Club Lyonnais de Chromatographie

Journe scientifique du 12 mai 2011

Mthodes prparatives et purification

Chromatographie en phase liquide prparative : principes anciens
Pierre GAREIL

Laboratoire de Physicochimie des Electrolytes, Collo Collodes & Sciences Analytiques (PECSA) UMR CNRS 7195

CAHIER DES CHARGES DE LA SEPARATION PREPARATIVE Compos dintrt :

un (plusieurs) compos(s) majoritaire(s) un (plusieurs) compos(s) minoritaire(s) Quantit totale de produit purifi recherche Rendement horaire Contraintes : puret taux de rcupration colonne, appareillage, investissements CHOIX D UNE STRATEGIE

CHROMATOGRAPHIE SEMI-PREPARATIVE
Sparations occasionnelles Echelle modre (g) Identification, caractrisation, tude des proprits Optimisation : quantit purifie rcupre par injection Mise au point limite Instrumentation analytique Choix de colonnes limit

CHROMATOGRAPHIE PREPARATIVE OU DE PRODUCTION

Sparations rptitives Grande chelle (> kg) Usage synthse / commercial Optimisation : rendement horaire et cots Mise au point approfondie Appareillage spcifique Colonnes ddies

Une sparation prparative est une sparation analytique sur une colonne plus large Une sparation avec retour la ligne de base est indispensable pour obtenir des produits purs en chromatographie prparative

Les colonnes prparatives nont pas besoin dtre aussi efficaces que les colonnes analytiques

QUELQUES IDEES REUES CONCERNANT LES SEPARATIONS PREPARATIVES

Les dtecteurs pour la chromatographie prparative nont pas besoin dtre aussi sensibles que ceux pour la chromatographie analytique

La puret des solvants nest pas aussi critique que pour les sparations analytiques

La purification chromatographique dun produit partir de sa matrice doit tre ralise en une seule tape

CLASSEMENT DES TECHNIQUES EN CHROMATOGRAPHIQUE PREPARATIVES Selon la nature des phases

Premire phase / phase stationnaire Solide Liquide Deuxime phase (mobile) Gaz Liquide Supercritique

Selon le mode de mise en contact des phases

Une phase stationnaire au contact dune phase mobile Deux phase mobiles contre-courant

Selon le rgime dintroduction du mlange

Injection unique Injection squentielle / squentielle avec recyclage Injection en continu

Selon le nombre et larrangement des phase mobiles Elution Dplacement Selon la technologie de colonne
Cylindrique, compression axiale / radiale, cellules en cascade, lits mobiles simuls, etc

CRITERES ET CONTRAINTES DOPTIMISATION EN CHROMATOGRAPHIE PREPARATIVE Dure ()

Quantit (QR, TR) CRITERES Quantit rcupre par injection : QR Rendement horaire : Rh = R Rendement volumique : Rv = Rendement massique : Rm =
1 QR F QR m Q

Qualit (Pi) CONTRAINTES

QR T = Taux de rcupration : R Q 0

Puret : Pi Perte de charge : P = Solubilit de lchantillon Dimensions de la colonne

LU
2 dp

PURETE

Pi = 1 - Ti

Taux dimpuret dans la fraction1

Taux dimpuret dans la fraction 2

Ti1 =

Q2 Q 01 Q1

Ti2 =

Q1 Q 02 Q 2

TRANSPOSITION ANALYTIQUE - PREPARATIVE ETAPES PRELIMINAIRES Tests de solubilit

A partir dune chromatographie analytique : Recherche de la plus grande slectivit de sparation (paire critique) Identification des constituants Analyse quantitative

Choix du systme de phase

Optimisation raisonne de la quantit injecte

FACTEURS INFLUENANT LE CHOIX DU SYSTEME DE PHASE

PHASE MOBILE

PHASES STATIONNAIRE Slectivit

Solubilit de lchantillon Point d bullition Simplicit de composition Toxicit Puret

