UNIVERSIDAD DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

ESTUDIO BSICO DEL METABOLISMO LIPDICO EN AVES COMERCIALES

JANCY DARLY FLREZ OCHOA

TESIS PRESENTADA AL PROGRAMA DE MAESTRA EN CIENCIAS VETERINARIAS REA DE CONCENTRACIN: NUTRICIN ANIMAL, COMO PARTE DE LOS REQUISITOS PARA LA OBTENCIN DEL TITULO DE MAGISTER.

MANIZALES 2012

UNIVERSIDAD DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

ESTUDIO BSICO DEL METABOLISMO LIPDICO EN AVES COMERCIALES

JANCY DARLY FLREZ OCHOA Mdica Veterinria Zootecnista

ORIENTADOR: Dr. JOS HENRY OSORIO TESIS PRESENTADA AL PROGRAMA DE MAESTRA EN CIENCIAS VETERINARIAS REA DE CONCENTRACIN: NUTRICIN ANIMAL, COMO PARTE DE LOS REQUISITOS PARA LA OBTENCIN DEL TITULO DE MAGISTER.

MANIZALES 2012

DEDICATORIA A mi madre: Carmen Ochoa Rincn por su amor y su apoyo en este proyecto y en toda mi vida

AGRADECIMIENTOS

A mi tutor Doctor Jos Henry Osorio por su constancia, por todo lo que me enseo en el proceso, a su paciencia y a la confianza que deposito en m para el desarrollo de este trabajo.

Al director de la maestra Doctor Luis Fernando Uribe Velsquez por su interseccin en el apoyo econmico del proyecto, y por su paciencia en todos los altibajos que ocurrieron en el proceso.

Al Doctor William Narvez por el tiempo que le dedico al proyecto. A Juan Manuel Salgado por su gran ayuda en el laboratorio de Nutricin Animal de la Universidad de Caldas y especialmente Jorge Enrique Prez por su colaboracin en el anlisis de las muestras en el laboratorio de Microbiologa de la Universidad de Caldas.

A Diana Salamanca, Juan Manuel Prez, Alex Narvez Sols y Luis Fernando Reyes Gonzles, por su amistad y colaboracin en el trabajo de campo.

NDICE

RESUMEN................................................ ABSTRACT..... CAPITULO 1 CAPITULO 2 2.1 2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.1.4 2.1.5 INTRODUCCIN... REVISIN BIBLIOGRFICA... Metabolismo de lpidos en aves comerciales.. Generalidades de los lpidos. Digestin y absorcin lipdica en las aves... Transporte de lpidos exgenos................................. Transporte endgeno de los lpidos.. Diferencias del metabolismo lipdico entre lneas de pollos de engorde. 2.1.6 2.2 CAPITULO 3 3.1 3.2 CAPITULO 4 4.1 4.1.1 Diferencias de metabolismo de lpidos en las hembras Mtodos para la evaluacin de lpidos sanguneos. OBJETIVOS.... Objetivo general... Objetivos especficos.... MATERIALES Y MTODOS Animales y dieta... Caractersticas fenotpicas de las gallinas Hy-line W-36 y Lohmann Brown-Classic.. 4.1.2 4.1.3 Manejo de las gallinas ponedoras. Caractersticas fenotpicas de los pollos de engorde Ross 308 y Cobb 500.. 4.1.4 4.2 4.3 4.3.1 Manejo de los pollos de engorde.. Recoleccin de la muestra Mtodos de anlisis. Determinacin del colesterol HDL mediante el mtodo de precipitado (Fosfotungstato)........

8 9 10 15 16 16 17 20 23

24 26 28 31 32 32 33 34

34 34

35 35 36 36

36

4.3.2

Determinacin del colesterol HDL mediante el mtodo directo (Detergente).. 37

4.3.3

Determinacin del colesterol LDL mediante el mtodo de precipitado (Polivinil sulfato)........................................................... 37

4.3.4

Determinacin del colesterol LDL mediante el mtodo directo (Detergente).. 38 38 39 Mtodo de Friedewald... Anlisis estadstico EVALUACIN DE LOS MTODOS FRIEDEWALD,

4.3.5 4.4 CAPITULO 5

PRECIPITADO Y DIRECTO, PARA LA CUANTIFICACIN DE COLESTEROL HDL Y LDL EN GALLINA 40 41 42 42 45 PONEDORA....................... 5.1 5.2 5.3 5.4 CAPITULO 6 Introduccin. Materiales y Mtodos... Resultados y discusin..... Conclusiones EVALUACIN DE LOS MTODOS FRIEDEWALD,

PRECIPITADO Y DIRECTO, PARA LA CUANTIFICACIN DE COLESTEROL HDL Y LDL EN POLLOS DE 46 47 48 48 50 ENGORDE.. 6.1 6.2 6.3 6.4 CAPITULO 7 Introduccin. Materiales y Mtodos.. Resultados y discusin.... Conclusiones COMPARACIN DE LOS NIVELES DE COLESTEROL TOTAL Y TRIGLICRIDOS EN DOS LNEAS DE GALLINA PONEDORA.... 7.1 7.2 7.3 7.3.1 Introduccin. Materiales y Mtodos... Resultados y discusin. Comparacin y correlacin de los niveles de colesterol total y TAG gallinas ponedoras.............. 53 51 52 53 53

7.4 CAPITULO 8

Conclusiones COMPARACIN DE LOS NIVELES DE COLESTEROL TOTAL, TRIGLICRIDOS Y COLESTEROL HDL EN DOS LNEAS DE POLLO DE ENGORDE.

56

57 58 58 59

8.1 8.2 8.3 8.3.1

Introduccin. Materiales y Mtodos... Resultados y discusin. Comparacin y correlacin de los niveles de colesterol total, TAG Y C-HDL en pollos de engorde

59 62 64

8.4 CAPITULO 9 9.1

Conclusiones DISCUSIN GENERAL Comparacin de un mtodo de precipitado con un mtodo directo para la cuantificacin del C-HDL en aves comerciales...

65

9.2

Comparacin de la frmula de Friedewald, un mtodo de precipitado y un mtodo directo para la cuantificacin del C-LDL en aves comerciales.. 66 68 70 72 74 85 86 87 89 Diferencias de los lpidos sanguneos en aves comerciales. Patrn metablico en aves comerciales

9.3 9.4

CONCLUSIONES.. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS ANEXOS. LISTA DE FIGURAS. LISTA DE TABLAS... LISTA DE ABREVIATURAS

RESUMEN El metabolismo lipdico en pollos y gallinas, ha sido estudiado por numerosos autores con el fin de disminuir la grasa abdominal en los pollos de engorde o los lpidos de la yema de huevo en las gallinas ponedoras. En las diferentes investigaciones se usaron algunos de los mtodos disponibles para la evaluacin del perfil lipdico en las aves comerciales; tal es el caso, del mtodo de ultracentrifugacin, el cual, requiere de equipo costoso y de personal entrenado para los anlisis; tambin, se emplearon mtodos de precipitacin de lipoprotenas, o mtodos directos con lquidos homogneos, o calcularon, el colesterol de la lipoprotena de baja densidad utilizando la frmula de Friedewald. No obstante, despus de comparar los diversos trabajos, se encontr diferencias entre los resultados obtenidos, debido a los mtodos utilizados o por diferencias genticas entre las lneas analizadas, ya sea, en pollos de engorde o gallinas ponedoras. En el presente trabajo de grado, se cuantificaron los niveles sricos del colesterol de las lipoprotenas de alta densidad por medio de los mtodos de: precipitado (Fosfotungstato) y directo (detergente y N,Nbis(4-sulfobutil)-m-toluidina), se cuantificaron los niveles sricos del colesterol de las lipoprotenas de baja densidad, por medio de los mtodos de precipitado (Polivinil sulfato), directo (detergente y N,Nbis(4-sulfobutil)-m-toluidina), y la frmula de Friedewald. Se compararon los valores sricos del colesterol y los triglicridos en las lneas de gallina ponedora de 26 semanas de edad de las lneas Hy-Line-W-36 y Lohmann Brown-Classic, y se compararon los niveles sericos de triglicridos, colesterol total y colesterol de las lipoprotenas de alta densidad, en los pollos de engorde de 36 das de edad, de las lneas Ross 308 y Cobb 500; lneas comnmente utilizadas en Colombia para produccin de huevo y carne respectivamente. Hubo diferencias significativas entre los mtodos utilizados, excepto, para la evaluacin del colesterol de la lipoprotena de alta densidad en los pollos de engorde; y se encontr diferencias entre lneas, en los parmetros analizados, excepto, para el colesterol total en las dos lneas de pollo de engorde. Palabras clave: Colesterol, gallinas ponedoras, metabolismo, mtodos de anlisis, pollos de engorde, triglicridos.

ABSTRACT The lipid metabolism in chickens and hens has been studied to date by several authors in order to decrease abdominal fat in broilers or egg yolk lipids in laying hens. Some available methods have been used for evaluation of lipid profile in poultry, such is the case of ultracentrifugation method, which requires expensive equipment and trained personnel for analysis, also lipoprotein precipitation methods or direct methods with homogeneous liquids were used, on the other hand, cholesterol low density lipoprotein was measured using the Friedewald formula. Nevertheless, after comparing the different studies, it was found differences between the results obtained, due to the methods used or the genetic differences between the lines analyzed, either in broilers or laying hens. In this work, serum levels of high density lipoprotein cholesterol were quantified using the precipitation method (Phosphotungstate), and direct method (detergent and N,Nbis (4-sulfobutyl)-m-toluidine); also serum levels of low density lipoprotein cholesterol were quantified by the precipitation method (Polyvinyl sulfate), direct method

(detergent and N,Nbis(4-sulfobutyl)-m-toluidine) and the Friedewald formula. Serum levels of cholesterol and triglycerides were compared, for 26-week-old laying hens (HyLine W-36, and Lohmann Brown-Classic), and serum levels of triglycerides, total cholesterol and high density lipoproteins cholesterol, for 36-day-old broilers (Ross 308 and Cobb 500), lines commonly used in Colombia for eggs and meat were compared respectively. There were significant differences between the methods used except for the evaluation of high density lipoprotein cholesterol in broilers; and it were found differences between lines, in the parameters analyzed, except for total cholesterol in the two broilers lines. Keywords: analytical methods, broilers, Cholesterol, laying hens, metabolism, triglycerides.

CAPTULO 1

INTRODUCCIN

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INTRODUCCIN El metabolismo de los lpidos en las aves comerciales se ha estudiado desde hace dcadas, no solo para conocer las diferencias que tienen con los mamferos, sino tambin con el fin de alterar su metabolismo; con lo cual, han logrado disminuir la grasa en pollo de engorde, pues esta fue aumentando con el rpido crecimiento que han desarrollado los pollos en los ltimos 40 aos; igualmente, en las gallinas ponedoras se ha estudiado dicho metabolismo, para lograr disminuir los lpidos del huevo, que finalmente van a ir para consumo humano. En diversos trabajos en pollos de engorde, se ha estudiado el perfil lipdico en aves ayunadas y saciadas (HERMIER et al., 1984), se han comparado esos niveles en pollos grasos y magros (GRIFFIN et al., 1989; MUSA et al., 2006), as como tambin se ha evaluado este perfil en pollos castrados (CHEN et al., 2005), y por supuesto se ha investigado cmo el perfil lipdico puede alterarse con los diferentes tipos de dieta y la relacin que hay con el acumulamiento de grasa (CRESPO & ESTEVE-GARCA, 2001; CRESPO & ESTEVE-GARCA, 2003; CHOI et al., 2010), todo con el fin de disminuir no solo la grasa abdominal, sino tambin, disminuir la grasa presente en la piel y aumentar la grasa en pechuga (XU et al., 2003) lo que ha proporcionado, un mejor sabor a dicho msculo. Tambin las gallinas ponedoras han sido investigadas, encontrndose diferencias no solo con los mamferos sino con los machos y las hembras inmaduras de su misma especie, debido a la produccin de huevo que afecta los niveles de triglicridos (TAG) y por tanto los niveles de lipoprotenas de muy baja densidad (VLDL, del ingls: very low density lipoprotein), en plasma (BACON et al., 1978; GRIFFIN et al., 1982;

HERMIER et al., 1996; HERMIER et al., 1989a; WALZEM et al., 1999), y as como en los pollos de engorde, en las gallinas ponedoras se ha investigado la influencia de la dieta en el perfil lipdico y la relacin con la disminucin de lpidos de la yema de huevo (AYERZA & COATES, 2000; CHOWDHURY et al., 2002). En los primeros estudios realizados para separar y cuantificar las lipoprotenas en las aves, se ha utilizado el mtodo de ultracentrifugacin junto con el de electroforesis (HERMIER et al., 1984; HERMIER et al., 1989a) para arrojar resultados del

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metabolismo de los lpidos en dicha especie. El mtodo de ultracentrifugacin a pesar de la difcil recuperacin de las lipoprotenas y a la falta de homogeneidad de las fracciones obtenidas (PALACIOS et al., 1999), se ha considerado como el mtodo de referencia en combinacin con un mtodo de precipitado si se requiere medir el colesterol de las lipoprotenas de alta densidad (HDL, del ingls: High density lipoprotein) (NAUCK et al., 2000), y junto con el mtodo de -cuantificacin, si se requiere medir el colesterol de las lipoprotenas de baja densidad (LDL, del ingls: Low density lipoprotein) (BACHORIK, 2000), no obstante, ninguno de los dos mtodos est totalmente garantizado en la actualidad. Debido a los altos costos operacionales, a la necesidad de personal entrenado y a lo complicado de la metodologa para realizar las ultracentrifugaciones, se han considerado otros mtodos ms fciles y asequibles para la cuantificacin de las lipoprotenas, pero dichos mtodos se basan en la medicin del colesterol que transportan las lipoprotenas medidas por ultracentrifugacin. Existen diversos mtodos para medir el colesterol de las HDL (C-HDL) y el colesterol de las LDL (C-LDL). Uno de los mtodos es la frmula que describi Friedewald et al. (1972), para el clculo del C-LDL, el cual depende de las concentraciones del colesterol total, los TAG y C-HDL de la muestra, este mtodo es econmico ya que al evaluar el perfil lipdico del individuo se obtienen todas las variables que se necesitan para la frmula; pero sus resultados se ven afectados por los niveles TAG del suero. Otros mtodos son los que consisten en la precipitacin de lipoprotenas, los cuales por accin de diferentes reactivos (que varan segn el fabricante), precipitan las lipoprotenas no HDL cuando se requiere cuantificar el C-HDL, o precipitan las LDL cuando se necesita medir el C-LDL; sin embargo, para calcular el C-LDL se precisa del valor del colesterol total de la muestra. El problema de estos mtodos es la alta interferencia que existe por los niveles sricos de los TAG, ya sea para medir C-HDL, el cual se afecta segn la concentracin de TAG y el precipitante utilizado (DEMACKER et al., 1980) o para medir el C-LDL, el cual se afecta cuando hay concentraciones >400mg/dL de TAG en el suero, sin importar el precipitante utilizado (NAUCK et al., 2002). Tambin existen los mtodos directos, igualmente conocidos como homogneos, los cuales disminuyen costos operacionales comparados con el de ultracentrifugacin, son

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mtodos especficos y estn libres de interferencias endgenas tales como altas concentraciones de TAG en sangre, ya sea para C-HDL (WARNICK et al., 2001) o para C-LDL (NAUCK et al., 2002), pese a esto, no todos los mtodos homogneos tienen las mismas garantas, y algunos pueden llegar a ser afectados por los niveles de TAG de la muestra (MILLER et al., 2002). En recientes investigaciones que se han realizado del metabolismo lipdico en aves comerciales, han utilizado la frmula de Friedewald para cuantificar el C-LDL tanto como para pollo de engorde (DANDRE HIRWA et al., 2010) como para gallina ponedora (SALMA et al., 2007), as como tambin, han usado algunos de los mtodos de precipitado o directos (YIN et al., 2008). En cuanto a la medicin del C-HDL, se han utilizado mtodos de precipitado en pollos (WANG & MUSA, 2007) y en gallinas (SALMA et al., 2007), al igual que otros mtodos de precipitado o directos (YUE et al., 2011). Por otra parte, debido a las diferencias y mejoramiento gentico que hay entre las lneas, ya sea de gallina ponedora (FRANCESCH et al., 1997) o pollo de engorde (EMMERSON, 1997), existe la posibilidad, que la concentracin sangunea de los lpidos en las aves, vare entre las lneas disponibles comercialmente, debido a que estas provienen del entrecruzamiento de razas diferentes. En un trabajo donde compararon dos tipos ponedoras comerciales, no encontraron diferencias en los lpidos sanguneos entre lneas (YIN et al., 2008), a pesar de ello, estos autores observaron que cambios en la composicin de la dieta tena una influencia en los niveles de lpidos de manera diferente en cada lnea. Respecto a los pollos de engorde se encuentran controversias entre los tipos de pollo (magro y graso); pues, unos autores dicen que hay diferencias en la concentracin triglicridos sanguneos (HERMIER et al., 1984) y otros dicen que hay diferencias entre el colesterol total, pero no en los triglicridos de la sangre (MUSA et al., 2007; MUSA et al., 2006) Debido a todo lo anterior, se quiso evaluar el comportamiento de 2 mtodos (uno de precipitado con fosfotungstato + Mg2+ y otro directo a base detergente y N,Nbis(4sulfobutil)-m-toluidina) para cuantificar el colesterol HDL y 3 mtodos (la frmula de Friedewald, uno de precipitado con polivinil sulfato y otro directo a base detergente y N,Nbis(4-sulfobutil)-m-toluidina), para cuantificar el colesterol LDL en las aves

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comerciales, y a su vez medir el colesterol total y los triglicridos en dos lneas de gallinas ponedoras y dos lneas pollos de engorde, lneas comnmente utilizadas en Colombia en la actualidad, para finalmente analizar si las diferencias encontradas entre los valores presentados en las diversas publicaciones, se debe a los mtodos, o s es por las diferentes lneas utilizadas que vara tanto el perfil lipdico en las aves comerciales.

