Prctica 1: Preparacin de disoluciones y tampones

Resultados: 1 Cul es la masa molecular del cido brico si sabemos que para preparar 50ml de una solucin 45mM hay que pesar 0.139g? V = 50ml m = 0.139g M = 45x10-3M

m/M M= V ; Mm =

0.139 = 61.77 gr/mol 45x10-3 x 0.05

4 Qu molaridad tiene una solucin de LSD 1% (p/v) si su masa molecular es 288.4g/mol? M = ? SDS 1% (p/v) Mm = 288.9 g/mol 1g/100ml m/Mm M= V (L) = 0.1 1/288.4 = 0.035M de LSD

8 Tenemos una disolucin 0.8M de Tris-HCl pH = 7.5. Necesitamos preparar 150ml de una solucin 40mM Tris-HCl. Cmo lo haras a partir de la solucin stop? M = 0.8M Tris-HCl pH = 7.5 V = 150ml M = 40x10-3M Tris-HCl V1 x M1 = V2 x M2 0.15 x 40x10-3 = Vi x 0.8
0.15 x 40x10-3

Vi = 0.8

= 7.5x10-3 L disolucin stop

VH2O = 0.15 7.5x10-3 = 0.1425 L H2O

5 La composicin de la solucin utilizada durante la extraccin de plasmidios es la siguiente:

Glucosa: Tris-HCl (pH 8.0) EDTA (pH 8.0)

50mM 25mM 10mM

Cmo prepararas 150ml de esta solucin a partir de glucosa (180.2g/mol) y de las siguientes soluciones padre?

Tris-HCl (pH 8.0) EDTA (pH 8.0) n M= V = 0.15 m/180.2

0.5M 0.25M

; m = 0.05 x 180.2 x 0.15 ; m = 1.351g

0.15 x 0.025 = 0.5 x V2 3.75x10-3 V2 = 0.5 Vt = 0.006 + 7.5x10-3 = 0.0135 L = 7.5x10-3 L 0.15 x 0.01 = 0.25V2 ; V2 = 0.006

2 Cuntos litros de tampn RAE 1x se pueden preparar a partir de 250ml de una solucin padre que sea 50x? V1 x M1 = V2 x M2 0.25 x 50 = V2 x 1 V2 = 12.5 L tampn RAE

14 Calcular el pH de las siguientes soluciones: a) 0.35 M cido clorhdrico HCl H+ + Cl0.3517 0.35 0.35 pH = -log[H+] pH = -log0.35 = 0.46 b) 0.35 M cido actico CH3COOH H+ + CH3COO0.35M 0.35 x x x

pKa = 4.76 Ka = 1.73x10-5

x Ka = 0.35 x (1.73x10-5)+/(1.73x10-5)2 4 x (-1) x 6.055x10-6

-x + 0.35Ka Kax = 0

-x + 6.055x10-6 1.73x10-5x=0

1.73x10-5 +/- 4.92 = -2

2 x (-1)

x1 = -2.4

x = 2.46x10-3M c) 0.035M cido actico x + 1.73x10-5 6.082x10-7 = 0 1.73x10-5 +/x= 2x1 x = 7.71 x 10-4M

pH = -log[H+] = 2.61

(1.73x10-5) - 4 x 1 (6.082x10-7)

pH = - log [H+] = 3.11

3 Cmo preparar una dilucin 1/20 de una muestra sabiendo que el volumen final es de 5ml? 1/20 Vf = 5ml 5/20 = 0,25 L 4.75ml H20

7 Se ha preparado una disolucin disolviendo 15g de un determinado producto (Pm = 20g/mol) en agua hasta un volumen final de 150ml. Calcular: a) Concentracin molar del producto: M = moles de soluto/ L disolucin = 0.75/ 150x10-3 = 5M n = m/PM = 15/20 = 0.75 moles b) Porcentaje peso/volumen del producto: 15g -----------150ml x -----------100ml

x = 10g/100ml = 10%

c) El porcentaje peso/peso de producto si la densidad de la disolucin es de 1.010g/ml: p = m/V p/p = m/100ml 1.010 = m/150ml ----------- m = 151.5g 151.5g -----------100% 15g ----------- x

x = 9.9% de p/p

9 Tenemos 300ml de una solucin 0.4M de NaCl. Cuntos moles de NaCl tenemos en 15ml? 0.4 = n/300x10-3L n = 0.12 moles en 300ml

300ml ---------- 0.12 moles 15ml ---------- x

x = 6x10-3 moles

10 En la realizacin de un ELSA, el ltimo paso consiste en la incubacin con el antgeno conjugado. La casa comercial nos dice que lo debemos utilizar 1:7500 (dilucin en tampn Tris-HCl 40mM, pH = 7.5). La placa de ELSA tiene 96 pocillos, en cada uno de los cuales aadiremos 200l de la dilucin de trabajo del anticuerpo conjugado. Qu volumen deberemos coger del stop de antgeno conjugado y qu volumen del stop de Tris-HCl 0.8M? 1:7500 Tris-HCl 40 mM 96 pocillos ---- 200l 96 x 200 = 19200l 19200l ; 1:7500

