Mtodos para la evaluacin nutricional de forrajes Hctor Jairo Correa Cardona, MSc.

Universidad Nacional de Colombia Sede Medelln Departamento de Produccin Animal 1. Introduccin. Los forrajes son la base de la alimentacin en los sistemas de produccin bovina en los trpicos y en algunos pases de las zonas templadas. Esto es debido a que los forrajes son alimentos de alta disponibilidad y suficientemente baratos para sostener una industria bovina competitiva. Incluso en algunos pases de zonas templadas como los Estados Unidos y Canad, donde los sistemas de produccin en confinamiento han sido importantes por muchas dcadas, los sistemas de produccin bajo pastoreo han estado ganando terreno en los ltimos tiempos debido a que resultan ms adecuados para las condiciones y retos que se plantean para la produccin animal moderna: estos son ms apropiados en trminos ambientales y de bienestar para los animales, amn de los menores costos, comparados con los sistemas de produccin bajo confinamiento (Clark y Jans 1995). El incremento en la demanda por alimentos sanos hace cada vez ms atractiva la produccin bajo pastoreo puesto que se ha demostrado que en estas condiciones la concentracin de compuestos nutraceticos en la carne y la leche bovina, tales como el cido linolico conjugado, es ms alta que en los productos de animales que reciben dietas mezcladas con granos (Dhiman et al 1999). Pero una industria bovina no se hace competitiva por el solo hecho de basar la alimentacin de sus animales en el pastoreo. Para ello se requieren forrajes de alta calidad nutricional. Esto implica que los animales deben consumir pasturas que contengan adecuados niveles de nutrientes de alta digestibilidad y que sean eficientemente utilizados para la deposicin de tejidos o la produccin de leche. De all que la calidad nutricional de los forrajes debe medirse como el producto del contenido de nutrientes, el consumo y la digestibilidad, todo lo cual, en ltima instancia se ver reflejado en el comportamiento productivo de los animales. De esta manera, la calidad nutricional de un forraje tambin podra leerse como la capacidad de cubrir las demandas nutricionales de los animales. As, el valor nutricional de un forraje no depende solamente de las caractersticas intrnsecas del forraje en s, si no adems, de los animales a los que se les ofrece. Esto significa que un forraje que puede ser bueno para una vaca seca y gestante podra resultar inadecuado para una vaca en produccin o un novillo en levante. Una ganadera moderna y eficiente debe partir, entonces, por conocer la calidad nutricional de sus forrajes y los requerimientos nutricionales de sus animales. En este documento se discutir lo concerniente a los mtodos para estimar la calidad nutricional de los forrajes. 2. Mtodos para determinar el contenido de nutrientes. Muchas son las fracciones nutricionales y los compuestos qumicos que se pueden analizar en un forraje. Sin embargo, el tipo de anlisis que se solicite para una muestra de forraje va a depender del uso que se le vaya a dar a dicha informacin. As, este anlisis puede ser tan simple como establecer si un solo componente nutricional es

deficiente en el forraje hasta la necesidad de estimar un balance nutricional completo, en el que la determinacin del contenido de nutrientes es solo una parte de la informacin necesaria. Para un mismo componente qumico se pueden utilizar diferentes mtodos de anlisis. De all que sea importante que en tales casos el anlisis est acompaado de la metodologa utilizada para poder hacer comparaciones vlidas. 2.1. Materia seca. La materia seca (MS) es el anlisis ms simple que se puede realizar sobre un forraje y se cuantifica como el residuo que queda luego de extraer el agua a la muestra. Aunque no es un anlisis qumico en s, es necesario para una adecuada caracterizacin de los componentes nutricionales de los forrajes ya que estos deben expresarse en base a la MS para hacer comparaciones vlidas y realizar el balance de nutrientes (Cherney 2000). Existen muchos mtodos para la determinacin de la MS. En el caso de forrajes frescos los mtodos oficialmente aprobados implican un secado previo parcial a 55 60oC durante 12 h y el molido de la muestra. Esta muestra luego puede ser sometida a diferentes procedimientos: el secado a 100oC en estufa al vaco (1.3 x 104 Pa) durante 5 h, el secado en estufa de aire forzado a 105oC por 16 h, a 125oC por 4 h a 135oC por 3 h (AOAC, 1995). El secado en horno microondas es un mtodo no oficialmente recomendado por la AOAC pero si por la NFTA (Undersander et al 1993) y consiste en el secado de una muestra de forraje de entre 100 y 200 gr en un horno microondas de 600 watts durante cuatro a cinco ciclos de 3 min y varios ciclos de 1 min hasta alcanzar el peso constante de la muestra residual. En el caso de ensilajes, debido al alto contenido de compuestos voltiles que se pueden perder con los procedimientos para forrajes frescos, se emplea la destilacin con tolueno como el mtodo preferido para estimar la MS (Undersander et al 1993).Tambin se han desarrollado algunos procedimientos para establecer el contenido de agua por mtodos cromatogrficos en forrajes fermentados (Fenton et al 1981). 2.2. Cenizas y Materia Orgnica. El residuo que queda luego de incinerar la muestra en una mufla a 600oC durante 2 horas (AOAC 1995), corresponde al contenido de cenizas. La fraccin que desaparece durante la combustin corresponde a la Materia Orgnica (MO). El contenido de cenizas de un forraje no aporta informacin sobre minerales especficos, pero es un paso intermedio para determinar el contenido de minerales en la muestra. 2.3. Protena Cruda. El mtodo comnmente utilizado para determinar el contenido de protena cruda (PC) en muestras de alimentos es el de Kjeldahl (Cherney 2000, Galyean 1997) el cual es muy preciso y confiable. Este mtodo realmente no determina el contenido de protena de la muestra, si no el de N en un procedimiento que comprende tres pasos: 1) digestin de la muestra durante 2 a 3 h en cido sulfrico a 350oC utilizando sulfato de potasio o de cobre (o una mezcla de los dos) como catalizador dando como resultado la formacin de sulfato de amonio, 2) adicin de NaOH fuerte a la solucin digerida para la formacin NH4OH el cual es calentado y destilado en una solucin de cido brico para retener el amonio y, 3) titulacin del NH4OH con un cido estndar (HCl cido sulfrico) al que se le adiciona un indicador (Galyean 1997).

