I.

INTRODUCCION

Las protenas son filamentos largos de aminocidos unidos en una secuencia especfica. Son creadas por los ribosomas que "leen" codones de los genes y ensamblan la combinacin requerida de aminocidos por la instruccin gentica. Las protenas recin creadas experimentan una modificacin en la que se agregan tomos o molculas adicionales, como el cobre, zinc y hierro. Una vez que finaliza este proceso, la protena comienza a plegarse sin alterar su secuencia (espontneamente, y a veces con asistencia de enzimas) de forma tal que los residuos hidrfobos de la protena quedan encerrados dentro de su estructura y los elementos hidrfilos quedan expuestos al exterior. La forma final de la protena determina su manera de interaccionar con el entorno. Si en una disolucin de protenas se producen cambios de pH, alteraciones en la concentracin, agitacin molecular o variaciones bruscas de temperatura, la solubilidad de las protenas puede verse reducida hasta el punto de producirse su precipitacin. Esto se debe a que los enlaces que mantienen la conformacin globular se rompen y la protena adopta la conformacin filamentosa. De este modo, la capa de molculas de agua no recubre completamente a las molculas proteicas, las cuales tienden a unirse entre s dando lugar a grandes partculas que precipitan. Las protenas que se hallan en ese estado no pueden llevar a cabo la actividad para la que fueron diseadas, en resumen, no son funcionales.

II. OBJETIVOS 2.1.Objetivos generales Hacer prcticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la obtencin y reconocimiento de protenas a partir de muestras naturales. 2.2.Objetivos especficos Evaluar mediante pruebas fsicas y qumicas la presencia de protenas en las diferentes muestras. Emplear tcnicas de reconocimiento de protenas. III. MARCO TEORICO 3.1.PROTEINAS Las protenas estn constituidas por largas cadenas polipeptdicas, en donde los aminocidos estn ubicados en una secuencia determinada y esto corresponde a una estructura primaria de una protena. La estructura secundaria se refiere a la extensin en que un polipptido o cadena posee una estructura helicoidal. Una espiral diestra o -hlice se estabiliza mediante la presencia de enlaces hidrgeno entre los grupos carbonilo e unido de los enlaces peptdicos. La estructura terciaria se refiere al modo como la cadena polipeptdica se curva para formar la estructura estrechamente plegada y compacta de las protenas globulares, la estabilizacin de esta estructura se atribuye a las diferentes reactividades asociadas a los grupos R de los residuos aminoacdicos tales como: interacciones electrostticas enlaces hidrgenos, interacciones hidrofbicas, unin dislfuro. La estructura cuaternaria pone de manifiesto cmo se disponen en el espacio las cadenas, por ejemplo: la enzima fosforilasa contiene dos subunidades idnticas que por separado son catalticamente inactivas, pero cuando se unen para formar un dmero, constituyen la enzima activa.

3.2.PROPIEDADES DE LAS PROTEINAS Las propiedades biolgicas de una protena, as como parte de sus propiedades fsicoqumicas, dependen de su estructura. Cuando estas estructuras se alteran o se destruyen, aunque no haya ruptura de las cadenas polipeptdicas, la protena pierde sus caractersticas funcionales y se alteran sus propiedades fsico-qumicas; este proceso se denomina desnaturalizacin. El trmino desnaturalizacin tiene una variedad de significados, segn: la protena sea o no oligomrica, la prdida de la conformacin sea parcial o completa y la actividad biolgica

se pierda o no. En algunos casos el proceso es irreversible, en otros, se puede restaurar la conformacin nativa y la actividad biolgica. Los agentes desnaturalizantes actan esencialmente destruyendo los enlaces puente hidrgeno y las uniones dislfuro, lo que altera la estructura secundaria y terciaria de las protenas. Los agentes desnaturalizantes ms comunes son cidos fuertes, bases fuertes, calor y agitacin mecnica. El aspecto ms visible en la desnaturalizacin es el descenso de la solubilidad proteica. Por tales causas, los manejos de protenas se hacen a temperatura reducida para evitar la desnaturalizacin trmica, se emplean tampones para mantener el carcter poliinico natural de la protena y se evita el trauma fsico como la agitacin o se mantiene al mnimo. Las investigaciones que tratan del aislamiento, purificacin, y anlisis de las protenas, son verdaderamente representativas del arte del anlisis bioqumico.

