pozos del testigo y de las 6 concentraciones del compuesto N (3 acetoxi 4 carboxi fenil) maleimida. Se adiciona a cada pozo un volumen de 100 L de isopropanol cido (pH = 4) , y se pone a agitacin a 100 rpm por un periodo de 15 minutos. La microplaca es leda por un lector de Elisa a 595 y 630 nm mediante el software Gen5 para anlisis de datos, en donde es necesario seleccionar la longitud de onda requerida de acuerdo al filtro que emplee el instrumento 8.

Los datos obtenidos son tratados estadsticamente en hoja de clculo de Microsoft Office Excel.

6. Resultados experimentales y clculos

6.1 Cuenta celular La cuenta celular de los cultivos se realiza cuando en la botella de cultivo se observa una alta confluencia (aproximadamente 100%). Se realiza el conteo de nmero de clulas por el mtodo de viabilidad por exclusin de colorante (azul de tripano) en el Hemocitmetro, tomando en cuenta solo las clulas encontradas en las 4 esquinas de la cuadricula, y se calcula el promedio. Conteo de clulas HeLa

23

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El promedio de clulas HeLa no teidas encontradas en la cmara de Neubauer es de 23.75. La concentracin celular se calcula como:

Donde: C = Concentracin de clulas = [N Clulas / mL] n = Promedio de clulas contadas. F.D. = Factor de dilucin = 10 (10 L de suspensin celular en 90 L de azul de tripano). Factor de cmara = 10,000.

Conociendo que la concentracin celular es de 2,375,000 clulas / mL, se procedi a diluir 150 L de la suspensin celular obtenida en 3.25 mL de medio DMEM / SFB (3.4 mL de solucin celular total) para poder llenar los 32 pozos de la microplaca con 10,000 clulas (100 L) cada uno. Para la siembra de clulas HeLa en la placa de 6 pozos se diluy 2.95 mL de la suspensin celular en 11.05 mL de medio DMEM complementado, para poder sembrar 1*10 6 clulas por pozo en 2 mL.

Conteo de fibroblastos Este experimento se realiz en 2 ocasiones, por ello se tiene dos conteos y por lo tanto dos ensayos de citotoxicidad.

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26

23

El promedio de fibroblastos no teidos encontrados en la cmara de Neubauer en una ocasin es de 25 y en otra de 3. En el segundo ensayo solo se realiz la prueba de viabilidad por MTT. Se procedi a calcular la concentracin celular de ambos conteos:

Para la concentracin de 2,550,000 clulas se procedi diluir 133 L de la suspensin celular obtenida en 3.27 mL de medio DMEM F12 / SFB (3.4 mL de solucin celular) para poder llenar los 32 pozos de la microplaca, por lo tanto en cada pozo se tenan aproximadamente 10,000 fibroblastos. Para la siembra de fibroblastos en la placa de 6 pozos se diluy 2.75 mL de la suspensin celular en 11.25 mL de medio DMEM F12 complementado, para poder sembrar 1*10 6 clulas por pozo en 2 mL. Para el segundo ensayo de MTT para los fibroblastos, se sembraron cerca de 8,823 fibroblastos por pozo.

6.2 Ensayo de citotoxicidad Mtodo de MTT La exposicin de las clulas HeLa y de los fibroblastos al compuesto N (3 acetoxi 4 carboxi fenil) maleimida se realiz cuando en cada pozo exista un porciento de confluencia entre el 50 y 60%. Las lecturas en el lector de Elisa para ambos tipos de clulas se realizaron a 595 y 630 nm. Los datos obtenidos por el espectrofotmetro lector de Elisa a 595 nm fueron los siguientes:

Absorbancia 595 nm (Fibroblastos) Blanco 0.278 0.164 0.128 0.169 Testigo 0.640 0.485 0.456 0.483 Concentracin de la N (3 acetoxi 4 carboxi fenil) maleimida (mM) 10.6 5.3 2.65 1.325 0.6625 0.33125 0.300 0.323 0.420 0.406 0.459 0.414 0.448 0.454 0.462 0.494 0.497 0.482 0.511 0.532 0.515 0.564 0.565 0.545 0.534 0.648 0.651 0.621 0.617 0.561

