ANLISE DA QUANTIDADE DE FERRO NA FERRITINA

RELATRIO DO TRABALHO PRTICO A

LICENCIATURA EM BIOQUMICA

CATARINA CRUZ VAZ E PATRCIA FERREIRA DE CASTRO, TURMA P4 Data de realizao: 07 de Maro de 2013 Data de entrega: 21 de Maro de 2013

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NDICE
Resumo ......................................................................................................................................................... 3 Parte experimental ....................................................................................................................................... 3 Reagentes ................................................................................................... Erro! Marcador no definido. Instrumentao .......................................................................................... Erro! Marcador no definido. Alteraes ao procedimento experimental fornecido ............................................................................. 4 Preparao da soluo padro de DHF .................................................................................................... 4 Resultados experimentais ............................................................................................................................ 5 Determinao do mx e do para o complexo [Fe(o-fenantrolina)3] .................................................... 5 Determinao do mx e do para o complexo [Fe(ferrozina)3] ............................................................. 7 Clculo da quantidade de ferro na ferritina ............................................................................................. 8 Soluo de ferritina com o-fenantrolina .............................................................................................. 9 Soluo de ferritina com ferrozina ..................................................................................................... 10 Discusso dos resultados e concluses ...................................................................................................... 10 Bibliografia.................................................................................................................................................. 12
42+

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ANLISE DA QUANTIDADE DE FERRO NA FERRITINA

RESUMO
O objectivo deste trabalho prtico foi quantificar o nmero de tomos de ferro presentes por molcula de ferritina. A ferritina uma protena armazenadora de ferro na sua forma oxidada. Para quantificarmos a quantidade de ferro na ferritina primeiro tivemos que adicionar cido sulfrico que levou desnaturao da protena e s assim o ferro armazenado consegue ser libertado dos canais formados pelas subunidades da ferritina para o podermos quantificar. Usamos ainda um agente redutor- DHF- que reduz o Fe(III) a Fe (II) pois s nesta forma possvel dosear o ferro atravs da utilizao de um agente quelante. Ou seja, utilizamos dois quelantes diferentes (o-fenantrolina e ferrozina) para determinar a quantidade de ferro armazenada na ferritina, pois os quelantes ligam-se ao ferro na sua forma reduzida permitindo o seu doseamento. Utilizando dois quelantes diferentes vamos ainda poder comparar qual dos dois actua como melhor agente quelan te dependendo do que conseguir captar mais tomos de ferro.

RESULTADOS OBTIDOS EXPERIMENTALMENTE

mx / nm 509 nm / mol .dm .cm 12282
1 -3 -1

N tomos Fe/ molcula ferritina 199

Tabela 1. Valores obtidos para a soluo com o-fenantrolina

mx / nm 564 nm

/ mol .dm .cm 36736

-3

-1

N tomos Fe/ molcula ferritina 311

Tabela 2. Valores obtidos para a soluo com ferrozina

PARTE EXPERIMENTAL REAGENTE MARCA

Ferritina o-fenantrolina SIGMAALDRICH VWR International BVBA/ Carlo ERBA Reagents

QUALIDADE
99%

PERIGOS
Txico por ingesto. Muito txico para os organismos aquticos com efeitos duradouros.

Acetato de sdio

100%

cido sulfrico DHF Soluo padro Fe(II)

97% 99%

Corrosivo. Provoca queimaduras na pele e leses oculares graves. Lquido e vapor facilmente inflamveis. Pode libertar perxidos explosivos

Tabela 3- Dados relativos aos reagentes utilizados neste trabalho prtico

Marca Espectrofotmetro UNICAM Balana Mettler Toledo

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Modelo UV300 AG204

Erros e incertezas 0,001 0,0001 g

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Tabela 4 - Dados relativos instrumentao laboratorial utilizada neste trabalho prtico

ALTERAES AO PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL FORNECIDO

A nica alterao verificada em comparao com o procedimento experimental fornecido foi a utilizao de uma soluo padro de Fe(II) de mol/L, em vez de uma soluo de concentrao mol/L.