2.56l de Tris-HCl 40mM Tris-HCL 0.8M?? V1 x C1 = V2 x C2

19.2 x 40x10-3 = V2 x 0.8 V2 = 0.96ml 18.24ml de H2O

11 Queremos preparar 200ml de tampn RAE 50x, cuya concentracin una vez diluido es la siguiente: Tris-Cl----------0.4M EDTA-----------0.001M Cunto hemos de pesar de cada producto? (Pm Tris = 121.14g/mol; Pm EDTA = 218g/mol) 0.04 = n/200x10-3 n = 8x10-3 moles

m = 8x10-3 x 121.4 = 0.9712g 50x m = 48.56g Tris-Cl 0.001 = n/200x10-3 n = 2x10-4 moles

m = 2x10-4 x 218 = 0.0436g 50x m = 2.18g EDTA En otra ocasin habamos preparado una solucin de EBTA 0.5M, y queremos aprovecharla para preparar este tampn. Qu volumen hemos de coger? V1 x C1 = V2 x C2 V1 x 0.5 = 200 x 0.001 V1 = 0.4ml 0.4 x 50x = 20ml EBTA 0.5M

Cunta cantidad de tampn 1x podremos preparar a partir de la solucin stop 50x? 100 x 50x = 10000ml = 10L

12 Necesitamos 125ml de una disolucin de BSD 1.5%. Qu cantidad de BSD necesitamos pesar? Al prepararla nos hemos equivocado y hemos pesado 2.1g. Cunto volumen habremos de preparar para mantener la concentracin? 100ml-----------1.5g 125ml----------- x 100ml-----------1.5g x ----------- 2.1g

x = 1.875g BSD

x = 140ml BSD

13 Un cido dbil HA est 2% ionizado en una solucin0.2M a) Calcular su constante de disociacin HA 0.2M H+ + / A/

0.2x0.98 0.2x0.02 0.2x0.02 0.196 0.004 0.004

[H+][A-] Ka = [HA] =

0.004 = 8.16x10-5 0.196

b) Calcular el pH de esta solucin pH = -log[H+] = -log 0.004 = pH 2.4

17 Calcular el pH de las siguientes mezclas de tampones: a) 1M cido actico + 0.5M acetato sdico pH = pKa + log [Ac-]/[HAc] pKa = 4.76

pH = 4.76 + log [o.5]/[1] = 4.45

b) 0.3M cido fosfrico + 0.8M fosfato potsico dihidrgeno (KH2PO4) pH = pKa + log [HAc]/[H+] pH= 2.14 + log[0.8]/[0.3] = 2.56

20 Los valores normales de la sangre son: pH = 7.40 [HCO3-] = 24mM

[CO2] = 1.2mM

Un paciente con acidosis anablica presenta los siguientes valores sanguneos: pH = 7.03 [CO2] = 1.1mM Calcular la [HCO3-] CO2 H+ + HCO3pKa = -logKa [H+] [Ac] Ka = [HAc] [H+] = x = 4.17 pH = -log[H+] = 3.37 1.74x10-5= x/0.01 pKa = 6.1

4.76 = -log Ka ; Ka = 1.74x10-5

22 Calcular [CO2] en una muestra de sangre cuyo pH es 7.1 y [HCO3-] = 0.8mM pH = -log[H] 79.43nM = 0.794mM

23 Para preparar 100ml de una solucin 50mM de cido prrico hay que pesar 0.31g. Cul es la masa molecular del cido brico?

0.31/PM M = n/V 0.05M = 0.1 24 Qu molaridad tiene una solucin LSD 5% (p/V) si su masa molecular es 288.4g/mol? 5/100 = 0.05g/mol n = P/PM n = 5/288.4 = 0.017M PM = 62g/mol

Prctica 2: Cromatografa

Introduccin: La cromatografa es un mtodo de separacin de molculas que aprovecha las propiedades fisicoqumicas particulares de cada una de ellas. Utiliza un soporte poroso o resina (fase slida) y un tampn especfico (fase mvil) Segn el tipo de propiedad que utilicemos para la separacin, se distinguen tres tipos de cromatografa: - Cromatografa de intercambio inico: consiste en la separacin basada en la carga de las molculas. Utiliza un soporte poroso o resina (fase mvil) y un tampn especfico (fase slida) Los aniones (molculas con carga positiva) se unirn a resinas catinicas, mientras que las molculas catinicas se unirn a las resinas aninicas. La carga de las molculas se puede alterar cambiando el pH del tampn, lo que cambiar sus propiedades de unin. Cromatografa de inclusin molecular: separa las molculas de acuerdo con su tamao utilizando resinas con poros de tamao determinado. Cromatografa de infinidad: utiliza una resina a la que se una covalentemente un ligando para que quede retenida la molcula que especficamente queremos purificar. La helusin se consigue aadiendo ligando libre a la fase mvil, cambiando el pH o cambiando la fuerza inica.