3.3.ACCIONES PARA DESNATURALIZAR LAS PROTENAS a) precipitacin por solventes orgnicos La adicin de solventes orgnicos neutros miscibles con el agua, tales como metanol, etanol o acetona, disminuye la solubilidad en agua de la mayor parte de las protenas globulares de tal manera que precipitan de la solucin. La solubilidad de una protena a un pH y fuerza inica determinados est en funcin de la constante dielctrica del medio. La precipitacin proteica por los solventes no solo se explica en base a la constante dielctrica, tambin, hay que considerar la deshidratacin de las protenas. Las molculas del solvente no acuoso forman hidratos compitiendo por el agua con las molculas proteicas producindose la precipitacin por deshidratacin de las protenas. Los solventes pueden llegar a distorsionar la estructura de las protenas, posiblemente por accin a nivel de los enlaces hidrofbicos, determinando la desnaturalizacin de las protenas. Este fenmeno disminuye a bajas temperaturas ya que el calor por s mismo es un agente desnaturalizante. b) precipitacin de protenas por formacin de sales insoluble

Las protenas precipitan por la accin de ciertos cidos como el cido Tricloroactico, cido tnqstico, cido molbdico y otros; tambin las protenas pueden precipitar por la accin de ciertos iones metales pesados como Hg, Zn, Cd, Cu, y Pb. Todos estos agentes hacen precipitar las protenas por que forman con ellas sales insolubles.

El mecanismo de accin de estos agentes es la siguiente: los precipitantes cidos forman sales insolubles con las formas catinicas (+) de la protena, siendo necesario efectuar el proceso de un pH ms cido que el punto isoelctrico. A su vez los metales pesados forman sales insolubles con las formas aninicas (-) de la protena necesitndose entonces un pH ms alcalino que el punto isoelctrico. c) Efecto de la temperatura. Dentro de un intervalo de temperatura entre 0C y 40C aumenta la solubilidad de las protenas con el aumento de temperatura. Por sobre 40C a 50C la mayor parte de las protenas son cada vez ms inestables y comienzan a desnaturalizarse, por lo comn con prdida de solubilidad. La desnaturalizacin puede conducir a la coagulacin de la protena, es decir, a su agregacin y precipitacin irreversible. La coagulacin es un criterio para reconocer la desnaturalizacin de una protena. La formacin de un coagulo blanco, insoluble, cuando se hierve la clara de huevo es un ejemplo comn de desnaturalizacin trmica. Los fraccionamientos de protenas por lo general se realizan a 0C, ya que la mayor parte de las protenas son estables a bajas temperaturas. d) Precipitacin o separacin por punto isoelctrico

Las molculas proteicas son polivalentes, es decir, llevan varias cargas en forma simultnea. Aparte de los grupos carboxilo (COO-) y amino terminales (NH3), la molcula proteica puede tener otras cargas positivas provenientes de aminocidos diaminados. Otras cargas negativas pueden provenir de aminocidos dicarboxlicos, aminocidos con grupos SH y aminocidos de carcter fenlico. Se denomina carga neta de la protena a la diferencia absoluta entre el nmero de cargas positivas y el nmero de cargas negativas. Una misma molcula proteica puede presentar cualquiera de los tres estados electroestticos (positivo, neutro, negativo) dependiendo del pH del medio en el cual se encuentra disuelta. Si el nmero de cargas positivas es mayor que el nmero de cargas negativas, la protena estar cargada positivamente y viceversa. Si el nmero de cargas positivas es igual al de las cargas negativas, entonces la protena ser elctricamente neutra. El punto isoelctrico, queda definido como aquel valor de pH al que la molcula proteica no posee carga elctrica neta ya que hay igualdad de cargas positivas y negativas y es incapaz de desplazarse en un campo elctrico. Cada protena y aminocido tiene un punto isoelctrico (pH) caracterstico que depende del nmero de grupos ionizables y de sus constantes de disociacin.

La menor solubilidad en el pH igual al punto isoelctrico, se debe a que como la molcula no tiene carga elctrica neta, no existen repulsiones electroestticas entre molculas de protenas vecinas, lo cual conduce a la formacin de agregados insolubles. Puesto que las diferentes protenas poseen valores de pH, tambin diferentes, con frecuencia pueden separarse, unas de otra, mediante precipitacin isoelctrica. La menor solubilidad de una protena en su punto isoelctrico puede ser utilizada como un mtodo conveniente para determinar este punto. e) Electroforesis

