las clulas comienzan a dividirse por lo CURVA DE CRECIMIENTODE LA CEPA

Bacillus thuringiensis

que entran a un perodo de crecimiento o de kurstaki (BTK) HD-73

Lozada Lay Keren Areli, Ramos Pimentel Alex, Tllez Mani Cristian, Velzquez Ramrez Lucino

Ingeniera en Bioprocesos, Universidad Politcnica de Puebla

RESUMEN En este trabajo se obtuvo la curva de crecimiento a partir de la inoculacin e incubacin de la cepa Bacillus thuringiensis kurstaki (BTK) HD-73. Este trabajo se realiz con el fin de conocer el ciclo de vida de vida de la cepa. La caracterizacin se realiz en base a las curvas de crecimiento realizadas por los mtodos de peso seco, peso hmedo y absorcin de rayos UV.

INTRODUCCIN El crecimiento es definido como un incremento en los constituyentes celulares; lo cual ocasiona un aumento del nmero de clulas en el caso de microorganismos que se multiplican por procesos como gemacin y fisin binaria.1 El crecimiento de una poblacin bacteriana se estudia a travs de un anlisis de una curva de crecimiento de un cultivo bacteriano. En el caso del crecimiento bacteriano que se multiplica por fisin binaria se puede representar como el logaritmo del nmero de clulas frente al tiempo de incubacin. La curva resultante tiene cuatro fases diferentes: 1 1)Fase de Latencia: Hay un aparente reposo en que las clulas sintetizan enzimas necesarias para la actividad metablica que se lleva a cabo adelante. La bacteria se prepara para usar los nutrientes que el medio le est aportando, por lo que es la fase de adaptacin al medio, con aumento de masa celular pero no de nmero de clulas. 2 2)Fase Exponencial: La velocidad de crecimiento es mxima2, en esta fase de incremento logartmico, pues la reproduccin celular alcanza su actividad mxima durante este perodo por lo que las clulas presentan una mayor actividad metablica3. Tambin durante esta fase la poblacin bacteriana es ms uniforme, qumica y fisiolgicamente1, pero la velocidad de crecimiento que alcanza el cultivo va depender del tipo de microorganismo y diversos factores ambientales (temperatura, pH, oxigenacin, etc.)2. 3) Fase Estacionaria: En este perodo, la velocidad de crecimiento va comenzar a disminuir hasta hacerse nula, ya que habr cambios en la composicin y concentracin de nutrientes entre el cultivo del inculo y medio fresco lo que puede desencadenar el control y regulacin de la actividad enzimtica. En esta fase hay un agotamiento del suministro de algn nutriente esencial acumulacin de productos metablicos que sean txicos. Tambin durante esta fase se equilibran el nmero de clulas nuevas con el nmero de clulas que mueren.2 4)Fase de Muerte: Al final el nmero de muertes supera el nmero de nuevas clulas formadas por lo que la

poblacin entra en esta fase. Esta fase continua hasta que la poblacin disminuye una pequea fraccin de clulas ms resistentes que todas sus integrantes mueren.3 Cambios ambientales perjudiciales, como privacin de nutrientes y acumulacin de residuos txicos, originan la disminucin del nmero de clulas viables.1 El crecimiento se puede evaluar haciendo mediciones sucesivas en tiempos determinados de la poblacin en estudio. Hay diversas formas de evaluar una poblacin bacteriana y entre ellas estn: a)Peso seco celular: Es un mtodo muy usado para medir el crecimiento bacteriano, el cual consiste en secar volmenes conocidos de cultivo celular lentamente hasta obtener un peso constante.4 b)Absorcin: Es la determinacin de la masa microbiana a travs de la absorcin de la luz. Cuando aumenta la poblacin y turbidez, hay una mayor cantidad de dispersin de luz, por lo que aumenta la absorcin leda en el espectrofotmetro.1 c) Peso hmedo: Es la centrifugacin o filtracin de muestras de un cultivo seguida por el pesado directo. Este mtodo mide el agua tanto intracelular como extracelular y puede ocasionar errores considerables. 4 La cepa Bacillus thuringiensis HD-73 es una bacteria formadora de esporas, aerbica que produce protenas contaminantes con productos de esporulacin. Estos productos son denominados protenas cristalinas insecticidas. La temperatura ptima para el crecimiento de esta bacteria es de 20C. La patogenicidad de los cristales va dirigido hacia las larvas en su uso como insecticida, las cuales al ingerirlos se solubilizan y se activan, una vez activados se une a membranas

receptoras ubicadas en las clulas de la larva.

METODOLOGA Inoculacin La inoculacin se realiz un medio especfico para el crecimiento de la bacteria compuesto por las siguientes cantidades: (cantidades dadas en gramos por litro) Dextrosa Extracto de Levadura Peptona de Casena MgSO4 7H2O Fe(SO4) H2O ZnSO4 7H2O MnSO4 H2O 7 g/l 2 g/l 10 g/l 0.30 g/l 0.02 g/l 0.02 g/l 0.02 g/l

-Se hizo la preparacin de 300 ml de medio, dividido en 2 matraces erlen meyer, con la cantidad de 150 ml en cada matraz. -Se esterilizan los medios en autoclave por 15 min a 120oC y 1 atm de presin. -Una vez los medios estriles, se le agreg a un matraz con medio la cantidad de 1ml de inculo de la cepa Bacillus thuringiensis HD-73 y se incub a la temperatura de 20C y con un movimiento de 120 rpm.