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CAPTULO 2

REVISIN BIBLIOGRFICA

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REVISIN BIBLIOGRFICA 2.1 Metabolismo de lpidos en aves comerciales 2.1.1 Generalidades de los lpidos Los lpidos son un grupo de compuestos orgnicos, caracterizados por ser pocos solubles en agua pero fciles de disolver en compuestos como el benceno, cloroformo, y ter entre otros. En general, pueden mencionarse en este grupo los cidos grasos y sus esteres (acilgliceroles, ceras y fosfolpidos), los cuerpos cetnicos y lpidos no saponificables (esteroides, carotenos y terpenos) (MURRAY et al., 2004). En la

alimentacin animal, los lpidos son importantes por su elevado valor energtico, y entre ellos estn las vitaminas liposolubles y los cidos grasos esenciales (3, 6 y 9). Dentro de las principales funciones de los lpidos, cabe mencionar, que pueden ser fuente de energa metablica (cidos grasos, cuerpos cetnicos) oxidndose para producir ATP (fuente de energa directa); depositarse en el tejido adiposo como triacilglicroles (llamados tambin triglicridos o triacilglicridos) (Figura 1) (fuente de energa potencial); circular por el plasma como cuerpos cetnicos, cidos grasos de cadena larga (NEWSHOLME & LEECH, 1987) y hacer parte de la yema de huevo de las aves (WALZEM et al., 1999). En las aves, la digestin y transporte hasta el hgado de los lpidos difiere en gran manera con los mamferos; los TAG se almacenan especialmente en los hepatocitos, en el tejido adiposo o en la yema de huevo, asimismo, son fuente de energa para el embrin (HERMIER, 1997).

Figura 1. Triglicrido Entre las clasificaciones de los lpidos se encuentra la divisin general entre lpidos simples y lpidos complejos. Los lpidos simples son esteres de cidos que varan segn el alcohol e incluyen: a. cidos grasos de cadena larga, como los cidos monocarboxlicos, entre 12 y 22 tomos de carbono y generalmente con nmero par de carbonos; b. Grasas o aceites, que son esteres de cidos grasos donde el alcohol es el glicerol (TAG), denominndose grasas cuando son slidos o aceites cuando son

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lquidos, a temperatura ambiente, y c. Ceras; conformadas por esteres de cidos grasos de cadena larga, con alcoholes monohdricos de peso molecular ms elevado. Los lpidos complejos son esteres de cidos grasos con un alcohol y otros grupos qumicos y entre ellos se encuentran los fosfolpidos, los cuales adems del cido graso y el alcohol (glicerol o esfingosina), tienen cido fosfrico (Glicerofosfolpidos o

esfingofosfolpidos) o carbohidratos (glucolpidos) (MURRAY et al., 2004). Un ltimo grupo de lpidos complejos lo constituyen las lipoprotenas que transportan TAG, colesterol libre (CL), esteres de colesterol (EC), fosfolpidos y apolipoprotenas; as mismo, existen combinaciones de lpidos y protenas en las membranas celulares y de las mitocondrias (MONTGOMERY & CONWAY, 1998) 2.1.2 Digestin y absorcin lipdica en las aves El trayecto digestivo de las aves consta de cavidad bucal, esfago, buche, proventrculo (estomago glandular), ventrculo (estomago muscular o molleja), intestino delgado, ciegos, intestino grueso, cloaca. En las aves no se reporta la accin de las lipasa lingual ni de la lipasa gstrica, por lo tanto la molleja y el intestino son los encargados de la emulsificacin de los lpidos, formacin de micelas y absorcin de lpidos, dicha emulsificacin est a cargo de los cidos biliares y el jugo pancretico, con sus componentes ms importantes: las sales biliares y la lipasa pancretica (LP), respectivamente, adems, de la fosfolipasa A2 y la colipasa secretadas tambin por el pncreas (KROGDAHL, 1984). En las sales biliares de las aves, el cido tauroquenodesoxiclico est presente en gran proporcin, y es uno de los cidos de dichas sales que inhiben la LP, efecto que se contrarresta con la colipasa (BOSCBIERNE et al., 1984); finalmente, los lpidos hidrolizados en el intestino son devueltos a la molleja (reflejo entero-gstrico) (PLACE, 1996) antes de ser absorbidos por el duodeno y la parte anterior del yeyuno principalmente (SKLAN et al., 1975). La regulacin del flujo biliar y enzimas pancreticas, est a cargo de la colecistoquinina (hormona peptdica), la cual es sintetizada por la mucosa del intestino delgado y secretada en el duodeno cuando hay presencia de cidos grasos y aminocidos (GIBBS et al., 1973).

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En las aves comerciales una de las causas de la alteracin en la absorcin de los lpidos, es debida a cambios en la composicin de la dieta que alteran la microflora intestinal, afectando la conversin de las sales biliares primarias (cido quenodesoxicolico y clico) a las secundarias (cido litoclico y desoxiclico) (KROGDAHL, 1985); por tal motivo si se alimenta a las aves con sales biliares primarias y antibiticos para reducir los microorganismos intestinales, se favorece la absorcin del alimento, hay mejor conversin alimenticia y se disminuye la mortalidad de las aves (BAURHOO et al., 2009; SUN et al., 2005). Pero el uso de antibiticos como promotores de crecimiento es prohibido actualmente segn el CODEX alimentarius (FAO, 2004); por lo tanto, actualmente se investigan sustancias tales como polifenoles que modifican la morfologa y microflora intestinal de las aves (VIVEROS et al., 2011). Las micelas compuestas facilitan la absorcin de los lpidos, debido a que proveen altas concentraciones de los productos de la digestin de las grasas (TAG, fosfolpidos, esteres de colesterol y vitaminas liposolubles) en las clulas de la mucosa intestinal. (Figura 2). En el caso de los TAG, estn los monoacilgliceridos y los cidos grasos de cadena larga, que al entrar a clulas son resintetizados (figura 3); en las aves la resntesis intramucosal de los TAG est dada por las vas de los monoacilgliceroles y la del cido fosfatdico (BOCKERSTAFFE & ANNISON, 1969). La reesterificacin de los cidos grasos depende de la suplementacin con carbohidratos, debido a que estos proveen substrato y energa para su sntesis (KROGDAHL, 1984).

Figura 2. Hidrlisis de TAG, formacin de micelas compuestas y absorcin por enterocitos

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Los fosfolpidos son hidrolizados por la lipasa pancretica, la cual hidroliza el cido graso en posicin 1, y la fosfolipasa A2 tambin segregada por el pncreas la cual elimina el cido graso en posicin 2; estas hidrlisis dan lugar a lisofosfoglicridos ms cidos grasos. El colesterol en la dieta viene en forma de esteres de colesterol, que son hidrolizados en la luz del intestino por la colesterol esterasa, enzima segregada por el pncreas. Este colesterol hidrolizado y el colesterol libre proveniente de las clulas epiteliales de descamacin, junto con los fosfolpidos tambin hacen parte de las micelas compuestas (NEWSHOLME & LEECH, 1987). Otros compuestos lipdicos que hacen parte de las micelas son las vitaminas liposolubles A, D, E y K. Todos estos lpidos son transportados a las clulas epiteliales las cuales los absorben para su posterior paso a la va sangunea. La transferencia de los lpidos del medio micelar, la cual es favorable al medio acuoso, pero desfavorable al epitelio, se facilita por la protena enlazante de cidos grasos (FABP, del inlges: fatty acid binding protein). Esta protena tiene preferencia por los cidos grasos de cadena larga. En las aves, la concentracin de FABP es alta en la porcin proximal del intestino y va disminuyendo a medida que se acerca a la parte distal del mismo, aunque su nivel puede estar mediado por las sales biliares (KATONGOLE & MARCH, 1979). El sitio de absorcin de los lpidos por el intestino delgado es variado segn los estudios realizados, por ejemplo algunos encontraron que la mayora del cido palmtico en los pollos se absorbe en el duodeno (NOYAN et al., 1964), mientras que en gallinas ponedoras el cido linoleico, esterico y el palmtico se absorben significativamente por el leon (HURWITZ et al., 1973), sin embargo, en las aves la mayora de los lpidos son absorbidos en el yeyuno (HURWITZ et al., 1979), dicha absorcin se realiza a travs de los cilios de las membranas celulares de forma pasiva (GARRET & YOUNG, 1975), para formar las lipoprotenas encargadas del transporte de lpidos. Las sales biliares se absorben en el yeyuno e leon en similares cantidades, esto indica que la absorcin de lpidos y sales biliares se superponen (HURWITZ et al., 1973; KROGDAHL, 1984), las sales biliares llegan al hgado por el sistema porta-heptico para ser secretados nuevamente por la bilis y las que se pierden por las heces son sustituidas por las sntesis de novo en el hgado (LEHNINGER, 1991).

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La yema es la fuente principal de energa para el pollito. Despus de la eclosin, el pollito digiere dicha yema, esta es catalizada por las lipasas secretadas desde la cara interna del saco vitelino. La yema no pasa al intestino antes de la eclosin o lo hace en muy pocas cantidades y su tasa de asimilacin incrementa despus de la eclosin por medio de: la membrana del saco vitelino, el epitelio del conducto onfalomesentrico y la mucosa intestinal. Por otra parte, los procesos que realizan las enzimas pancreticas, las sales biliares y el hgado en los pollitos recin eclosionados, no son importantes hasta que el pollito empieza a comer, ya que la yema lleva a cabo su propia asimilacin (ROMANOFF, 1969). La digestibilidad de los lpidos en pollitos va incrementando gradualmente, desde la primera semana hasta estabilizarse en la octava (GIBBS et al., 1973), esto se debe probablemente a que los pollitos no tienen la habilidad de incrementar la sntesis de sales biliares para sufragar su demanda; no obstante, despus de la sexta semana esta se estabiliza (SERAFIN & NESHEIM, 1970); adems, la concentracin de FABP es baja en la primera semana de edad pero incrementa hasta en un 50% entre la semana 3 y 5 de edad (KATONGOLE & MARCH, 1980). Sin embargo, los pollitos tienen una concentracin alta de lpidos en sangre e hgado principalmente de colesterol, lo cual probablemente se debe a la transferencia intacta de este, desde la madre hacia el embrin permaneciendo hasta despus de la eclosin (CONNOR et al., 1969). 2.1.3 Transporte de lpidos exgenos Para ser transportados los lpidos hidrolizados en la luz del intestino deben ser reesterificados. En las aves, solo la mitad de los lpidos consumidos tienen este proceso dentro de las clulas de la mucosa intestinal; luego en las clulas epiteliales del intestino, se combinan TAG, fosfolpidos, colesterol, esteres de colesterol y apolipoprotenas formando portomicrones (PM) (Figura 3) (GRIFFIN & HERMIER, 1988), los cidos grasos no reesterificados son absorbidos directamente y son transportados por la albumina (BAYNES & DOMINICZAK, 2005). En las aves toma el nombre de portomicrn, debido a que las lipoprotenas formadas entran en los vasos sanguneos a travs de las vesculas intracitoplasmticas endoteliales (FRASER et al., 1986) y son transportados desde las venas pancreaticoduodenal y yeyunal hasta la vena porta (NOYAN et al., 1964), en cambio los quilomicrones en los mamferos entran en

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los vasos linfticos intestinales a travs de los espacios intercelulares endoteliales (FRASER et al., 1986), para ser segregados al torrente circulatorio a travs del conducto torcico. Los portomicrones de las aves, tienen igual tamao que los quilomicrones de los mamferos (GRIFFIN et al., 1982). Estn compuestos por 88,8% de TAG, 6,2% de fosfolpidos, 3,6% de colesterol libre y esteres de colesterol, y 1,4% de protena (apolipoprotenas: apoB y apoC-II) (GRIFFIN & HERMIER, 1988). Los portomicrones aunque pasan directamente a la circulacin portal no son metabolizados por el hgado debido al gran tamao que poseen (FRASER et al., 1986), por lo tanto, siguen su camino para ser parcialmente metabolizados en un tiempo entre 3-4 minutos por tejidos extrahepticos (GRIFFIN & HERMIER, 1988).

Figura 3. Composicin de portomicrones

El ingreso de los TAG que transportan los portomicrones a los tejidos, depende de la hidrlisis realizada por la lipoprotena lipasa (LPL), la cual se encuentra en los tejidos extrahepticos en la cara externa de las clulas endoteliales que rodean los capilares; la LPL hidroliza a los TAG a glicerol y cidos grasos, el glicerol es transportado al hgado y al rin para su posterior metabolismo y los cidos grasos son captados por el tejido donde se realiz la hidrlisis; no obstante, para que los portomicrones sean sustrato de

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la LPL deben adquirir apolipoprotena C-II a partir de las HDL (HERMIER, 1997), una vez ha disminuido la relacin lpido/protena quedan partculas ms pequeas que son metabolizadas en el hgado, las cuales en los mamferos toman el nombre de quilomicrones remanentes (CSAR et al., 2006; COOPER, 1997). La LPL es sintetizada en el tejido adiposo, muscular, pulmonar y renal; pero solo una fraccin es secretada a la cara externa de los capilares para realizar su funcin (HERMIER, 1997). La LPL en las aves es sensible a hormonas, principalmente la insulina; y la actividad de esta enzima, difiere segn tejido o el estado nutricional ya que es mayor en estados de ayuno en tejidos como msculo estriado y cardiaco, y en estados de alimentacin es mayor en el tejido adiposo (BORRON et al., 1979), no obstante, otros autores han encontrado que el estado de ayuno no afecta la actividad del LPL en el tejido adiposo (BENSON & BENSADOUN, 1976).

