16/04/2009

Bibliotecas Genmicas Coleccin de fragmentos de DNA que representan todas las secuencias de un genoma los cuales son clonados en un vector que puede ser usado y mantenido establemente. Aplicaciones: * Secuenciar un gen entero o una regin de un cromosoma * Secuenciacin de genomas * Identificar promotores

Construccin y screening de una biblioteca genmica Vector de alta capacidad Digestin con ER Extraccin de DNA genmico Digestin con ER Fraccionamiento del DNA genmico

Ligacin y transformacin de clula huesped

Seleccin de transformantes clones independientes

Screening de la biblioteca genmica Obtencin de los clones conteniendo la/s secuencia/s de inters Secuenciacin

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Requerimientos de una buena biblio genmica: * Fcil de analizar, almacenar, amplificar y estable. * Representacin completa. * Representacin superpuesta del genoma (overlapping clones). digestin con ER en posiciones al azar: digestin parcial: fragmentos al azar del DNA completo.

Vectores de alta capacidad empleados Vector Csmidos/Fsmidos Vectores basados en fago P1 PAC (cromosoma artificial derivado del fago P1) BAC (cromosomas artificiales bacterianos) YAC (cromosomas artificiales de levaduras) Capacidad (Kb) 30 - 45 80 - 100 50 - 150 100 - 300 200 - 1000

Vectores de baja capacidad: fago lambda (9-23 kb) -Lambda DASH II -Lambda EMBL3 -Lambda Fix II

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Caracterizacin de las bibliotecas genmicas Representacin completa del genoma

Pocos clones independientes: muy poca probabilidad de encontrar el fragmento de inters.

Ms clones: ms sitios del genoma representados. Clones son al azar y superpuestos: algunas partes del genoma estn sobrerrepresentadas mientras que otras no aparecen. Nmero suficientemente grande de clones: certeza de que todo el genoma est representado y poder encontrar el fragmento de inters con una P: 99%

Caracterizacin de las bibliotecas genmicas N: Nmero de clones necesarios para encontrar un determinado fragmento con una probabilidad P (99%) P: probabilidad deseada de aislar el fragmento de inters: 0,99 (probabilidad del 99%) f: fraccin del genoma representado por el tamao promedio del inserto = tamao del inserto/tamao genoma

N=ln(1-P)/ln(1-f)

Para genoma humano: 3x109 pares de bases:

vector csmido YAC

Tamao inserto 30000 1000000

N 500000 14000

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Caracterizacin de las bibliotecas genmicas equivalente genmico (EG): nmero mnimo de clones independientes para lograr una cobertura completa del genoma si fueran clones adyacentes 1 EG: tamao genoma/tamao promedio del inserto
Ejemplo Csmidos Tamao promedio inserto (bases) 30000 genoma haploide humano: 3x109 bases 1EG=1x105

BAC

200000

1EG=15.000

N (csmido)= ln(1-0,99)/ln (1-(30.000/3x109))= 5x105 Screenear 5 veces el EG para encontrar el fragmento de inters con una probabilidad del 99%

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Preparacin de DNA genmico de alto peso molecular Objetivo: Purificar DNA genmico (eliminar protenas y contaminantes) empleando mtodos que eviten su fragmentacin mecnica. En promedio se utiliza 2-4x mas largo segn la aplicacin:

Aplicacin Southern blot Cosmidos YACs

Tamao 50 kb 200 kb 1000 - 4000 kb

Mtodos para extraccin de DNA genmico 200 kb < (Cos, P1) Proteinasa K/SDS Extraccin solventes orgnicos Precipitacin etOH resuspensin Estimacin de la calidad: 0,30,4% agarosa Digestin parcial con ER >200 kb (BACs-YACs) Clulas embebidas en plugs de agarosa

Infusin para lisar las clulas / remover las protenas Digestin parcial con ER en el plug de agarosa

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Digestin parcial con Enzima de Restriccin -Fragmentos cortos -No hay clones superpuestos y no se puede reconstruir la seq del DNA -Fragmentos largos -Representacin superpuesta del genoma Sau3AI o MboI : GATC (4 cutter): freq de corte: 1/4n : 1/256 bases: coleccin de fragmentos ms randomizados. Adems: generan extremos cohesivos compatibles con BamHI (6 cutter-menor frecuencia de corte): ligar en vectores cortados con BamHI

Digestin parcial: Variar la cc de enzima o tiempo de incubacin.

