Prof.

Siham Salmen Halabi Idic-ULA Curso de Pre-grado 2010

Ontogenia de linfocitos
Linfocitos son las nicas

clulas del cuerpo con una alta diversidad de receptores, capaces de reconocer a una amplia variedad de antgenos Diversidad generada durante el desarrollo Responder frente a los agentes extraos, con alta especificidad (respetando la integridad de los tejidos propios) y preservando la tolerancia

La inmunidad efectiva requiere de un balance entre la defensa contra los Ag extraos y la no respuesta contra los antgenos propios
Preguntas a responder: A partir de que clula se generan los diferentes linajes? Donde maduran las clulas linfoides? Que factores median este proceso? Cuales son las decisiones que deben tomar los linfocitos? Que factores condicionan la decisin hacia los diferentes linajes?

Ontogenia de linfocitos
Cul es la razn de la existencia de finos

mecanismos de regulacin del desarrollo de los linfocitos?

Asegurarse de contar con el repertorio de clulas

capaces de reconocer a todos los Ag extraos presentes en la naturaleza Asegurarse que el sistema inmune reconozca como propio a los Ag del individuo (TOLERANCIA) Asegurarse que los linfocitos migren hacia la periferia con las herramientas bsicas para enfrentarse a los Ag extraos

Ontogenia de linfocitos
Cul es la razn de la existencia de mecanismos finos de regulacin del desarrollo de los linfocitos?
Asegurarse que el receptor antignico (BCR, TCR)

sean tiles (seleccin positiva) y los receptores potencialmente peligrosos y autorreactivos sean eliminados (seleccin negativa) Asegurarse que los linfocitos puedan comunicarse con las clulas accesorias (aquellos que no lo hacen sufren muerte por negligencia)

Ontogenias de linfocitos
Elementos que participan
Clula progenitora pluripotencial Mediadores solubles Interaccin entre las clulas linfoides

con elementos del microambiente

Elementos del sistema inmune

Microambiente dado por los rganos linfoides primarios y secundarios
MHC-I y MHC-II
Molculas del complejo mayor de

histocompatibilidad de clase I y II

Receptor de linfocitos T (TCR) Receptor de linfocitos B (BCR)

Mediadores solubles (Ej. Interleukinas)

rganos del sistema inmune

rganos primarios Timo Mdula sea Epitelio intestinal rganos secundarios Ganglios y amgdalas Bazo MALT
Elementos de l a respuesta inmune: Inmunidad innata: Celulas mieloides (Celulas dendriticas, Monocitos/macrofagos , PMN, mastocitos) Celulas linfoides (celulas dendriticas plasmocitoides, NK, linfocitos Tgd) Inmunidad adaptativa Linfocitos T y B

Bradley et al Curr Opin Immunol 2003; 15:343

Ontogenia de linfocitos
Clulas hematopoyticas (HSC):
Se alojan en la mdula sea Fenotipicamente son

reconocidas por expresar CD34 Actividad de la telomerasa y autorenovacin Precursor

temprano con potencialidad para desarrollar clulas del linaje linfoide y mieloide (EPLM)

Krause Oncogene 2002; 21:3262; Kiel et al NRI 2008

Ontogenia: ORIGEN DE LAS HSCs

Mdula sea
Nicho: combinacin de HCS y

clulas del estroma, median seales extrnsecas que mantienen a las HCS.
Sitios de contacto cel-cel, cel-ECM,

concentracin variable de citokinas y factores de crecimiento Endostio Formado por osteoblastos y osteoclasto ECM: colgeno, elastina (estructurales); fibronectina y laminina, proteoglicanos (especializadas)

Suda R Trends Immunol 2005; 26:426;

Ontogenia:
ORIGEN DE LAS HSCs
Arresto en el ciclo celular y adhesin a los osteblastos
Inicio de la diferenciacin requiere de activacin de c-Myc, prdida de la expresin de N-caderina e integrinas
Divisin celular asimtrica