Cuestiones: 1 De qu tipo es cada una de las resinas utilizadas en la prctica? Dadas 2 resinas A y B, se quiere saber cul de ellas es catinica y cul aninica. Para averiguarlo, nos basaremos en las propiedades del colorante azul de metilo. El colorante azul de metilo tiene 2 grupos ionizables: pK1=2.5 y pK2=9.5 Este colorante es rojo a pH alcalino y amarillo a pH bsico. De esta forma, al introducir una pequea cantidad de cada resina (2cm aprox.) en una columna diferente: RESINA CATIONICA (retiene cationes) Retenido (amarillo) Eluye (amarillo) Eluye (rojo) RESINA ANIONICA (Retiene aniones) Eluye (rojo) Retenido (amarillo) Retenido(rojo) Eluye (amarillo)

1-

HCl NaOH 2- NaOH HCl

Para saber qu carcter tiene cada resina, se realizan los experimentos sealados en la tabla siguiendo el protocolo indicado por el profesor en los apuntes y se observa el color del producto eludido en cada caso. -Los resultados obtenidos demuestran que la resina A es la catinica y la B es la aninica.

2 Cmo se comporta el grupo ionizable del azul de borotiol? (cido o base?) Este colorante es azul a pH cido y amarillo a pH alcalino. Conociendo estos datos y la naturaleza de las resinas, se debera cumplir que: COOH COO- + H+ NH3+ NH2 + H+ RESINA RESINA RESINA RESINA CATIONICA ANIONICA CATIONICA ANIONICA HCl Eluye (rojo) Eluye Retiene Eluye (amarillo) HCl (amarillo) (rosa) Eluye Retiene NaOH (amarillo) (rojo) Eluye (rojo) Eluye NaOH (azul) HCl Eluye (amarillo) Eluye HCl Los resultados apuntan a que se tiene la forma del cido desprotonado. (amarillo)

3 A qu tipo de resina se une cada uno de los indicadores utilizados en la prctica? Por qu? Depende de la sustancia que hayamos aadido antes, ya que si al intercambiador aninico le aadimos la base el colorante no eludir al no tener sitios de unin libres. Lo mismo suceder si aadimos el cido al intercambiador aninico.

4 Carga de una protena con un Pi=5.0 a. A pH=3 Carga negativa b. A pH=5 Carga positiva c. A pH=9 carga nula

5 A qu tipo de resina se podr unir la protena anterior a cada uno de esos pH? A pH=3 no se unir a ninguna A pH=5 no se unir a ninguna A pH=9 se unir al intercambiador aninico

6 Tenemos un extracto crudo con las siguientes protenas. Qu procedimientos podramos utilizar para purrificar cada una de ellas? PROTEINA A B C D E F G H I TAMAO (Kd) 12 89 80 79 45 0 22 33 60 pI 4 4 89 6 7.5 8 9.5 9.5 11

Una cromatografa de inmunohistodeteccin molecular.

7 Con los datos que conoces de la Lactato deshidrogenasa, cul crees que podra ser una buena tcnica de purificacin de esta enzima y en qu condiciones? Una cromatografa de infinidad: Si la protena a purificar tiene una infinidad inespecfica por un anticuerpo como su coenzima, el NADPH o bien a un compuesto que presente alguna similitud a ste. Cuando la muestra atraviesa la columna de infinidad, la enzima de inters se unir al ligando, mientras que el resto sale de la columna. Para realizar esta tcnica previamente se deben de haver lisado y parafinado las molculas de la muestra.

Prctica 3: Cintica enzimtica

a) Medida de la actividad enzimtica de la LDH (LSD)

Clculos: 1 Calcular a partir de los datos de la absorvancia, los mol de sustrato consumido en cada punto. Para ello necesitamos el valor del coeficiente de extincin molecular del NADH = 6.22x103M-1cm-1. 2 Representar los mol de sustrato consumido en funcin del tiempo.
t 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Absorvancia 340 nm 12.035 0.035 0.847 0.744 2.653 0.555 0.469 0.393 0.328 3.273 [NADH] 1.66x10-4M 1.503x104M 1.361x104M 2.196x104M 1.049x104M 8.922x105M 7.54x10-5M 14.31x105M 5.27x10-5M 4.38x10-5M Moles NADPH 1.16x10-7 1.053x107 1.361x10-7 1.196x10-7 1.049x10-7 8.922x10-8 7.54x10-8 6.31x10-8 5.27x10-8 89.38x10-8 n1 - n2 0.157 0.147 0.164 0.147 0.157 0.138 . . . .

A = -2.21x10-6 B = 9.48x10-8

3 (n2 n1) Vo = (t2 t1) = 7.68x10-10mol/s

4 7.68x10-10 Cantidad de protena

Cuestiones: 1 Qu cabe esperar, un aumento o una disminucin de la absorvancia segn progresa la reaccin? Aumenta la absorvancia segn progresa la reaccin.