No obstante la precisin y confiabilidad del mtodo Kjeldahl, este presenta varias desventajas que incluyen el hecho de requerir mucho tiempo y generar residuos peligrosos. Esto ha generado la necesidad de trabajar mtodos alternativos. Entre estos, el mtodo Dumas parece convertirse cada da en la mejor alternativa. En este mtodo la muestra es quemada en una atmsfera rica en oxgeno con lo que se genera gas nitrgeno el cual es medido por conductividad trmica (Galyean 1997). Este es un mtodo rpido (tarda entre 3 y 4 minutos por muestra) que no genera residuos peligrosos y de menor costo que el Kjeldahl. Tanto el mtodo Kjeldahl como el Dumas cuantifican el contenido de N total de la muestra y mediante un factor de conversin (FC) este es traducido en trminos de protena cruda. El clculo del factor de conversin se basa en la concentracin de N en las protenas de la muestra bajo el supuesto de que todo el N en la muestra hace parte de protenas (FC = 100/% de N) pero, dado que las protenas estn constituidas de aminocidos, el clculo realmente corresponde al promedio del contenido de N en los aminocidos. Este contenido, sin embargo, es variable encontrndose valores tan bajo como 7.73% en la tirosina y 8.4% en la fenilalanina hasta 24.1% en la arginina y 26.9% en la histidina. De esta manera, dependiendo de la proporcin de uno u otro aminocido en las protenas de la muestra, el porcentaje promedio de N cambia. Esto implica que, en principio, para cada tipo de alimento se debera tener un factor de correccin en funcin de su contenido de aminocidos, siendo menor en alimentos con una alta proporcin de aminocidos con alto contenido de N y siendo mayor en alimentos con alta proporcin de aminocidos con bajo contenido de N. A pesar de ello, es comn que en el caso de los forrajes se utilice de manera genrica un solo factor de conversin (6.25) presumiendo que el contenido de N en las protenas de este tipo de alimento es del 16% (6.25 = 100/16) (Cherney 2000). El porcentaje de N en los forrajes, sin embargo, no es constante y puede ser ms bajo que 16% como se desprende de los datos de Echeverri y Parra (2001) en pasto kikuyo en los que este valor es de 13% implicando que el factor de correccin debera ser de 7.72 y no de 6.25. La proporcin de aminocidos en un mismo forraje adems, cambia con la edad y el nivel de fertilizacin de N como los muestran tambin los datos publicados por Echeverri y Parra (2001) en pasto kikuyo. Estos datos permiten calcular que mientras que la arginina represent el 3.8% de los 16 aminocidos analizados en una muestra con 14.4% de PC este mismo aminocido correspondi al 4.7% de los aminocidos analizados en una muestra con 17.8% de PC. Otro aspecto que hace problemtica la determinacin de la PC en los alimentos es que el supuesto de que todo el N de la muestra hace parte de protenas no es correcto. En el caso de los forrajes una proporcin importante del N hace parte de compuestos nitrogenados de bajo peso molecular tales como peptidos, aminocidos libres, cidos nuclicos, aminas, amidas y amonio (NRC 2001), y que en su conjunto de conoce como Nitrgeno No Proteico (NNP). De por s, el dato de PC como tal aporta una idea muy vaga sobre la calidad nutricional de la protena de los forrajes ms an si se trata de forrajes con alto contenido de PC o ensilados (Cherney 2000). De all que se hallan desarrollado mtodos que permiten establecer el valor de la protena de los alimentos para rumiantes en trminos de su

utilizacin ruminal y posruminal (Licitra et al 1996) y que se han incorporado en modelos tales como el Sistema de Carbohidratos y Protena Neta de Cornell (SCPNC) (Sniffen et al 1992). 2.4. Fracciones de protena. Licitra et al (1996) desarrollaron un procedimiento in vitro ajustado al SCPNC para describir la protena de los alimentos en cinco fracciones: A, B1, B2, B3 y C. La fraccin A corresponde al NNP y es estimada qumicamente como la proporcin de la PC que es soluble en una solucin tampn de borato-fosfato sin que se precipite en una solucin de cido tngstico. La fraccin B1 se calcula como el porcentaje de la PC total que es soluble en la solucin tampn de borato-fosfato pero que se precipita en la solucin de cido tngstico. Una porcin de la protena cruda de los forrajes se encuentra ligada a la fibra en detergente neutro (NIDN) y otra, ms baja, a la fibra en detergente cido (NIDA). En el SCPNC, la fraccin B3 se calcula como la diferencia entre el NIDN y el NIDA. La fraccin B2 es calculada como la diferencia entre la PC total del alimento y la suma de las dems fracciones mientras que la fraccin C corresponde al NIDA. 2.5. Extracto Etreo. El extracto etreo (EE) hace referencia a un grupo de compuestos lipdicos que son insolubles en agua pero solubles en ter, cloroformo o benceno (Maynard et al 1979). El EE en los forrajes est compuesto fundamentalmente por triacilglicridos en las semillas y galactolpidos y fosfolpidos en las hojas (Van Soest 1994). El mtodo oficial utiliza ter dietlico para disolver todos los compuestos liposolubles presentes en la muestra (AOAC 1995). Previamente tanto la muestra colocada en el dedal como los beakers, deben ser puestos a secar a 100oC durante al menos 5 horas y 1 hora, respectivamente. Posteriormente, se adiciona el ter, se instalan los beakers y los dedales con las muestras en el extractor, el cual se activa y se deja en funcionamiento durante cerca de 16 horas trabajando a una tasa de extraccin de 2 a 3 gotas por segundo. Posteriormente el ter es evaporado y al residuo resultante se le denomina el extracto etreo. Un limitante de esta tcnica es que adems de extraes cidos grasos, tambin incluye compuestos que se disuelven en ter pero tienen baja digestibilidad como son las ceras y los aceites esenciales (Galyean 1997). Esta es la razn por la que Weiss et al (1992) calculan la digestibilidad de las grasas no a partir del contenido de EE si no a partir del contenido de cidos grasos (AG) (AG = EE 1). 2.6. Carbohidratos no estructurales. Los carbohidratos no estructurales (CNE) son la energa de reserva para el rebrote de las plantas (Tejos 1996) y se localizan preferentemente en las races y tallos basales de las gramneas (Botrel y Gomide 1981). Estos se hallan conformados por azcares solubles e insolubles como monosacridos (glucosa y fructosa), disacridos (sacarosa y maltosa) y polisacridos (almidones y fructosazas) (Smith 1973). El valor nutricional de estos carbohidratos reside en que son la fuente de energa de rpida disponibilidad para el crecimiento de los microorganismos ruminales (Lee et al 2002, Miller et al 1999) de tal manera, que su contenido esta relacionado con la eficiencia en la utilizacin de la PDR para la sntesis de protena microbiana (Montoya et al 2004).