Figura 4. Transporte y metabolismo de lpidos exgenos y endgenos

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2.1.4 Transporte endgeno de los lpidos El transporte endgeno de los lpidos se realiza desde el hgado a los tejidos perifricos. Este transporte est a cargo de las VLDL. Las VLDL de las aves tienen una densidad <1,013g/cm3 estn compuestas por 41,7% de TAG, 15,2% de fosfolpidos, 3,1% de colesterol libre, 15% de esteres de colesterol y 26,8% de protena (apoA-I, apoB-100, apoC-II y adems las apoVLDL-II para gallinas), estando la apoB-100 en mayor cantidad en las VLDL (GRIFFIN & HERMIER, 1988; NIMPF & SCHNEIDER, 1991). Debido a que el hgado en las aves es el mayor productor de TAG (GRIFFIN et al., 1989) se destacan las tres fuentes de cidos grasos para la sntesis de VLDL: a partir del acetil coenzima A (acetil-CoA) en la sntesis de novo, de los portomicrones y por captacin de los cidos grasos libres unidos a la albumina procedentes del tejido adiposo; adems de generar TAG, el hgado es tambin la fuente principal de colesterol y fosfolpidos (HERMIER, 1997). La sntesis y la lipognesis de novo de las VLDL es mejorada por la insulina, mientras que la tiroxina y el glucagn tienen el efecto contrario (HERMIER, 1997). Despus de adquirir la apoC-II, las VLDL son hidrolizadas por la LPL, liberando sus TAG para su acumulacin respectiva; despus de la disminucin en la relacin lpido/protena se producen las lipoprotenas de densidad intermedia (IDL, del ingls: intermediate density lipoprotein), las cuales siguen metabolizndose hasta formar las LDL (HERMIER, 1997). Las IDL tienen una densidad entre 1,013-1,023g/cm3 estn compuestas por 14,4% de TAG, 17,7% de fosfolpidos, 7,3% de colesterol libre, 30,3% de esteres de colesterol y 29,8% de protena y las LDL tienen una densidad entre 1,023- 1,046g/cm3 y estn compuestas por 7,5% de TAG, 21,9% de fosfolpidos, 10,1% de colesterol libre, 30,4% de esteres de colesterol y 29,7% de protena (HERMIER et al., 1984), siendo la misma para las dos lipoprotenas (apoA-I y apoB) (GRIFFIN & HERMIER, 1988), ests diferencias se deben a que las IDL pierden TAG por la hidrlisis de la LPL, y entregan las apoC y reciben esteres de colesterol de las HDL. Las LDL suministran su colesterol para la sntesis de membranas celulares en su degradacin o para su almacenamiento, las apolipoprotenas se hidrolizan a aminocidos. La acumulacin de colesterol y esteres de colesterol a nivel intracelular, se puede controlar inhibiendo la enzima hidroximetil glutaril CoA reductasa (HMG-CoA reductasa), la que es especfica

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para la biosntesis del colesterol (IDE et al., 1978), o con la disminucin de los receptores de LDL debido a un aumento de la concentracin de colesterol (TABAS, 2002). Las HDL tienen una densidad entre 1,052-1,130g/cm3, estn compuestas por 1,7% de TAG, 28,6% de fosfolpidos, 3,9 % de colesterol libre, 23,4% de esteres de colesterol y 45,4% de protenas (apoA-I y apoC-II) (GRIFFIN & HERMIER, 1988). La apoA-I es la protena ms importante en las HDL (BANERJEE & REDMAN, 1983) y la mayora de los fosfolpidos se asocian a la apoA-I dentro de las HDL (HERMIER, 1997). El Hgado en las aves es el mayor productor de HDL y dentro del aparato de Golgi, se encuentran formas esfricas y discoidales de dicha lipoprotena (BANERJEE & REDMAN, 1983), pero en la circulacin a diferencia de los mamferos solo se conoce la forma esfrica y no la discoidal de HDL (VIEIRA et al., 1995). Las funciones de las HDL son las de aceptar las apolipoprotenas y fosfolpidos de las lipoprotenas degradadas, aceptar el colesterol de los tejidos y de las lipoprotenas; entregar a estas los esteres de colesterol para mantener el equilibrio lpido/protena, para esto necesita de la fosfolipasa A2 adherida al endotelio capilar y de la lecitina-colesterol aciltransferasa (LCAT) (DING & LILBURN, 2000); la fosfolipasa acta sobre los fosfolpidos que transportan las lipoprotenas y la LCAT es necesaria para la conversin del colesterol de las HDL a esteres de colesterol, los esteres de colesterol entregados por las HDL a las LDL y a los remanentes proteicos son transportados hacia el hgado y a los tejidos extrahepticos (DE BEER et al., 2000; DING & LILBURN, 2000). Asimismo, enzimas como la LCAT y la protena de transferencia de esteres de colesterol participan en el transporte inverso del colesterol, transportando el colesterol de las paredes arteriales al hgado usando como intermediario a la cascada de las VLDL (DING & LILBURN, 2000; TOTH, 2005). 2.1.5 Diferencias del metabolismo lipdico entre lneas de pollos de engorde La lipognesis en el tejido adiposo de las aves es limitada, lo que implica que el depsito de grasa dependa de los lpidos ingeridos en la dieta y de la lipognesis heptica (GRIFFIN et al., 1989), por lo tanto, la acumulacin de los TAG en los adipocitos se relaciona con el metabolismo de las VLDL y otras sustancias, sin

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embargo, sta puede estar afectada por sustancias que no alteran directamente las VLDL (XU et al., 2003). Las lneas genticas modernas de pollo de engorde se seleccionan a partir de altas o bajas concentraciones en el plasma de VLDL dando lugar a las lneas grasas y magras de pollo, respectivamente (GRIFFIN et al., 1989). Debido a la mayor concentracin de VLDL en sangre en las lneas grasas, hay una mayor cantidad de TAG disponibles para ser depositados en el tejido adiposo con una menor cantidad de esteres de colesterol y protena. Las IDL, LDL y HDL presentan menor cantidad de esteres de colesterol en las lneas grasas, pero solo las IDL tienen mayor contenido de TAG en dichas lneas (HERMIER et al., 1984). No obstante, se ha encontrado que la mayor cantidad de grasa abdominal en pollos tipo graso, est relacionada positivamente con los niveles de LDL y colesterol total y negativamente con los niveles de TAG, HDL, VLDL, pero, en los pollos tipo magro, la grasa abdominal se relaciona positivamente con TAG, VLDL, HDL, LDL y CT (MUSA et al., 2007). Adems, la seleccin de aves para un rpido y mayor crecimiento muscular a partir de un incremento en el consumo de alimento repercute en un aumento en el depsito de grasa (HAVENSTEIN et al., 2003), y se ha demostrado que el tipo de alimentacin ejerce un papel importante en el metabolismo lipdico, en la acumulacin de grasa abdominal, haciendo parte dichos lpidos del tejido muscular, esqueltico o visceral (AN et al., 1997; CRESPO & ESTEVE-GARCA, 2001; CRESPO & ESTEVE-GARCA, 2002), por otra parte, los niveles de insulina tambin estn involucrados en las diferencias entre lneas magras y grasas de pollo, pues altas concentraciones de esta, estn asociadas con alto contenido de grasa abdominal (SINSIGALLI et al., 1987). En cuanto a la actividad de la LPL en las dos lneas (grasas y magras) es un poco mayor en los msculos cardiaco y estriado de las lneas con concentraciones bajas de VLDL (GRIFFIN et al., 1989), lo contrario ocurre con las lneas de alta concentracin de VLDL, pues hay una mayor actividad funcional de la LPL en el tejido adiposo debido a la hipertrofia e hiperplasia de los adipocitos, (HERMIER et al., 1989b); por otra parte, la concentracin de -hidroxibutirato en el plasma de las lneas de baja concentracin de VLDL es ms alta, esto indica, que los cidos grasos tienden a ser oxidados en vez transportarse para la sntesis de VLDL (GRIFFIN et al., 1989). La actividad de la LPL

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se puede inhibir para modificar la grasa abdominal en los pollos (SATO et al., 1999), pero no es un factor limitante para la acumulacin de TAG en el tejido adiposo debido a que este almacenamiento depende del substrato de las VLDL del plasma hacia dicho tejido (GRIFFIN et al., 1989). Respecto a las HDL en los pollos tipo magro y graso, tambin se han reportado diferencias. Se postula que no hay relacin de las HDL con el colesterol total y TAG en las razas tipo graso, pero si entre las HDL con el colesterol total en algunas razas de tipo magro (MUSA et al., 2007; MUSA et al., 2006). 2.1.6 Diferencias de metabolismo de lpidos en las hembras La vitelognesis es caracterizada por la acumulacin de lpidos especialmente TAG (HERMIER et al., 1996), por tal razn, la cantidad srica de VLDL es mayor en las lneas de huevo comparadas con los machos, ya sean de lneas pesadas (tipo carne) livianas o semipesadas (tipo huevo) (WALZEM et al., 1994) o hembras inmaduras (BACON et al., 1974), adems, en las gallinas existe la vitelogenina (VTG), una lipofosfoprotena de alta densidad, que solo se encuentra en las gallinas en produccin, y junto con otras lipoprotenas, van a ser parte de la yema de huevo (HERMIER et al., 1989a; VIEIRA et al., 1995; WALZEM et al., 1999), finalmente, la VTG forma las fosfoprotenas de la yema de huevo: lipovitelin y fosvitina (DEELEY et al., 1975; MORAN, 1987). En las gallinas ponedoras en produccin, hay un aumento en la concentracin y secrecin de VLDL, y no solo cambian de manera cuantitativa sino cualitativa, debido, a que hay mayor cantidad de colesterol libre que de esteres de colesterol en su composicin, lo cual difiere de los machos (HERMIER et al., 1996; HERMIER et al., 1989a), adems, hay diferencias en la concentracin de las lipoprotenas entre las mismas gallinas, lo cual puede ir relacionado con la cantidad de 17 -estradiol, pues, las gallinas inmaduras estn en un rango menor que las gallinas en produccin (HERMIER et al., 1989a). Los oocitos son los receptores de los TAG de las VLDL con apoB-100 en las gallinas ponedoras. Las VLDL con tamao mayor a 44nm sufren una serie de cambios metablicos y de ensamblaje para formar las VLDLy, que son ms pequeas en dimetro (25-44nm) pero ricas en TAG y son las encargadas de transportar la energa

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necesaria para la yema de huevo (la y viene del ingls yolk, por esta razn se han denominado VLDLy) (WALZEM et al., 1999), las VLDLy contienen grandes cantidades de apoVLDL-II, son resistentes a la actividad lipoltica de la LPL por lo tanto previenen la formacin de IDL o LDL (SCHNEIDER et al., 1990; WALZEM et al., 1999), sin embargo, en estudios anteriores encontraron apoVLDL-II en todas las lipoprotenas (HERMIER et al., 1989a) inclusive en las HDL (VIEIRA et al., 1995), aunque en menor proporcin; y en cuanto a la composicin de las VLDLy, estas tienen gran cantidad de TAG pero bajos niveles de esteres de colesterol (WALZEM et al., 1999). El proceso de ensamble de las VLDLy depende del nivel de estrgenos (NIMPF & SCHNEIDER, 1991; WALZEM et al., 1999). Los estrgenos estimulan la sntesis de fosfolpidos y TAG, as como la incorporacin de acetato y glucosa para la formacin de los TAG, adems de la liberacin de estos hacia el torrente sanguneo y la sntesis y acumulacin en el hgado, mientras que la sntesis de colesterol aumenta en menor grado por el hgado (DASHTI et al., 1983; KUDZMA et al., 1975). Los estrgenos tambin estimulan la sntesis de apoB (KIRCHGESSNER et al., 1987) y apoVLDL-II por el hgado (NIMPF & SCHNEIDER, 1991), pero las apoB formadas en el intestino delgado y el rin no dependen de los estrgenos (LAZIER et al., 1994). En las aves, en el retculo endoplsmico de los tbulos proximales del rin se ensamblan partculas de VLDL de 60nm de dimetro, estas VLDL nacientes son excretadas y llegan rpidamente a la sangre (WALZEM et al., 1999), y poseen la apoB sintetizada a lo largo de los tbulos contorneado distal y proximal principalmente (TARUGI et al., 1988), por lo tanto, se ha considerado a los tbulos proximales como anlogos del intestino delgado; al parecer, en las gallinas ponedoras los estrgenos transforman todas las VLDL nacientes en VLDLy en los hepatocitos; las VLDLy poseen apoB-100 y apoVLDL-II, pero los tbulos proximales no sintetizan apoVLDLII, por lo tanto, las VLDL estaran expuestas a la hidrlisis por parte de la LPL mientras llegan al hgado (WALZEM et al., 1999). En las aves los estrgenos pueden causar un incremento en la concentracin de cidos grasos libres en el plasma (BACON et al., 1978), lo cual, podra incrementar el flujo de cidos grasos en el sistema urinario y estimular la produccin en tamao y nmero de

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VLDL nacientes en los tbulos proximales. Por otra parte, la LPL est incrementada en el corazn y disminuida en el tejido adiposo, para suplir las necesidades energticas del msculo cardiaco a partir de las VLDL nacientes (WALZEM et al., 1999). En los casos donde el hgado excede la produccin de lpidos, pero disminuye la secrecin de las VLDL, se produce esteatosis heptica o sndrome de hgado graso por acumulacin excesiva de TAG en dicho rgano, este problema afecta a las gallinas ponedoras reduciendo la produccin de huevo e incrementando la mortalidad, consecuentemente, es considerada el desorden metablico ms importante en las gallinas (HERMIER, 1997; RAHIM, 2005), pero con una dieta rica en fosfolpidos se puede reducir la acumulacin de TAG en el hgado (AN et al., 1997). 2.2 Mtodos para la evaluacin de lpidos sanguneos Debido a la relacin que existe entre las lipoprotenas plasmticas con la acumulacin de lpidos en la yema de huevo (HERMIER et al., 1989a; VIEIRA et al., 1995; WALZEM et al., 1999) y con la grasa subcutnea y abdominal de pollos de engorde (GRIFFIN et al., 1989), se han usado diferentes mtodos de cuantificacin de lpidos sanguneos, para realizar las diferentes investigaciones sobre el metabolismo de lpidos en las aves comerciales. Al usar los trminos de colesterol HDL o colesterol LDL, se refiere a la fraccin de colesterol que es transportado por dichas lipoprotenas definidas por ultracentrifugacin, aunque, solo constituyen aproximadamente el 27% en los pollos y el 5-17% en las gallinas ponedoras de la composicin total de una HDL, y 40% en los pollos y el 1426% en las gallinas ponedoras, de la composicin total de una LDL (HERMIER et al., 1984; HERMIER et al., 1989a). Como el mtodo de ultracentrifugacin es costoso, y necesita de personal entrenado para realizarlo, las lipoprotenas han sido fraccionadas y separadas por otros mtodos tales como, electroforesis, precipitacin qumica, determinacin directa, entre otros, por lo tanto, las HDL y las LDL se miden en trminos de su contenido en colesterol. La precipitacin qumica de las HDL, consiste en aislar dicha lipoprotena en el suero o plasma, mediante precipitacin selectiva de las otras lipoprotenas, quedando en el sobrenadante solo las HDL previa centrifugacin y as medir nicamente colesterol de

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las HDL. Dicha precipitacin selectiva se debe a que las sustancias qumicas, las cuales cambian segn el fabricante (heparina + cloruro de manganeso, sulfato de dextranocloruro de magnesio, fosfotungstato + iones de magnesio, polietilenglicol y concanavalina A), forman complejos insolubles con las apoB presentes en las VLDL, IDL y LDL, sedimentndose y separndose de las HDL por centrifugacin (PALACIOS et al., 1999). Sin embargo, este mtodo puede dar errores en sus resultados, cuando algunos complejos formados que deberan precipitar, quedan flotando en el sobrenadante, esto ocurre cuando hay una elevada concentracin de lipoprotenas ricas en TAG en la sangre (DEMACKER et al., 1980). La precipitacin qumica de las LDL consiste en que el reactivo utilizado, el cual cambia segn el laboratorio (heparina a un pH 5.12, polivinil sulfato, polmeros anfipticos o dextran sulfato), se mezcla con la muestra y al centrifugarse las LDL precipitan quedando en el sobrenadante las VLDL, IDL y HDL. Al sobrenadante con las lipoprotenas no LDL, se le adiciona el reactivo con las enzimas colesterol esterasa y oxidasa, dando como resultado el C-VLDL, C-IDL y C-HDL. Previamente se cuantifica el colesterol total de la muestra. Finalmente el colesterol LDL se cuantifica a partir de la diferencia entre el colesterol total de la muestra y el colesterol del sobrenadante (NAUCK et al., 2002). Los mtodos homogneos, son mtodos completamente automatizados que al usar reactivos especficos miden directa y selectivamente el colesterol de las lipoprotenas de alta o de baja densidad. Debido a esto se les conoce como mtodos directos para la evaluacin del colesterol HDL o LDL (GARCA et al., 2006; NAUCK et al., 2002; WARNICK et al., 2001). En cuanto al anlisis del C-HDL por los mtodos homogneos, tienen como fin evitar que las lipoprotenas no HDL sean hidrolizadas por las enzimas especficas para hidrolizar el colesterol (colesterol esterasa y oxidasa). El primer mtodo homogneo descrito por International Reagents Corporation (Kobe, Japan), explica que, esto se debe a que las lipoprotenas que contiene apoB (quilomicrones, VLDL, IDL y LDL) se agregan y se bloquean con los reactivos especficos evitando la hidrolisis posterior de su colesterol (WARNICK et al., 2001). En el caso del mtodo a base de detergentes, primero se adiciona un reactivo que contiene polmeros y polianiones, que adsorben la

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superficie de los quilomicrones, VLDL, IDL y LDL, formando complejos que los hacen resistentes a la accin del reactivo 2; en el segundo reactivo, se encuentra el detergente que solubiliza las HDL, finalmente, el C-HDL es hidrolizado por la colesterol esterasa y oxidasa para ser cuantificado espectrofotomtricamente (HARRIS et al., 1997; NAUCK et al., 1998). En el anlisis de C-LDL por los mtodos homogneos, los reactivos existentes tienen diferentes mecanismos de accin para determinar directamente el C-LDL. Un estudio donde usaron polioxietileno-polioxipropileno y sulfato de ciclodextrina como reactivos, describen, que la funcin de estos es no permitir la separacin de: las protenas, el colesterol y los fosfolpidos de las VLDL y quilomicrones, por otra parte, las HDL sufren un cambio en la composicin de lpido/protena, variando la densidad de carga o induciendo a la agregacin de las HDL formando macropartculas. Estas dos reacciones hacen que las VLDL, quilomicrones y HDL sean resistentes a las reacciones enzimticas del colesterol esterasa y oxidasa. Lo contrario ocurre con las LDL, pues estas sufren la separacin de las protenas, colesterol y fosfolpidos, quedando el colesterol de las LDL susceptible a las reacciones enzimticas (SUGIUCHI et al., 1998). A diferencia del mtodo anteriormente descrito, el mtodo homogneo a base de detergentes, consiste en que el detergente del reactivo 1, solubiliza las lipoprotenas no LDL, y su colesterol es hidrolizado por las enzimas colesterol esterasa y oxidasa, el producto reacciona con la 4-aminoantipirina en una reaccin no formadora de color. Despus, se aade el reactivo 2, este reactivo tambin contiene un detergente especfico que libera el colesterol de las LDL, las enzimas colesterol esterasa y oxidasa hidrolizan el colesterol LDL, el producto reacciona con N,Nbis(4-sulfobutil)-m-toluidina y la reaccin es formadora de color, la cual es proporcional al C-LDL de la muestra (NAUCK et al., 2002).