Es un trmino que se refiere al movimiento de partculas cargadas (iones) en un campo elctrico. Es uno de los mtodos ms efectivos de separacin y caracterizacin. Los requerimientos bsicos son: 1. Que los componentes de la mezcla tengan forma inica o puedan ser convertidos en iones. 2. Que cada componente tenga una carga neta distinta. La electroforesis ha sido muy valiosa en el aislamiento y separacin de protenas esto se debe a que los mtodos electroforticos se pueden realizar en condiciones muy suaves protegiendo a las protenas de cualquier modificacin estructural severa. En la actualidad han adquirido gran desarrollo las tcnicas electroforticas de zona en que las protenas se mueven a travs de un soporte uniforme del tipo de un gel, almidn, etc. f) propiedad tampn de las protenas El carcter de cido dbil de las protenas en presencia de sus bases conjugadas les permite funcionar como soluciones tampones, es decir, que pueden agregarse cantidades relativamente grandes de cido o de lcalis sin que vare apreciablemente el pH. Esta propiedad es de gran importancia en los sistemas biolgicos, donde se ha visto que las protenas constituyen el principal sistema tampn. Por ejemplo, aproximadamente el 80% del poder amortiguador de la sangre de los mamferos se debe a las protenas.

g) Reacciones para el reconocimiento de protenas Las reacciones de coloracin para el reconocimiento de protenas se basan en muchos casos en la identificacin de grupos estructurales de algunos de sus aminocidos.

REACCIN DE BIURET La producen los pptidos y las protenas, pero no los aminocidos, ya que se debe a la presencia del enlace peptdico (- CO- NH -) que se destruye al liberarse los aminocidos. Cuando una protena se pone en contacto con un lcali concentrado, se forma una sustancia compleja denominada Biuret. Debido a dicha reaccin fue que observamos que al agregar el reactivo de sulfato de cobre mas solucin de protena precipito una coloracin violeta. Quedando en el fondo del tubo una tonalidad azul cielo reaccin positiva. Precipitando a una coloracin amarilla la reaccin nos torna negativa al no haber presencia de protenas. Identificacin de protenas mediante la reaccin el Biuret La reaccin debe su nombre al biuret, una molcula formada a partir de dos de urea (H2N-CO-NH-CO-NH2), que es la ms sencilla que da positiva esta reaccin La presencia de protenas en una mezcla se puede determinar mediante la reaccin del Biuret. El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en solucin acuosa alcalina (de NaOH o KOH). La reaccin se basa en la formacin de un compuesto de color violeta, debido a la formacin de un complejo de coordinacin entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrgeno que forma parte de los enlaces peptdicos presentando un mximo de absorcin a 540 nm.

Da positiva esta reaccin en todos los compuestos que tengan dos o ms enlaces peptdicos consecutivos en sus molculas.

REACCIN XANTOPROTICA

Esta reaccin se debe a la formacin de nitroderivados aromticos por reaccin del cido ntrico sobre grupos bencnicos que poseen algunos aminocidos como la fenilalanina, la tirosina y el triptfano. Por lo tanto, la dan positiva todas aquellas protenas que tengan aminocidos aromticos en su molcula. IV. MARCO EXPERIMENTAL 4.1.Materiales de laboratorio Tubos de ensayo Goteo Pipeta Vaso de precipitacin Gradilla Bagueta Pinzas Mechero Fosforo Mortero Papel filtro 4.2.Materiales biolgico Leche Gelatina Carne molida Semilla molida Albmina de huevo Suero sanguneo Jugo de papa 4.3.Reactivos Hidrxido de sodio al 10 y 40% Sulfato de cobre al 1y 10% Alcohol cido actico 4.4.Equipos Bao mara Termmetro Balanza

4.5.Procedimiento Experiencia 01. REACCION DE PRESIPITACION o Enumere 5 tubos de ensayo y coloque 3 mL. De albmina en cada uno 01tubo: 1mL. De cido actico. 02tubo: 1mL. De hidrxido de sodio al 40%. 03tubo: 1mL. De sulfato de cobre al 10% 04tubo: 1mL. De alcohol. 05tubo: calentar ligeramente frente al mechero. Reaccin 01tubo: una parte de la muestra se coagulo completamente (donde se coloc directamente en la muestra) el coagulo es de color blanco; el resto se puso en una forma colode. 02tubo: la albmina se coagula y mantiene su color. 03tubo: la coagulacin es mucho mayor entre los cuatro tubos primeros. Color celeste. 04tubo: el alcohol lo coagula de color blanco solo en la parte superior 05tubo: la solucin de la albumina se solidifico completamente de color blanco Experiencia 02. REACCIN DE BIURET o Enumere los tubos de ensayo del 1-5. o Trabaje segn el cuadro

reactivo Albmina Jugo de semilla leche Jugo de papa Suero sanguneo Na(OH) 40%

01 2mL.

02 2mL.