El contenido de carbohidratos solubles en agua puede ser determinado espectrofotomtricamente, luego de la extraccin en agua y cido perclrico, utilizando anthrone preparada en cido sulfrico y haciendo la lectura en un analizador calibrado con fructosa (Thomas 1977, Olvera et al 1993). Tambin pueden ser analizados por un mtodo espectrofotomtrico basado en la reaccin de cido sulfrico y fenol con los carbohidratos (Dubois et al 1956). El contenido de almidn es determinado luego de lavar la muestra con etanol al 80% para remover los azcares. Una vez extrado, el almidn puede ser analizado por un mtodo enzimtico, gravimtrico o polarimtrico (McClements 2000). De estos, el mtodo enzimtico es el ms preciso y se basa en la digestin selectiva de la amilasa y la amilopectina por una amilo-glucosidasa (van Eys et al 2004). En este mtodo el almidn extrado es posteriormente gelatinizado, solubilizado e hidrolizado con una amilasa. La gelatinizacin se obtiene luego de aadir agua destilada a la muestra y someterla a una temperatura de 124oC durante 90 minutos en autoclave a 14 atm de presin. Posteriormente la muestra es enfriada y se le adiciona una solucin tampn de acetato y el kit enzimtico (NAD, ATP, hexoquinasa, glucosa-6-P, iones de Mg, tampn y estabilizadores no reactivos) y se deja reaccionar en una estufa a 60oC durante 24 h. Luego se deja reposar, enfriar y se centrifuga a 1000 g x 10 min para obtener el sobrenadante, en el cual se determina la concentracin de glucosa. Para ello es necesario preparar una curva estndar a partir de glucosa diluda en varias concentraciones (0, 50, 100, 200, 300, 400 y 800 mg de glucosa por gramo de muestra). La lectura se realiza en un espectrofotmetro a 340 nm (Galyean 1997, van Eys et al 2004). 2.7. Carbohidratos estructurales. El residuo que resulta de someter una muestra de alimento a la digestin con una solucin neutra (pH 7.0) de lauril sulfato de sodio y EDTA, es denominada la fibra en detergente neutro (FDN) y est conformada principalmente por celulosa, hemicelulosa y lignina, presentando cantidades bajas de nitrgeno, minerales y cutina (Van Soest 1994). Aunque para algunos autores la determinacin de la FDN es la forma ms completa de medir el contenido de fibra total de los alimentos (Harris 1993), debido a que la mayor parte de las pectinas se solubilizan en el detergente neutro, se considera que este mtodo subestima la fibra total en el caso de los forrajes con alto contenido de pectinas (Van Soest 1994). As mismo, en el caso de alimentos que son sometidos a altas temperaturas, una fraccin de las protenas son retenidas en la FDN sobreestimando la fibra total. Por estas razones, la FDN debe ser concebida ms como la porcin menos digerible de los alimentos (Van Soest 1994) que como una entidad biolgica. 2.7.1. Hemicelulosa. La hemicelulosa constituye un grupo heterogneo de polisacridos cuya composicin vara marcadamente entre especies vegetales. Esta es estimada como la diferencia entre la FDN y el residuo resultante de la digestin de la muestra en una solucin cida de detergentes cuaternarios, denominada fibra en detergente cido (FDA) (Van Soest 1994). Durante este proceso, sin embargo, tambin se solubilizan algunas protenas de la pared celular sobreestimando el contenido de hemicelulosa. 2.7.2. Celulosa.