Caractersticas de las HSCs en reposo 1. Proteccin contra el estrs a) Regulacin de radicales libre, actividad de aldehdo deshidrogenasa 2. Adhesin a los nichos a) Bajo requerimiento de factores de crecimiento, inhibicin de la apoptosis, enlentecimiento del ciclo celular y unin por N-cadherin a osteoblastos 3. Hipoxia en los nichos

Suda R Trends Immunol 2005; 26:426; Congdon Current Opinion in Immunology 2008, 20:302307

Ontogenia: ORIGEN DE LAS HSCs

Stem cell: Divisin

celular asimtrica, simtrica autorenovacin y simtrica comisionada

Preservacin de la

autorenovacin Mecanismo propuesto en linfocitos maduros para generar clulas hijas efectoras y de memoria

Mathias el al Nat Rev Immunol 2005;5:497; Pelayo et al Curr Opin Immunol 2005; 17:100

Ontogenia de linfocitos
Primer paso:
Progenitor multipotencial origena el linaje linfoide y mieloide En ciertos estadios de maduracin puede revertirse el desarrollo de un linaje celular

CLP: precursor linfoide comn CMP: precursor mieloide comn

Comienza a expresar Rag (recombinasas)

Mathias el al Nat Rev Immunol 2005;5:497

Que elementos contribuyen con la decisin: Linaje mieloide vrs linfoide o Lin T vrs B

Factores de transcripcin involucrados en el desarrollo

Ontogenia: SERIE LINFOIDE

Los linfocitos T, B y NK se originan de un precursor
El primer evento es ubicarse en estadio

precursor linfoide comn (CLP), dar origen a: T, B, NK y clulas dendrticas de origen linfoide (plasmocitoides) Destinados a originar clulas B permanecen en la MO Destinados a madurar como clulas T egresan de la MO y se ubican en el timo IL-7 indispensable para el desarrollo de linfocitos T y B Mientras IL-15 es requerida para el desarrollo de NK

NK

Ontogenia de los linfocitos

El desarrollo de los linfocitos depende de tres procesos bsicos: Migracin y proliferacin Diferenciacin: adquisicin de fenotipos

maduros Seleccin del repertorio: clulas especficas a los antgenos (Ag) extraos y restringidas por las molculas de histocompatibilidad (MHC) propias

Abul Abbas Mol Immunol 2002

Uno de los objetivos fundamentales de la ontogenia:

Generacin del receptor antignico funcional en linfocitos B (BCR) Y T (TCR)

BCR

TCR

Ontogenia de los linfocitos T

TCR: cadenas a y b (g y d) asociados con CD3 (g,d,e, y zz) Molculas que permiten la comunicacin intracelular
CD4 o CD8
www.sanidadanimal.info/cursos/inmun_it/segun2.htm

Ontogenia de linfocitos T
Durante la ontogenia de linfocitos T se toman las siguientes decisiones:
Comisionar hacia el linaje linfoide y decidir

hacia linfocito T o B Reordenamiento del TCR Escoger entre TCRgd o TCRab Seleccin positiva y negativa Escoger entre CD4 o CD8

Microambiente tmico
Clulas epiteliales corticales

Corteza

Clulas epiteliales medulares y clulas dendrticas

Regin crticomedular

Mdula
Nat Rev Immunol

Boroski et al Curr Opin Immunol 2002; 14:200; Coste Immunol letters 2006; 102:1

Ontogenia: SERIE LINFOIDE

Que camino tomar?

Ligando de Notch est presente en las clulas epiteliales corticales tmicas

Ontogenia de Linfocitos T
Decisin Tgd vrs Tab
Clulas Tgd Comienzan a desarrollarse primero que los precursores de linfocitos T ab Sin embargo, predomina desarrollo de Tab Su desarrollo en el timo es inhibido por la expresin del pre-TCR Emigran del timo, para ubicarse en las barreras epiteliales, donde culminan su desarrollo

Ontogenia de Linfocitos T
Timocito temprano: Pro-T:
Reordenamiento de la Cadena b del TCR (receptor del linfocito T) Doble negativo (DN=CD4/CD8-)
1 2 3 4 5 6 n

b/Tdt/Rag1 y2

Mediado por Recombinasas 1 y 2 (Rag1 y 2)