Promedio de lectura de Absorbancia 595 nm 0.154 0.475 0.383 0.444 0.484 0.531 0.573 0.613

Coeficiente de variacin de lectura de Absorbancia 595 nm 14.55627 3.41223 13.68953 4.58293 3.28318 4.54623 9.00880 6.12843

Absorbancia 595 nm (Clulas HeLa) Blanco 0.042 0.040 0.041 0.037 Testigo 0.733 0.602 0.726 0.743 Concentracin de la N (3 acetoxi 4 carboxi fenil) maleimida (mM) 10.6 5.3 2.65 1.325 0.6625 0.33125 0.516 0.452 0.476 0.475 0.548 0.646 0.715 0.573 0.655 0.665 0.665 0.684 0.608 0.653 0.632 0.702 0.674 0.766 0.659 0.717 0.699 0.699 0.829 0.678

Promedio de lectura de Absorbancia 595 nm 0.040 0.701 0.480 0.589 0.667 0.649 0.704 0.726

Coeficiente de variacin de lectura de Absorbancia 595 nm 5.40062 9.46757 5.54203 8.64542 1.81655 6.16233 6.83099 9.53000

Los datos obtenidos por el espectrofotmetro lector de Elisa a 630 nm fueron los siguientes:
Absorbancia 630 nm (Fibroblastos) Blanco 0.265 0.156 0.122 0.161 Testigo 0.322 0.268 0.254 0.264 Concentracin de la N (3 acetoxi 4 carboxi fenil) maleimida (mM) 10.6 5.3 2.65 1.325 0.6625 0.33125 0.179 0.205 0.229 0.230 0.260 0.238 0.255 0.253 0.273 0.276 0.269 0.253 0.279 0.287 0.268 0.298 0.295 0.295 0.289 0.340 0.354 0.334 0.315 0.290

Promedio de lectura de Absorbancia 630 nm 0.146 0.262 0.221 0.252 0.268 0.283 0.305 0.323

Coeficiente de variacin de lectura de Absorbancia 630 nm 14.50186 2.75233 6.39484 3.76511 3.82554 4.47895 7.76689 8.44336

Absorbancia 630 nm (Clulas HeLa) Blanco 0.042 0.040 0.041 0.037 Testigo 0.427 0.319 0.375 0.364 Concentracin de la N (3 acetoxi 4 carboxi fenil) maleimida (mM) 10.6 0.300 0.258 0.266 0.255 5.3 0.304 0.331 0.358 0.299 2.65 0.339 0.338 0.336 0.345 1.325 0.320 0.349 0.325 0.387 0.6625 0.346 0.378 0.334 0.366 0.33125 0.354 0.351 0.432 0.339

Promedio de lectura de Absorbancia 630 nm 0.040 0.353 0.270 0.311 0.340 0.331 0.356 0.348

Coeficiente de variacin de lectura de Absorbancia 630 nm 5.40062 8.41316 7.67162 5.52923 1.14079 4.67888 5.54257 2.28082

El promedio de las lecturas de absorbancia y los coeficientes de variacin de estas fueron obtenidos a travs del las funciones del programa de Microsoft Office Excel. Se requiri tener el valor de coeficiente de variacin (C.V.) para conocer qu datos se dispersaban demasiado, y por lo tanto eliminarlos. Se tomo como parmetro que el C.V. fuese 15. Se de scartaron varios valores (sombreados en las tablas), para tener los C.V. de acuerdo al criterio establecido, y por lo tanto tener menos dispersin de resultados.

La concentracin de la N (3 acetoxi 4 carboxi fenil) maleimida se determina mediante el peso molecular de este (233 g / mol) y la formulacin de la solucin madre que est compuesta por 0.00494 g del compuesto en 0.2 mL de agua tipo I y en 1.8 mL de medio de cultivo complementado.