Al contrario que en la hemicelulosa, la celulosa presenta un bajo contenido de pentosas estando constituida principalmente por glucosa en enlaces 13 y b 14. Es estimada como la diferencia entre la FDA y la lignina en detergente cido (LDA) (Van Soest 1994). 2.8. Lignina. La lignina es un polifenol con una estructura no definida, que no presenta secuencias repetidas y cuyo tamao no est bien definido (Ralph 1996). Se considera que la lignina es el factor ms limitante en la digestibilidad de los forrajes (Jung y Vogel 1986, Jung et al 1997, Van Soest 1994). La manera en que la lignina afecta la digestibilidad de otras fracciones no est completamente comprendida (Van Soest 1994), sin embargo, parece estar asociada a tipos de enlaces entre la fraccin fibrosa y la lignina tales como enlaces cruzados mono y diferulatos, ciclodimeros de p-coumarato y posiblemente enlaces cruzados bencil ster y ter (Casler 2001, Casler y Jung 2006, Grabber et al 2004). Existen diversos mtodos para determinar el contenido de lignina (Kamstra et al 1966, Van Soest 1994, Hatfield y Fukushima 2005), cada uno de los cuales puede rendir cantidades diferentes. As, normalmente la determinacin mediante cido sulfrico al 72% rinde una mayor concentracin que con el mtodo del detergente cido (Lignina en Detergente cido, LDA) de Van Soest (1963), siendo este ltimo el ms popular (Van Soest 1994). 2.9. Fracciones de carbohidratos. El SCPNC clasifica los carbohidratos en cuatro fracciones en funcin de su degradacin en el rumen (Sniffen et al 1992): A, B1, B2 y C. La fraccin A corresponde a los azcares mientras que la B1 corresponde a los almidones. La fraccin B2 son los carbohidratos estructurales disponibles mientras que la fraccin C corresponde a la porcin no disponible de los carbohidratos no estructurales. Los carbohidratos no estructurales (CNE) contienen azcares (Fraccin A) y almidones y pectinas (Fraccin B1). Los CNE hacen referencia a los carbohidratos solubles en el detergente neutro y se calcula como 100 menos la FDN corregida por PCIDN, la PC, el EE y las cenizas de la muestra. La fraccin A se puede calcular como la diferencia entre los CNE y los almidones (Fox et al 2003) o como la diferencia entre los CNE y la fraccin B1 (Sniffen et al 1992). La fraccin B1 se determina directamente mediante el anlisis de almidones y pectinas (Sniffen et al 1992) pero tambin como la diferencia entre los CNE y los azcares (Fox et al 2003). La fraccin B2 se determina como la diferencia entre la FDN libre de cenizas con la fraccin C de la FDN y las protenas asociadas a la FDN (B2 = FDN lignina x 2.4 NIDN x 6.25). La fraccin C se calcula como el contenido de lignina (determinada en cido sulfrico al 72%) multiplicado por 2.4. 2.10. Minerales. Las tcnicas para determinar el contenido de minerales en muestras de alimentos, se basa en caractersticas fisico-qumicas tales como la baja volatilidad, la electronegatividad, su habilidad para reaccionar con agentes qumicos especficos y generar cambios medibles, y su espectro electromagntico individual. De all que las tcnicas ms adecuadas se basen en espectrofotometra, absorcin atmica y espectroscopia de emisin. Sin embargo, para ciertos minerales se emplean mtodos gravimtricos y con electrodos selectivos (McClements 2000).

En los mtodos gravimtricos, el mineral que se va a analizar se hace precipitar en la solucin al aadir compuestos con los que se forman complejos insolubles. El precipitado es separado de la solucin por filtracin, luego es lavado, secado y pesado. La cantidad de mineral en la muestra se establece a partir del peso del complejo qumico precipitado. Este mtodo es utilizado para determinar Cl (McClements 2000). La espectrofotometra se basa en la medicin de la absorcin de una determinada longitud de onda (ultravioleta, visible o infrarroja) por un compuesto presente en una solucin (Galyean 1997). Este mtodo es utilizado para determinar la concentracin de fsforo. Para ello este mineral se hace reaccionar con molibdo-vanadato para generar un complejo que absorbe luz a 400 nm (Galyean 1997, McClements 2000, van Eys et al 2004). La concentracin de minerales como el K+, Na+, Li+ y Ca2+ en solucin se puede establecer utilizando electrodos selectivos. En esta tcnica dos electrodos (uno de referencia y otro selectivo) son introducidos en la solucin que contiene el mineral disuelto. El voltaje que fluye a travs de los electrodos va a depender de la concentracin del mineral de tal manera que teniendo una curva de calibracin previa del voltaje a travs de concentraciones conocidas del mineral, se puede establecer la concentracin de este en la muestra problema (McClements 2000). La determinacin de la concentracin de minerales por espectroscopia atmica es ms sensible, especfica y rpida que los mtodos convencionales, razn por la cual esta tcnica est reemplazando a las dems (McClements 2000). La espectroscopia de absorcin atmica se basa en la absorcin de radiacin UV visible por tomos libres en estado gaseoso. Las cenizas de la muestra de alimento son disueltas en una solucin acuosa que es calentada para vaporizar y atomizar el mineral. Un haz de radiacin se hace pasar a travs de la muestra atomizada y la radiacin absorbida es medida en la longitud de onda correspondiente al mineral que se est analizando. La informacin sobre el tipo y la concentracin del mineral se obtiene al establecer la ubicacin y la intensidad del pico en el espectro de absorcin (Galyean 1997, McClements 2000). La espectroscopia de emisin atmica se basa en la emisin de radiacin de una muestra. Para ello la muestra se somete a una temperatura lo suficientemente alta como para evaporar el solvente y hacer que una cierta proporcin de los tomos pasen a un estado gaseoso y alcancen un estado excitado (Galyean 1997, McClements 2000). Cuando los electrones de estos tomos regresan a al estado normal, emiten una onda de UV o luz visible que es proporcional a la concentracin del elemento en la muestra (Galyean 1997). 3. Mtodos para determinar la digestibilidad. La composicin nutricional de un alimento es solo un indicativo del contenido de estos pero no de su disponibilidad. La digestibilidad es una medida de la disponibilidad de las fracciones nutricionales de un alimento y corresponde a la proporcin del alimento consumido que no es excretado en las heces (Galyean 1997, Rymer 2000). No es una medida de las fracciones absorbidas puesto que dos tipos de errores aparecen en la estimacin de la digestibilidad. Primero, los gases (principalmente metano) que se