1 2

1 2 3 4 n

1er alelo
Regin constante

Familia de genes de la regin variable, diversidad y unin

Reordenamiento de los genes que codifican para la cadena b

Dos alelos: el reordenamiento exitoso de uno de ellos inhibe el reordenamiento del otro: EXCLUSIN ALLICA

Rag1 y Rag2

Bergman et al Curr Opin Immunol 2003; 15:176; Schissel Nat Rev Immunol 2003; 3:890

Ontogenia: REORDENAMIENTO DEL TCR Y

BCR
Modificaciones de las histonas Acetilacin: accesibilidad a la cromatina Demetilacin del ADN
Un solo alelo Exclusin allica

Ontogenia de Linfocitos T
Pre-T: expresin de la cadena b y formacin
de pre-TCR
La expresin del pre-TCR determina (cadena b + pTa): reordenamiento de la cadena a del TCR (receptor del linfocito T) Doble negativos (DN= CD4-/CD8-)
1 2 3 4 5 6 n

1 2 3 4 n

1er alelo
Regin constante

Regin variable, diversidad y unin

Ontogenia: LINFOCITOS T
preTCR:
Es expresado seguido al reordenamiento exitoso de TCRb. Media seales debido a su localizacin constitutiva en microdominios de membrana ( rafts lipdicos):
Fosforilacin y degradacin de recombinasas (RAG1 y 2), asegura que no ocurra mas reordenamiento de b (exclusin allica) Favorece reordenamiento de la cadena a

Proliferacin y da paso a timocitos Doble Positivos (co-expresin de CD4 y CD8)

Ontogenia de linfocitos
Mecanismos involucrados en la generacin de la diversidad
Diversidad en las posibilidades de combinacin Familias de genes V, D y J Combinaciones entre las cadenas b y a (en el caso de linfocitos T) o pesadas y livianas (en el caso de linfocitos B) Mediado por las Recombinasas (Rag1 y Rag2) Diversidad en los sitios de unin de los genes

mediado por la enzima deoxiribonucleotil transferasa terminal o TdT

Ontogenia de Linfocitos T
Timocito doble positivo (DP):
CD4
TCR/CD3 TCRab

Expresan TCR y adems CD4 y CD8 (Doble Positivas) en la superficie: da paso a los mecanismos de seleccin positiva y negativa y se define el fenotipo

CD8

Ontogenia de Linfocitos T
Control de calidad:
Capaz de interactuar con MHC propia (base de toda respuesta inmune) y de esta manera reconoce los antgenos presentados
Ag
MHC

Klein et al. Curr OGray D Curr Opin Immunol 2005; 17:137 pin Immunol 2000; 12:179, Peter NRI 2007; , Klein NRI 2009, 9:833

Ontogenia de linfocitos T:
CLULAS DEL ESTROMA TMICO
Las DC expresan

bajos niveles de AIRE y adems tienen la capacidad transportar Ag propios directamente desde la periferia

Funciones asociadas a las ETC

Tienen la capacidad de expresar diversas protenas de los tejidos perifricos por va endgena presentarlos a los timocitos y transferirlas a las DCs. Mediado por AIRE (autoimmune regulator) que es un activador transcripcional expresado en TEC

Desarrollo de las clulas DN a DP La seleccin positiva regulada por las cEpcs Macroautofagia Luego migran hacia la regin crticomedular y la mdula, maduran a SP La tolerancia central, es mediada principalmente por las mETC y clulas dendrticas tmicas residentes del timo

Ontogenia de Linfocitos T: Seleccin positiva y negativa

Muerte o anergia

Ontogenia: MECANISMOS DE SELECCIN

Mecanismos involucrados en la anergia
Reciclaje acelerado

del TCR, por ubiquitinacin mediado por la fosforilacin constitutiva de Cbl (ligasa de ubiquitina) Proceso reversible

Linfocito T maduro:
MHC-II
TCR/CD3

Ontogenia de Linfocitos T
MCH-I
TCR/CD3

CD4
TCRab

CD8

Ontogenia de linfocitos T
Seleccin positiva (rescate de la apoptosis):
TCR tenga baja afinidad por los Ag propios Clulas epiteliales tmicas