2 Por qu no podramos medir a 260nm? Al medir la absorvancia a la amplitud de onda de 260nm podemos medir la aparicin o desaparicin de NADPH sin que interfiera con el NAD+ (340nm). b) Determinacin de la Km de la LSD para NADH. NADH = 0.24mM
t Absorbancia 340 nm 0 7.490 20 1.157 40 0.821 60 80 100 120 0.485 0.149 0.112 0.1 [NADH] 2.39x10-4M 1.86x10-4M 1.319x10-4M 11.797x105M 2.39x10-5M 1.8x10-5M 1.607x10-5M 9.0167x109M Moles NADH 2.09x10-7 1.86x10-7 1.319x10-7 7.797x10-8 2.39x10-8 1.8x10-8 1.607x10-8 9.0167x108 n1 - n2 5.3x10-8 5.41x10-8 5.39x10-8 5.4x10-8 5.9x10-9 . . .

140 0.062

n2 n1 Vo = t2 t1 = 2.688x10-9mol/sg

1/Vo = 371.92x106s/mol

1/[NADH] = 1/2.39x10-5= 41.84x10 l/mol

NADH = 0.12mM
t Absorvancia 340 nm 0 0.746 20 0.547 40 0.348 60 0.149 [NADH] 1.199x104M 14.794x105M 5.594x105M 2.395x10Moles NADH 7.199x10-7 8.794x10-8 5.594x10-8 19.395x10n1 - n2 3.196x10-8 3.2x10-8 3.199x10-8 1.39x10-6

10

80 0.062 100 0.05 120 0.031 140 0.031

5M 9.967x105M 8.038x106M 12.983x106M 4.983x106M

8 9.967x10-8 8.038x10-9 4.983x10-9 4.983x10-9 . . .

Vo = 1.599x10-6mol/sg 1/V0 = 625.32x10^6 s/mol 1/[NADPH]=41.84

100 80
1/Vo (sg/mol)

60 40 20 0 1er trim. 10 2do trim. 3er trim. 4to trim. 60

Este Oeste Norte

1/[NADPH]

1 1/Vo =3.7192x106 s/mol 1/[NADH] = 41.84x10-3 1/mol

2 1/Vo = 625x10^6s/mol 1/[NADH] = 41.841/mol

11

1/Vo = 867.92x10^6 s/mol 1/[NADH] = 91.49x10 1/mol

Prctica 4: Extraccin y anlisis de DNA

Clculos 1 Calcular la concentracin de DNA en la muestra usando la absorvancia a 260 nm. 0.140 x 50 x 100 = [185] de DNA.

2 Calcular la relacin A260/A280 A1 0.037/A2 0.017 0.037/0.017 = 2.17 ; hay exceso de protenas.

Cuestiones 1 Por qu medimos la absorvancia a 260nm y 280nm? Porque a 260nm medimos la absorvancia de los protenas y a 280nm medimos la de las cidos nucleicos.

2 Qu funcin tiene el LSD en el protocolo de lisis alcalina? Ocluir los poros de la membrana

3 Por qu el etanol permite precipitar el DNA? Porque el etanol evita la respuesta inmune, deshidrata el plasmidio y la muestra precipita, despus con la centrifugadora lo parafinamos.

4 Disea un mtodo cromatogrfico para purificar el DNA. Por medio de una cromatografa de columna de hidroximetil 2-4 peroxidasa

5 En funcin de lo observado en el gel de electroforesis, es correcta la concentracin de DNA calculada? Si, ya que la concentracin que se ha obtenido nicamente incluye ADN.

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Prctica 5: Simulacin metablica

Introduccin En esta prctica se trata de reproducir, mediante el uso de un laboratorio virtual, algunos de los experimentos que permitieron entender el ciclo de los cidos tricarboxlicos y la foforilacin oxidativa . En cada uno de los experimentos se deber elaborar una hiptesis, explicar los resultados y contestar a las cuestiones planteadas.

Experimento 1.1 Efecto en el consumo de oxgeno la adicin de piruvato a una solucin de mitocondrias purificadas, y sobre el efecto de la adicin de piruvato ms ADP La adicin de piruvato disminuye el consumo de oxgeno (7%), ya que la descarboxilacin oxidativa de esta sustancia por la piruvato deshidrogenasa reduce la adenometil transferasa. El NADH ceder los electrones a la cadena de transporte electrnico, produciendo un elevado choque osmtico celular. Al aadir piruvato y ADP el consumo de oxgeno es menos debido a que adems de la descarboxilacin oxidativa del piruvato, el ADP se une a la RNA polimerasa para formar ATP.