producen durante la fermentacin de los carbohidratos no aparecen en las heces pero tampoco se absorben si no que se eliminan con el eructo y, segundo, en las heces aparecen compuestos endgenos que no corresponden a fracciones no digeridas de los alimentos consumidos. De all que a esta medida se le denomine digestibilidad aparente (McDonald et al 1995). Ha sido estimado que entre el 25 y el 50% de la variacin en la respuesta productiva de los animales a los forrajes que consumen se debe a su digestibilidad (Mertens 2000). Aunque esta puede ser medida en los animales de manera ms segura que el consumo, tanto las caractersticas de los animales como la metodologa empleada tienen un impacto significativo sobre las mediciones obtenidas. Existen varios mtodos para determinar la digestibilidad de los alimentos que se pueden agrupar en mtodos in vivo, in vitro y ecuaciones de prediccin. 3.1. Mtodos in vivo. Estos mtodos involucran el uso de animales para la determinacin de la digestibilidad total o parcial. 3.1.1. Digestibilidad total. En el caso de la digestibilidad total se emplean animales en jaulas individuales o animales en pastoreo suplementados con marcadores indigeribles. El manejo de animales en jaulas es tedioso, engorroso y demanda mucho tiempo: es necesario recoger y pesar las heces y registrar de manera precisa el alimento ofrecido y rechazado durante varios das consecutivos. Debido a que los animales permaneces en condiciones de estabulacin, los resultados generados no necesariamente son extrapolables a las condiciones que predominan en pastoreo (Cordova et al 1978, Galyean 1997, Schneider y Flatt 1975). Los marcadores presentan ventajas sobre la tcnica convencional debido a su simplicidad y bajo costo y al hecho de poder ser utilizados con animales en pastoreo. Para el estudio de la digestibilidad se han empleado marcadores internos indigeribles que son recuperados en las heces tales como la FDN indigerible, la FDA indigerible, la lignina, alcanos de cadena larga e impar, cromgenos vegetales, el slice y la cenizas insolubles en cido (Berchielli et al 2000, Crdova et al 1978, Rymer 2000). La estimacin de la digestibilidad mediante esta tcnica se calcula a travs de la siguiente ecuacin (Schneider y Flatt 1975):

3.1.2. Digestibilidad parcial. Los alimentos consumidos por los rumiantes son digeridos en diversos tramos del tracto gastrointestinal generando diferentes productos cuya disponibilidad y utilizacin por el animal hospedo depende del sitio y la extensin de la digestin. De all que sea importante el estudio de la digestibilidad parcial de los alimentos en los rumiantes en funcin del sitio de la digestin (Merchen et al 1997). Este tipo de estudios se han concentrado en el rumen y el tracto posruminal para lo cual se utilizan animales canulados en el rumen y en el duodeno (Stern et al 1997).

3.1.2.1. Digestibilidad ruminal in situ. Esta tcnica se basa en la incubacin ruminal de bolsas de niln durante varios tiempos conteniendo muestras del alimento a evaluar. Cumplido el tiempo de incubacin en el rumen, las bolsas son retiradas, lavadas y puestas a secar para obtener el residuo en el cual se determina la MS y la (s) fracciones qumicas a las que se les desea determinar su degradabilidad ruminal. La diferencia entre el material incubado y el material recuperado en las bolsas, se presume que corresponde al material degradado (rskov 2000). Con los datos de degradacin se calculan los parmetros de la cintica de degradacin ruminal para lo cual se han descrito y evaluado diversos modelos matemticos (Bach et al 1998, Lpez et al 1999, Naranjo et al 2005). Entre estos el ms utilizado ha sido el de rskov y McDonald (1979) el cual describe tres parmetros para estimar la degradabilidad ruminal (DR) a un determinado tiempo t (DR = a + b*(1 - exp(-kd*t)): la fraccin soluble (fraccin a) que se presume rpida y totalmente degradable en el rumen; la fraccin potencialmente degradable (fraccin b) cuya degradacin en el rumen depende de la constante de la cintica de degradacin ruminal (kd), el cuales el tercer parmetro estimado con este modelo. La presencia de un tiempo de retrazo inicial antes de que la degradabilidad ruminal de la fraccin b se incremente (tiempo lag), obliga a la estimacin de este cuarto parmetro. Para ello se han utilizado diversos modelos (Lpez et al 1999) entre los que se destaca el de McDonald (1981) (DR = a + b*(1 - exp(-kd*(t lag))). Debido a la falta de sentido biolgico del trmino lag en este modelo, ha sido propuesto el de Mitscherlich I (Kiviste et al 2002) (DR = a + b*(1 - exp(-kd*t)) como un modelo ms ajustado para explicar este tipo de fenmenos digestivos. El parmetro i en este modelo indica en punto de inflexin de la curva (Naranjo et al 2005). No todo el alimento que ingresa al rumen se fermenta completamente ya que una parte escapa a la degradacin ruminal. La degradabilidad efectiva en el rumen (DE) depende de la fraccin a, la fraccin b, la kd y la constante de la cintica del pasaje ruminal (kp), y se calcula con la siguiente ecuacin (rskov y McDonald 1979): DE = a + b * (kd/(kd + kp)). Un error que frecuentemente es cometido en el clculo de la degradabilidad efectiva es el de la interpretacin y utilizacin de las constantes kd y kp ya que muchos autores las asumen como velocidades o tasas de degradacin y de pasaje, respectivamente. El anlisis matemtico de dichos parmetros permite concluir que realmente se trata de la relacin constante entre la aceleracin y la velocidad de degradacin (kd) y de pasaje rumiunal (kp), respectivamente (Correa 2005). As, bajo este anlisis la propuesta de rskov y McDonald (1979) para estimar la DE es incorrecta y se requiere de otra aproximacin diferente para calcular correctamente la DE. 3.1.2.2. Digestibilidad pos-ruminal. El estudio de la digestibilidad posruminal in vivo del alimento no degradado en el rumen, implica el uso de animales quirrgicamente canulados en el abomaso (Emanuele et al 1991) y/o en el duodeno y el uso de bolsas mviles de niln (Emanuele et al 1990, 1991).