Capacit Densit de remplissage Accessibilit au solut Stabilit mcanique et chimique Facilit de rgnration Sensibilit lempoisonnement Cot

COUTS DES PHASES STATIONNAIRES

Diamtre des particules Largeur de la distribution granulomtrique Greffage Forme

Puret Rapport de cot silice C18 / silice vierge (forme irrgulire)

Granulomtrie ( m) 10 5-20 15-25 25-40 40-60 Rapport des cots 3 6 8 10 12

Rapport de cot silice sphrique / silice irrgulire (granulomtrie 20 m)

Silice Rapport des cots Vierge C18 3,5 1,25

COUT DES PHASES MOBILES

Rapport des cots phase inverse / phase normale : 25

COUT TOTAL / UNITE DE VOLUME DE COLONNE

(en absence de recyclage de solvant)

n (1+ k) CM + CS
Phase mobile Phase stationnaire

n : nombre d injections : porosit totale k : facteur de rtention CM : cot de la phase mobile / unit de volume : densit du remplissage CS : cot de la phase stationnaire / unit de masse

NOMBRE DE PLATEAUX THEORIQUES (pour la sparation analytique)

2 2 1+ k 2 2 N = 16 Rs 1 k 2
Rs 1 2 1,5 1,2 1,1 120 250 1000 3500 2 480 1000 4000 14000 3 1100 2300 9000 31000

Purnell

(k2 = 3)
N (longueur, 30 cm) 600 1800 3000 9000 Diamtre des particules ( m) 50 30 20 10

AVANTAGES ET INCONVENIENTS DES FINES PARTICULES

Grande efficacit

Grande vitesse Transposition directe Pressions leves Remplissage plus difficile Cot lev
TROIS GRANDES TENDANCES...

Fines particules (10 m)

Particules intermdiaires (20 - 40 m)

Particules grossires (50 - 100 m)

RECUPERATION DE COMPOSES PURS DANS LE CAS DUNE RESOLUTION INCOMPLETE

ISOTHERME DE DISTRIBUTION DE DEUX COMPOSES A ET B ENTRE LA PHASE MOBILE ET LA PHASE STATIONNAIRE

OPTIMISATION LINEAIRE DE LA QUANTITE INJECTEE

Rs < 1,3 V0 lin = min ((v)1, (v)2)

VR (v) = N
Rs > 1,3 V0 Lin = VR2 - VR1 - 2 ((v)1, (v)2) C0 Lin : dtermine exprimentalement (10-3 M < C0 Lin < 10-2 M) Q0 Lin = C0 Lin x V0 Lin

OPTIMISATION NON-LINEAIRE DE LA QUANTITE INJECTEE 1. Modle de la trane exponentielle

V + Q 02NLin = Cm 2 V2 exp R1

31 Vm V2

0,2 M < Cm 2 < 0,8 M

V2 ~ 0,2 VR2
V0 N-lin < V2

P. Gareil et coll., 1980

OPTIMISATION NON-LINEAIRE DE LA QUANTITE INJECTEE 2. MODELE SIMPLIFIE DE SNYDER (1/2) Reprsentation des profils dlution par un triangle rectangle

Rs prep =

tR2,0 tR1,0 w2

w2

tR1,0
Pour Rs prep = 1 et N/N0 = 1/3 :
(rendement horaire optimal)

tR2,0

Temps

Qs 1 2 Q2 = 9
(Qs : capacit de la colonne saturation)

1/k 1,0 + 2 N0 = 48 1
L.R. Snyder et coll., 1887.

OPTIMISATION NON-LINEAIRE DE LA QUANTITE INJECTEE 2. MODELE SIMPLIFIE DE SNYDER (2/2) DETERMINATION DE QS (Capacit de la colonne saturation) Injection dune quantit analytique : Injection dune quantit leve Qi : (ki / ki,0 < 0,95
ki = tmax tm tm

ki,0 , N0 ki , N

tR0 2 N = 16 wi

ki Qi Q s = 2N 1+ k i 1 k i / k i0
Valeurs habituelles : 0,3 0,5 mg/m2
L.R. Snyder et coll., 1887.