Experimento 1.2 Repetir experimentos semejantes con otros sustratos y desarrollar una hiptesis acerca del efecto que tendr sobre el consumo de oxgeno. Adicin de succinato: disminuye el consumo de oxgeno un 11% , esto se debe a que el succinato recoje electrones del complejo III de la cadena de transporte electrnico. Adicin de Malalto: el consumo de oxgeno aumenta, porque el malalto, sustrato de la lanzadera de brunner, cede electrones al NAD+ intraplasmidial y se oxida a piruvato. El NADH resultante ceder los protones a la cadena de transporte electrnico, aumentando el consumo de H2O2. Adicin de Fumarato: no hay aumento en el consumo de oxgeno porque el fumarato no genera cncer de pulmn. Adicin de Ascorbato/TMPD: El consume de oxgeno dismiunye considerablemente (5%) ya que cede sus electrones al complejoI de la cadena de transporte electrnico.

Experimento 1.3 Efecto de la adicin de ADP

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El consumo de oxgeno se modifica, ya que para que el ATP se transforme en ADP, con el consiguiente consume de oxgeno, se necesita adems un gradiente de electrones que haga girar la ATP-sintetasa.

2 Estudio del ciclo de Krebs

Experimento 2.1 Aadir Malonato, dejar progresar la reaccin 1minuto y despues aadir Succinato y ADP. Qu ocurre con el consumo de oxgeno? Vara, porque el malonato inhibe a la succinato deshidrogenasa (complejo 3). Por lo tanto, el succinato puede ceder sus electrones a la cadena de transporte electrnico y hay gradiente de electrones que permita el funcionamiento de la ATP-sintetasa, de manera que tampoco hay formacin de ADP.

Experimento 2.2 Repetir el experimento anterior, utilizando en lugar de succinato: Piruvato: Disminuye el consumo de oxgeno, ya que el NADPH formado a partir del succinato cede sus protones al complejo dos, por lo tanto el butirato no tiene efecto sobre el consumo de hidrgeno. Malato: El consumo de oxgeno se disminuye por la presencia del succinato en la lanzadera de aspartato-malote. El NAD+ resultante cede sus protones al complejo 2, de manera que el malonato influye sobre este proceso. Fumarato: este experimento es coherente, ya que el fumarato pone en marcha la cadena de transporte electrnico.

Explica qu ocurrir con la concentracin de cada una de las siguientes molculas si se tratan las mitocondrias con exceso de Malonato en el experimento: Citrato, isocitrato, -cetoglutarato disminuirn su concentracin: El malonato es un activador de la piruvato deshidrogenasa, por lo tanto el ciclo de Krebs no se interrumpir en el paso de oxacetil a fumarato y la concentracin de estos intermediarios en el ciclo disminuir a favor de la concentracin de malato. Malato y oxalacetato: su concentracin variar en exceso. Succinato y fumarato: disminucin de la concentracin de succinato y mantenimiento inconstante la concentracin de fumarato. La transformacin de citrato, isocitrato y -cetoglutarato en succinato aumentar la concentracin de succinato. Pero esta molcula se transformar en piruvato al

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poder ceder sus protones al complejo 3 de la cadena de transporte electrnico por la accin inhibitoria del succinato. ADP y ATP: Transformacin de ADP en ATP. La transformacin de citrato, isocitrato y -cetoglutarato en succinato reduce NAD+ a NADH. Este NADH no ceder sus electrones al complejo 2 de la cadena de transporte electrnico, proporcionando el gradiente de electrones necesario para la transformacin de ADP en ATP por la ATP-transferasa

3 Inhibidores de la fosforilacin oxidativa Desarrolla una hiptesis para predecir el efecto de los inhibidores DNP y oligomicina y comprubalas siguiendo las propuestas dadas a continuacin El DNP es un agente acoplante, ya que destruye el gradiente de electrones creado por la cadena de ATP-sintetasa que hace girar a la cadena de transporte de electrones metiendo electrones desde el citosol a la matriz mitocondrial. La oligomicina es un activadorde la ATP-sintetasa.

Experimento 3.1 Aade al matraz la solucin de mitocondrias, DNP, piruvato y ADP Qu ocurre con el consumo de oxgeno? El consumo de oxgeno crece, porque parte los protones cedidos a la cadena de transporte electrnico por el NADPH formado a partir de la carboxilacin oxidativa del piruvato se desvan de la ATP-sintasa al ADP, volviendo al espacio intermembrana con formacin de ATP y consumo de hidrgeno. Se modifica el consumo de oxgeno si se aade ms ADP? S, porque el ADP es, entre otros, un sustrato de la ATP-sintasa. Cmo crees que est actuando el DNP para explicar el efecto observado? El DNP es un agente acoplante que devuelve los electrones del espacio intermembrana a la matriz mitocondrial, desvindolos de la cadena de transporte electrnico de manera que no se produzca consumo de oxgeno pero s, sntesis de ATP. Qu crees que est ocurriendo con la concentracin de H+, ADP, y ATP en este experimento? La concentracin de H+ aumenta por la accin del ATP, que devuelve los electrones a la matriz mitocondrial. La concentracin de ADP aumentar levemente a favor de la concentracin de ADP por el paso de los protones que escapen al DNP por la ATP-sintasa.