Digestin parcial de DNA genmico con Sau3AI en agarosa 0,9%

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Mtodos para extraccin de DNA genmico 200< (Cos, P1) Proteinasa K/SDS Extraccin solventes orgnicos Precipitacin etOH resuspensin Estimacin de la calidad: 0,30,4% agarosa >200 kb (BACs-YACs) Clulas embebidas en plugs de agarosa

Infusin para lisar las clulas / remover las protenas

Digestin parcial con ER

Digestin parcial con ER

Fraccionamiento: Electroforesis de campo pulstil (PFGE)

Electroforesis de campo pulstil (PFGE) Electroforesis comn: fragmentos >50 kb migran juntos. Si el DNA cambia la direccin durante la corrida se pueden separar: PFGE Con cada reorientacin del campo elctrico los fragmentos menores reaccionan ms rpido en la nueva direccin (las ms grandes tardan ms en arrancar): hay una diferencia de velocidad en los primeros milisegundos luego de aplicado el campo elctrico.

Fw: 0.5 seg Rv: 0.25 seg

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Fraccionamiento DNA digerido: PFGE

Seleccionar el tamao de fragmento adecuado Cosmidos y vectores basados en P1: no es tan crtico: durante el empaquetamiento el fago selecciona por tamao PAC, BAC, YAC: hay que fraccionar el DNA Electreoelucin: slice a tubo de dilisis electroforesis colectar buffer del tubo precipitar Tb: disolver el gel y precipitar el DNA

DNA

Csmidos: 30 45 kb Csmido: hbrido fago-plsmido se empaquetan en cpsides (ms capacidad y ms eficiencia de transformacin que los plsmidos) replican como plsmidos en bacterias: no da playas de lisis sino colonias!!! (no tiene protenas del fago : no forma partculas virales) Cos de fago: empaquetar en fagos e infectar XbaI para linealizar Ampr/ori: replicacin en E coli (ori: alto nmero de copias) Sitio de Clonado: BamHI para clonar el DNAg (BamHI o compatibles) prom RNApol T7 y T3: generar ribo-sondas a partir de los extremos del inserto (caminado cromosmico)

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Terminasa del fago : empaqueta csmidos entre el 75% y 105% del largo del fago normal: seleccin por tamao Corta en sitios cos. Deja extremos cos cohesivos 5-overhang

Infectar E coli
COS cohesivos se ligan en coli: circulariza

seleccin LB-Amp (Colonias!!) Screening.

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Fsmidos: 30 45 kb
Similares a csmidos (sitios cos) pero mantiene 1 copia por clula: mayor estabilidad Tienen elementos del plsmido F (como los BAC): par A, B y C, ori/repE: 1 copia por clula, controlan la particin durante la divisin

Vectores basados en bacterifago P1: 80 100 kb Ventajas: * alta eficiencia de transformacin (por que se empaqueta en fagos) * alta capacidad (ms que csmido) * mayor estabilidad (1copia/cell) -ScaI: linalizar el vector -Sitio Clonado: BamHI -Sitio de empaquetamiento del P1 (Pac): empaquetar en fagos - Sitios de recombinacin del P1 (loxP): circularizar el DNA una vez inyectado por el fago en E coli (cepa P1 Cre recombinasa +) - Kanr: seleccin bacterias que incorporaron y recircularizaron el vector - replicn plasmdico del P1: 1 copia/bacteria: > estabilidad - replicn ltico del P1: inducible por IPTG 20 copias/bacteria - SacBII: levansucrasa: seleccin de bacterias con vector+inserto (levansucrasa en medio con 5% sacarosa: levan : letal para E. coli) 30 kb