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CAPITULO 3

OBJETIVOS

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OBJETIVOS 3.1 Objetivo general Estudiar el metabolismo lipdico bsico en aves comerciales. 3.2 Objetivos especficos Establecer el mtodo de eleccin para medir perfil lipdico en aves comerciales. Realizar un anlisis comparativo de lpidos sanguneos en dos lneas de gallina ponedora en dos lneas de pollo de engorde. Establecer un perfil lipdico completo para aves comerciales. Confirmar el patrn metablico al que pertenecen las aves comerciales.

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CAPITULO 4

MATERIALES Y MTODOS

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MATERIALES Y MTODOS 4.1 Animales y dieta 4.1.1 Caractersticas fenotpicas de las gallinas Hy-line W-36 y Lohmann BrownClassic La lnea: Hy-Line W-36, fue formada a partir de la raza Leghorn, esta raza se caracteriza por ser de plumaje y huevos blancos, cresta simple, se especializa en la produccin de huevo para consumo (VACA, 1991); el peso promedio de la Hy line W36 es: 1530g (conocidas como aves livianas), el consumo de alimento en fase de produccin es de aproximadamente 95g/ave/da, la produccin de huevo hasta la semana 80 est alrededor de 347huevos/ave, estos resultados se consiguen siguiendo las recomendaciones de la gua de manejo (HY-LINE INTERNATIONAL, 2009). Hay que tener en cuenta que las lneas descendientes de la raza Leghorn, pertenecen a un grupo minoritario de aves, de las cuales es de conocimiento pblico su genealoga. La lnea: Lohmann Brown-Classic, se caracteriza por poseer plumaje marrn, tiene algunas plumas blancas en la punta de la cola, los huevos son de color marrn uniforme, y la cresta es simple. El peso promedio de la Lohmann Brown-Classic vara segn la semana produccin entre 1650g (semana 20) y 2100g (semana 80), por lo tanto son conocidas como gallinas semi-pesadas, el consumo de alimento en fase de produccin es de 110-120g/ave/da, la produccin de huevo hasta la semana 80 est alrededor de 337huevos/ave, estos resultados se consiguen siguiendo las recomendaciones de la gua de manejo (LOHMANN-TIERZUCHT, 2007). 4.1.2 Manejo de las gallinas ponedoras Las gallinas de las lneas Hy-Line W-36 y Lohmann Brown-Classic, fueron criadas en la Granja Montelido propiedad de la Universidad de Caldas, a una temperatura promedio de 25C, y 13 horas de luz aproximadamente, fueron alimentadas hasta la semana veinticuatro de edad con una dieta comercial para gallinas ponedoras, junto con todo el lote de aves. Se eligieron completamente al azar las aves a estudiar, mantenindose en el mismo galpn, y durante las semanas 25 y 26 de edad, se alimentaron con una dieta a base de maz, torta de soya y aceite de soya, cuya

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composicin qumica se muestra en la Tabla 1. La produccin para la semana 26 de las aves escogidas fue del 96% en las gallinas Hy-Line W-36, con un peso promedio de 1.444g, y 98% en las gallinas Lohmann Brown-Classic, con un peso promedio de 1.851g. Se realiz un ayuno previo de 16h 2h para la toma de muestras. Tabla 1. Composicin de la dieta para gallina ponedora
Materia Seca Nitrgeno Total Protena Bruta Grasa Total Fibra Bruta Cenizas Fsforo Calcio

93,05%

3,6%

22,50%

2,32%

3,04%

6,41%

0,22%

0,46%

4.1.3 Caractersticas fenotpicas de los pollos de engorde Ross 308 y Cobb 500 Los pollos de engorde de las lneas Ross 308 y Cobb 500, se caracterizan por ser aves de plumaje blanco y rpido crecimiento; los pollos Ross 308, llegan a pesar al da 35: 2021g/ave, con un consumo de alimento acumulado de 3248g/ave, o llegan a pesar al da 50: 3348g/ave, con un consumo de alimento acumulado de 6413g/ave (AVIAGEN, 2007). En cuanto a los pollos Cobb 500, los machos pueden llegar a pesar al da 35: 2155g/ave, con un consumo de alimento acumulado de 3381g/ave, o llegan a pesar al da 50: 3571g/ave, con un consumo de alimento acumulado de 6546g/ave (COBBVANTRESS, 2008). En general, hay que tener en cuenta, que la ganancia de peso y el consumo de alimento son afectadas por la variedad de climas, medioambiente del galpn (agua, polvo, temperatura, luz aire) y los sistemas de produccin. 4.1.4 Manejo de los pollos de engorde Los pollos de las lneas Ross 308 y Cobb 500, fueron adquiridos de una granja ubicada en Chinchin (Caldas), Colombia, de la empresa Zarpollo, a los 21 das de edad, los cuales se mantuvieron a una temperatura promedio de 25C, 12 horas de luz y 12 de oscuridad, en un cuarto de ambiente controlado. Fueron alimentados durante 15 das con una dieta a base de maz, torta de soya y aceite de soya, cuya composicin qumica se muestra en la Tabla 2. El peso promedio al da 36 fue para los pollos Ross 308 de 1.640 g, y para los pollos Cobb 500 fue de 1.735 g. Previamente a la toma de muestras, se realiz un ayuno de 19h 2h.

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Tabla 2. Composicin de la dieta para pollos de engorde

Materia Seca Nitrgeno Total Protena Bruta Grasa Total Fibra Bruta Cenizas Fsforo Calcio

93,48%

3,02%

18,88%

2,1%

4,09%

6,41%

0,45%

0,7%

4.2 Recoleccin de la muestra Se tomaron 20cm de sangre directamente de la yugular a todas las aves. La sangre se centrifug a 3000 rpm durante 15 minutos y el suero se congel a -30C, hasta su procesamiento. Al momento de procesar las muestras, los sueros fueron descongelados a temperatura ambiente, luego, se llevaron al bao mara a una temperatura de 37C por 10 minutos (10) y se agitaron en un vortex para los diferentes anlisis. 4.3 Mtodos de anlisis Todos los reactivos pertenecan a los laboratorios BioSystems S.A., Barcelona, Espaa, los valores de colesterol libre, TAG y colesterol HDL y LDL, fueron determinados por mtodos enzimticos-colorimtricos, de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. Los anlisis fueron realizados en un equipo RAYTO RT-1904C, analizador

semiautomtico de qumica. En los procedimientos se usaron tubos de ensayos, micropipetas, puntas azules (100-1000L) y amarillas (5-200L). 4.3.1 Determinacin del colesterol HDL mediante el mtodo de precipitado (Fosfotungstato) Para realizar este mtodo se us 1mL de reactivo (Fosfotungstato 0,4 mmol/L y cloruro de magnesio 20 mmol/L), que se mezcl con 0,2mL de la muestra de suero, se agit bien y se dej durante 10a temperatura ambiente, se centrifug por 10 a 4000rpm. En el precipitado quedaron las VLDL, IDL y LDL, y en el sobrenadante quedaron las HDL. Finalmente, se recogi con cuidado 100L del sobrenadante, depositndolo en otro tubo de ensayo, se mezcl con 1mL del reactivo para CT (descrito en la seccin 4.3.5) y se incub por 10 al bao mara a 37C. El C-HDL fue hidrolizado por la colesterol esterasa y la colesterol oxidasa, esto dio lugar a perxido de hidrogeno que fue consumido por una peroxidasa en presencia de la 4-aminoantipirina (4-AA) y fenol, quedando como producto final la quinonaimina, siendo este producto proporcional al CHDL de la muestra, y este se cuantific espectrofotomtricamente.

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4.3.2 Determinacin del colesterol HDL mediante el mtodo directo (detergente) Este mtodo consta de: un Reactivo A. que contiene: Buffer good, colesterol oxidasa <1U/mL, peroxidasa <1U/mL, N,Nbis(4-sulfobutil)-m-toluidina (DSBmT) 1mmol/L, un acelerador 1mmol/L. Un Reactivo B. que contiene: Buffer good, colesterol esterasa <1.5U/mL, 4-AA 1mmol/L, ascorbato oxidasa <3.0KU/L y un detergente. Se tomaron 7L de la muestra de suero y se le aadieron 750L del Reactivo A. Aqu es hidrolizado el colesterol de los PM, VLDL, IDL y LDL por la colesterol oxidasa, en una reaccin no formadora de color. Inmediatamente despus, se aadi al producto del paso anterior el 250L del Reactivo B. La mezcla se incub por 5 a 37C. El detergente presente en dicho reactivo solubiliz el colesterol HDL, la colesterol esterasa y la colesterol oxidasa hidrolizaron el colesterol HDL, y dieron como productos finales colestenona y perxido de hidrgeno; el perxido de hidrogeno, junto con el DSBmT y la 4-AA reaccionaron en presencia de una peroxidasa y dieron lugar a quinonaimina y cuatro molculas de agua. La quinonaimina es proporcional a la concentracin de colesterol-HDL presente en la muestra, y se cuantific espectrofotomtricamente. 4.3.3 Determinacin del colesterol LDL mediante el mtodo de precipitado (Polivinil sulfato) Se utiliz 0,2mL de reactivo (Polivinil sulfato 3g/L, polietilenglicol 3g/L) y 0,4mL de la muestra de suero, los dos se mezclaron, se agitaron y se dejaron reposar durante 15 a temperatura ambiente, despus se centrifugaron por 15 a 4000rpm. En el procedimiento las LDL presentes en la muestra, precipitaron en presencia de polivinil sulfato y polietilenglicol, este ltimo sirvi como acelerador de la precipitacin. En el sobrenadante qued el colesterol VLDL, IDL y HDL. Finalmente, se recogi con cuidado 20L del sobrenadante, depositndolo en otro tubo de ensayo, se mezcl con 1mL del reactivo para CT (descrito en la seccin 4.3.5) y se incub por 10 al bao mara a 37C. El colesterol del sobrenadante, se cuantific espectrofotomtricamente mediante las reacciones acopladas descritas a continuacin: La colesterol esterasa y colesterol oxidasa dieron lugar a colestenona y perxido de hidrogeno, el cual por accin de la peroxidasa junto con la 4-AA + fenol formaron la quinonaimina. Esta es proporcional al colesterol VLDL, IDL y HDL.

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La concentracin de colesterol LDL se calcul mediante la siguiente formula: C-LDL = CT (descrito en la seccin: 4.3.5) colesterol del sobrenadante. 4.3.4 Determinacin del colesterol LDL mediante el mtodo directo (detergente) Este mtodo consta de: Un Reactivo A: Buffer MES >30mmol/L, colesterol esterasa <1,5U/mL, colesterol oxidasa <1,5U/mL, 4-AA 0,5mmol/L, ascorbato oxidasa <3,0 U/L, peroxidasa >1U/mL, detergente, pH 6,3. Un Reactivo B: Buffer MES >30mmol/L, DSBmT 1mmol/L, detergente, pH 6,3. Se pipete: 750L del Reactivo A y 7L de la muestra de suero. El detergente del Reactivo A, solubiliz el colesterol de las HDL, VLDL y los PM. Los steres de colesterol fueron hidrolizados simultneamente por la colesterol esterasa y la colesterol oxidasa, dieron lugar a colestenona y perxido de hidrogeno, este ltimo, fue consumido por una peroxidasa en presencia de 4-AA. Esta reaccin no fue formadora de color. Se aadi al producto del paso anterior 250L del reactivo B y de dej incubar por 5 a 37C. El detergente presente en dicho reactivo solubiliz el colesterol LDL, al igual que en el paso anterior la colesterol esterasa y la colesterol oxidasa hidrolizaron el colesterol LDL, y dieron como productos finales colestenona y perxido de hidrgeno, el perxido de hidrogeno y el DSBmT se condensaron en presencia de una peroxidasa para formar quinonaimina. La quinonaimina es proporcional a la concentracin de colesterol-LDL presente en la muestra, la cual se cuantific espectrofotomtricamente. 4.3.5 Mtodo de Friedewald Se determinaron en suero los niveles de CT, el C-HDL y los TAG. La medicin del CHDL se describi previamente en la seccin 4.3.1. La determinacin del CT en suero se realiz mezclando 10L de la muestra y 1mL de Reactivo (Pipes 35mmol/L, colato sdico 0,5mmol/L, fenol 28mmol/L, colesterol esterasa >0,2U/mL, colesterol oxidasa >0,1U/mL, peroxidasa >0,8U/mL, 4-AA 0,5mmol/L, pH 7,0). Se agit bien la mezcla y se dej incubar los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente. Los steres de colesterol se hidrolizaron por la colesterol esterasa, dieron lugar a colesterol libre, el cual por accin de la colesterol oxidasa form colestenona + perxido de hidrgeno, este ltimo en presencia de la 4-

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AA y fenol dieron lugar a la quinonaimina por accin de la peroxidasa. La quinonaimina es proporcional al colesterol total de la muestra y se cuantific espectrofotomtricamente. Se determinaron los TAG en suero, utilizando 10L de la muestra y 1mL de Reactivo (Pipes 45mmol/L, 4-clorofenol 6mmol/L, cloruro magnsico 5mmol/L, lipasa >100U/mL, glicerol-quinasa >1,5U/mL, glicerol-3P-oxidasa >4U/mL, peroxidasa >0,8U/mL, 4-AA 0,75mmol/L, ATP 0,9mmol/L, pH 7,0). Se agit bien la mezcla y se dej incubar los tubos durante 15 minutos a temperatura ambiente. En el anterior proceso, los TAG fueron hidrolizados por la lipasa a glicerol y cidos grasos, el glicerol, en presencia de ATP fue fosforilado por la glicerol-quinasa y dio lugar al glicerol 3P + ADP, el glicerol 3P en presencia de oxigeno form perxido de hidrgeno por accin de la glicerol-3P-oxidasa, finalmente se cuantific espectrofotomtricamente la

quinonaimina producto de la accin de la peroxidasa sobre el perxido de hidrgeno en presencia de 4-AA y clorofenol, la quinonaimina es proporcional a la concentracin de los TAG. Los valores de colesterol LDL fueron calculados mediante la siguiente frmula: colesterol LDL = colesterol total - colesterol HDL colesterol VLDL. El C-VLDL fue calculado por la divisin de los triglicridos entre 5 (TAG/5) (FRIEDEWALD et al., 1972). 4.4 Anlisis estadstico Los datos fueron analizados usando ANOVA simple, Para el anlisis estadstico se utiliz Statgraphics Plus 5.1. Las diferencias estadsticamente significativas fueron basadas con el P<0,05 del test F, y cuando fueron significativas las diferencias entre medias se les realiz el test de Tukey (P < 0,05). Se evalu el coeficiente de correlacin de Pearson entre CT, TAG, C-HDL para las dos lneas de pollos de engorde CT y TAG para las dos lneas de gallinas ponedoras, con una significancia P < 0,05.