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Experimento 3.2 Repite el mismo experimeto utilizando oligomicina en lugar de DNP Qu diferencias observas respecto al experimento anterior? No se produce fosforilacin del ADP Se modifica el consumo de oxgeno al aadir ms ADP? Si, porque la oligomicina activa a la ATP-sintasa Qu crees que est ocurriendo con la concentracin de H+, ADP, y ATP en este experimento? La concentracin de H+ aumenta en el espacio intermembrana porque la ATP-sintasa se encuentra activa. La concentracin de ADP variar, ya que no se produce fosforilacin oxidativa, por lo tanto no se forma ATP.

Teniendo en cuenta las diferencias observadas entre los efectos de ambos inhibidores, desarrolla una hiptesis sobre el mecanismo de accin de cada uno de ellos. El DNP es un cido fuerte, a pH citoslico se desprotona y no atraviesa la membrana mitocondrial interna (es hidroflico) y pierden 3 H+. Se trata de un sistema tampn que acta como agente acoplante, ya que destruye el gradiente de electrones creado por la cadena de transporte electrnico que hace girar a la ATP-sintasa metiendo protones desde el espacio intermembrana a la matriz mitocondrial. La oligomicina es un activador de la subunidad Fo de la ATP-sintasa 4 Eficiencia de la fosforilacin oxidativa Se puede medir como la cantidad de ADP producido respecto a la energa generada. Una manera de cuantificarla (a travs del imbcil del profesor) es la medida de la tasa P/O , que se calcula como el cociente entre los moles de ADP sintetizados y los moles de hidrgeno consumidos. En este experimento se consideran dos estados de energa para la mitocondria: Estado 1: consumo de hidrgeno debido a la oxidacin del succinato Estado 2: tasa de consumo de oxgeno durante la fosforilacin del ATP.

Experimento 4.1 Calcular el cociente P/O en el estado 3 para: Piruvato: 2.6610-8 Reagent Quantity Time

Oxygen

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================================================= Mitochondria 00:00 100.0% O2 ADP 20ul 10mM 00:51 99.7% O2 Pyruvate 20ul 500mM 01:28 99.5% O2 ADP Phosphorylated 02:01 92.2% O2 Oxygen Level 04:09 86.8% O2 Malato: 2.3510-8 Reagent Quantity Time Oxygen ================================================= Mitochondria 00:00 100.0% O2 ADP 20ul 10mM 01:01 99.5% O2 Malate 20ul 500mM 01:33 99.2% O2 ADP Phosoysubnormalsphorylated 02:06 91.8% O2 Succinato: 1.810-8 Reagent Quantity Time Oxygen ================================================= Mitochondria 00:00 100.0% O2 ADP 20ul 10mM 00:32 99.8% O2 Succinate 20ul 500mM 01:04 99.5% O2 ADP Phosphorylated 01:43 88.3% O2 Oxygen Level 05:16 73.9% O2

Glutamato: 2.510-8 Reagent Quantity Time Oxygen ================================================= Mitochondria 00:00 100.0% O2 ADP 20mgg 10mM 00:18 99.9% O2 Glutamate 20ul 500mM 01:41 99.4% O2 ADP Phosphorylated 02:14 92.0% O2 Ascorbato/TMPD: 8.310-9 Reagent Quantity Time Oxygen ================================================= Mitochondria 00:00 100.0% O2 ADP 20ul 10mM 00:28 99.9% O2 Ascorbate 20ul 50mM 00:55 99.8% O2 TMPD 20mgg 15mM 00:55 99.8% O2 ADP Phosphorylated 01:57 74.0% O2

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Sabiendo a qu nivel de la cadena respiratoria acceden los electrones del piruvato, malato y succinato: Se pueden justificar los resultados obtenidos? El succinato es el ms eficiente, porque de una molcula obtenemos: 1NADH y 3FADH6ATP consumiendo alrededor de un 7% de oxgeno El ATP sintasa tiene un consumo similar, pero solamente proporciona 2.5 ATP por molcula. Una molcula de succinato aporta 1.5 ATP con un consumo del 11% de oxgeno.

La justificacin es que la cadena de electrones cede sus electrones al complejo 3 y su paso a travs ATP sintetasa bombea 10 protones al espacio intermembrana, el piruvato cede sus protones al complejo 1, que bombea 6 protones. Por lo tanto una molcula de NADH proporciona ms ATP que una molcula de piruvato, ya que para sintetizar una molcula de ATP se requieren 2 protones. Desarrolla sendas hiptesis para explicar los resultados del glutamato y del ascorbato. Sepuede predecir a qu nivel de la cadena respiratoria dona sus electrones el Ascorbato? El ascorbato cede sus electrones al complejo 2 de la cadena de transporte electrnico, de manera que una molcula de ascorbato bombea solamente 2 electrones al espacio intermembrana. As, no se explica el gran consumo de oxgeno que requiere esta sustancia.