PREPARAO DA SOLUO PADRO DE DHF

PREPARAO DA SOLUO AQUOSA DE DHF DE CONCENTRAO 5MMOL/L

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RESULTADOS EXPERIMENTAIS DETERMINAO DO m x E DO PARA O COMPLEXO [FE( o -FENANTROLINA) 3 ] 2+

De forma a traar uma recta de calibrao cuja expresso permitisse determinar o mx e o para solu2+ es do complexo [Fe(o-fenantrolina)3] , foram preparadas 5 solues a partir da soluo padro de Fe(II), presente em diferentes concentraes, contendo DHF, NaCH3COO e o-fenantrolina, e ainda um ensaio a branco, todas com um volume final de 25,00 mL. Os dados referentes s solues preparadas encontram-se sucintamente apresentados na tabela que se segue: Soluo branco 1 2 3 4 5 VFe/mL 0,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 [Fe ]/mol.dm 0,00E+00 8,00E-06 1,20E-05 1,60E-05 2,00E-05 2,40E-05
2+ -3

Tabela 5 - Volume de soluo padro de Fe(II) e respectiva concentrao final em cada soluo, em mol/dm3

A concentrao de Fe(II) foi calculada atendendo diluio efectuada, atravs da expresso: [ ] [ ]

( )

Antes da medio da absorvncia das diferentes solues, era necessrio determinar o comprimento de onda no qual se verificava absorvncia mxima, atravs do espectro de absorvncia da soluo mais concentrada:

ESPECTRO DE ABSORO DO COMPLEXO [FE(O-FENANTROLINA)3]2+ (400-800 NM)

0.35 0.3 0.25 Absorvnica 0.2 0.15 0.1 0.05 0 400 450 500 550 600 /nm
Grfico 1 - Espectro de absoro obtido para a soluo mais concentrada do complexo [Fe(o-fenantrolina)3]2+ no intervalo de comprimento de onda de 400 a 800 nm (zona UV-VIS), e respectivo mx.

mx = 509 nm Abs = 0,3254

650

700

750

800

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Dado que o comprimento de onda de absorvncia mxima de 509 nm, a medio da absorvncia das 2+ solues padro do complexo [Fe(o-fenantrolina)3] foi efectuada para esse valor de comprimento de onda. A reaco espectrofotometricamente analisada foi a seguinte: [ ( ) ] ( ) ( ) [ ( ) ] ( ) ()

ABS(509 NM) DAS SOLUES DO COMPLEXO [FE(O-FENANTROLINA)3]2+

0.350 0.300 0.250 Abs(509 nm) 0.200 0.150 0.100 0.050 0.000 0.00E+00 5.00E-06 1.00E-05 1.50E-05 [Fe2+]/mol.dm-3
Grfico 2 - Valores de absorvncia, a um comprimento de onda de 509 nm, das solues preparadas do complexo [Fe(ofenantrolina)3]2+, e respectiva recta de calibrao e erro quadrtico

Abs = 12282[Fe2+] + 0,0046 R = 0,9688

2.00E-05

2.50E-05

3.00E-05

Tendo ainda em considerao os erros de regresso linear da recta de calibrao, esta est definida como ( )[ ] . Ento, para as solues do complexo [Fe(o2+ fenantrolina)3] , a equao da recta de calibrao obtida foi: [( ) ][ ]

A lei de Lambert-Beer descreve a relao estabelecida entre a absorvncia e a concentrao de uma soluo atravs da expresso , sendo a absortividade molar, a distncia percorrida pelo feixe de luz UV atravs da soluo (corresponde largura da cuvete, 1 cm) e c a concentrao da soluo. Deste modo, o valor da absortividade molar corresponde ao declive da recta. Ento:

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DETERMINAO DO m x E DO PARA O COMPLEXO [Fe(FERROZINA) 3 ] 4A determinao dos valores de mx e para o complexo com ferrozina foi efectuada de forma semelhante adoptada para o complexo de o-fenantrolina. Foram preparadas 5 solues a partir da soluo padro de Fe(II) presente em diferentes concentraes, e ainda um ensaio a branco, todas com um volume final de 1,5 mL. Os dados referentes s solues preparadas encontram-se sucintamente apresentados na tabela que se segue: Soluo branco 1 2 3 4 5 VFe/L 0 120 180 240 300 360 [Fe ]/mol.dm 0,00E+00 8,00E-06 1,20E-05 1,60E-05 2,00E-05 2,40E-05
2+ -3