Esta tcnica implica la estimacin previa de la degradacin de la muestra del alimento en el rumen durante un periodo de 24 h utilizando bolsas de niln. Posteriormente, el residuo es empacado en bolsas de niln de menor tamao e incubado en el abomaso para ser recuperadas en las heces. Sin embrago, debido al bajo porcentaje de recuperacin de estas bolsas al quedarse retenidas en el abomaso, esta tcnica ha sido abandonada (Emanuele 1991). En lugar de utilizar animales con cnula abomasal se emplean animales con cnula duodenal. En este caso los residuos recuperados de la incubacin ruminal, tambin son empacados en bolsas de niln pequeas e incubados durante 1 h en una solucin de HCl/Pepsina para simular la digestin abomasal. Posteriormente son incubadas en el duodeno y recuperadas en las heces. Como una alternativa al uso de animales con cnula duodenal, se han evaluado algunos modelos biolgicos tales como gallos (Gerber et al 2000) y ms frecuentemente, cerdos en levante (Monsalve 2004, Mustafa et al 2000) con buenos resultados. 3.2.2. In vitro. Debido a que los mtodos in vivo para estimar la digestibilidad parcial implican el uso de animales quirrgicamente modificados que son costosos y exigentes en su manejo y cuidado, se han utilizado tcnicas alternativas in vitro. Estas se pueden agrupar entre aquellas tcnicas basadas en inculos ruminales y mtodos enzimticos. 3.2.2.1. Tcnicas basadas en inculos ruminales. Las tcnicas in vitro ms comnmente utilizadas en la evolucin de la digestibilidad de alimentos para rumiantes, se basan en la incubacin de la muestra durante cierto tiempo en un frasco con inculo ruminal en un medio anaerobio y tamponizado. La tcnica de Tilley y Terry (1963) ha sido el mtodo in vitro de referencia para los laboratorios de bromatologa en el mundo (Mabjeesh et al 2000) con modificaciones segn el alimento a evaluar (Aufrere y Michalet-Doreau 1988). El inculo ruminal se obtiene de lquido ruminal extrado a travs de sonda esofgica o de animales canulados. El lquido ruminal se pasa por varias capas de gasa y es diludo (20 : 80) en una solucin salina, saliva artificial o en una sustancia tamponizante (Stern et al 1997). El inculo ruminal es colocado luego en un tubo de ensayo (de 50 ml) al que se le agrega una pequea cantidad de la muestra (0.5 g), es gaseado con dixido de carbono, posteriormente es sellado con la vlvula de Bunsen y puesto a incubar durante 48 h a 39oC en bao mara con agitacin manual cada 12 horas. Al menos tres tubos blancos (sin muestra) son puestos a incubar simultneamente. Pasado este tiempo se sacan los tubos del bao, se les retiran las vlvulas y se les aade cido clorhdrico 3N (6 ml) y pepsina (2 ml). Esta mezcla es agitada y puesta a incubar por 24 a 39oC en bao mara. Al final de la incubacin, el contenido de los tubos se filtra en papel filtro previamente secado y tarado obtenindose el peso del residuo (y del blanco) (Galyean 1997, Llamas y Tejada 1990). La digestibilidad in vitro de la materia seca (DIVMS) es calculada, entonces, con la siguiente formula:

Van Soest et al (1966) desarrollaron un mtodo alternativo consistente en la incubacin de la muestra con lquido ruminal durante 48 h a 39C como se describi en la tcnica

de Tilley y Terry (1963), pero en lugar de hacer la incubacin en HCl/Pepsina, el residuo obtenido es tratado con una solucin neutro-detergente durante 1 h a 100C. Esto hace del mtodo de Van Soest et al (1966) un procedimiento ms rpido sin que se afecte la precisin del anlisis (Van Soest 1994). La tcnica de produccin de gases es otro mtodo in vitro. En este, la degradacin del alimento se evala midiendo el volumen del gas generado durante la fermentacin (Theodorou et al 1994) para lo cual se utilizan jeringas de vidrio o transductores de presin. Se han desarrollado sistemas semiautomticos y sistemas automticos para el trabajo de esta tcnica en el laboratorio (Posada y Rosero 2005). Uno de los problemas ms importantes en la aplicacin de esta tcnica es el hecho de que la cantidad de gas producido depende de la proporcin molar los cidos grasos voltiles producidos durante el proceso de fermentacin (Stern et al 1997). Por ello algunos autores (Schofield and Pell 1995) sugieren que es necesario monitorear la proporcin de estos cidos grasos para corregir estas diferencias. Aunque la evaluacin in vitro de los forrajes mediante el uso de inculos de microorganismos ruminales presenta probablemente el mejor clculo hecho en laboratorio sobre la digestibilidad in vivo, los ensayos in vitro requieren una fuente uniforme y confiable de inculo ruminal que a menudo es difcil de obtener, adems de la variabilidad del inculo (Arce et al 2003). De all que los mtodos de fermentacin en cultivo continuo se constituyan en una alternativa a los mtodos sin intercambio de slidos y lquidos como el de Tylley y Terry (1963) y el de Van Soest et al (1966). Estos sistemas simulan el ambiente ruminal y tambin se basan en el uso de inculos ruminales que, en este caso, son mantenidos mediante el bombeo continuo de una solucin tampn. El flujo del lquido se establece por su salida a travs de un filtro. El material slido se administra en dosis repartidas en el tiempo (Hoover et al 1976; Teather y Sauer 1988) o mediante introduccin escalonada en bolsas de nylon, como en el Rusitec (Czerkawski y Breckenridge 1977). Las ventajas de estos sistemas residen en su bajo costo y menor variacin entre las unidades experimentales. Adicionalmente, no se presentan dificultades por la presencia de fuentes endgenas como en las pruebas in vivo, y el flujo de la digesta es medido directamente (Stern et al 1997). 3.2.2.1. Tcnicas basadas en enzimas. A diferencia de las tcnicas in vivo o in vitro basadas en el uso de inculos ruminales, las tcnicas enzimticas tienen la ventaja de ser completamente independientes de los animales, lo que les confiere menor variacin haciendo de estas unas tcnicas fciles de estandarizar. La desventaja de estas tcnicas reside en que la actividad enzimtica en el laboratorio es incompleta cuando se compara con la del ambiente ruminal, limitando la validez de los resultados obtenidos (Stern et al 1997). El uso de celulasas para estimar la digestin de la MS o la materia orgnica en alimentos para rumiantes, es la tcnica enzimtica ms importante. Las celulasas ms efectivas para solubilizar la MS y predecir la digestibilidad in vivo de los forrajes ha sido una mezcla de enzimas fibolticas obtenidas de Trichoderma spp (Broderick y Cochran 2000, Jones y Theodorou 2000). Celulasas obtenidas de Basidiomicete, Rhizopus spp., Aspergillus Nger y Penicillium funiculosum tambin han sido utilizadas con estos fines (Arce et al 2003, Jones y Theodorou 2000).