Seleccin negativa:
TCR con alta afinidad por el Ag propio o incapaz de

interactuar con MHC (I y II) Corteza profunda, unin crtico-medular y mdula Clulas interdigitantes

Pica et al Curr Opin Immunol 2005; 17:131

Ontogenia de linfocitos: DESARROLLO

DE CLULAS T REGULADORAS
Seleccin positiva por agonista

Resumen

Ontogenia de los linfocitos B CD20

CD19 BCR: Inmunoglobulina (IgM e IgD) + cadenas a y b (comunicacin intracelular)

www.sanidadanimal.info/cursos/inmun_it/segun2.htm

Ontogenia de linfocitos B
Su desarrollo se inicia en el hgado fetal 8va-9na semana y luego contina en la mdula sea
El repertorio de clulas se genera por recombinaciones de segmentos de los genes del receptor de linfocito B (BCR)

Estn sujetos a mecanismos de seleccin positiva y negativa

Ontogenia: LINFOCITOS B

Ontogenia de Linfocitos B
pro-B:
Reordenamiento gentico de la cadena pesada de las inmunoglobulinas : cadena m

IL-7R
Bisagra

IL-3R

Reordenamiento de los genes que codifican para las inmunoglobulinas

Dos alelos: el reordenamiento exitoso de uno de ellos inhibe el reordenamiento del otro: EXCLUSIN ALLICA

Ontogenia de Linfocitos B
pre-B:
-Expresin de la cadena pesada de la Ig (m), en el citoplasma y membrana (pre-BCR) asociado con las cadenas sustitutivas (SL) (VpreB y l5)
m CD79 a/b Las seales del preBCR median la exclusin allica del locus de la cadena pesada -Reordenamiento gentico de las cadenas livianas Ig

Linfocito B inmaduro:

Igm

Linfocito B IgM/IgD maduro:

Ontogenia de Linfocitos B

Niiro et al Nat Rev immunol 2002; 2:945, Hardy Immunity 26, June 2007, von boehmer Nat immunol 2010;

Ontogenia: LINFOCITO B
Emigran de la MO (ya evaluadas?: seleccin

positiva)
Estados: T1: no expresa o tiene bajos niveles de IgD, CD21 y CD23

Fase donde ocurre la seleccin negativa y la gran mayora muere (autoreactivas) o re-editan BCR Altos niveles de Fas y ausencia de Bcl2 Activacin del BCR=apoptosis

T2: entran y sobreviven en el bazo y expresan IgM/IgD, CD21, CD23 T3: CD23+ , bajos niveles de IgM
T2 se hace mas resistente a la apoptosis

Ontogenia:
LINFOCITOS, mecanismos de seleccin
Seleccin positiva Seleccin negativa: Muerte Anergia Re-edicin del BCR Escape de la seleccin negativa por cambio de la especificidad antignica
tambin se ha demostrado en T

No es exclusivo de B,

Hardy et al Annu Rev immunol 2001; 19:595; Su et al Curr Opin Immunol 2000; 12:191

Ontogenia de linfocitos B: Subpoblaciones en la periferia

B-1:
CD5+ Ubicadas preferencialmente

en cavidad peritoneal Potencialmente autorreactivas No son eliminadas por antgenos propios

B-2
Predominan en la periferia CD5-

Resumen

Que eventos regulan la migracin y alojamiento dentro de un tejido o de un tejido a otro?

Recirculacin y alojamiento de los leucocitos: De qu depende?

Qu determina esta

distribucin y trfico diferencial?