INFLUENCE DU DIAMETRE DES PARTICULES DANS DES CONDITIONS DE SURCHARGE EN MASSE

CONDITIONS DE SURCHARGE

X 200

CONDITIONS ANALYTIQUES

Colonne 25 cm x 1 cm d.i. Lichrosorb Si 60 / heptane - actate dthyle (90 : 10, v/v), dbit : 12 mL. min-1 Dtection RI, sensibilit x 4 en c et d Echantillon : dibutyl-, dithyl-, dimthylphtalate dans lluent.
Eisenbeiss et coll., 1985.

AVANTAGE ET INCONVENIENT DES FINES PARTICULES

Grande efficacit Grande vitesse Transposition directe Pressions leves Remplissage plus difficiles Cot lev

TROIS GRANDES TENDANCES

Fines particules (10 m)

Particules intermdiaires (20-40 m)

Particules grossires (50-100 m)

CHOIX ENTRE UNE OPTIMISATION LINEAIRE ET UNE OPTIMISATION NON-LINEAIRE

SEPARATION FACILE Optimisation non-linaire

Grosse granulomtrie (~ 40 m) Dbit lev Colonnes longues (50-100 cm) Rendements (horaire, volumique, massique) levs

SEPARATION DIFFICILE Optimisation linaire

Fine granulomtrie (~ 10 m) Dbit modr Colonnes courtes (30 cm) Rendements (horaire, volumique, massique) faibles

EXEMPLE DAPPLICATION DU MODELE DE SNYDER Oxydes de phosphines nantiomres

Colonne : 22 cm x 8 cm d.i. Phase stationnaire : (500 g) Lichrosorb NH2 7 m greff Dinitrobenzoylphnylglycine Phase mobile : (112 mL.min-1) hexane-chloroforme-thanol

1g
Modlisation (Qs = 11,5 g, 0,06 mg / m2) (2 mg/g)

1g

500 mg

P1 : 99,5 % (TR1 : 96 %) P2 : 99 % (TR2 : 75 %)

A. Tambut et coll., 1986

EVALUATION DES SEPARATIONS A PARTIR DES MODELES 1- et 4-adamantanol

1g
(2 mg/g)

Impossibilit de rcuprer ltat pur lisomre 4 Dissolution lente de lchantillon dans la phase mobile / quantit de silice da lchantillon insuffisante

5g
(25 mg/g) Colonne : 27 cm x 4 cm d.i. Phase stationnaire : 200 g silice vierge 10-20 m. Phase mobile : pentane-2-propanol 98 : 2, v/v Dbit : 22 mL.min-1. Introduction chantillon solide dans la silice (1/2, (m/m)

VR1 + 3 1
J. Kritz et coll., 1982

METHODE DES FACTEURS DECHELLE (1/2)

DONNEES Colonne analytique OBJECTIF Colonne prparative Dimensions Dbit Diamtre des particules Perte de charge Quantit injecte Rendement horaire HYPOTHESES (pour les deux colonnes) mmes critres et contraintes doptimisation mmes facteurs de rtention et slectivits mme efficacit de remplissage Quantit injecte proportionnelle au volume de colonne
G. Crtier et coll., 1979.

METHODE DES FACTEURS DECHELLE (2/2)

Longueur de colonne : Diamtre de colonne : Diamtre des particules : Vitesse linaire : Perte de charge : Quantit demande : Nombre d injections : Rendement horaire :

L prep = l L anal dc prep = a dc anal dp prep = b dp anal U prep = u U anal Pprep = p Panal Q = q QR anal i = Q / QR prep Rh prep = r Rh anal

ul p= 2 b

u q r= l i

q = la 2 i

SEPARATION DANTIBIOTIQUES HOMOLOGUES

Phase stationnaire : silice C18. Phase mobile : eau - MeOH 12 : 88, v/v. Colonne : 33,6 cm x 8 cm d.i. Colonne : 34 cm x 0,4 cm d.i. 830 g de silice C18 dp : 10 m. F : 1 ml.min-1. dp : 15 m. F : 80 ml.min-1. Injection : 0,1 mg (500 L). Injection : 1 g (25 mL) (1,2 mg / g) Q0 Anal Opt = 3 mg