El principal inconveniente con las tcnicas enzimticas se halla a la variabilidad en la actividad de las enzimas debido al bache y a la fuente de la enzima (Adesogan 2000). Esta variabilidad, sin embrago, se puede reducir al utilizar estndares de referencia o por establecer ecuaciones de regresin de la digestibilidad de la celulosa sobre la cantidad de celulosa utilizada como sustrato (De Boever et al 1988). 4. Mtodos para estimar el consumo. El consumo y la digestibilidad no son variables independientes y, por el contrario, se hallan estrechamente relacionadas (Mould 2002). De esta manera, cuando los datos de digestibilidad son combinados con los de consumo, es posible predecir de manera ms precisa el valor nutritivo del alimento y, por lo tanto, la capacidad productiva del mismo (Galyean 1997). Debido a su importancia, desde principios del siglo pasado, se han estado ideando y modificando mtodos para estimar el consumo de materia seca (CMS) en bovinos bajo pastoreo con el objetivo de superar los inconvenientes metodolgicos de los mtodos anteriores y aumentar la precisin en la estimacin de esta variable (Berrio y Correa 1992). Existen numerosas revisiones sobre los mtodos desarrollados para estimar la cantidad de forraje que los animales consumen de la pradera (Berrio y Correa 1992, Cordova et al 1978, Chvez et al 1981, Garrigus y Rusk 1939, Lippke 2002, Meja 2002, Minson 1981, Schneider y Flatt 1975). Todos los autores coinciden en que ningn mtodo desarrollado hasta el presente cuantifica con exactitud el consumo de forraje por rumiantes bajo condiciones de pastoreo. 4.1. Mtodo de la diferencia en el peso vivo. En este mtodo el animal es pesado antes y al final del periodo de pastoreo durante el cual las heces y la orina son recogidas y pesadas por asistentes (Garrigus y Rusk 1939). El CMS es estimado como el peso final ms el peso de las heces y la orina, menos el peso inicial del animal. Este mtodo fue posteriormente mejorado al calzar los animales con botas que incluyen transductores de presin para detectar cambios en el peso y relacionarlos con el CMS (Minson 1990). 4.2. Mtodo de la diferencia agronmica. Fue uno de los primeros mtodos utilizados para estimar el CMS de forrajes por rumiantes en pastoreo (Garrigus y Rusk 1939). Por este mtodo el forraje total ofrecido a un animal en un rea determinada es estimado y luego se permite que el animal pastoree el rea experimental por 24 h y el material remanente es cortado y pesado asumindose que la diferencia entre el material ofrecido y el remanente corresponde al material consumido. Cordova et al (1978) haciendo referencia a este mtodo, coinciden con Garrigus y Rusk (1938) en sealar que este mtodo genera resultados aproximados debido a los errores en la estimacin, sobre todo, del material remanente. Sin embargo, es mtodo que an se utiliza para estimar el CMS en bovinos en pastoreo (Smit et al 2005). 4.3. Mtodo de la relacin de la materia seca. En este mtodo el coeficiente de digestibilidad de la MS del forraje es determinado primero es una muestra representativa de lo que se espera consuma el animal de una pradera y posteriormente, se estima la MS defecada por el animal (Garrigus y Rusk

1938). Estos dos datos son utilizados para estimar el CMS del forraje segn la siguiente ecuacin:

Garrigus y Rusk (1938) disearon y utilizaron por primera vez arneses y bolsas para la recoleccin total de heces en bovinos bajo pastoreo. Entre las fallas ms importantes de este mtodo se resalta la determinacin de la digestibilidad en una muestra que puede no ser representativa del forraje que el animal selecciona en la pradera. 4.4. Mtodo de los marcadores. Mientras que los marcadores internos son utilizados para estimar la digestibilidad in vivo, los marcadores externos se han utilizado para estimar la produccin de heces y estos dos valores se introducen en la ecuacin anterior para estimar el CMS. Los marcadores externos son sustancias indigeribles que se suministran al animal con el propsito de estimar la excrecin total de heces en pastoreo. Se han empleado sustancias tales como el xido de Cromo, el xido de Hierro (Corova et al 1978, Malossini et al 1996, Lippke 2002) y elementos raros como el Iterbio, Europiuo, Disprosio, Circonio, Lantano e Itrio, entre otros (Le Du y Penning 1982). El marcador se suministra durante varios das antes de realizar la recoleccin de muestras de heces. Estas muestras se recolectan durante varios das consecutivos, luego de lo cual se mezclan y se obtiene una sola muestra en la que se analiza la concentracin del marcador. Estos datos se introducen en la siguiente ecuacin para estimar la produccin total de MS en las heces:

El limitante ms importante de esta tcnica se encuentra en la variabilidad en la concentracin del marcador en las heces (Malossini et al 1996) la cual se puede reducir si se incrementa la frecuencia en la dosificacin y esta se mantiene constante. 4.5. Mtodo del comportamiento ingestivo. Este mtodo se basa en la cuantificacin del tiempo dedicado a pastorear (T), el nmero de bocados por unidad de tiempo (TB) y el tamao o peso del bocado (B) (Spedding et al 1966). Estos valores de introducen en la siguiente ecuacin: CMS = T x TB x B Stobbs (1973) dise un mtodo para medir el tamao del bocado mediante el uso de animales con fstula esofgica provistos de un tapn de gomaespuma para bloquear el paso del bocado hacia el rumen mientras que Stobbs y Cowper (1972) inventaron un equipo para medir el nmero de bocados (bocadmetro). Para la medicin del tiempo de pastoreo, por otro lado, se han utilizado tacmetros (Cangiano y Gmez 1984).