Expresin y activacin diferencial

de receptores de quimiocinas y de integrinas

Interacciones entre las clulas

endoteliales, la matriz extracelular, quemokinas y las molculas de adhesin

Migracin de leucocitos:
ELEMENTOS QUE PARTICIPAN
Quemokinas y sus receptores Interleukinas con capacidad quimiotctica Integrinas Cadherinas Selectinas ICAM

Una vez maduras las clulas migran a travs de las vnulas endoteliales altas hacia los rganos linfoides secundarios

Von Adrian et al N Engl J Med 2000; 343:1020

Recirculacin de linfocitos
Quemokinas

Selectinas

Integrinas/ICAM

Bradley et al Curr Opin Immunol 2003; 15:343

Migracin celular:
QUEMOKINAS

CXCR5: expresado sobre Th, permitir interaccin con clulas B

Durante la activacin inicial los linfocitos pierden el receptor CCR7 y adquieren otros, lo que le permite salir hacia los tejidos inflamados

CCR7: Expresado sobre los linfocitos T naive y DC maduras

rganos secundarios
Funcin:
Facilitan el trabajo de los linfocitos Sitios de encuentro entre clulas presentadoras de

antgeno (APC) y linfocitos

Proveen el microambiente adecuado para la expansin

de linfocitos T
Optimizan la activacin de linfocitos B naive

rganos secundarios: ndulos linfticos, sitio de activacin de la respuesta inmune

Seno subcapsular Cpsula Manto Centro germinal Vaso aferente

Folculo primario
Paracorteza

Reticulina Mdula Vlvula Vaso eferente

rganos secundarios: Folculo

secundario
Zona externa Cel. T

Centro germinal
Apical

Manto folicular Red de C. Dendrticas foliculares

Zona clara

Centrocitos

Basal

Zona obscura

Centroblastos

Pocas C. Dendrticas foliculares

rganos secundarios: Folculo

secundario
Centroblastos, completan

su ciclo de replicacion 612 horas Son altamenten susceptibles a la apoptosis

de Villartay et al Nat Rev Immunol 2003; 3:962,

Ontogenia: CSR e hipermutaciones

somticas
Cambio de isotipo (CSR)
Cambio de la regin constante

conservando la misma especificidad antignica

Hipermutaciones somticas:
Introduce mutaciones en la

regin variable, seguido de seleccin positiva o negativa

Ambos activados por la

interaccin entre BCR/CD40 en los centros germinales

rganos secundarios: ndulos linfticos

Cordones paracorticales:
Unin cortico-medular Cordones paracorticales Corredores SC Sinusoides

Red de fibroblastos

Corteza

Mdula

CPV

HEV
CRF

Todo el proceso de ontogenia permite a los linfocitos estar preparados para reconocer de manera especfica a los antgenos extraos

Problema

La protena BTK (una tirosin kinasa de los

linfocitos B), involucrada en la ontogenia de los linfocitos B, media la transicin de clulas proB a pre-B y participa en la activacin de los linfocitos B maduros. Ciertas mutaciones en el gen que codifica para esta protena conducen a fallas en su expresin originando un sndrome conocido como Agammglobulinemia ligada al cromosoma X o Sndrome de Bruton.

Interrogantes
a)

Cual elemento del sistema inmunolgico se encuentra alterado en estos pacientes? Explique la ontogenia de los linfocitos B Si se realiza post-mortem una biopsia de los ndulos linfticos, Que modificaciones en el microambiente esperara encontrar? Uno de los productos finales de la activacin de los linfocitos B es la secrecin de anticuerpos (inmunoglobulinas). qu niveles de inmunoglobulinas esperara encontrar en el suero del paciente?

b) c)

d)

Problema 2

La falta de expresin de la molcula de histocompatibilidad de clase II (MHC-II) en la superficie de las clulas presentadoras de antgeno profesionales, es debida mutaciones en los factores de trascripcin responsables de

activar la trascripcin del gen que codifica para MHC-II (RFX5, CIITA). Este trastorno molecular conduce a un cuadro de inmunodeficiencia severa causado por alteracin en el desarrollo de los linfocitos T.

Interrogantes
a) Explique cual es el papel de la presentacin de antgenos en el contexto de MHC- II y MHC- I a nivel de los rganos linfoides primarios. b) Explique como se genera el proceso de seleccin positiva y negativa durante la ontogenia de los linfocitos y cual es el papel de las molculas de histocompatibilidad en este proceso. c) Que consecuencia tiene sobre la tolerancia a los tejidos propios la alteracin de los mecanismos de seleccin positiva o negativa?