Tabela 6 - Volume de soluo padro de Fe(II) e respectiva concentrao final em cada soluo, em mol/dm3

Tal como para as solues do complexo com o-fenantrolina, a concentrao de ferro em cada soluo foi calculada atravs da expresso seguinte: [ ] [ ]
( )

Inicialmente, foi determinado o comprimento de onda de absorvncia mxima, a partir do espectro obtido:

ESPECTRO DE ABSORO DO COMPLEXO [FE(FERROZINA)3]4- (400-800 NM)

0.9 0.8 0.7 Absorvncia 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 400 450 500 550 600 /nm
Grfico 3 - Espectro de absoro obtido para a soluo mais concentrada do complexo [Fe(ferrozina)3]4- no intervalo de comprimento de onda de 400 a 800 nm (zona ultravioleta-visvel do espectro electromagntico), e respectivo mx.

mx= 564 nm Abs= 0,8304

650

700

750

800

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Dado que o comprimento de onda de absorvncia mxima de 564 nm, a medio da absorvncia das 4solues padro do complexo [Fe(ferrozina)3] foi efectuada para esse valor de comprimento de onda. A reaco espectrofotometricamente analisada foi a seguinte: [ ( ) ] ( ) ( ) [ ( ) ] ( ) ()

ABS(564 NM) DAS SOLUES DO COMPLEXO [FE(FERROZINA)3]41.000 0.900 0.800 Abs(509 nm) 0.700 0.600 0.500 0.400 0.300 0.200 0.100 0.000 0.00E+00 5.00E-06 1.00E-05 1.50E-05 [Fe2+]/mol.dm-3 Tendo ainda em considerao os erros de regresso linear da recta de calibrao, esta est definida como ( )[ ] . Ento, para as solues do complexo 4[Fe(ferrozina)3] , a equao da recta de calibrao obtida foi: [( ) ][ ] 2.00E-05 2.50E-05 3.00E-05 Abs = 36736[Fe2+] + 0,0109 R = 0,9943

Deste modo, o valor da absortividade molar corresponde ao declive da recta. Ento:

CLCULO DA QUANTIDADE DE FERRO NA FERRITINA

A quantidade de ferro na ferritina foi determinada em quatro solues preparadas a partir de soluo stock de ferritina 0,5 mg/mL, sendo que duas delas continham o-fenantrolina e as duas restantes continham ferrozina, a concentraes idnticas duas a duas. Para cada conjunto, foi tambm preparado um ensaio a branco. Foram medidas as absorvncias para todas as solues, sendo os resultados desta medio sucintamente apresentados na seguinte tabela: Soluo branco 1 2 mdia Abs (564 nm) 0,000 0,455 0,472

0,464

Tabela 5 - Valores de absorvncia obtidos para as solues de ferritina preparadas com o-fenantrolina

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Soluo branco 1 2 mdia

Abs (509 nm) 0,000 0,106 0,101 0,104

Tabela 6 - Valores de absorvncia obtidos para as solues de ferritina preparadas com ferrozina

Como proceder ao clculo da quantidade de ferro presente na ferritina analisada? Admitindo que todo o Fe(III) presente no mineral core da ferritina foi reduzido e complexou com a ferrozina ou com a o-fenantrolina, ento: [ ]
( ) ( )

A concentrao de Fe(II) que complexa pode ser determinada atravs da recta de calibrao correspondente soluo do complexo a que se refere o clculo, anteriormente construda. A massa do mineral core permite-nos determinar a quantidade de ferro a presente. Logo:
( )

O mineral core tem uma massa de 97,7 gramas por cada mole de Fe (III) a presente, pelo que este se considera um valor de massa molar. A massa de apoferritina pode ser determinada pela diferena entre a massa total de ferritina e a massa do mineral core. A massa de ferritina calculada da seguinte forma: [ ]

Assim, o quociente entre a quantidade de Fe(III) e a quantidade de apoferritina permite-nos saber a quantidade de ferro por molcula de ferritina:

SOLUO DE FERRITINA COM o -FENANTROLINA Pela recta de calibrao . Ento, [ [ ]

( ) ( ( ) )

[ ]

] .