Varios artefactos han sido diseados para monitorear los movimientos de la quijada en rumiantes bajo pastoreo que van desde el interruptor accionado por el movimiento de la mandbula de Stobbs y Cowper (1972) hasta el sensor acstico utilizado por Delagarde et al (1998) para detectar las caractersticas de los sonidos generado durante el consumo de forraje y la rumia. En este mtodo es difcil estimar adecuadamente el tamao del bocado debido a la variacin en funcin de la oferta forrajera y la arquitectura de la pradera (Cangiano y Gmez 1984, Meuret et al 1985). 5. Valor Relativo y Calidad Relativa de Forrajes. En vista de que en la calidad nutricional de los forrajes estn implicadas diversas variables, ha sido necesario establecer un parmetro que permita clasificar los forrajes por su calidad nutricional (Moore y Undersander 2002). Es as como se han desarrollado algunos ndices tales como el Consumo Estimado de Energa Digestible, el ndice de Valor Nutritivo, el ndice de Calidad Forrajera y el Valor Relativo de los Forrajes (Moore 1994, Chase 2002). Cada uno de estos incluye una estimacin del CMS y de la energa disponible asumiendo que el forraje fuera la nica fuente de nutrientes para el animal. Esto es debido a que tanto el CMS como la energa disponible son de los principales factores que afectan el desempeo productivo de los animales (Moore y Undersander 2002). El contenido de FDN est correlacionado positivamente con la densidad del forraje y el llenado del rumen, de tal manera que un mayor contenido de FDN significa un menor CMS (Mertens 1985; Belyea et al 1996). Esto implica que podra existir un lmite para el CMS en funcin de la concentracin de FDN de la dieta. Mertens (1985) analiz los resultados obtenidos de varios experimentos y estim que el consumo diario de FDN oscil entre 1.1 y 1.2 % del peso vivo (PV) del animal. Basado en tales datos, este autor sugiri que el CMS puede ser estimada de manera precisa a partir de la concentracin de FDN de la dieta y el peso vivo del animal como CMS = 1.2 / FDN%. Aunque muchos trabajos han demostrado que tal afirmacin no es correcta (), aun se sigue utilizando para estimar el valor nutricional de los forrajes. As, Kolver y Muller (1998) encontraron que el consumo de FDN correspondi al 1.5% del PV en vacas que solo consuman pasturas. Fulkerson et al (2006), por su parte, reportaron que este valor oscil entre el 1.6 y 2.2% para el pasto kikuyo y entre 1.5 y 1.6% para ryegrass. Vazquez y Smith (2000) entre tanto, encontraron que en la medida en que la oferta forrajera se incrementa, el consumo de FDN como porcentaje del peso vivo se incrementa significativamente. El contenido de la FDA, por su parte, se ha correlacionado negativa y significativamente con la digestibilidad de la MS (r = -0.75) que la concentracin de la FDN (Van Soest et al 1978), por ello se ha utilizado con ms frecuencia para estimar el contenido de energa de los forrajes (Belyea et al 1996; Weiss 1998). Van Soest et al (1978), sin embargo, tambin reportaron correlaciones altas y positivas entre la FDA y la digestibilidad de la MS. Tal es el caso de Bromus inermis y de Festuca arundinacea en los que las correlaciones fueron de + 0.37 y +0.99, respectivamente en dos de las evaluaciones reportadas. Laredo y Mendoza (1982), por su parte, encontraron que el aporte que hace la FDA a la estimacin de la digestibilidad in vitro de la matera seca (DIVMS) y a la energa digestible del pasto kikuyo es mnima.

An as, basados en estas correlaciones, Linn et al (1989) desarrollaron uno de los ndices de calidad de forrajes ms utilizado: el Valor Relativo de Forrajes (VRF), el cual es aceptado por la NFTA (Undersander et al 1993) como el indicador oficial del valor nutritivo de los forraje en los Estados Unidos. Segn estos autores, el CMS mximo es estimado con base en el contenido de FND segn la siguiente ecuacin: CMS (% PV) = 120/FND(%MS). La digestibilidad de la MS, por su parte, se calcula en funcin del contenido en FDA: DMS (%)= 88,9 - (0,779 x FAD,%). De esta manera, el VRF = DMS x CMS/1.29. El valor obtenido es un ndice que no tiene unidades, pero que permite comparar la calidad (entendida como la capacidad de un forraje de generar una respuesta productiva) de leguminosas, gramneas y sus mezclas, bien sean en fresco, ensiladas o henificadas (Calsamiglia 1997; Moore y Undersander 2002; Texeira y de Andrade 2001). Estos ndices han sido utilizados bsicamente con fines comerciales y no en modelos nutricionales debido a las debilidades en los supuestos que los sustentan (Moore y Undersander 2002). En vista de esto, Moore y Undersander (2002) han propuesto un ndice para evaluar el valor nutricional de los forrajes basado en el CMS y los nutrientes digestibles totales (NDT): la Calidad Relativa de Forrajes (CRF). CRF = (CMS, % del PV) * (NDT, % de la MS)/1.23 En esta propuesta, el CMS es estimado con base en dos ecuaciones dependiendo del tipo de forraje. As, para forrajes de estaciones clidas y templadas esta ecuacin es (Moore and Kunkle 1999): CMS = -2.318 + 0.442*PC -0.0100*PC2 - 0.0638*NDT + 0.000922*NDT2 + 0.180*FDA - 0.00196*FDA2 - 0.00529*PC*FDA Los NDT, por otro lado, son estimados con base en la propuesta del NRC (2001). No obstante las modificaciones que implica el clculo del CRF frente al VRF, Moore y Undersander (2002) consideran que este nuevo ndice an no puede hacer parte de modelos nutricionales y solo debe utilizarse para evaluar forrajes con fines comerciales. Bibliografa. Adesogan A. T. 2002. What are feeds worth?: A critical evaluation of selected nutritive value methods. Proceedings 13th Annual Florida Ruminant Nutrition Symposium, pp 33-47. AOAC. 1995. Animal Feed. Chapter 4 in 'Official methods of analysis'. 16th edition. AOAC International, Arlington, VI, USA. 30pp. Arce C., Arbaiza T., Carceln F. y Lucas O. 2003. Estudio comparativo de la digestibilidad de forrajes mediante dos mtodos de laboratorio. Rev Inv Vet Per; 14 (1): 7-12.

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