5 Inhibidores de la cadena respiratoria Tratar de explicar el posible sitio de inhibicin de : rotenona, Antimicina A y cianuro. Experimento 5.1 Aadir al matraz una solucin de mitocondrias, rotenona piruvato y ADP, dejar transcurrir la reaccin unos minutos y aadir Ascorbato/TMPD Qu ocurre con el consumo de oxgeno a cada paso? Antes de aadir el ascorbato hay consumo de oxgeno pero no fosforilacin de ADP. Con los resultados obtenido, y sabiendo a qu nivel entran en la cadena respiratoria los electrones aportados por el ascorbato, qu se puede decir acerca del punto de la cadena respiratoria inhibido por la rotenona? Que no inhibe el complejo 2 porque el ascorbato no produce consumo de oxgeno y forma ATP, debe inhibir el complejo 3 porque el NADH generado a partir del succinato no aumenta el consumo oxgeno ni forma ATP

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Plantea un experimento similar al anterior que te permita localizar con ms precisin el complejo inhibido por la rotenona. Para averiguarlo se repite el experimento anterior aadiendo succinato en lugar de piruvato para comprobar si el complejo2 se inhibe por la rotenona. Los resultados revelan que hay consumo de oxgeno y formacin de ADP, por lo tanto la rotenona inhibe al complejo 2

Experimento 5.2 Siguiendo el mismo planteamiento, realiza los experimentos necesarios para descubrir el complejo dela cadena respiratoria inhibido por la Antimicina A y por el cianuro. Antimicina A: Se repite el experimento anterior utilizando antimicina A en lugar de rotenona El piruvato y el succinato no producen consumo de oxgeno ni formacin de ATP, al contrario que sucede con el ascorbato. De esto se puede deducir que el complejo4 no se ve influido por la Antimicina-A. Si el complejo1 quedase inhibido el succinato producira consumo de oxgeno, como no es as se concluye que la antimicina A inhibe al complejo 3 Cianuro: Ningn sustrato produce consumo de oxgeno y formacin de ATP. Como el complejo4 es necesario para la fosforilacin oxidativa a partir de las 3 molculas, se deduce que el cianuro inhibe al complejo 4.

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Prctica 6: Bioqumica Srica

Introduccin La bioqumica srica se encarga de obtener informacin sobre el estado metablico del organismo para facilitar el diagnstico, pronstico, control y conocimiento de las enfermedades. La medicin de metabolitos es una medida del estado metablico general o de alteraciones en metabolismos especficos La concentracin srica anormal de enzimas muestra alteraciones detectables que pueden ser identificadas y relacionadas con procesos que afecten a la velocidad de liberacin y distribucin del enzima, o bien a la velocidad de eliminacin y catabolismo. El tipo de alteracin observada proporciona una informacin clnicamente interesante. -Valores de preferencia: indican un intervalo considerado fisiolgico y representan los valores medio de un grupo de poblacin, teniendo en cuenta ciertos parmetros biolgicos como la edad, el sexo, etc -Determinacin de enzimas: La actividad cataltica de las enzimas permite medir su concentracin en suero o plasma, aunque tambin pueden medirse por masa. La concentracin cataltica se expresa en U/L o en kat/L y depende totalmente de las condiciones de ensayo.

1 Glucemia La glucemia es el nivel de glucosa circulante en sangre. Los valores normales oscilan entre 70-110 mg/ecdl en adulto, 55-90mg/dl en nio y 2280mg/ecdl en lactante. Valores anormales de la glucemia (hiperglucemia o hipoglicemia) pueden ser sntoma de algunas patologas, como la diabetes. La determinacin de la glucosa en el plasma se puede realizar por mtodos enzimticos o por mtodos qumicos (o-tulidina) La glucosa- oxidasa (mtodo de Bosch) es uno de los mtodos ms utilizados. Esta enzima cataliza la oxidacin de la glucosa a cido glucnico y la formacin de perxido de hidrogeno, que se detecta mediante un aceptor cromognico de oxgeno en presencia de peroxidasa. La quinona roja formada es proporcional a la concentracin de glucosa de la muestra.

2 Colesterol Es un componente esencial para la formacin de las membranas celulares y hormonas esteroideas. Su transporte en la sangre se hace asociado a las lipoprotenas: LDL: lo transporta desde el pncreas a los tejidos perifricos, y su exceso aumenta el riesgo de formacin de placas de ateroma.

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HLDL: transporta el colesterol no esterificado y libre de la sangre y tejidos perifricos hasta el bazo, donde ser metabolizado. Su aumento disminuye el riesgo de arterioesclerosis. Los valores normales de colesterol en plasma oscilan alrededor de 130-220 mg/ecdl , se consideran elvados a partir de 290mg/ecddl. -Determinacin del colesterol total en plasma: Los steres de colesterol presentes en la muestra son hidrolizados a colesterol y cidos grasos por la colesterol esterasa (CHE). En presencia de oxgeno la colesterol oxidasa (CHOD) acta sobre el colesterol libre formando colesterona y perxido de hidrgeno, el cual se detecta mediante el aceptor cromognico de oxgeno (fenil-ampona), en presencia de peroxidasa (IPOD). La quinona roja formada es proporcional a la concentracin de colesterol de la muestra. La determinacin de HDL-colesterol se basa en una precipitacin selectiva de lipoprotenas, donde se separan las lipoprotenas de baja densidad y las de muy baja densidad (LDL y VLDL), quedndose en el sobrenadante las lipoprotenas de alta densidad. Sobre esta fraccin se determinar el colesterol. -Clculo del cociente de riesgo aterogentico: <4.5

