UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE QUIMICA FARMACEUTICA BIOLOGICA LABORATORIO DE BIOLOGA MOLECULAR APLICADA PRACTICA No.

1 EXTRACCIN DE ADN EN MUESTRAS SANGUNEAS

Material 1. Material necesario para extraccin de sangre 2. Tubos de centrfuga de 15 ml, de polipropileno, fondo cnico, estriles 3. Pipetas graduadas de 5 y 10 ml 4. Tubos Eppendoff de 1.5 ml Reactivos 1. Solucin amortiguadora de lisis I (sacarosa 0.3 M, Tris-HCl. 0.010 M, MgCl2 0.005 M 6H2O, tritn X-100 pH 7.5) 2. Solucin amortiguadora de lisis II (NaCl 0.075 M, EDTA 0.024 M) 3. SDS al 10 % 4. Perclorato de sodio 5 M 5. NaCl 6 M 6. Isopropanol absoluto 7. Etanol al 70 % 8. Solucin amortiguadora TE (Tris-HCl pH 8.0 10 mM, EDTA pH 8.0 1 mM) Equipo 1. Centrfuga refrigerada con velocidad hasta 14,000 rpm y cabezales mltiples. 2. Rotor 3. Bao de agua con control de temperatura 4. Pipetas automticas de 0 a 20 l, 20-200 l, 200 a 1000 l Procedimiento 1. Recolectar 5 ml de sangre perifrica en tubos con E.D.T.A. 2. En tubos de centrfuga de polipropileno, estriles, con capacidad de 15 ml y fondo cnico, colocar 3 ml de sangre y adicionar 11 ml de la solucin amortiguadora de lisis I a 4 C (reactivo 1). Mezclar perfectamente por inversin, sin agitar, y proceder a centrifugar a 4,500 rpm a 4 C durante 10 minutos. 3. Decantar cuidadosa y rpidamente el sobrenadante a otro tubo, sin levantar el botn formado que es el necesario para la extraccin del ADN, tratando de eliminar bien el sobrenadante. 4. Resuspender el botn obtenido con 2.25 ml de solucin amortiguadora de lisis II (reactivo 2), 62.5 l de SDS al 10 % (reactivo 3) y 550 l de perclorato de sodio 5 M (reactivo 4). Agitar durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitacin mecnica. 5. Adicionar a cada tubo 1 ml de NaCl 6 M (reactivo 5); agitar muy fuerte con la mano durante 15 segundos y centrifugar a 3,500 rpm por 30 minutos a 4 C. 6. Recuperar el sobrenadante en otro tubo de centrfuga de 15 ml estril, adicionar 3.5 ml de isopropanol absoluto a 4C, tapar los tubos y mezclar suavemente en posicin horizontal hasta la formacin de las hebras de ADN 7. Desechar poco a poco el lquido sobrenadante hasta un volumen de aproximadamente 1 ml, cuidando de no tocar las hebras de ADN. 8. Posteriormente pasar el ADN obtenido junto con el lquido restante a un tubo Eppendoff estril de 1.5 ml, agregar etanol al 70 % hasta llenar el tubo, mezclar y centrifugarlo a 10,000 rpm durante 5 minutos. 9. Eliminar el sobrenadante y lavar el ADN obtenido 2 veces con etanol al 70 %, teniendo precaucin en el lavado y eliminando completamente el etanol despus del ltimo lavado. 10. Finalmente resuspender el ADN con 150 l de solucin amortiguadora TE, incubndolo a 37 C por una hora. 11. La solucin de ADN obtenida se conserva a 4C. Preguntas: 1. Qu utilidad tiene hacer una extraccin de ADN? 2. Al realizar esta prctica de cul de los componentes sanguneos se obtiene el ADN? cmo se separan? 3. Cul es la funcin del NaCl durante la extraccin? 4. Cul es la funcin del isopropanol durante la extraccin? 5. Describe un mtodo para extraccin de ADN distinto al utilizado en esta prctica

M.C. Clara Elena Yerena Aguilar