Se determina la concentracin de cada una de las 6 diluciones dividiendo la molaridad de la solucin madre entre 2 consecutivamente. El clculo de porciento de viabilidad celular se efecta sustrayendo de la lectura del testigo y de las 6 concentraciones, al valor de absorbancia del blanco. Calculo ejemplificado para el testigo y la Concentracin I del ensayo de clulas HeLa a 595 nm:

Para el testigo

Para la Concentracin I (10.6 mM N (3 acetoxi 4 carboxi fenil) maleimida)

Se debe de restar a cada lectura el blanco, ya que este comprende la absorcin comprendida por las clulas, el medio de cultivo y el material plstico de la microplaca. El testigo, por no ser expuesto al compuesto en evaluacin, se le considera como el 100% de viabilidad celular.

Se obtiene para cada ensayo (de fibroblastos y de clulas HeLa a 595 y 630 nm cada uno) l % de viabilidad.

Viabilidad celular (Fibroblastos) Concentracin de la N (3 acetoxi 4 carboxi fenil) maleimida (mM) 0 0.33125 0.6625 1.325 2.65 5.3 10.6 Promedio de Absorbancia 595 nm Ajustada 0.321 0.459 0.419 0.377 0.330 0.290 0.229 Porciento de Viabilidad (%) 100.00 142.94 130.63 117.39 102.83 90.37 71.44

Viabilidad celular (Clulas HeLa) Concentracin de la N (3 acetoxi 4 carboxi fenil) maleimida (mM) 0 0.33125 0.6625 1.325 2.65 5.3 10.6 Promedio de Absorbancia 595 nm Ajustada 0.661 0.686 0.664 0.609 0.627 0.549 0.440 Porciento de Viabilidad (%) 100.00 103.82 100.45 92.10 94.89 83.06 66.53

Viabilidad celular (Fibroblastos) Concentracin de la N (3 acetoxi 4 carboxi fenil) maleimida (mM) 0 0.33125 0.6625 1.325 2.65 5.3 10.6 Promedio de Absorbancia 630 nm Ajustada 0.116 0.177 0.158 0.137 0.121 0.105 0.075 Porciento de Viabilidad (%) 100.00 152.95 136.96 118.16 104.97 90.92 64.84

Viabilidad celular (Clulas HeLa) Concentracin de la N (3 acetoxi 4 carboxi fenil) maleimida (mM) 0 0.33125 0.6625 1.325 2.65 5.3 10.6 Promedio de Absorbancia 630 nm ajustada 0.313 0.308 0.316 0.291 0.300 0.271 0.230 Porciento de Viabilidad (%) 100.00 98.51 101.07 93.18 95.79 86.78 73.48

Se procede a graficar l % de Viabilidad celular contra la concentracin del compuesto de inters para 595 y 630 nm de los ensayos sobre los fibroblastos y las clulas HeLa:

Figura 9. Ensayo de capacidad metablica (MTT) de fibroblastos y clulas HeLa ledo a 595 nm.

Figura 10. Ensayo de capacidad metablica (MTT) de fibroblastos y clulas HeLa ledo a 630 nm.

6.3 Anlisis morfomtrico de los fibroblastos y de las clulas HeLa Se tomaron las fotografas de los cubreobjetos teidos por la tcnica de Papanicolaou con ayuda de una cmara digital acoplada al microscopio de fluorescencia. A continuacin se presentan las imgenes de los testigos y de las clulas (fibroblastos y clulas HeLa) expuestas a diversas concentraciones de la N (3 acetoxi 4 carboxi fenil) maleimida.

Figura 11. Fibroblastos de ratn. Muestra Testigo.

Figura 12. Fibroblastos de ratn expuestos a una concentracin de 10.6 mM de maleimida.

Figura 13. Fibroblastos de ratn expuestos a una concentracin de 5.3 mM de maleimida.

Figura 14. Fibroblastos de ratn expuestos a una concentracin de 2.65 mM de maleimida. Centro germinal.

Figura 15. Fibroblastos de ratn expuestos a una concentracin de 1.325 mM de maleimida.

Figura 16. Fibroblastos de ratn expuestos a una concentracin de 0.6625 mM de maleimida.

Figura 17. Fibroblastos de ratn expuestos a una concentracin de 0.33125 mM de maleimida.

Figura 18. Lnea celular HeLa. Muestra testigo.

