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CULTIVO IN VITRO DE TEJIDOS VEGETALES

Mara Elena Daorden E.E.A. INTA SanPedro

CULTIVO IN VITRO DE TEJIDOS VEGETALES Conjunto de tcnicas que permiten el mantenimiento y/o crecimiento de clulas o tejidos en un medio nutritivo y en condiciones ambientales controladas.

Los tejidos vegetales pueden cultivarse in vitro

La clula retiene toda la informacin para regenerar una planta completa

Diferenciacin celular
La clula adquiere propiedades diferentes a las de la clula que la origin Desdiferenciacin
Clula diferenciada Clula diferenciada Clula desdiferenciada Retiene informacin

Totipotencialidad

CULTIVO IN VITRO DE TEJIDOS VEGETALES Conjunto de tcnicas que permiten el mantenimiento y/o crecimiento de clulas o tejidos en un medio nutritivo y en condiciones ambientales controladas.

Medio nutritivo
Las porciones del vegetal que se cultivan in vitro: explantos No son autotrficos

Necesidades nutricionales y hormonales de los cultivos de rganos y tejidos vegetales Agua Macro Micro Sustancias orgnicas Nutrientes Fe Zn Azcares N B Aminocidos P Mn Vitaminas K Cu Auxinas Ca Ni Citocininas Mg Co Giberelinas S Al Mo I

Medio nutritivo: Fitohormonas Auxinas


0.01 a 10 mg/l
Acido indol Actico (AIA) Acido Indol Butirico (IBA) Acido Naftaln Actico (ANA) 2-4 D

Citocininas
0.03 a 10 mg/l
Bencil adenina-(BA) Bencilaminopurina (BAP) 2ip Zeatina Tridiazuron

Se disuelven en NaOH 1N

Giberelinas

Se disuelven en HCl 1N En cultivo de meristemas y para elongacin: Acido Giberlico


(GA3)

Medio nutritivo

Auxinas Citocininas

Auxinas

Citocininas

Parte area

Enraizamiento

Modalidades de cultivo in vitro Cultivo de meristemas Cultivo de yemas

Cultivo in vitro de plantas superiores

Cultivo de anteras

Cultivo de embriones

Cultivo de protoplastos

Tipos de cultivo in vitro

Esquema modificado a partir de Lindsey y Jones, 1989, en Plant Biotechnology in Agriculture. p 59)

Multiplicacin en plantas Semillas


Reproduccin sexual Progenie con distinto genotipo

Vegetativa:

bulbos, esquejes, estacas, tubrculos

Reproduccin asexual Progenie con idntico genotipo Descendencia uniforme Se transmiten enfermedades

Produccin de plantas libres de enfermedades


Mtodos Tratamientos con calor: Cultivo de meristemas Ambos Microinjerto: Injerto de meristemas sobre un pie sano.

para algunos virus y micoplasmas

Cultivo de meristemas

Esquema modificado a partir de Lindsey y Jones, 1989, en Plant Biotechnology in Agriculture)

Obtencin de plantas de sanidad controlada (Cultivo de meristemas)


Por qu el meristema?

La concentracin del patgeno no es uniforme en la planta infectada


Meristema
Sistema vascular poco diferenciado Elevada actividad metablica Elevada concentracin de auxinas

Esquema para la obtencin de plantas de sanidad controlada


Extraccin del pice (0.2-0.5 mm) Cultivo del pice en un medio adecuado Planta regenerada Planta establecida en sustrato Planta saneada Cultivo libre de virus
Cuidadoso control de la humedad Rigurosas evaluaciones (plantas indicadoras, injertos, serologa etc)

Mantenimiento, multiplicacin, Monitoreo de reinfecciones virsicas

Cultivo de meristemas
Consideraciones generales
El proceso no ofrece total seguridad Importancia de las tcnicas de diagnstico Anlisis confiables Sistemas de deteccin sensibles Especificar de qu virus se ha liberado y la tcnica de diagnstico empleada

Produccin de plantas libres de enfermedades


Mtodos Tratamientos con calor: Cultivo de meristemas Ambos Microinjerto: Injerto de meristemas sobre un pie sano.
para algunos virus y micoplasmas

Microinjertos
Injertar pices caulinares en un portainjerto

Etapas: Germinacin in vitro de las semillas del portainjerto Preparacin de la plntula para ser injertada Extraccin del pice de la planta infectada Mantenimiento de la plntula injertada en cultivo Mantener la planta obtenida en invernadero Indexar las plantas obtenidas

Microinjertos

Plntula especialmente acondicionada

Dos a cuatro semanas

Ubicacin del pice en la plntula


Published as a special insert to Caliiformia Agriculture, Nov-Dec. 1982 Universtiy of California, Berkeley, California.94720

Microinjertos

http://www.ivia.es/germo/Foto1.jpg

Tipos de cultivo in vitro

Esquema modificado a partir de Lindsey y Jones, 1989, en Plant Biotechnology in Agriculture. p 59)

Influencia del material de partida: Planta madre Capacidad regenerativa


Genotipo Edad Estado del rgano o tejido Estado fisiolgico Estado sanitario Ao Condiciones de crecimiento Posicin del explanto Tamao del explanto Condiciones fisiolgicas
Segn Pierik, R.L.M. In vitro Culture of higher plants

Influencia del material de partida: Planta madre Capacidad regenerativa


Genotipo: Dicotiledneas mejor
que monocotiledneas, y entre ellas las Solanceas, crucferas muy fcil regeneracin