, sendo a mdia das absorvncias medidas

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SOLUO DE FERRITINA COM FERROZINA

Pela recta de calibrao, . Ento, [ [ ]
( ) ( ( ) )

[ ]

] .

, sendo a mdia das absorvncias medidas

O clculo do nmero de tomos de ferro por molcula de ferritina pode tambm ser efectuado com base na seguinte expresso geral: [ [( [ ]) ]
( )]

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DISCUSSO DOS RESULTADOS E CONCLUSES

A determinao do espectro de absoro na zona de comprimento de onda do UV-VIS permitiu determinar o comprimento de onda mximo para os complexos de ferrozina e o-fenantrolina, aos quais foi medida a absorvncia para as solues preparadas do complexo correspondente. O comprimento de onda mximo obtido no espectro de absoro do complexo [Fe(o-fenantrolina)3] [1] foi de 509 nm, muito prximo do valor de 510 nm fornecido. O mesmo acontece com o espectro do 4complexo [Fe(ferrozina)3] , para o qual obtivemos um comprimento de onda de absoro mxima de [2] 564 nm, sendo que o valor encontrado na literatura foi de 562 nm.
2+ [1] 2+

O valor fornecido de absortividade molar para o complexo [Fe(o-fenantrolina)3] foi de 11 100 mol 1 3 -1 -1 3 -1 dm cm , que se afasta um pouco do valor obtido, 12 282 mol dm cm . J para o complexo 4-1 3 -1 [Fe(ferrozina)3] , o afastamento do valor obtido (36 736 mol dm cm ) em relao ao valor presente na [2] -1 3 -1 literatura ( 27 900 mol dm cm ) ainda mais acentuado, e, de facto, o erro padro associado a estes valores, apresentados anteriormente, um pouco elevado se tivermos em considerao a ordem de grandeza dos valores de absortividade molar (correspondentes ao declive das rectas de calibrao) e os erros padro associados a estes. Esta elevada incerteza pode dever-se a eventuais erros experimentais, como erros do espectrofotmetro, ou erros ocorridos durante a preparao das solues analisadas. Ao preparar as diferentes solues usando a o-fenantrolina e a ferrozina como agentes complexantes ocorreu o aparecimento de diferentes cores, sendo que as solues com o-fenantrolina tinham uma cor alaranjada e as solues com ferrozina apresentavam uma cor roxa. Tendo em conta o tipo de ligando de cada complexo, seria de esperar que nenhuma das solues apresentasse cor, pois so ambos ligan2+ dos de campo forte, ou seja de spin baixo, e como o tomo de Fe tem uma configurao electrnica 6 [Ar] d todos os electres se encontram emparelhados no estado de menor energia pois o maior que a energia de emparelhamento. Sabemos que os ligandos so de campo forte pois so aceitadores devido sua estrutura com ligaes duplas e deslocalizaes electrnicas (o facto de possuir orbitais 2+ vazias significa que so capazes de captar electres), ento o metal Fe ter uma configurao octadrica estvel de spin baixo, como j referido. A imagem seguidamente apresentada permite verificar que no existem transferncias electrnicas d-d permitidas por spin, pois todos os electres se encontram emparelhados no estado de menor energia.

Imagem 1. Configurao electrnica do Fe2+ no estado de spin baixo.

Observando os valores de absortividade molar obtidos para cada complexo verificam-se valores bastan-1 3 -1 te elevados (superiores a 1 000 mol dm cm ) o que indica que ocorreu uma transferncia de carga permitida por simetria. Observa-se, em ambos os espectros de absoro, apenas uma banda a comprimentos de onda mais baixo, a uma energia superior, o que indica, de facto, o que j constatamos acerca da transferncia de carga. No aparecem mais bandas o que tambm nos indica que no ocorre nenhuma transio d-d permitida por spin, tal como era esperado. A cor das solues com os complexos de o-fenantrolina e ferrozina em cima mencionados ocorrem portanto devido transferncia de carga referida, visto que nenhuma transio d-d permitida pelo que a cor das solues deveria ser incolor mas tal no acontece como verificamos experimentalmente.