Figura 19. Clulas HeLa expuestas a una concentracin de 10.6 mM de maleimida.

Figura 20. Clulas HeLa expuestas a una concentracin de 5.3 mM de maleimida.

Figura 21. Clulas HeLa expuestas a una concentracin de 2.65 mM de maleimida.

Figura 22. Clulas HeLa expuestas a una concentracin de 1.325 mM de maleimida.

Figura 23. Clulas HeLa expuestas a una concentracin de 0.6625 mM de maleimida.

Figura 24. Clulas HeLa expuestas a una concentracin de 0.33125 mM de maleimida.

7. Discusin de Resultados:
7.1 Preparacin y esterilizacin del material, limpieza del cuarto de cultivo, preparacin del medio de cultivo y pruebas de esterilidad. El xito de la prctica depende fundamentalmente de las buenas prcticas de laboratorio, la limpieza que se efectu en el cuarto de cultivo, la higiene y cuidado del personal que labore en esta rea, el manejo adecuado de reactivos y material biolgico y la correcta limpieza y esterilizacin del material (en autoclave a aproximadamente 1.5 Kg / cm 2 durante 15 minutos). La utilizacin de alcohol etlico al 70% en las superficies del cuarto de cultivo, del material desechable, de plstico y de vidrio, campana de flujo laminar y en las manos permiten mantener condiciones necesarias de asepsia; de ello depende que las inocuidad se mantenga en el rea de trabajo, se evite en la medida de lo posible el riesgo de contaminacin de tipo bacteriana y por lo tanto errores en los resultados obtenidos. El medio de cultivo DMEM y F12 se complement con SFB al 7%, debido que este suero posee factores de crecimiento, y algunos metabolitos como el piruvato que favorecen la fosforilacin oxidativa y por ende la produccin de compuestos de alta energa (ATP). Esta concentracin tambin favorece la duplicacin de las clulas durante la fase de crecimiento exponencial. El uso de antibitico en la formulacin del medio DMEM y F12 disminuye en gran medida la posibilidad de tener contaminacin microbiana, sin embargo se debe ser cuidadoso con el manejo de ello ya que puede afectar la viabilidad celular del cultivo. Es importante realizar las pruebas de esterilidad del medio como una medida de seguridad, para corroborar que las condiciones de inocuidad se han mantenido. 7.2 Descongelacin de las clulas (Rehabilitacin de una lnea celular) Fue importante llevar correctamente este procedimiento, que implica evitar que las clulas descongeladas sufran el menor dao mecnico y se mantenga su integridad durante la transferencia del criotubo a la botella de cultivo, as como cuidar que el medio agregado no se desagasifique (perdida de CO2), lo que implica que el valor de pH se mantenga en el parmetro necesario para que se lleve el cultivo en las mejores condiciones. El adicionar los diferentes volmenes de medio de cultivo y homogenizar con la suspensin celular, permite a la clula adaptarse gradualmente a las condiciones de cultivo. 7.3 Mantenimiento de la lnea celular HeLa Durante el cultivo celular fue importante consultar las indicaciones y recomendaciones contenidas en el catalogo de la ATCC. Esta informacin explica las condiciones requeridas para llevar a cabo el cultivo de clulas de forma ptima. Para el caso de la lnea celular HeLa, se explica que las condiciones de cultivo deben de tener una concentracin de SFB al 10% como complemento del medio, una temperatura de 37 C y una tensin de CO 2 de 5% y de 95% de aire. Para el caso de esta prctica, el medio complementado con SFB al 7% mantiene las condiciones ptimas de