03

04

05

2mL. 2mL. 2mL. 1mL. 1mL. 1mL. 1mL. 1mL.

o Agite los tubos y agregue 5 gotas de sulfato de cobre al 1% a cada uno de los tubos o Observe el cambio de coloracin o Explique compare y esquematice Reaccin El proceso de biuret determina la cantidad de protenas cualitativamente y se logra observar un color morado en la superficie del tubo de cada muestra. El sulfato se une a una de las cargas, hace el proceso de xido reduccin, hay viraje (cambio de color). Cuando ms intenso sea el color, va a ver mayor cantidad de protenas. Albmina: presencia de protenas Jugo de semilla: presencia de protenas Leche: presencia de protenas Jugo de papa: presencia de protenas Suero sanguneo: mayor cantidad de presencia de protenas

Experiencia 03 REACCIN XANTOPROTICA o Enumere los tubos de ensayo del 1-5. o Trabaje segn el cuadro.

reactivo Albmina Leche Carne molida Semilla Gelatina HNO3 concentrado

01 2mL.

02 2mL.

03

04

05

2mL. 2mL. 1mL. 1mL. 1mL. 1mL. 2mL. 1mL.

o Observar y calentar al mechero a cada tubo, hasta cuando se observe un cambio de color y luego se pone a enfriar. o Agregar 1mL. De hidrxido de sodio al 40% a cada tubo. o Observar el cambio de color, explicar y esquematizar.

Reaccin: o Al homogenizar con Acetic Acid con las siguientes reactivos va a coagular (espesar) a todas las sustancias excepto al jugo de carne. o Al calentar al mechero la: Albumina: Al someter al calor la muestra de albumina se form un precipitado blanco en el tubo de ensayo, se present una coagulacin de las protenas. Leche: Simplemente se calent no hubo cambios. Carne molida: Cambia su apariencia a un color translucido Semilla molida: No hubo cambios Gelatina: igualmente cambia su apariencia pero su color va hacer ms denso a un color ms rojo. o Al agregar hidrxido de sodio al 40%. Albumina: Perdida de protenas por la coagulacin (negativa). Leche: Presencia de aminocidos (positiva). Carne molida: Presencia de aminocidos (positiva). Semilla molida: Presencia de aminocidos (positiva). Gelatina: No pas nada un hubo reaccin (negativa).

Experiencia 04 REECONOCIMIENTO DE ALBMINAS Llevar 10 gr. De carne molida con 50ml de agua destilada. Filtrar y recibir el agua en un vaso de precipitacin. Calentar este ltimo 70f luego usar una muestra de agua de lavado y realizar la prueba de biuret. Explicar y esquematizar. Reaccin: Agregamos 5 gotas de NaOH al 40% Aadimos 5 gotas de CuSO4 AL 10%. Observacin: Observamos una Color verde opaco, lo que significa que existe poca cantidad de albminas.

Experiencia 05 RECONOCIMIENTO DE GLOBULINAS Adicionar la carne molida usada en la prueba anterior en una solucin salina diluida de NaOH al 10% y homogenizar. Filtrar, luego e agua de lavado, y calentar a 70f. Usar una muestra del agua del filtrado y realizar la reaccin de biuret. Reaccin: Agregamos 5 gotas de NaOH al 40%, y le aadimos 5 gotas de sulfato de cobre (CuSO4).

Observacin: Se observ un color marrn claro, existe presencia de globulinas, mucho ms que la experiencia N4. Conclusin, es que el sulfato de cobre va a teir de color violeta a las sustancias que contengan mayor presencia de protenas. V. CONCLUCIONES Hemos reconocido la presencia de protenas mediante el mtodo de biuret. Hemos reconocido la presencia de protenas mediante el mtodo xantaproteica. Evaluamos mediante pruebas fsicas y qumicas la presencia de protenas en las diferentes muestras. Empleamos tcnicas de reconocimiento de globulinas y albminas. BIBLIOGRAFIA Qumica Orgnica G. Devore, Muoz MENA Qumica Orgnica Morrison y Boyd Bioqumica Stryer, L. 2da. Edicin. San Francisco California.

VI.

VII.

LINKOGRAFIA

http://www.educaguia.com/apuntes/apuntes/nutricion/PROTEINAS/PROTEINASI.pdf. http://www.uv.es/tunon/pdf_doc/trabajo_matilde.pdf. http://pendientedemigracion.ucm.es/info/analitic/Asociencia/DesnatProteinas.pdf. http://academico.upv.cl/doctos/KINE-7011/%7BB1987286-67F3-4C1E-B40E59C33C389AE4%7D/2012/S2/GUIALABN%C2%B02-2012.

VIII.

ANEXOS

Experiencia N 1

Experiencia N 2

Experiencia N 2

Experiencia N 3

Experiencia N 4

Experiencia N 5