Muestreo Se tomaron alcuotas de 5ml cada dos horas a partir de que se inocul el matraz, conservndolas en tubos de ensaye estriles y puestos en refrigeracin para reducir el metabolismo del microorganismo. El primer matraz se inocul a las 9.30 hrs as que la primera muestra se tom a las 11.30 hrs con dos horas de

inoculacin. As se realiz progresivamente hasta obtener la cuarta muestra a las 17.30 hrs con 8 horas de haber sido inoculada. A las 18.30 hrs se inocul el segundo matraz dejndolo incubar durante 14 horas, para poder seguir la continuidad de la toma de muestras y la continuidad de incubacin de estas no se vea afectado. A las 8.30 hrs del siguiente da se tom la primer muestra del ultimo matraz inoculado y se continua con la misma metodologa con el el primero tomando muestras de cada uno cada dos horas. Tabla de muestras ordenadas segn las horas de incubacin: Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Horas de Incubacin 2 4 6 8 14 16 18 20 21 22 23 24 25 27 28 30

ANALISIS DE MUESTRAS Peso hmedo De cada muestra obtenida, se pas 1ml a 1 tubo eppendorf de 1.5ml. Se realiza el procedimiento por duplicado en cada muestra. Se centrifugan los tubos eppendorf con la muestra a 8 000 rpm durante 20 minutos. Posteriormente se decant el sobrenadante para dejar nicamente la pastilla de biomasa ubicada en el fondo del tubo eppendorf, producto de la centrifugacin. Se pesaron los tubos eppedorf para determinar el peso hmedo, teniendo en cuenta el peso del tubo eppendorf (aprox 1gr). Peso seco Posteriormente del pesado para la determinacin del peso hmedo, se metieron al horno los tubos eppendorf a una temperatura de 80oC durante 15 minutos con el fin de deshidratar y eliminar el agua de la muestra. Una vez pasado este tiempo se pusieron en el desecador durante 15 minutos para evitar la variacin de peso y se mantenga constante. Hecho esto se vuelven a pesar los tubos teniendo en cuenta el peso del tubo eppendorf.

Absorcin de rayos UV Para este paso se prepararon disoluciones en una relacin de 4.5ml agua por cada 0.5ml de muestra. Por cada muestra se realizaron 3 disoluciones en la relacin antes mencionada. Se puso como blanco agua. Y se fueron poniendo las muestras conforme fueron inoculadas para poder realizar su grfica correspondiente.

Tabla 1.- Tabla de muestras ordenadas respecto a las horas de incubacin.

La absorcin utilizada fue de 200 y 600 nm por muestra.

RESULTADOS Peso Hmedo Peso en gramos 0 0.0144 0.0222 0.0359 0.0357 0.0279 0.0303 0.0253 0.0508 0.0355 0.04235 0.0262 0.04035 0.03325 0.02565 0.04855 0.0721 Horas de inoculacin 0 2 4 6 8 14 16 18 20 21 22 23 24 25 27 28 30 Absorcin de rayos UV Grafica 2.- Crecimiento del peso en gramos respecto al tiempo, en base el peso seco Grafica 1.- Curva de crecimiento del peso en gramos respecto al tiempo, en base a la biomasa. Se puede observar que en base a la biomasa hay una variacin en el crecimiento conforme el pasa el tiempo. Peso Seco

Tabla 2.- Tabla de pesos en gramos respecto a la hora de inoculacin

Grafica 3.- Crecimieento en base a la absorcin de 270nm con respecto al tiempo.

BIBLIOGRAFA

1. Prescott Harley Klein. 2004. Microbiologa. 5aEdicin. Ed.Mc GRAW HILLINTERAMERICANA DE ESPAA S. A. U. Grafica 4.- Crecimieento en base a la absorcin de 600nm con respecto al tiempo. 2. . Benintende, Silvia y Sanchez, Cecilia. Crecimiento Bacteriano. [En lnea]. Consultado el 18 de Junio del 2013. Disponible en la web: http://www.fca.uner.edu.argg 3. Gerard J. Tortora, Berdell R. Funke, Christine L. Case. 2007. Introduccin a la Microbiologa. 9a Edicin. Ed. Mdica Panamericana. 4. Scar 1996. Biotecnologa para Ingenieros. Editorial Limusa S.A De C.V.

CONCLUSIN Nos pudimos percatar que el crecimiento de nuestra bacteria fue inestable, ya que en algunas muestras presentaba mayor crecimiento que en otras, esto se pudo comprobar mediantes diferentes mtodos los cueles fueron, peso seco, peso humero y UV los resultados arrojados se graficaron, y vimos que nuestras curva de crecimiento se comportaba de una forma no muy normal, todas estos mtodos graficados se realizaron mediante tiempo contra mas para saber el rendimiento en el microorganismo al pasarlo en un birreactor, como ya se sabe los microorganismos a nivel industrial solo son materia prima, entonces para poder arrancar un birreactor tenemos que saber la cantidad de materia prima que se empleara para saber la cantidad de metabolito que obtendr, y lo mejor es que entre menos tiempo mayor produccin y menos costo, los resultados no se pudieron completar para tener ms certeza, ya que no se realiz el conteo de esporas, y lo que se quera saber era la cantidad de esporas que tuviese 1 Ml i inoculo y el tiempo para poder obtener esas esporas.