propagacin de la lnea celular. Estos factores de crecimiento repercuten en su morfologa y favorecen la formacin la monocapa de clulas (proliferacin). El recambio de CO 2 ayuda a mantener el pH ptimo, ya que en contacto con el medio acuoso se transforma en cido carbnico (H2CO3) y sales de bicarbonato, permitiendo que el medio no se alcalinice. Es importante por su parte estar al pendiente de la concentracin celular, ya que una alta confluencia de clulas implica que se llegue a agotar el medio, lo que dificulta el subcultivo en un futuro y en el peor de las circunstancias a la muerte celular. La lnea celular HeLa es muy proliferante, por lo que su propagacin en realidad resulta ser muy sencilla, siempre y cuando se tenga cuidado de no daar a las clulas y cuidar que el medio de cultivo este siempre en las condiciones ptimas de pH e inocuidad bacteriana. 7.4 Subcultivo y tripsinizacin (Pase) La tripsinizacin permiti desprender las clulas que crecieron en la botella de cultivo tanto de la lnea celular, como de los fibroblastos. Esta enzima junto con el Verseno (EDTA) ayuda a aislar las clulas, que se adhirieron a la botella, para realizar la cuenta celular y el estudio citotxico del compuesto de inters. Es importante mencionar que la tripsinizacin se debe de realizar con cuidado, ya que la enzima puede afectar negativamente la integridad del cultivo celular (dao proteoltico a la membrana), dependiendo del tiempo de contacto con esta proteasa. Es por ello que se realiz la neutralizacin de la tripsina con medio de cultivo complementado, en donde este el suero fetal bovino compite como sustrato por el sitio activo de la enzima, evitando as el menor dao a las clulas. Tambin fue importante que la correcta tripsinizacin permitiera recuperar el mayor nmero de clulas. 7.5 Congelacin celular Las clulas a congelar, recibieron un tratamiento previo al congelamiento, que implic la incubacin en hielo a 4 C por 30 min (ambientacin de la clula a una menor temperatura) y ligeros movimientos que no permiten la formacin de cristales grandes que pudieran daar la integridad celular. El Dimetilsulfxido es un agente criognico que se coloca en la membrana celular y le ofrece mayor flexibilidad a esta, permitiendo que sufra el menor deterioro por el cambio de temperatura. 7.6 Cultivo primario El cultivo primario es una herramienta muy importante para la obtencin de clulas procedentes de un rgano o tejido, en donde este es disgregado enzimtica o mecnicamente. Las clulas disociadas resultantes de este proceso pueden ser sembradas en botellas con medio de cultivo, y pueden emplearse como un testigo cuando se est evaluando alguno agente qumicos (compuestos con posible actividad antineoplsica) a los cuales se les desea determinar si son citotxicos, y si lo son, conocer a que concentraciones pueden generar algn efecto indeseable en tejidos propios de un organismo.

Durante el desarrollo de cultivo primario en la prctica, fue importante mantener las condiciones de asepsia y esterilidad en cada una de las etapas del experimento. Fue importante emplear la solucin de Tripsina a la concentracin de 0.25%, lo que favoreci la mayor disgregacin de los embriones. La siembra en la botella de cultivo, y las condiciones a los cuales se mantuvieron los fibroblastos en incubacin fueron de gran relevancia, debido a que la combinacin de medios de cultivo (DMEM F12) aport los requerimientos metablicos, energticos y de crecimiento necesarios para la prevaleca, adhesin y formacin de la monocapa deseada. Fue posible percatarse que los fibroblastos formaban centros germinales, en donde las clulas se colocaban una sobre otra, lo cual es tpico de este tipo de cultivos. Fue necesario disgregar estos centros germinales para poder inducir la formacin de la monocapa y as poder proseguir con el conteo de clulas para realizar el ensayo de citotoxicidad y la tincin de Papanicolaou. 7.7 Conteo celular El conteo celular se realiz mediante una prueba de viabilidad de exclusin de colorante, donde una alcuota de 10 L de suspensin celular se puso en contacto con una solucin de azul de tripano al 0.02%. Las clulas que fueron teidas por el colorante son aquellas que sufrieron algn dao en su membrana y por lo tanto permitieron la retencin del colorante dentro de ellas, mientras que aquellas que mantuvieron su integridad no se tien. La observacin de la coloracin de las clulas en la cmara de Neubauer facilit el conteo de aquellas que aun son viables, y se efectu el promedio de estas. Conociendo el factor de la cmara y la dilucin empleada se conoci la concentracin celular tanto de los fibroblastos (2,550,000 clulas por mililitro) como de las de la lnea HeLa (2,375,000 clulas por mililitro) para la siembra en las placas con cubre objetos de 6 pozos, como en las de 96. 7.8 Ensayo de citotoxicidad Mtodo de MTT El ensayo de citotoxidad por el mtodo de la reduccin de la sal de MTT a formazan, arroj unas curvas de viabilidad celular que muestra que a la concentracin de 10.6 mM de la N (3 acetoxi 4 carboxi fenil) maleimida, el compuesto tiene un efecto considerablemente negativo en la viabilidad tanto de los fibroblastos como de las clulas HeLa (Figuras 9 y 10). Sin embargo a concentraciones menores a 2.65 mM, de acuerdo a los grficos, la disminucin de la viabilidad solo parece afectar a las clulas de cncer cervicouterino, mientras que los fibroblastos parecen incrementar su crecimiento (valores de viabilidad celular mayores al 100% para los fibroblastos). Esta tendencia puede implicar que en un rango de concentraciones del compuesto, solo haya efecto citotxico en clulas cancerosas, y que una elevada concentracin mayor a 5.3 mM tiene un efecto totalmente negativo tanto en clulas tumorales, como epiteliales. Se propone que se llevara acabo de nuevo el experimento, para corroborar si existe repetitividad de los resultados, y as poder tener una idea concluyente. Se sugiere que tambin se pruebe otros