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CAPITULO 5

EVALUACIN DE LOS MTODOS FRIEDEWALD, PRECIPITADO Y DIRECTO, PARA LA CUANTIFICACIN DE COLESTEROL HDL Y LDL EN GALLINA PONEDORA

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EVALUACIN DE LOS MTODOS FRIEDEWALD, PRECIPITADO Y DIRECTO, PARA LA CUANTIFICACIN DE COLESTEROL HDL Y LDL EN GALLINA PONEDORA 5.1 Introduccin Varios de los trabajos en nutricin que se han realizado hasta el da de hoy, lograron disminuir los lpidos de la yema de huevo, e investigaron la relacin que tienen con los lpidos circulantes. No obstante, entre estudios se encontraron diferencias en los valores arrojados de los niveles de lpidos sanguneos, ya sea por la gentica, cambios en el ambiente, dieta o posiblemente por el mtodo de anlisis de las muestras (Brenes et al. 1988; Knig et al. 2007; Yin et al. 2008). Los mtodos de referencia para la cuantificacin de las HDL, son el de ultracentrifugacin y un mtodo de precipitado (NAUCK et al., 2000) y para medir las LDL son el de ultracentrifugacin y el mtodo de -cuantificacin (BACHORIK, 2000). Sin embargo, es conveniente tener en cuenta que el proceso de ultracentrifugacin no es totalmente preciso (PALACIOS et al., 1999) y requiere de personal capacitado, lo cual acarrea costos extras en los anlisis. En los estudios del metabolismo de los lpidos en gallinas en produccin, realizaron la cuantificacin de las lipoprotenas por los mtodos de ultracentrifugacin y electroforesis (HERMIER et al., 1989a), utilizaron la frmula de Friedewald y/o mtodos de precipitados o mtodos directos que miden el colesterol de las HDL o LDL (LIU et al., 2010; SALMA et al., 2007; YIN et al., 2008). Estos ltimos mtodos mencionados, actualmente son apetecidos por que disminuyen los costos operacionales. Sin embargo, algunos de estos mtodos, pueden llegar a verse afectados por los niveles de TAG en el suero, dando resultados falsos en los anlisis (NAUCK et al., 1996; NAUCK et al., 2002). Debido a que una de las diferencias entre los datos de los diversos estudios, son los mtodos utilizados para el anlisis de las muestras, se debe tener en cuenta una de las particularidades que tienen las gallinas ponedoras en produccin, pues, los niveles de TAG en suero son muy elevados (HERMIER et al., 1989a; WALZEM et al., 1999), y esto puede afectar la cuantificacin de los lpidos dependiendo del mtodo aplicado.

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En el presente captulo, se evaluaron dos mtodos para la cuantificacin del C-HDL y tres para la cuantificacin de C-LDL, con el fin de determinar el mtodo o los mtodos factibles para la cuantificacin de lpidos en gallinas ponedoras en produccin. 5.2 Materiales y Mtodos Se obtuvo suero de 40 gallinas ponedoras en ayunas de la lnea Hy-Line W-36 (seccin 4.1.2). Se determinaron los valores de colesterol HDL por el mtodo de precipitado (Seccin 4.3.1) y mtodo directo (Seccin 4.3.2); y el colesterol LDL por el mtodo de precipitado (Seccin 4.3.3), directo (seccin 4.3.4) y Friedewald (seccin 4.3.5). 5.3 Resultados y discusin En el anlisis del colesterol de las lipoprotenas de alta densidad se encontr que, los niveles del colesterol varan significativamente con los dos mtodos analizados. Las medias desviacin estndar para los niveles de C-HDL, por los mtodos directo y precipitado, en mg/dL, fueron de: 66,221,1; 13,43,5; respectivamente. El P valor del test F fue inferior a 0,05, lo que evidenci, diferencia estadsticamente significativa, con una confianza del 95% entre mtodos (Tabla 3). El mtodo directo para la cuantificacin de C-HDL, adems, de reducir costos operacionales, tiene como ventaja, que inhibe la reaccin del colesterol de los PM, VLDL, IDL y LDL y mide directamente el C-HDL, sin afectarse por los altos niveles de TAG en suero (WARNICK et al., 2001), y adems, en las recomendaciones del laboratorio, se aceptan valores de TAG de hasta 3000mg/dL. Los valores del mtodo directo fueron similares a los encontrados en un trabajo, donde, analizaron los efectos del cido linoleico conjugado en la dieta, usando un Kit comercial (Beijing Biological Technology Co., Beijing) (YIN et al., 2008), no obstante, los valores se observaron diferentes en el estudio donde usaron en la dieta varios subproductos del crtamo y cebo de ganado vacuno como control, donde las lipoprotenas fueron separadas por ultracentrifugacin y el colesterol de dichas lipoprotenas fue analizado por un kit colorimtrico (AN et al., 1997), por otra parte, otra investigacin donde analizaron el C-HDL, usando el mtodo de precipitado con fosfotungstato y iones de magnesio (Wako HDL-cholesterol 431-52501) (SALMA et

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al., 2007), encontr valores intermedios a los revelados en los dos estudios mencionados. Sin embargo, hay que tener en cuenta que las diferencias entre estudios tambin pudieron estar afectadas por el tipo de lnea de gallina ponedora, la dieta u otros factores no mencionados. Los valores arrojados en la presente investigacin por el mtodo de precipitado para la cuantificacin de C-HDL (Tabla 3), difieren con los datos de las tres investigaciones mencionadas anteriormente, a pesar de que el mtodo utilizado por SALMA et al. (2007), es el mismo mtodo de precipitado que se us en la presente investigacin (fosfotungstato y iones de magnesio); teniendo en cuenta que dicho mtodo consiste en formar complejos entre el cido fosfotngstico + Mg2+ con las apoB de las VLDL, IDL y LDL, para su posterior precipitacin (PALACIOS et al., 1999), un correcto resultado depende de los niveles de TAG, pues con concentraciones superiores a 700mg/dL se encuentran alteracin de los datos (DEMACKER et al., 1980); debido a la gran cantidad de TAG en plasma disponibles para la yema de huevo de las gallinas ponedoras (WALZEM et al., 1999), se esperara que los valores de C-HDL por el mtodo de precipitado fueran mayores a los reales. Los niveles de C-LDL por los mtodos: Friedewald, precipitado y directo, en mg/dL fueron: -26,536,8; 117,338,6 y 49,311,1; respectivamente. El P valor del test F fue inferior a 0,05 y evidenci diferencias estadsticamente significativas, con una confianza del 95% entre mtodos.
Tabla 3. Concentracin en mg/dL de CT, TAG, C-VLDL, C-HDL precipitado, C-HDL directo, C-LDL Friedewald, C-LDL precipitado, C-LDL directo en gallina ponedora
CT Media Desviacin estndar Mnimo Mximo Rango P-valor 142,3 33,3 92,1 255,5 163,4 TAG 777,4 284,2 129,7 1398,2 1268,4
C-VLDL

155,5 56,8 25,9 279,6 253,7

C-HDL C-HDL Precipitado Directo 13,4 66,2 3,5 21,1 6,8 31,8 21,3 122,2 14,4 90,4 0,000

C-LDL Friedewald -26,54a 36,8 -121,7 52,8 174,5

C-LDL Precipitado 117,3c 38,6 48,9 238,9 189,9 0,000

C-LDL Directo 49,3b 11,1 30,5 71,9 41,5

CT: Colesterol total, TAG: Triglicridos, C-VLDL: colesterol de la lipoprotena de muy baja densidad (calculado: dividiendo los TAG entre 5) C-HDL: colesterol de la lipoprotena de alta densidad, C-LDL colesterol de la lipoprotena de baja densidad, P: precipitado, D: directo, F: Friedewald.

Para hallar el C-LDL usando la frmula de Friedewald, se tuvo en cuenta las concentraciones CT, C-HDL y TAG en suero, y se calcul el C-VLDL, con la frmula TAG/5. En diversos trabajos se demostr que esta frmula funcion en humanos sanos,
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con niveles de TAG inferiores a 400mg/dL, que tenan una relacin de 5:1 entre TAG y CT en las VLDL (FRIEDEWALD et al., 1972). En el caso de las gallinas, se encontr que todo cambia, siendo menor la proporcin de CT y mayor la de TAG en relacin a la protena de las VLDL (HERMIER et al., 1989a). Pese a lo anterior y a que en el presente trabajo los niveles de TAG en suero fueron mayores a 400mg/dL (Tabla 3), se calcularon los datos de C-VLDL dando como resultado una media de 155,5mg/dL, datos muy diferentes a los arrojados por el mtodo de ultracentrifugacin, que en el trabajo realizado por HERMIER et al. (1989) tenan valores tres veces ms elevados que los encontrados en el presente trabajo. Esto confirm que la frmula de Friedewald, no es factible en gallinas ponedoras ni para el clculo del C-VLDL y mucho menos para el clculo del C-LDL, debido a los errores sumados en las ecuaciones que se necesitan para dar los resultados requeridos, y que en el presente estudio arroj valores negativos (Tabla 3), En contraste a dicha informacin, en un estudio donde adicionaron a la dieta bacterias del gnero Rhodobacter, usaron la frmula de Friedewald con resultados no solo positivos sino con concentraciones mayores a 80mg/dL (SALMA et al., 2007). En cuanto a la determinacin del C-LDL por el mtodo de precipitado con polivinil sulfato, se public la ventaja de este sobre otros mtodos de precipitado, por que funciona bien en el pH del suero, pues, otros mtodos a base de heparina necesitaron un pH 5.12, y un control estricto de este pH (NAUCK et al., 2002; RIFAI et al., 1992), la desventaja, del mtodo de precipitado con polivinil sulfato, es que se ha demostrado la alteracin de los resultados, cuando los niveles de TAG en suero son elevados, (KERSCHER et al., 1985), especialmente valores superiores a 400mg/dL, dando como resultado datos falsos en el proceso de precipitacin con dicho reactivo (RIFAI et al., 1992). No obstante, segn las indicaciones del fabricante de los reactivos utilizados, no debera presentarse problemas con muestras < 1000mg/dL. Por esta razn y a pesar de que las gallinas ponedoras, tienen altos niveles de VLDL y por ende altos niveles de TAG (HERMIER et al., 1989a; WALZEM et al., 1999), se realiz el anlisis de las muestras por este mtodo y los resultados mostraron una media de 117,3mg/dL. Con todo lo anterior, hay que tener en cuenta que en este trabajo, se encontr que la tercera

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parte de las muestras tenan los niveles de TAG entre 950mg/dL y 1400mg/dL, y de las 40 muestras tomadas solo 3 eran menores a 400mg/dL. La medicin del C-LDL, con tcnicas de ensayos con lquidos homogneos o tambin conocidos como mtodos directos, fueron promocionados como mtodos que no presentaron problemas en pacientes con ausencia de ayuno, y con la capacidad de medir el C-LDL en muestras donde los TAG eran mayores a 400mg/dL (FEI et al., 2000), sin embargo, el mtodo que se us para el presente trabajo (detergente + DSBmT), se afect por las altas concentraciones de TAG en suero (MILLER et al., 2002), pues hubo muestras con niveles superiores a 1290mg/dL (nivel mximo de TAG que debe tener la muestra segn el laboratorio). En el presente capitulo, se muestran valores de los TAG de hasta 1398mg/dL (Tabla 3), sin embargo, en este trabajo se encontraron niveles ms elevados de TAG en las gallinas (captulo 7), no obstante, se hizo el anlisis del suero por el mtodo directo y se compar con los resultados obtenidos en trabajos anteriores. Se encontr que los resultados analizados con el mtodo directo son similares a los datos en el estudio donde analizaron en la dieta los subproductos del crtamo (AN et al., 1997), donde utilizaron el mtodo de ultracentrifugacin junto con un Kit enzimtico para colesterol; pero, difirieron con los datos del trabajo donde analizaron otros aditivos como el cido linoleico conjugado (YIN et al., 2008), el problema con este ltimo estudio, es que no mostraron con claridad el mtodo utilizado para el anlisis del C-LDL en suero. 5.4 Conclusiones En las gallinas ponedoras no es recomendable hacer el anlisis en suero del C-HDL por el mtodo de precipitado con fosfotungstato y iones de magnesio, el C-LDL por el mtodo de precipitado con polivinil sulfato y tampoco debe usarse la frmula de Friedewald, debido a las altas concentraciones de TAG sanguneos (>400mg/dL) que van a depositarse en la yema de huevo. Es factible el anlisis del C-HDL y C-LDL en suero de gallinas ponedoras, por los mtodos directos a base de detergentes especficos que disuelven el colesterol de las lipoprotenas que se est evaluando, sin embargo altas concentraciones de TAG en las gallinas ponedoras pueden llegar a alterar los resultados del C-LDL, cuando tengan niveles de TAG mayores a 1290mg/dL.

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CAPITULO 6

EVALUACIN DE LOS MTODOS FRIEDEWALD, PRECIPITADO Y DIRECTO, PARA LA CUANTIFICACIN DE COLESTEROL HDL Y LDL EN POLLOS DE ENGORDE

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EVALUACIN DE LOS MTODOS FRIEDEWALD, PRECIPITADO Y DIRECTO, PARA LA CUANTIFICACIN DE COLESTEROL HDL Y LDL EN POLLOS DE ENGORDE 6.1 Introduccin Diversos trabajos publicaron el perfil lipdico de los pollos de engorde en diferentes ocasiones y con diferentes propsitos (CHEN et al., 2005; GRIFFIN et al., 1989; GRIFFIN & HERMIER, 1988; HERMIER et al., 1984; MUSA et al., 2006; WANG & MUSA, 2007). No obstante, sin importar el objetivo de estudio, no se menciona si el o los mtodos utilizados fueron los ms recomendables para la cuantificacin de los niveles de lpidos sanguneos en pollos. En los humanos se han realizado diferentes estudios del colesterol de las lipoprotenas de alta y baja densidad, y para su cuantificacin han desarrollado diversos mtodos de precipitado o directos con el fin de tratar de reemplazar el mtodo de referencia ya sea para HDL o LDL (NAUCK et al., 2002; NAUCK et al., 2000). Debido a que los mtodos de referencia necesitan de ultracentrifugacines, los hace costosos por la necesidad de personal entrenado, y adems, tiene problemas tales como, de presentar dificultad en la recuperacin de las lipoprotenas (PALACIOS et al., 1999). Con el fin de esclarecer que mtodos (frmula de Friedewald, precipitados o directos) son los ms recomendables para cuantificar el colesterol de las HDL o LDL, diversos autores los han analizado en personas no ayunadas (NAUCK et al., 1998), y en pacientes que presentan alteraciones metablicas tales como hiperlipmias (USUI et al., 2002), hiperlipoproteinemias (DEMACKER et al., 1984; DEMACKER et al., 1980), diabetes (JENSEN et al., 2002), colestasis (los cuales presentan una lipoprotena-X) (FEI et al., 2000), entre otras. Algunos de los mtodos analizados no son factibles y otros s, segn el problema metablico que presenta cada individuo. Por todo lo anterior y debido a que las aves son especies totalmente diferentes a los mamferos, particularmente a los humanos, se decidi evaluar dos mtodos para la cuantificacin del C-HDL y tres para la cuantificacin de C-LDL con el fin, de identificar el mtodo o los mtodos viables para la cuantificacin de lpidos en pollos.