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O facto de termos obtido um nmero to baixo em relao ao esperado para o nmero de tomos de ferro por molcula de ferritina pode advir de alguns pressupostos que seguimos para efectuar os clculos, que foram os seguintes: A quantidade de cido sulfrico utilizada foi suficiente para desnaturar completamente a protena e assim, pressupomos que todo o Fe(III) presente na ferritina foi libertado. A quantidade de DHF (agente redutor) utilizada foi suficiente para reduzir todo o Fe(III) a Fe(II), e assim todo o ferro pde ser captado pelos agentes quelantes para posterior quantificao.

Alm de estes pressupostos poderem no ser totalmente verdadeiros, o afastamento dos valores de absortividade molar para ambos os complexos em relao literatura ter sido o factor que mais influenciou a ocorrncia desta discrepncia em relao ao nmero de tomos de ferro por molcula de ferritina que seria de esperar. Este valor, dado que directamente retirado da recta de calibrao construda para cada complexo por medio da absorvncia das solues padro correspondentes, afecta tambm directamente o clculo da concentrao de ferro na ferritina e, portanto, o clculo final da quantidade de ferro presente nesta protena. Para alm destes factores, o coeficiente de correlao linear (R ) da recta de calibrao efectuada a partir das solues padro de o-fenantrolina (R = 0,9688) afasta-se um pouco mais da unidade do que o que seria de esperar para uma regresso linear de boa qualidade, podendo dar origem a uma propagao de erros considervel. Os valores obtidos para o nmero de tomos de ferro por molcula de ferritina foram, respectivamente, 199 e 311, para as solues em que o agente quelante foi a o-fenantrolina e a ferrozina. Cada molcula [2] de ferritina tem a capacidade de se ligar, atravs do seu mineral core, a um nmero mximo de 4500 tomos de ferro. Ento, tendo em conta os resultados obtidos, a taxa de saturao da ferritina obtida para a soluo com o-fenantrolina como agente quelante foi de 4,42%, e para a soluo com ferrozina como agente quelante foi de 6,91%, o que, em princpio, revela uma saturao muito baixa da ferritina da soluo stock. Em concluso, os resultados obtidos mostraram a ferrozina como um melhor agente quelante do Fe(II), apesar da baixa taxa de saturao obtida, pois complexou com um maior nmero de tomos de ferro, e assim levou a uma quantificao mais eficaz do nmero de tomos de ferro na ferritina do que usando o agente quelante o-fenantrolina.
2

BIBLIOGRAFIA FICHAS MSDS

Sigma-Aldrich - ficha de dados de segurana da 1,10-fenantrolina (99+)%, de acordo com a Regulamento (CE) No. 1907/2006. Verso 4.0 - Data de reviso 12.03.2010; disponvel no endereo: http://sites.ffclrp.usp.br/cipa/fispq/1,10-Fenantrolina.pdf Sigma-Aldrich - ficha de dados de segurana do cido sulfrico (ref. 339741), de acordo com a Regulamento (CE) No. 1907/2006 Verso 4.0 Data de reviso 14.03.2010; disponvel no endereo: http://sites.ffclrp.usp.br/cipa/fispq/Acido%20sulfurico.pdf Sigma-Aldrich - ficha de dados de segurana do 2,3-DHF 99% (ref. 200018), de acordo com a Regulamento (CE) No. 1907/2006

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Verso 5.0 Data de reviso 30.12.2011; disponvel no endereo: http://sites.ffclrp.usp.br/cipa/fispq/Acido%20sulfurico.pdf

[1]

Qumica Bioinorgnica - Trabalhos Prticos, Departamento de Qumica, Faculdade de Cincias da Universidade do Porto (2012/13); Trabalho prtico A Anlise da quantidade de ferro na ferritina
[2]

M. J. Donlin, R. F. Frey, C. Putnam, J.K. Proctor, J.K. Bashkin, J. Chem. Ed., 1998, 75, 437-441

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