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digerir y deP DNAg

Cortar con ScaI y deP. Cortar con BamHI Ligacin

30 kb

PacA y PacB

Pac

Seleccin: Kan (vector) + sacarosa (con inserto) Replicn plasmdico (1 copia/cell) Replicn ltico: IPTG (20 copias/cell): para aislar el plsmido luego del screening (tb para amplificar vector)

Seleccin por tamao: muy chico: no empaqueta muy grande: corta y elimina loxP distal: no circulariza: no crece stuffer: flexibilidad corta ah

PAC (P1 derived artificial cromosome): 50 150 kb PAC: cromosoma artificial derivado de vectores basados en bacterifago P1 (pAD10 modificado): Remocin de una regin que contiene el sitio pac, el fragmento stuffer y un sitio lox (ac no hay fagos!!!). Insercin de una regin derivada del pUC19 en el sitio de clonado BamHI (dentro del SacBII) para anular la toxicidad de SacBII y aumentar la cant del vector (tiene ori de replicacin de alto nmero de copias): PAC (vaco) replica mejor: se puede amplificar bien en bacterias para digerir y hacer la library Replicn ltico (IPTG), replicn plasmdico, kan idem pAD10

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fosfatasa deP

Genomic DNA Partial digestion Sau3I or MboI. Select fragment by size

NO fosfatasear

Seleccin y screening de library: rep plasmdico. Para amplificar clon de inters: rep ltico.

Ligate vector to a genomic DNA fragments Transform E. coli by electroporation

Select recombinants on media containing Kan and 5% sucrose

Kan: selecciona bacterias que incorporaron vector SacBII: seleccin de clones con inserto (levansucrasa en E. coli es letal en medio con 5% sacarosa)sin fragm DNAg (religacin): expresan levansucrasa y mueren

Cromosomas artificiales bacterianos (BAC): 100 300 kb Contienen elementos del plsmido F (solo 1 copia por clula que se divide y particiona en las 2 clulas hijas): -par A, B y C, oriS/repE: mantienen 1 copia por clula (muchas copias: inestabilidad), controlan la particin durante la divisin

-Cm(r): resist cloranfenicol: seleccin de bacteria transformantes -MCS: HindIII-BamH -LacZ: identificacin de recombinantes -prom T7 y SP6: para generar ribosondas (pegado primers para seq los extremos del inserto)

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O digerir vector con BamHI y DNA con Sau3AI-MboI loxP y cosN: puntos para clivaje (prot P1cre y terminasa del fago)

Transformar E. coli x electroporacin Seleccin en CAM/IPTG/X-gal Transformar E. coli x electroporacin Seleccin en CAM/IPTG/Xgal

Cromosomas artificiales de levaduras (YAC): 200-1000 kb YACs se propagan en levaduras como cromosoma lineal. Elementos de cromosoma de levaduras: TEL: secuencias telomricas CEN4: seq del centrmero ARS: seq de replicacin autnoma Cloning site: EcoRI dentro del SUP4: seleccin de recombinates con inserto. URA3/TRP1: seleccin levaduras transformantes (ura-, trp-) Ori/Amp: amplificacin del vector en Ecoli

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ade2 ochre: rosado x acumulacin de intermediario biosntesis de adenina SUP4: suprime los efectos de ade2ochre No rec: expresa SUP4: suprime ade2ochre colonia blanca Rec: no expresa SUP4, no suprime ade2ochre colonia rosada Seleccin en medio trpura- y baja cc de ade: colonias rosadas! Transf levaduras trp1- ura3- ade2 ochre (mut en gen ade2 -biosntesis de adenina-: stop prematuro) Placas de 96 wells

Eleccin del vector

Vector Tamao del fragmento a clonar Husped/ Facilidad de recuperacin del DNA clonado Inestabilidad de la secuencia clonada Facilidad de screening Cosmidos/ Fsmidos < 50 kb P1 > 50 kb PAC >50 kb BAC > 50 kb YAC >250 kb