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6.2 Materiales y Mtodos Se obtuvo suero de 30 pollos de engorde en ayunas de la lnea Cobb 500 (seccin 4.1.4). Se determinaron los valores de colesterol HDL por el mtodo de precipitado (Seccin 4.3.1) y mtodo directo (Seccin 4.3.2); y el colesterol LDL por el mtodo de precipitado (Seccin 4.3.3), directo (seccin 4.3.4) y Friedewald (seccin 4.3.5). 6.3 Resultados y discusin Los resultados de media, desviacin estndar, mnimo, mximo y rango para del colesterol HDL y el colesterol LDL, por los mtodos de directo, precipitacin y Friedewald se presentaron en la Tabla 4. El C-HDL con el mtodo directo fue de 93,3mg/dL y con el mtodo de precipitacin fue de 92,8 mg/dL. El P valor del test F mayor a 0,05, evidenci que no hubo diferencias estadsticamente significativas entre mtodos para dichos valores, con una confianza del 95%. Estos datos coincidieron con los resultados encontrados en trabajos anteriores donde midieron el C-HDL por el mtodo de precipitado pero con heparina y manganeso (MUSA et al., 2007) y con la tcnica de Bayer Advia Reagent Packs (VELASCO et al., 2010), pero difirieron, con los resultados donde usaron mtodo de precipitacin del C-HDL con heparina y manganeso (MUSA et al., 2006) y ultracentrifugacin (HERMIER et al., 1984), aunque la diferencia entre estudios puede ser por las lneas y/o razas de pollos estudiadas.
Tabla 4. Concentracin en mg/dL de CT, TAG, C-VLDL, C-HDL precipitado, C-HDL directo, C-LDL Friedewald, C-LDL precipitado, C-LDL directo en pollo de engorde
CT Media Desviacin estndar Mnimo Mximo Rango P valor 126,3 23,8 74,4 166,6 92,1 TAG 21,3 8,1 10,4 46,4 36,0 C-VLDL 4,3 1,6 2,1 9,3 7,2 C-HDL C-HDL Precipitado Directo 92,8 93,3 15,7 16,3 54,6 50,2 128,9 134,1 74,3 83,9 0,897 C-LDL Friedewald 29,2b 15,4 2,9 67,6 64,6 C-LDL Precipitado 23,5b 13,9 1,7 59,1 57,4 0,000 C-LDL Directo 52,4a 9,2 34,9 65,9 31,0

CT: Colesterol total, TAG: Triglicridos, C-VLDL: colesterol de la lipoprotena de muy baja densidad (calculado: dividiendo los TAG entre 5) C-HDL: colesterol de la lipoprotena de alta densidad, C-LDL colesterol de la lipoprotena de baja densidad, P: precipitado, D: directo, F: Friedewald.

El colesterol LDL report valores en mg/dL por el mtodo directo de 52,4 por el mtodo de precipitado de 23,5 y Friedewald de 29,2. En cuanto a los valores encontrados por el mtodo de precipitado y Friedewald, el P valor del test F mayor a 0,05, evidenci que no hay diferencias estadsticamente significativas entre mtodos

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para dichos valores, con una confianza del 95%, sin embargo, el mtodo directo tuvo un P valor del test F inferior a 0,05, indic diferencia estadsticamente significativa entre el mtodo directo con los mtodos de precipitado y de Friedewald, con una confianza del 95% (Tabla 4). Los recientes estudios para la cuantificacin del colesterol LDL en pollos utilizaron la frmula de Friedewald debido a que es mucho ms sencillo y econmico que determinar las lipoprotenas directamente por ultracentrifugacin. Pese a esto, el mtodo de Friedewald present errores en los resultados de diversos trabajos en humanos debido a la dependencia de tres parmetros (CT, TAG y C-HDL), dando lugar a imprecisiones analticas (GARCA et al., 2006; MENDES DE CORDOVA et al., 2004), las cuales se hacen ms evidentes cuando la especie a analizar tiene los TAG elevados en un rango mayor a 400 mg/dL (FRIEDEWALD et al., 1972) o cuando hay otras alteraciones metablicas (NAUCK et al., 2002). En los pollos de engorde se encontr que los niveles de TAG eran de 22 mg/dL, lo cual coincidi con otros trabajos donde reportaron valores similares del total de TAG en suero (HERMIER et al., 1984; MUSA et al., 2007; VELASCO et al., 2010), pero contradijeron, los valores que encontraron en un ensayo donde comparaban el perfil lipdico con pollos castrados y pollos enteros (CHEN et al., 2005). Los valores del colesterol total, tambin se tuvieron en cuenta y sus datos coincidieron con otros trabajos en pollos (MUSA et al., 2006; ZDOAN & AKIT, 2003; VELASCO et al., 2010), pero difirieron con otros que tenan los valores un poco ms elevados (CHEN et al., 2005; HERMIER et al., 1984; MUSA et al., 2007); pero, pudo ser por el tipo de grasa utilizada en la dieta (ZDOAN & AKIT, 2003; VELASCO et al., 2010). Pese a esto, los niveles de colesterol total y de TAG finalmente repercutieron en los niveles de C-LDL en pollos, por la frmula de Friedewald. Asimismo, para aplicar dicha frmula, hubo que tener en cuenta los niveles de C-HDL, que en el presente trabajo no encontr diferencias entre los mtodos utilizados (precipitado y directo). En cuanto al mtodo de precipitado para el C-LDL, en los pollos no present problema por los niveles de TAG en suero, pero, al igual que el mtodo de Friedewald se observ una variacin en los datos muy alta, lo cual pudo deberse a que los resultados finales dependen del colesterol total en el suero y al colesterol sobrenadante de la muestra

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(seccin 4.3.3), por lo tanto, no es una medicin directa del C-LDL en el sobrenadante. Adicional a lo anterior, se observ, que los valores mximos por los mtodos de precipitado y de Friedewald son similares al C-LDL por el mtodo directo (Tabla 4). En el anlisis del C-LDL por el mtodo homogneo o mtodo directo (detergente), FEI et al. 2000), demostraron que los resultados en humanos, no se afectaron por el tiempo de ayuno de las personas (con presencia de quilomicrones en plasma). En este caso, aunque el ayuno no fue muy prolongado entre el primer y ltimo animal analizado, el rango entre los datos fue mucho menor que por los otros dos mtodos que necesitaron de las variables de CT y TAG para la cuantificacin de C-LDL. Pese a todo lo anterior, los valores encontrados por el mtodo de Friedewald y de precipitado fueron similares a los encontrados en un trabajo donde realizaron una suplementacin con inulina en pollos de engorde (VELASCO et al., 2010). Los datos del mtodo directo, fueron similares a otros trabajos donde compararon razas y/o lneas magras y grasas, los cuales usaron diferentes mtodos de anlisis de las muestras, como fueron: el mtodo de ultracentrifugacin (HERMIER et al., 1984) y el mtodo de Friedewald (MUSA et al., 2006). 6.4 Conclusiones En la determinacin del colesterol HDL en pollos de engorde, es factible la utilizacin del mtodo de precipitado con Fosfotungstato + Mg2+ y del mtodo directo a base de detergentes especficos y DSBmT. No se recomienda el uso del mtodo de Friedewald ni el de precipitado con polivinil sulfato para el C-LDL, debido a que presentan un rango muy amplio en los resultados, pues estos dependen de los niveles de colesterol total, TAG y C-HDL para la frmula de Friedewald y del colesterol total para el mtodo de precipitado. Por lo tanto, se hace factible el uso del mtodo directo a base de detergentes para el anlisis del C-LDL en pollo de engorde, el cual no se ve influenciado por los niveles de TAG ni colesterol de la muestra.

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CAPITULO 7

COMPARACIN DE LOS NIVELES DE COLESTEROL TOTAL Y TRIGLICRIDOS EN DOS LNEAS DE GALLINA PONEDORA

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COMPARACIN DE LOS NIVELES DE COLESTEROL TOTAL Y TRIGLICRIDOS EN DOS LNEAS DE GALLINA PONEDORA 7.1 Introduccin Los lpidos en el suero de las gallinas ponedoras han sido descritos previamente, y se ha demostrado la diferencia que existe entre estas con los machos y las hembras inmaduras (que no han empezado a poner huevos) (BACON et al., 1974; HERMIER et al., 1989a; WALZEM et al., 1994; WALZEM et al., 1999). En varios estudios se confirm la presencia de hipertrigliceridemia en las gallinas ponedoras por accin de los estrgenos (KUDZMA et al., 1975), debido a cambios metablicos en las VLDL. WALZEM et al. (1999) describieron que los estrgenos inducen a la sntesis de la apoVLDL-II, la cual, impide la hidrolisis de las VLDL por la LPL, y adems inducen a que las VLDL formen las VLDLy, lipoproteinas ricas en TAG pero de menor tamao, las que entran fcilmente al oocito. Tambin se describi que algunas de las VLDL que tienen la apoVLDL-II y apoB son hidrolizdas por la LPL y son convertidas en LDL, y as mantener la homeostasis del colesterol, de una forma similar a los mamferos (NIMPF & SCHNEIDER, 1991). Se comprob, que los estrgenos tambin afectan los niveles de HDL, pero disminuyen su concentracin en plasma (HERMIER et al., 1989a), y tambin, se demostr que al igual que las VLDL esta lipoprotena entra al oocito en crecimiento (VIEIRA et al., 1995), siendo, las HDL fuente principal de colesterol para la yema. Las diferencias genticas de las gallinas repercuten en la produccin y la calidad de huevo (FRANCESCH et al., 1997); adems, factores como la dieta, pueden llegar a afectar el metabolismo de los lpidos segn la lnea de gallina ponedora (YIN et al., 2008). Sin embargo, por la dificultad de saber las razas que dieron origen a las diferentes lneas de gallinas ponedoras, se hace necesario comparar las lneas de gallinas disponibles a nivel comercial y observar si entre ellas se presentan o no diferencias en la concentracin de lpidos en suero. En el presente captulo se compara los niveles de colesterol total y triglicridos en las dos lneas de gallina ponedora ms utilizados en Colombia en la actualidad y se muestra la relacin que tienen estos dos parmetros en ellas.

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7.2 Materiales y mtodos Se obtuvo suero de gallinas ponedoras en ayunas de 26 semanas de edad, 45 Hy-LineW-36 y 45 Lohmann Brown-Classic, se determinaron los niveles de colesterol total y triglicrido para las gallinas ponedoras usando el mtodo enzimtico-colorimtrico (Seccin 4.3.5). 7.3 Resultados y discusin 7.3.1 Comparacin y correlacin de los niveles de colesterol total y TAG gallinas ponedoras La lnea de gallinas ponedoras Hy-Line W-36 present mayores valores en los niveles sanguneos de CT y TAG que la lnea Lohmann Brown-Classic, mostrando diferencias significativas (P < 0,05) (Tabla 5). Los niveles de CT en este estudio, difirieron con otros trabajos donde no encontraron diferencias en la concentracin sangunea de colesterol entre lneas (YIN et al., 2008), sin embargo, en este mismo trabajo encontraron diferencias significativas entre lneas cuando interactuaron lneas y dietas con niveles diferentes de cido linoleico conjugado, por lo tanto las diferencias en el presente trabajo, no fueron influenciadas por la presencia de cido linoleico conjugado en la dieta administrada, ya que la proporcin de este cido en los aceites vegetales es bajo. La influencia de la dieta sobre los niveles de colesterol vara entre estudios, debido a que trabajos donde enriquecieron la dieta con esteroles vegetales no encontraron diferencias entre los niveles de colesterol (LIU et al., 2010), pero en el caso donde compararon el aceite de crtamo con el de palma si encontraron deferencias entre los niveles de colesterol (AN et al., 1997).
Tabla 5. Efecto de las lneas de gallina ponedora en el colesterol total y triglicridos
LNEA Hy-Line W-36 Lohmann Brown-Classic PARMETRO Media + DE Estadstica Media + DE Estadstica P-valor mg/dL mg/dL Mnimo: 68,8 Mnimo: 68,8 Colesterol total Mximo: 255,5 Mximo: 170,4 0,000 141,836,9a 111,124,03b Rango: 186,8 Rango 101,6 Mnimo: 111,7 Mnimo: 140,5 Triglicridos Mximo: 879,3 0,000 773,2322,4a Mximo: 1524,3 431,7192,8b Rango: 1412,6 Rango: 738,7 a-b Letras diferentes en la misma fila indican diferencias significativas con P < 0,05. DE: desviacin estndar

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Es posible, que la mayor o menor concentracin de colesterol en la sangre de las gallinas ponedoras, no sea un indicativo especifico del mayor o menor porcentaje de colesterol en la yema de huevo, pues se presentan resultados contradictorios en las diversas publicaciones, mostrando correlacin del colesterol sanguneo con el colesterol del huevo (CHOWDHURY et al., 2002), o negando la relacin directa de estos dos parmetros (CHOWDHURY et al., 2005); pero esto puede deberse a las caractersticas genticas de las diferentes lneas de gallinas ponedoras usadas, a los aditivos (Allium sativum y Tamarindus indica) de las dietas suministradas y/o a la interaccin entre lneas y dieta. Se ha investigado, que en las diferentes semanas de produccin, hay cambios en la redistribucin del colesterol srico de las diferentes lipoprotenas de las gallinas ponedoras (PEEBLES et al., 2004) as como tambin, hay cambios en el porcentaje de colesterol en la yema de huevo (ANDERSON, 2011). Todo lo anterior indica que, no solo hay influencia gentica (lneas de gallinas ponedoras) en el colesterol de la yema de huevo, sino tambin, se debe a la edad de las gallinas (semana de produccin) y al tipo de dieta. Por lo tanto, la relacin entre el colesterol sanguneo y el colesterol de la yema, puede ser afectada por dichos parmetros.
Tabla 6. Porcentaje de produccin de huevo de Hy-Line W-36 y Lohmann Brown-Classic Semana de Produccin Semana 24 Semana 25** Semana 26** Hy-Line W-36* No. Huevos/semana 296 302 300 Lohmann B-C* % No. Huevos /semana % 94 307 98 96 301 96 96 309 98

*45 aves de cada lnea **Alimentados con la dieta a base de maz y torta de soya, composicin bromatolgica mostrada en la Tabla 1 Nota: No se tiene en cuenta la produccin total de los dos lotes dentro del galpn

En el presente capitulo, los niveles de TAG presentaron diferencias significativas entre lneas (Tabla 5), esto contrast, con otra investigacin donde no se observaron diferencias entre las lneas estudiadas (YIN et al., 2008); adems, se encontr que los niveles de TAG tuvieron un rango amplio, especialmente en las gallinas Hy-Line W-36 (Tabla 5), esto pudo deberse a que en las gallinas ponedoras las lipoprotenas ms abundantes en la circulacin son las VLDL, y debido a que TAG son componentes ms abundante de dichas lipoprotenas (HERMIER, 1997; HERMIER et al., 1989a), estos van a variar en concentracin dependiendo de la cantidad de las VLDL en el plasma, lo

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que se confirm en el mismo trabajo de HERMIER et al. (1989a) ya que sus resultados mostraron una gran variacin en la concentracin de las VLDL en el suero. Por otra parte, al revisar las diversas investigaciones, donde estudiaron los niveles de TAG sanguneos, se observaron las variaciones que hay de estos lpidos entre estudios, (KNIG et al., 2007; PEEBLES et al., 2004; SALMA et al., 2007), sin embargo, en estos casos las diferencias pudieron deberse al mejoramiento gentico, condiciones medioambientales, dieta y/o tiempo de ayuno; no obstante, en algunos trabajos, encontraron que no hay diferencias significativas en algunas clases de dietas y lneas de gallinas ponedoras (YIN et al., 2008).
Tabla 7. Coeficiente de correlacin de las variables colesterol total y triglicridos en dos lneas de gallinas ponedoras
Lohmann Brown-Classic Hy-Line W-36

Parmetro

CT

TAG

CT TAG

1 0,68**

0,82** 1

** Relacin significativa (P < 0,05) moderadamente fuerte CT: colesterol total, TAG: triglicridos

En este estudio se encontr que los niveles de TAG estaban ms elevados en las gallinas de la lnea Hy-Line W-36 (Tabla 5), probablemente, porque es una lnea genticamente desarrollada para tener una alta produccin de huevo (345-361 huevos hasta la semana 80 de edad) (HY-LINE INTERNATIONAL, 2009), y para esto necesita una alta concentracin de VLDL en plasma, pues KNIG et al. (2007) comprobaron que cuando disminuye la concentracin de triglicridos-VLDL, disminuye la produccin de las gallinas. Sin embargo, es posible que debido a la excesiva manipulacin y/o cambios de temperatura ambiental, a la que estuvieron sometidas las gallinas del presente estudio, su produccin fue menor comparada con las gallinas Lohmann Brown-Classic (Tabla 6), adems, el lote de la lnea Hy-Line W-36, de donde se adquirieron las aves, lleg solo al 92% de produccin en la semana 26 (datos no reportados). Por otra parte, se

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demostr, que en casos de estrs, los niveles de colesterol aumentaron pero los TAG disminuyeron (MUMMA et al., 2006). Tambin se encontr que las altas concentraciones de TAG estuvieron relacionadas significativamente en las dos lneas con los niveles de CT (Tabla 7); esto pudo ser debido a los altos niveles de VLDL presentes en las gallinas ponedoras, y aunque la concentracin de colesterol libre y esterificado dentro de las VLDL es baja, (HERMIER et al., 1989a), entre ms VLDL haya en sangre disponible para el huevo, ms colesterol total y por lo tanto ms TAG van a estar disponibles para la yema de huevo, no obstante, esto contradice otros estudios donde alteraron la dieta con el fin de bajar los lpidos en el huevo, y mostraron que la relacin entre TAG y CT en suero era muy baja (SALMA et al., 2007; YIN et al., 2008) 7.4 Conclusiones En las condiciones del presente trabajo, se encontr que la lnea de gallinas ponedoras Hy-Line W-36, present niveles ms elevados de CT y TAG comparado con la lnea Lohmann Brown-Classic, presentndose una correlacin significativa de estos parmetros en las dos lneas.