intervalos de concentraciones que se encuentren dentro de los lmites de afectacin a los fibroblastos. 7.9 Anlisis morfomtrico de los fibroblastos y de las clulas HeLa Este anlisis se realiz a partir de la tincin de Papanicoloaou, donde los fibroblastos y las clulas HeLa se tien con diferentes colorantes tanto el ncleo, los nuclolos y el citoplasma para su identificacin en el microscopio. Se llev el seguimiento del dao a la morfologa de los fibroblastos y de clulas HeLa debido a la exposicin de estas a las diferentes concentraciones de la N (3 acetoxi 4 carboxi fenil) maleimida. Para los fibroblastos se pudo observar que entre las concentraciones de 1.325 a 10.6 mM del compuesto, las clulas sufren un dao en la membrana celular, ya que el citoplasma no se alarga en su forma caracterstica como se puede comparar con la muestra testigo (Figura 11). Tambin es posible percatarse que los ncleos de las clulas se ven abombados o hinchados, adems que unas presentan un dao membranal como de ruptura de la envoltura (Figuras 12, 13, 14 y 15). Las muestras expuestas a las 2 menores concentraciones del compuesto, parecen no tener un dao importante, ya que su morfologa caracterstica de alargamiento del fibroblastos est presente, y disminuye los espacios de inhibicin de crecimiento (Figuras 16 y 17). Para las clulas de cncer cervicouterino, es posible observar que igual forma, las muestras expuestas a las mayores concentraciones de la maleimida (Figuras 19, 20 y 21), sufren un dao a nivel de citoplasma y de abultamiento de ncleo. A pesar de la gran confluencia celular, es posible percatarse de espacio de inhibicin de crecimiento por efecto del compuesto. Es tambin posible identificar que a medida que disminuye la concentracin del compuesto, la clulas HeLa son ms parecidas en cuanto a su morfologa con respecto a la muestra testigo (Figura 18). Estos resultados pueden explicaran, fsicamente, la perdida de viabilidad de las clulas encontradas en los ensayos de capacidad metablica y por ende el efecto de este compuesto en la morfologa de las clulas tanto epiteliales como de carcter tumoral.

8. Conclusiones:
Las buenas prcticas de laboratorio y las condiciones de esterilidad evitan la contaminacin microbiana. La formulacin del medio es fundamental para llevar a cabo el cultivo celular. La lnea celular HeLa tiene condiciones ptimas de cultivo. El cultivo primario es una herramienta importante cundo se requiere tener clulas que funjan como testigo en ensayos de citotoxicidad. La correcta tripsinizacin permite obtener el mayor nmero de clulas recuperadas y evita el menor dao a la integridad celular. El conteo celular fue mayor a 2 millones de clulas por mililitro para los dos tipos de estirpes celulares. Las concentraciones del compuesto que afecto considerablemente la viabilidad celular y su morfologa son mayores a 1.325 mM.

9. Bibliografa:
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