E. coli Extraccin alcalina (EA)

E. coli EA

E. coli EA

E. coli EA

levaduras Difcil, requiere PFGE

Csmidos: alta (rearreglos) Fsmidos: baja Hibridizacin convencional

Baja

Baja

Baja

Clones quimricos por rec entre 2 YACs arrays

arrays

arrays

arrays

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Screening por hibridacin convencional (csmidos/fsmidos)

SuperCos: se pueden escrinear 20 placas con 50000 ufc c/u: 1.0 106 cfu en total

Screening de bibliotecas ordenadas en arrays (PAC, BAC, YAC) Array

Pins: c/u pica una colonia

96 wells con medio de cultivo

* 1 well=1 clon : fcil de replicar y almacenar. Robot * Existen servicios que construyen bibliotecas en formato array
etOH 70% Placas con colonias

Cada clon identificado: #placafila-columna Ej: 255A6: placa 255, fila A, clomna 6

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Screening de bibliotecas ordenadas en arrays (PAC, BAC, YAC)

Mtodos para screening Hibridacin Sondas para hibridacin gen vecino gen relacionado evolutivamente regin correspondiente a un dominio conservado exn conocido

PCR Screening en forma combinacional= los clones se agrupan en pooles y se analizan muchos clones al mismos tiempo

Sceening por hibridacin

Screening de BAC library (algodn): 16896 clones (bacterias) spottados x2.

11 filtros de 8x12cm. c/u: grilla de 386 cuadros (16x24: A-Px1-24). En cada cuadro: 4 colonias por duplicado (8 spots): 1,536 clones BAC por filtro (spottados por duplicado)

Se pueden pedir las membranas, hibridarlas y encargar los clones +

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Sceening por hibridacin

grilla de 386 cuadros. En cada cuadro 8 colonias por duplicado (16 spots): 3072 clones BAC por filtro (spottados por duplicado) Positivos: seal doble

Screening por PCR: pooles (sceening combinacional)

Cada fila de las 9 placas: 1 pool (A-H): 8 pooles

master pool 5

Cada columna de las 9 placas: 1 pool (1-12): 12 pooles

Cada placa: 1 pool: 9 pooles A-I

360 placas/9 = 40 master pooles

Placa G Fila E Pooles de filas Col 5 Pooles de columnas

Pooles de placas

Existen servicios de screening por PCR

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Secuenciacin Los insertos son muy largos!! - no se pueden secuenciar directamente Clonado de la secuencia genmica y promotora de un gen Screening (sonda correspondiente a una regin conocida) Clon que contiene la seq de inters: digestin o fragmentacin mecnica en fragm pequeos (2-3kb) superpuestos sub-library en otro vector Screening de la sub-library con la misma sonda y secuenciar los + A partir de las secuencias obtenidas se pueden generar nuevas sondas para re-escrinear la sub-library (encontrar clones adyacentes), secuenciar los +.repetir el proceso: caminado genmico

Secuenciacin

Sub-library Vectorette a partir de un clon de la biblio genmica seleccionado por screening

Seq correspondiente al primer vectorette

Amplificar secuencias adyacentes a cada lado de una regin conocida para secuenciar

De esa seq: primers para hacer caminando genmico

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Secuenciacin de genomas en BAC DNA digerido: fragm de 150000 pb: library en BAC Fingerprinting: para localizar cada BAC a lo largo del cromosoma (mapeos con ER de cada BAC: comparan x software).

c/BAC: digestin parcial en fragm de 1500 pb library de c/BAC en otro vector c/vector se seq: PHRAP: junta los fragm por superposicin

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Caminado Cromosmico: mapeado de regiones genmicas largas contenidas en distintos clones (por ej: clones de una biblioteca en csmidos)

Screening 1

Ribosondas con RNApol (T7, T3)

Screening 2

Screening n

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