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CAPITULO 8

COMPARACIN DE LOS NIVELES DE COLESTEROL TOTAL, TRIGLICRIDOS Y COLESTEROL HDL EN DOS LNEAS DE POLLO DE ENGORDE

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COMPARACIN DE LOS NIVELES DE COLESTEROL TOTAL, TRIGLICRIDOS Y COLESTEROL HDL EN DOS LNEAS DE POLLO DE ENGORDE 8.1 Introduccin En las aves se confirm que el hgado es el directamente responsable de la acumulacin grasa debido a la limitada lipognesis del tejido adiposo (GRIFFIN et al., 1992), por consiguiente, se encontr relacin entre el engrasamiento de los pollos y los TAG transportados por las VLDL (HERMIER, 1997), debido esto, en algunas investigaciones realizadas en pollos de engorde, los niveles de TAG fueron alterados con aditivos en las dietas administradas, con el fin de disminuir la acumulacin grasa (CRESPO & ESTEVE-GARCA, 2001; VELASCO et al., 2010). Algunos estudios demostraron la influencia de las altas o bajas concentraciones en plasma de las VLDL en las lneas grasas y magras de pollo, siendo ms eficientes las lneas magras con bajo contenido de VLDL y por consiguiente menor cantidad de TAG disponibles para depositar en el tejido adiposo (GRIFFIN et al., 1989; HERMIER et al., 1984), no obstante, se confirm que las lneas magras tienen una menor relacin fenotpica entre los niveles de VLDL con la grasa abdominal (WHITEHEAD, 1990), Asimismo, en diversos estudios, investigaron los niveles de TAG en suero, para observar su comportamiento con diferentes tipos de alimento u otras sustancias que pueden afectar el desarrollo del animal (HOLST-SCHUMACHER et al., 2010; ZDOAN & AKIT, 2003). Debido la influencia gentica en los parmetros productivos, tales como, conversin alimenticia, ganancia de peso y crecimiento (EMMERSON, 1997), en la capacidad de acumular ms o menos grasa abdominal y en la relacin que tiene esta con los lpidos sanguneos (HERMIER et al., 1984; MUSA et al., 2007), se decidi evaluar si las dos lneas de pollos de engorde ms utilizadas en Colombia presentaban o no variacin entre los niveles de TAG, CT y C-HDL; a pesar de las diferencias en el rendimiento de dichas aves. 8.2 Materiales y mtodos

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Se obtuvo suero de pollos de engorde de 36 das de edad en ayunas, 44 Ross 308 y 45 Cobb 500, se determinaron los niveles de triglicridos, colesterol total (seccin 4.3.5) y el colesterol de la lipoprotena de alta densidad (seccin 4.3.1), para las lneas de pollo de engorde. 8.3 Resultados y discusin 8.3.1 Comparacin y correlacin de los niveles de colesterol total, TAG Y C-HDL en pollos de engorde La informacin de CT, TAG y colesterol HDL en las dos lneas estudiadas con los valores estadsticos: media, desviacin estndar, mnimo, mximo y rango, y la correlacin entre dichos parmetros, se resumen en las tablas 8 y 9. Los valores de CT fueron para la lnea Ross 308 en mg/dL de: 136,8 y para la lnea Cobb 500 en mg/dL de: 132,9. El P>0,05, mostr que no hay diferencias estadsticamente significativas entre lneas para dichos valores, con una confianza del 95% (Tabla 8). No obstante, cuando se comparan razas magras y grasas, se encuentran diferencias significativas en los niveles de CT (MUSA et al., 2007; WANG & MUSA, 2007). Sin embargo, la concentracin sangunea de CT en la misma lnea de pollo, se puede afectar significativamente con la dieta (ZDOAN & AKIT, 2003).
Tabla 8. Efecto de las lneas de pollo de engorde en el colesterol, triglicridos y C- HDL
LNEA PARMETRO Ross 308 Estadstica Media DE mg/dL Mnimo: 92,1 136,821,4 Mximo: 188,6 Rango: 96,5 Mnimo: 15,3 Mximo: 45,5 24,97,1 Rango: 30,2 Mnimo: 73,8 101,512,9 Mximo: 131,0 Rango: 57,2 Cobb 500 Estadstica Media DE mg/dL Mnimo: 91,5 132,919,7 Mximo: 176,0 Rango 84,5 Mnimo: 10,4 Mximo: 37,4 20,36,2b Rango: 27,0 Mnimo: 74,3 Mximo: 113,9 96,29,9b Rango: 39,7 P-valor

Colesterol total

0,374

Triglicridos

0,001

C-HDL
a-b

0,033

Letras diferentes indican diferencias significativas con P < 0,05 DE: desviacin estndar, C-HDL (Colesterol de lipoprotena de alta densidad),

La media de los TAG, y C-HDL reportaron valores (mg/dL) para la lnea Ross 308 de: 24,9 y 101,5; respectivamente, mientras que la lnea Cobb 500 report valores (mg/dL)

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de: 20,3 y 96,2; respectivamente, siendo ms elevados en la lnea Ross 308. El P valor del test F inferior a 0,05, evidenci diferencia estadsticamente significativa entre lneas para dichos valores, con una confianza del 95 % (Tabla 8). Estos resultados coincidieron con un trabajo anterior donde los niveles de C-HDL fueron diferentes significativamente en dos razas tipo magro y graso de pollo de engorde (MUSA et al., 2007) y contradijeron los resultados donde se encuentra los niveles de C-HDL sin diferencias significativas, en otras dos razas tipo magro y graso de pollos de engorde (MUSA et al., 2006), sin embargo, en los dos trabajos relacionan el C-HDL con la grasa abdominal.

Figura 5. Efecto de la dieta en el incremento del peso corporal en pollos Ross 308 y Cobb 500 con 36 das de edad

Para los diversos ensayos en el estudio del engrasamiento de las aves, fue necesario realizar el perfil de las lipoprotenas plasmticas, teniendo en cuenta que los resultados varan segn el estado nutricional en que stas se encuentren (ayuno versus saciedad) (CORNEJO et al., 2007; DE BEER et al., 2008). En este estudio, se compararon las lneas Ross 308 y Cobb 500, y se encontr que al tener la lnea Ross 308 niveles ms

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elevados de TAG y con un peso vivo promedio menor a la lnea Cobb (Figura 5), posiblemente tendra ms tendencia a acumular grasa debido a la mayor cantidad de TAG disponibles en sangre. Esto es confirmado por HERMIER et al. (1984), pues, en su estudio descubrieron que los TAG estn en mayor porcentaje dentro de las VLDL. Por otra parte, trabajos anteriores indicaron que: uno de los factores de acumulacin grasa en las diferentes lneas (magras o grasas), fue la mayor concentracin de VLDL en sangre por ser sustrato de la lipoprotena lipasa (LPL) y no a la actividad de dicha enzima (GRIFFIN et al., 1989; HERMIER et al., 1989b), por lo tanto, a mayor cantidad de TAG mayores niveles sanguneos de VLDL (HERMIER et al., 1991), lo cual es importante en las aves, ya que se comprob que la lipognesis y su respectiva acumulacin, depende en su gran mayora del metabolismo heptico (GRIFFIN et al., 1992), igualmente, fue demostrado que es mayor esta actividad heptica en aves de tipo graso que en las tipo magro (LAGARRIGUE et al., 2000). Pese a todo lo anterior, no se puede asegurar la tendencia de la lnea Ross 308 a acumular grasa por los niveles altos de TAG, pues, en otros trabajos se compararon razas (magras y grasas) y no encontraron diferencias entre estas cuando compararon los niveles de TAG (WANG & MUSA, 2007). Lo cual pudo deberse a factores como: la hipertrofia e hiperplasia de los adipocitos, los cuales tendran una mayor actividad de la LPL (HERMIER et al., 1989b) o factores como la insulina, la cual est tambin envuelta en las diferencias entre lneas magras y grasas de pollo, pues altas concentraciones de esta junto con el glucagn estn asociadas con alto contenido de grasa abdominal (SINSIGALLI et al., 1987).
Tabla 9. Coeficiente de correlacin de las variables: colesterol total, triglicridos y C-HDL en dos lneas de pollos de engorde Ross 308 Parmetro CT Cobb 500 CT TAG C-HDL 1 0,10 0,73** TAG 0,31* 1 0,17 C-HDL 0,84** 0,15 1

CT: Colesterol total, TAG: Triglicridos, C-HDL: Colesterol de la lipoprotena de alta densidad *Relacin significativa (P < 0,05) relativamente dbil. ** Relacin significativa (P < 0,05) moderadamente fuerte

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En los datos analizados, se encontr correlacin positiva entre los TAG con el C-HDL, sin embargo, la relacin no fue significativa (P> 0,05) (Tabla 9), esto coincide con otro trabajo donde compararon dos razas: una tipo magro y otra tipo graso, presentndose en ellas una correlacin positiva entre los niveles de TAG y C-HDL (MUSA et al., 2007), pero, contradice otro estudio donde tambin compararon dos razas tipo magro y graso (MUSA et al., 2006) con una correlacin negativa entre estos dos parmetros. Se encontr una correlacin significativa entre los niveles de CT con TAG y C-HDL en los pollos Ross 308, situacin observada tambin en los Cobb 500, con la diferencia que estos no presentaron significancia entre el CT con los TAG (Tabla 9), concordando con un trabajo donde compararon pollos de diferentes casas comerciales donde encontraron una relacin positiva pero leve entre el CT y TAG (HOLST-SCHUMACHER et al., 2010), pero contradice otro trabajo, donde analizaron diferentes tipos de aceites en la dieta y encontraron una relacin negativa entre el CT y los TAG (ZDOAN & AKIT, 2003). En cuanto a la correlacin de CT y C-HDL se confirm con otros estudios donde compararon diferentes clases de dietas, y sin importar la variedad de sta, los niveles de CT y el colesterol de esta lipoprotena estaban relacionados (VELASCO et al., 2010). La relacin significativa entre estos dos parmetros tambin se encontr en el trabajo donde compararon las dos razas de tipo magro y graso, sin embargo la relacin entre CT y C-HDL fue significativa nicamente en la raza magra (MUSA et al., 2007). La relacin entre CT y C-HDL encontrada en el presente trabajo, concuerda con las dos lneas de pollo de engorde que se analizaron. 8.4 Conclusiones En los pollos de engorde de las lneas Ross 308 y Cobb 500, no se encontraron diferencias en los niveles sricos de colesterol total, pero, se encontraron diferencias significativas entre los niveles de TAG y C-HDL, presentado la lnea Ross 308 los mayores valores. Adems, se observ una relacin significativa entre el colesterol total y el C-HDL en las dos lneas, relacin que se ha encontrado en otros trabajos en pollos tipo magro. Es recomendable realizar estudios posteriores con las mismas lneas pero de mayor edad, para determinar, si la grasa abdominal que adquiera cada una de estas

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lneas est relacionada con los niveles de triglicridos sanguneos o es afectada por factores ajenos a los niveles de lpidos en suero.

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CAPITULO 9 DISCUSIN GENERAL

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DISCUSIN GENERAL 9.1 Comparacin de un mtodo de precipitado con un mtodo directo para la cuantificacin del C-HDL en aves comerciales La evaluacin de los dos mtodos (precipitado (Fosfotungstato) y directo (detergente y DSBmT) para cuantificar el C-HDL en una lnea de gallinas ponedoras (Hy-Line W-36) mostr diferencias significativas (P<0,05) (Tabla 3). Probablemente debido a las altas concentraciones de TAG en la sangre de las gallinas, la cual puede llegar a ser mayor de 400mg/dL (Tabla 3 y Tabla 5). En los diferentes estudios realizados del mecanismo de accin de los mtodos de precipitado para el C-HDL, explican que este mtodo consiste en la precipitacin de las lipoprotenas que contienen apoB (VLDL, LDL), al formar complejos con los polianiones y cationes divalentes que contienen (NAUCK et al., 2000). En el caso del mtodo de precipitado con cido fosfotngstico + Mg2+, este reactivo forma complejos con dichas lipoprotenas y as las precipita, dejando en el sobrenadante solo las HDL (PALACIOS et al., 1999), pero este mtodo tiene como desventaja, que en muestras con niveles sricos de TAG superiores a 400mg/dL, se forman complejos que evitan la precipitacin completa de las lipoprotenas no HDL dando como resultado concentraciones de C-HDL superiores a las reales (HARRIS et al., 1997), sin embargo, este no fue el caso del presente estudio (media: 13,43,5mg/dL (Tabla 3), probablemente debido a la presencia de otras protenas en las lipoprotenas de las gallinas ponedoras (SCHNEIDER et al., 1990; VIEIRA et al., 1995), que no estn presentes en las lipoprotenas de los humanos (NEWSHOLME & LEECH, 1987), los cuales son la especie donde ms han estudiado los diferentes mtodos de evaluacin del C-HDL. Pese a lo anterior, la razn de los niveles tan bajos, puede ser por otros factores que no fueron objeto de estudio del presente trabajo. En contraste, a los resultados encontrados en esta investigacin, SALMA et al. (2007), utiliz el mtodo de precipitado con fosfotungstato y present valores >42mg/dL. En cuanto al mtodo directo a base de detergente y DSBmT para la cuantificacin de CHDL, mostr una media de 66,221,1mg/dL (Tabla 3), a diferencia del mtodo de precipitado, este mtodo tiene la ventaja, de inhibir la reaccin del colesterol de los

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quilomicrones (portomicrones en aves), VLDL, IDL y LDL y mide directamente el CHDL, sin afectarse por los altos niveles de TAG en suero (WARNICK et al., 2001). Adems, en las recomendaciones de los laboratorios Biosystems, dicen que aceptan valores de TAG de hasta 3000mg/dL. Al comparar el C-HDL por estos dos mismos mtodos en la lnea de pollos de engorde Cobb 500, no se encontraron diferencias significativas (P>0,05) (tabla 4), lo cual pudo ser debido a que estas aves no presentan niveles altos de TAG en suero (tabla 4 y 8), que puedan afectar los resultados entre mtodos. 9.2 Comparacin de la frmula de Friedewald, un mtodo de precipitado y un mtodo directo para la cuantificacin del C-LDL en aves comerciales La cuantificacin del C-LDL por medio de la frmula de Friedewald, el mtodo de precipitado con polivinil sulfato y el mtodo directo a base de detergentes y DSBmT en las gallinas de la lnea Hy-Line W-36, arroj diferencias significativas entre mtodos (P<0,05) (Tabla 3). Al usar la frmula de Friedewald para calcular el C-LDL, en el presente trabajo se muestran resultados negativos (-26,5436,8 mg/dL). En estudios realizados en humanos sanos, se demostr que esta frmula funciona cuando los niveles de TAG son inferiores a 400mg/dL, adems, el clculo del C-VLDL (TAG/5) depende de que haya una relacin de 5:1 entre TAG y CT (FRIEDEWALD et al., 1972), pero, cuando en las personas se presentan alteraciones metablicas como la hiperlipoproteinemia tipo III, hay alteraciones en la relacin entre TAG CT y la protenas de las VLDL (QUARFORDT et al., 1971), dando como resultado que la frmula de Friedewald no de valores reales para el C-LDL. En el caso de las gallinas la relacin tambin cambia, siendo menor la proporcin de CT y mayor la de TAG en las VLDL (HERMIER et al., 1989a), adems, al tener concentraciones de triglicridos superiores a 400mg/dL no hacen factible el uso de esta frmula. No obstante, en un estudio donde adicionaron a la dieta bacterias del gnero Rhodobacter, usaron la frmula de Friedewald con resultados superiores a 80mg/dL para la determinacin del C-LDL (SALMA et al., 2007). En cuanto a la cuantificacin del C-LDL por el mtodo de precipitado con polivinil sulfato, tiene la particularidad de ser ms favorable que el mtodo de precipitado a base