Edad: Partes juveniles mejor que las adultas Estado del rgano o tejido: Mejor no leosos Estado fisiolgico: Partes vegetativas
mejor que partes generativas

Influencia del material de partida: Planta madre

Capacidad regenerativa
Estado sanitario: Las ms saludables
y vigorosas

Ao: sobre todo si el material proviene


de campo (inviernos severos veranos secos)

Condiciones de crecimiento: diferente respuesta si crece en


campo que en invernadero

Influencia del material de partida: Planta madre

Capacidad regenerativa
Posicin del explanto: Hay un gradiente
de regeneracin en la planta

Tamao del explanto: En general a mayor


tamao mayor capacidad regenerativa

Preparacin de la planta madre


Recomendable que crezca en invernadero o cmara de crecimiento Usar material homogneo Elegir plantas vigorosas Promover nuevas brotaciones: podas En maceta con sustrato estril Programa sanitario Controles y manipulacin de intensidad de luz, fotoperodo y temperatura Aplicacin de fitoreguladores

Preparacin de la planta madre

Prevenir insectos de cualquier tipo Prevenir hongos y bacterias Regar slo en la maceta (evitar riegos por encima) Mantener baja la humedad

Obtencin de explanto y desinfeccin


En invernadero
Elementos limpios en la coleccin Ubicarlos en bolsas identificadas En conservadoras

Obtencin de explanto y desinfeccin


En laboratorio
Agua corriente Se retiran hojas Soluciones desinfectantes (etanol-hipoclorito de sodio) Enjuagues con agua estril en cabina de flujo laminar Antibiticos y/o fungicidas

Contaminaciones

Micropropagacin

Segmentos uninodales

Fuente: http://www.etsea2.udl.es

Fuente: http://www.etsea2.udl.es

Micropropagacin

Tipos de micropropagacin

Esquema modificado a partir de Lindsey y Jones, 1989, en Plant Biotechnology in Agriculture. p 59)

Tipos de micropropagacin

Esquema modificado a partir de Lindsey y Jones, 1989, en Plant Biotechnology in Agriculture.)

Tipos de micropropagacin

Esquema modificado a partir de Lindsey y Jones, 1989, en Plant Biotechnology in Agriculture.)

Micropropagacin:
Etapa I

Etapas (Murashige)

Seleccin y desinfeccin de explantos Cultivo en medio nutritivo

Etapa II
Multiplicacin a travs de subcultivos

Etapa III
Enraizamiento

Micropropagacin
Transplante y aclimatacin

Planta entera Microtnel

Fuente: http://www.etsea2.udl.es

Micropropagacin
Transplante y aclimatacin

Invernadero

Fuente: http://www.etsea2.udl.es

Tnel de aclimatacin

Plntulas en aclimatacin

Plntulas aclimatadas

Tipos de cultivo in vitro

Esquema modificado a partir de Lindsey y Jones, 1989, en Plant biotechnology in agriculture. p 59)

Morfognesis directa
Regeneracin en hojas de Violeta africana

Fuente: http://www.unizar.es

Tipos de cultivo in vitro

Esquema modificado a partir de Lindsey y Jones, 1989, en Plant biotechnology in agriculture. p 59)

Fuente: Books Cole, a division of Thomson Learning. Inc

Morfognesis indirecta
Masas de callos indiferenciados

Regeneracin a partir de callos

Cultivo de Anteras
En qu consiste?
Polen inmaduro en medios adecuados para la formacin de embriones o callos

Cultivo de Anteras
Aplicaciones en fitomejoramiento
Cruzamiento A X B Plantas F1
Fuente: Cultivo de tejidos en la Agricultura. CIAT 1991

Cultivo de anteras

Lneas haploides Seleccin


Fuente:

Cultivo de embriones cigticos


Para qu se usa?
Superar dormicin Inhibidores en el endosperma Estudios fisiolgicos y nutricionales Acortar el ciclo en mejora Rescatar hbridos de cruzamientos

Recuperacin de hbridos
Barreras a los cruzamientos interespecficos Precigticas: el grano de polen no germina o no atraviesa el estilo. Postcigticas: relacionadas con el desarrollo del embrin

Cultivo in vitro de embriones

Cultivo de embriones cigticos


Mejoramiento Cruzamientos interespecficos Incompatibilidades Embriones abortivos Embriones cultivados in vitro

Cultivo de embriones cigticos


En el gnero Prunus
Duraznero X Almendro Portainjertos resistentes a nematodes Mariana 2624 Resistencia a Ring spot virus Cultivar Colt (Cerezo)

P. cerasifera X P. munsoniana

P. avium X P. seudocerasus

En la EEA San Pedro


En la EEA San Pedro
Duraznero x Duraznero

rboles polinizados

Cruzamientos: Metodologa
Parental Maculino

Recoleccin de flores en estado globoso

Extraccin y tamizado del polen

Parental femenino Ramas con flores emasculadas

Polinizacin
Ubicacin del polen

Embolsado de ramas

Frutos cuajados

Desembolsado de ramas a los 40 das de la polinizacin

En laboratorio
Acondicionamiento del fruto y extraccin de semilla

Siembra de embriones en condiciones aspticas

Germinacin in vitro

Embrin germinado in vitro

Alternativas

In vitro

A sustrato

Hbridos ambientados

Hbridos injertados sobre portainjertos francos

Hbridos en campo

Hbridos en campo Hbridos a campo

Gracias por su atencin!


www.inta.gov.ar/sanpedro Dra. Mara Elena Daorden daorden@correo.inta.gov.ar