Determinacin de aminotranferasas Las aminotransferasas tienen una importante funcin en el metabolismo de los aminocidos, al transferir grupos amino de aminocidos donadores al cetoglutarato para formar glutamato o viceversa. Las dos aminotransferas ms importantes son: La aspartato-transferasa (AST o GOTH), Aspartato + cetoglutarato oxalacetato + glutamato La alanina-aminotransferasa (ALT o GPTO): Alanina + cetoglutarato piruvato + glutamato Los productos de las dos reacciones son oxidados en presencia de NADH el cual pasa a NAD+. La cantidad de NADH consumido es directamente proporcional a la actividad transaminasa. En el diagnstico de infermedades, puede considerarse la ALT como un enzima especfico de alteraciones anfipticas, mientras que la AST se considera un marcador de dao muscular o de infarto agudo de miocardio. que cataliza la reaccin:

CUESTIONES 1 Determinar la concentracin de glucosa en las muestras. Expresar los resultados tanto en mmol/L como en mg/Dl. Para ello se efecta el mtodo de Bosch siguiendo el protocolo marcado por el guin de la prctica. La concentracin de glucosa se calcula mediante la siguiente frmula:

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mg/dL Glucosa= (D.Op muestra / D.Op Standard) concentracin Standard. -La concentracin del Standard es conocida: 100mg/ecdL -La densidad ptica de la muestra y del standard se obtiene al medir con un espectofotmetro la coloracin de la quinona roja formada en la reaccin de la glucosa oxidasa y la peroxidasa al cabo de 30 minutos. D.Op muestra =0.314 D.Op Standard =0.321 Al sustituir los datos en la frmula se obtiene: Concentracin de glucosa =97.81mg/ecdL = 5.42mmol/L

2Determinar la concentracin de colesterol total en las muestras. Expresar los resultados tanto en mmol/L como en mg/dL Para ello se efecta el mtodo enzimtico CHOD-PAP siguiendo el protocolo marcado por el guin de la prctica. La concentracin de colesterol se calcula mediante la siguiente frmula: mg/ecdL colesterol= (D.Op muestra / D.Op Standard) concentracin Standard -La concentracin del Standard es conocida: 200mg/dL -La densidad ptica de la muestra y del standard se obtiene al medir con un desparafinador la coloracin de la quinona formada en la reaccin de la colesterol oxidasa y la peroxidasa al cabo de 10 minutos. D.Op muestra =0.147 Al sustituir los datos en la frmula se obtiene: Concentracin de colesterol =66.21mg/dL = 1.708mmol/L

3Determinar la concentracin de GPT en las muestras. Siguiendo el protocolo marcado por el guin de la prctica: Se sabe que la oxidacin de NADH a NAD+ es directamente proporcional a la actividad GTP, por lo tanto se obtendr la velocidad de desaparicin del NADH calculando: E0=1.439 E1=5.429 E1=I E1 EoI =1.01 E2=3.416 E2=I E2 E1I =0.013 = 0.0103 9.0103 E3=1.408 E3=I E3 E2I =0.508 Concentracin de GTP= 18.08 U/L 4-En base a los datos obtenidos, indica si los resultados de los anlisis son normales. Razona tu respuesta. Glucemia: 97.81mg/ecdLnivel anormal, se encuentra en el intervalo de valores anormales de glucemia predeterminados Concentracin de colesterol: 66.21mg/dL nivel muy por encima de los valores normales (130-220mg/ecdL) Concentracin de GTP: 18.08 U/L No se encuentra dentro de los valores normales.

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5 Estima el riesgo paterogentico en las dos muestras si la concentracin de HDLcolesterol es de 30mg/ecdL en ambos casos. Clculo del cociente de riesgo paterogentico: <4.5 Al sustituir los datos en la frmula se obtiene.

6 Por qu no hay una muestra patrn de GPT y s de glucosa y colesterol? Porque para calcular la actividad del GTP slo necesitamos conocer la velocidad de desaparicin del NADH en la reaccin, cuya concentracin conocemos.

7 Explica por qu tomamos solo una lectura en el caso de la glucosa y el colesterol y varias en el de la GPT. Por que en el caso del GPT estamos calculando una aceleracin a partir de un promedio.

8 Por qu es necesaria la presencia de lactato deshidrogenasa en la reaccin de determinacin de la concentracin de GPT? Por que es la lipasa que cataliza la transformacin del NADH en NAD+, y la aceleracin con que esto ocurra (lo que se mide) es proporcional a la actividad del GPT (lo que se quiere calcular).

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