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de Heparina pues este requiere de un estricto manejo del pH a 5,12 (NAUCK et al., 2002; RIFAI et al., 1992), pero, al igual que todos los mtodos de precipitado para CLDL tiene la desventaja, de ser inexacto cuando los niveles de TAG en suero son elevados (BACHORIK, 2000), especialmente valores superiores a 400mg/dL (RIFAI et al., 1992). No obstante, segn las indicaciones del laboratorio de los reactivos utilizados, no debera presentarse problemas con muestras <1000mg/dL. Por esta razn se realiz, el anlisis de las muestras en las gallinas de la lnea Hy-Line W-36, a pesar de que algunas de ellas tenas valores superiores a 1000mg/dL de TAG, los resultados mostraron una media de 117,338,6mg/dL (Tabla 3), valores poco comunes de encontrar en gallinas ponedoras. La medicin del C-LDL con el mtodo directo a base de detergente y DSBmT, fue promocionado junto con los otros mtodos directos, de no presentar problemas en pacientes no ayunados, y con la capacidad de medir el C-LDL en muestras donde los TAG eran mayores a 400mg/dL (FEI et al., 2000), sin embargo, en estudios posteriores encontraron que las altas concentraciones de TAG en suero pueden afectar las mediciones del C-LDL, al utilizar dichos reactivos (MILLER et al., 2002), a pesar de lo anterior, en el inserto de los laboratorios Biosystems indican, que no se presentaron problemas con muestras <1290mg/dL de TAG en suero. Al determinar el C-LDL por este mtodo en gallinas ponedoras los valores fueron de 49,311,1mg/dL (Tabla 3), estos resultados se asemejan ms a la realidad de los niveles de colesterol de las LDL en esta especie, lo cual se comprueba con en el trabajo realizado por AN et al. (1997), pues ellos utilizaron el mtodo de ultracentrifugacin y un kit enzimtico para arrojar los resultados de C-LDL. Se realiz la comparacin de los tres mtodos en los pollos de engorde de la lnea Cobb 500 y se encontr que no hubo diferencias significativas (P>0,05) entre la frmula de Friedewald y el mtodo de precipitado, pero si hubo diferencias significativas (P<0,05) entre los dos mtodos ya mencionados y el mtodo directo. Hay que tener en cuenta que los mtodos de Friedewald y precipitado tienen la particularidad que dependen de los niveles de CT del suero, dando como resultado que en las muestras que tenan mayores niveles de CT arrojaban mayores niveles de C-LDL, pero al usar el mtodo directo los valores mximos (65,9mg/dL) y mnimos (34,9mg/dL) de C-LDL no eran tan extremos

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comparados con los otros dos mtodos (Tabla 3). Los datos que se muestran en los diversos trabajos realizados en pollos de engorde, los cuales utilizan mtodos como el de ultracentrifugacin (CHEN et al., 2005), mtodos enzimticos (VELASCO et al., 2010) y formula de Friedewald (MUSA et al., 2007; MUSA et al., 2006) tienen la particularidad, que unos coinciden con la frmula de Friedewald y el mtodo de precipitado y otros coinciden con el mtodo directo. 9.3 Diferencias de los lpidos sanguneos en aves comerciales Debido a que los mtodos directos u homogneos han mostrado tener menos interferencia con los altos niveles de TAG en suero y que a su vez no se dejan afectar por la variabilidad de los niveles de CT en el suero, los datos arrojados por dichos mtodos se tuvieron en cuenta para la cuantificacin del C-HDL y C-LDL en gallinas ponedoras y pollos de engorde, y as realizar el perfil lipdico en las aves comerciales (Tabla 10).
Tabla 10. Diferencias del perfil lipdico en aves comerciales
PARMETRO CT TAG C-HDL C-LDL PRECIPITADO DIRECTO DIRECTO Hy-Line W-36 Hy-Line W-36 6611,5 4911,1 MTODO GALLINAS PONDERAS Hy-Line W-36 Lohmann B-C Hy-Line W-36 Lohmann B-C VALORES mg/dL 14237a 11124b 773322a 432193b POLLOS DE ENGORDE Ross 308 Cobb 500 Ross 308 Cobb 500 Ross 308 Cobb 500 Cobb 500 VALORES mg/dL 13721 13320 257a 206b 10113a 9610b 52,49,2

CT: colesterol total, TAG: triacilglicridos, C-HDL: colesterol de la lipoprotena de alta densidad, C-LDL: colesterol de la lipoprotena de baja densidad, Precipitado: fosfotungstato, Directo: Detergente + DSBmT ab Las medias dentro de una columna con distinto superndice muestran diferencias significativas (P>0,05)

En el presente trabajo se encontraron diferencias significativas (P<0,05) al comparar el CT en las lneas Hy-Line W-36 y Lohmann Brown-Classic (Tabla 5 y Tabla 10), lo cual difiere con el estudio realizado por YIN et al. (2008) donde tambin compara el CT del suero en dos lneas de gallinas ponedoras (Brown and White) sin encontrar diferencias, pero, al adicionarle a la dieta cido linoleico conjugado, la lnea Brown disminuye los niveles de CT significativamente. Por tal razn, hay que tener en cuenta que el tipo de dieta influye en las concentraciones sanguneas de CT, pues, en otros estudios han

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encontrado que al adicionar diferentes tipo de aceite tambin se alteran significativamente los niveles sanguneos de CT (AN et al., 1997). Respecto a la evaluacin del CT en las dos lneas de pollo de engorde Ross 308 y Cobb 500, no se encontraron diferencias significativas (P>0,05) (Tabla 8 y 10). Estos resultados coinciden con el trabajo realizado por WANG & MUSA (2007), donde comparan dos tipos de pollo (magro y graso) y no encontraron diferencias significativas en los niveles de CT, sin embargo al igual que en las gallinas ponedoras los aditivos en la dieta, pueden hacer variar significativamente el CT en el suero de los pollos (ZDOAN & AKIT, 2003). Los niveles de TAG presentaron diferencias significativas entre lneas (P<0,05) (Tabla 10), mostrando un rango muy amplio entre los valores mximos y mnimos (Tabla 5). Las diferencias entre los niveles de TAG en las gallinas de la misma lnea pueden deberse a que ellos dependen de las concentraciones de VLDL sanguneos, los cuales pueden llegar a variar aproximadamente entre 300 y 900mg/dL (HERMIER, 1997; HERMIER et al., 1989a), por lo tanto es de esperarse que los niveles de TAG varen en concentracin en cada una de las gallinas. El contraste entre las medias de las lneas analizadas (Hy Line W-36 y Lohmann Brown-Classic), discrep, con la investigacin de YIN et al. (2008) donde no encontraron diferencias significativas entre las lneas estudiadas, a pesar de los aditivos usados en la dieta, No obstante, en otras investigaciones, encontraron que adicionando a la dieta clofibrato (KNIG et al., 2007) o bacterias del genero Rhodobacter (SALMA et al., 2007) si se presentan diferencias en los niveles de TAG. En cuanto a las lneas de pollo de engorde Ross 308 y Cobb 500, se encontr que al tener la lnea Ross 308 niveles ms elevados de TAG, posiblemente tendra ms tendencia a acumular grasa debido a la mayor cantidad de TAG en sangre. Esto se debe a que en aves donde hay mayor concentracin de VLDL en sangre hay mayor cantidad de TAG disponibles para acumular en el tejido adiposo (GRIFFIN et al., 1989;

HERMIER et al., 1984; HERMIER et al., 1989b), especialmente porque la lipognesis en las aves se realiza en su gran mayora en el tejido heptico (GRIFFIN et al., 1992), asimismo, la sntesis de cidos grasos en el hgado es mayor en aves de tipo graso que en aves tipo magro (LAGARRIGUE et al., 2000). Sin embargo, otros trabajos donde

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compararon pollos tipo magro y graso no encontraron diferencias entre los niveles de TAG (WANG & MUSA, 2007), y esto puede ser debido a que la acumulacin de la grasa depende de otros factores como: la hipertrofia e hiperplasia de los adipocitos, los cuales tendran una mayor actividad de la LPL (HERMIER et al., 1989b) o a las bajas o altas concentraciones de insulina, que tambin influye en las diferencias de acumulacin grasa entre lneas de pollos magros y grasos (SINSIGALLI et al., 1987). Se compararon los niveles de C-HDL en las dos lneas de pollos de engorde (Ross 308 y Cobb 500) y se encontraron diferencias significativas entre lneas (P<0,05) (Tabla 8 y Tabla 10), estos resultados coinciden con los encontrados por MUSA et al (2007) pero contradicen los encontrados por MUSA et al (2006), en estos dos estudios comparan dos tipos de pollo (graso y magro). En un trabajo, donde adicionaron a la dieta inulina no encontraron diferencias en los niveles de C-HDL (VELASCO et al., 2010), pero, en otra investigacin, donde compararon diferentes tipos de aceites si encontraron diferencias en la concentracin srica de C-HDL (ZDOAN & AKIT, 2003), esto indica que esta lipoprotena tambin se ve afectada por los cambios en la dieta. 9.4 Patrn metablico en aves comerciales En las aves comerciales el patrn metablico es muy diferente entre machos y hembras, ya que en los machos es claro que las lipoprotenas ms abundante son las HDL (CHEN et al., 2005; ZDOAN & AKIT, 2003), y esto se confirm en el presente estudio al comparar los niveles de C-HDL y C-LDL (Tabla 10). As mismo ocurre en las gallinas inmaduras (HERMIER et al., 1989a). Sin embargo, en las gallinas ponedoras no se cumple esta regla, debido a la gran cantidad de VLDL sanguneos disponibles para la yema de huevo (WALZEM et al., 1999). Los estrgenos son los que producen dicha diferencia, y a su vez, tambin disminuyen la concentracin de las HDL, alterando las lipoprotenas no solo cuantitativamente sino cualitativamente, pero si comparan las HDL y las LDL en el rango caracterstico de los pollos de engorde tienen mayores niveles de HDL (HERMIER et al., 1989a). No obstante, estos autores afirman que hay mayores niveles de LDL debido a la gran cantidad de VLDL. Pese a esto, y sin tener en cuenta los niveles de VLDL en sangre de las gallinas, al comparar el C-HDL y el CLDL por los mtodos directos se encontr mayor concentracin de C-HDL (Tabla 10), y esto coincide con otros trabajos donde muestras valores de estas dos lipoprotenas

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(YIN et al., 2008), aunque en otro trabajo los valores varan, siendo mayor las HDL o las LDL segn la dieta administrada (AN et al., 1997)

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CONCLUSIONES

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La cuantificacin de C-HDL por el mtodo de precipitado con fosfotungstato y la de CLDL por el mtodo de precipitado con polivinil sulfato y la frmula Friedewald, no es factible usarla en gallinas ponedoras en produccin, debido a los altos niveles de TAG en suero. Se encontr viable el uso de los mtodos directos para C-HDL y C-LDL, a base de detergentes que disuelven el colesterol de las diferentes lipoprotenas, aunque, el C-LDL por este mtodo, se afect un poco, por las altas concentraciones de TAG en suero de las gallinas. En los pollos de engorde, no hubo diferencias entre los mtodos de precipitado con cido fosfotngstico y iones magnesio, y el mtodo directo (detergente), para la cuantificacin del C-HDL. La frmula de Friedewald y el mtodo de precipitado con polivinil sulfato, presentaron un rango muy amplio entre los valores arrojados, los cual afect la media de los resultados, esto obedece a la dependencia a los niveles de TAG, CT y C-HDL, en el primer caso, y al CT en el segundo caso. El mtodo directo (detergente) para la cuantificacin del C-LDL del suero, present un rango menor de variabilidad entre los datos arrojados, por lo tanto, este mtodo es el ms recomendado para la evaluacin del C-LDL en pollos de engorde. Hubo diferencias de TAG y CT entre las lneas de gallinas ponedoras Hy-Line W-36 y Lohmann Brown-Classic, y fueron ms elevados en las Hy-Line W-36, con una relacin significativa entre estos dos parmetros en las dos lneas. Con estos resultados, se observ que es importante conocer como repercutiran los altos niveles de TAG sricos en los TAG de la yema, en las gallinas con una produccin inferior a la esperada, y a su vez sus implicaciones en la salud humana. No hubo diferencias en los niveles de CT, pero si en los niveles TAG y C-HDL entre las lneas de pollo de engorde Ross 308 y Cobb 500, siendo ms elevados en la lnea Ross 308, con una relacin significativa entre los parmetros C-HDL y CT en las dos lneas. Se hace necesario, realizar otros estudios con las mismas lneas de pollo de engorde, pero con mayor edad, y determinar, si la mayor cantidad de triglicridos, est relacionada con grasa abdominal o si esta es afectada por factores diferentes a los niveles de lpidos sanguneos.

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84

ANEXOS

85

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 -

Triglicrido/triacilglicrido.....

16

Figura 2 -

Hidrlisis de TAG, formacin de micelas compuestas y absorcin por enterocitos...... 18 Composicin de portomicrones.......

Figura 3 -

21

Figura 4 -

Transporte y metabolismo de lpidos exgenos y endgenos.. 22

Figura 5 -

Efecto de la dieta en el incremento del peso corporal en pollos Ross 308 y Cobb 500 con 36 das de edad... 60

86

LISTA DE TABLAS

Tabla 1 -

Composicin de la dieta para gallina ponedora..

35

Tabla 2 -

Composicin de la dieta para pollo de engorde...

36

Tabla 3 -

Concentracin de CT, TAG, C-VLDL, C-HDL precipitado, C-HDL directo, C-LDL Friedewald, C-LDL precipitado, C-LDL directo en gallina ponedora... 43

Tabla 4 -

Concentracin de CT, TAG, C-VLDL, C-HDL precipitado, C-HDL directo, C-LDL Friedewald, C-LDL precipitado, C-LDL directo en pollo de engorde... 48

Tabla 5 -

Efecto de las lneas de gallina ponedora en el colesterol y triglicridos...... 53

Tabla 6 -

Porcentaje de produccin de huevo de Hy-Line W-36 y Lohmann Brown-Classic. 54

Tabla 7 -

Coeficiente de correlacin de las variables: colesterol total y triglicridos en dos lneas de gallinas ponedoras. 55

Tabla 8 -

Efecto de las lneas de pollo de engorde en el colesterol total, triglicridos y C-HDL. 59

87

Tabla 9 -

Coeficiente de correlacin de las variables: colesterol total, triglicridos y C-HDL en dos lneas de pollos de engorde. 61

Tabla 10 -

Diferencias del perfil lipdico en aves comerciales.

68

88

LISTA DE ABREVIATURAS

Apo ATP CL CT C-HDL C-LDL C-VLDL EC FABP HDL IDL LCAT LDL LP LPL PM TAG VLDL VTG

Apolipoprotena Adenosn Trifosfato Colesterol Libre Colesterol Total Colesterol de la lipoprotena de alta densidad Colesterol de la lipoprotena de baja densidad Colesterol de la lipoprotena de muy baja densidad Esteres de Colesterol Protena Enlazante de cidos Grasos Lipoprotena de Alta Densidad Lipoprotena de Densidad Intermedia Protena de Transferencia de Esteres de Colesterol Lipoprotena de Baja Densidad Lipasa Pancretica Lipoprotena Lipasa Portomicrn Triglicrido / Triacilglicrido Lipoprotena de Muy Baja Densidad Vitelogenina

89