VC Prep / VC Anal = 395 Q0 Prep / Q0 Anal = 330 V0 Prep / V0 Anal = 50

Rgles doptimisation et de transfert mal suivies

0,4 g B (99,7 %) 0,5 g A (98,6 %)

M. Beran et coll., 1983

DIMENSIONS DES COLONNES EN CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE

Type

Diamtre

Longueur

Phase stationnaire

Analytique Semiprparative Prparative Industrielle

4 6 mm 6 12 mm

25 cm 25 cm

23g 3 12 g

2 10 cm 15 60 cm

25 50 cm 60 - 180 cm

40 g 2 kg 5 250 kg

TECHNOLOGIES DE COLONNES
Compression radiale Compression axiale Compression mixte

AVANTAGES ET INCONVENIENTS DE LELUTION ET DU DEPLACEMENT EN CHROMATOGRAPHIE PREPARATIVE ELUTION

Processus essentiellement linaire Transposition anal / prep simple Absence de rgnration Rcupration totale possible Rcuprations de traces ltat pur Rendements massiques faibles Rendements volumiques faibles Dilution Sparations difficiles si ~ 1

DEPLACEMENT
Processus non-linaire Mise au point dlicate Rgnration ncessaire Taux de rcupration( TR ) < 1
(mais TR ~1 si grand et zones longues)

Impossibilit de rcuprer des traces ltat pur Rendements massiques levs Rendements volumiques levs Possibilit de concentration Enrichissements levs ( mme avec ~ 1)

DEPLACEMENT : PRINCIPES
Isothermes

Influence de laugmentation de la quantit du composant (i) sur la forme du profil et la puret

Concentrations Dans les zones

INFLUENCE DE LA QUANTIT INJECTE SUR LES TAUX DE RCUPRATION Dipeptides

Colonne : 50 cm x 0,46 cm d.i. Silice ODS. Porteur : tampon phosphate pH 2 Dplaceur : TBA 150 mM dans porteur chantillon : (0,5 mL de porteur) 10 mg / 15 mg / 15 mg 20 mg / 30 mg / 30 mg

Nuclosides
Colonne : 40 cm x 0,46 cm d.i. Silice ODS. Porteur : tampon actate 10 mM, pH 5 Dplaceur : benzyltributylammonium 300 mM dans porteur chantillon : 10 mg de chaque nuclotide dans 2 mL porteur
C. Horvath et coll., 1983.

SEPARATIONS PREPARATIVES MULTIDIMENSIONNELLES Objectif

Augmenter la quantit maximale injectable et / ou la puret Augmenter le rendement horaire En absence de modification de slectivit Colonne unique : recyclage Prcolonne + colonne : rtrobalayage Avec modification de slectivit Modification seule de la composition de la phase mobile
(procds multi-tapes en ligne ou en diffr)

Modification simultane des phases mobile et stationnaire

(procds multi-tapes en ligne ou en diffr)

Recyclage

Sparation multidimensionnelle avec modification de slectivit

Heart-cutting

ASPECTS ECONOMIQUES
Cot dexploitation annuel dune unit Production (8000 h / an) Dveloppement (2000 h / an)
50 mg / g phase stationnaire 1h 500 injections (4 remplissages / an) recycle avec 10 % de pertes 1 technicien / poste
Poste

Injection Priode dinjection Dure de vie des colonnes Phase mobile Main duvre
Poste

50 mg / g phase stationnaire 1h 2000 injections (4 remplissages / an) recycle avec 10 % de pertes 1/3 technicien / poste
Diamtre de la colonne (quantit injecte) 150 mm (0,25 kg)
PN PI

Diamtre de la colonne (quantit injecte) 150 mm (0,25 kg)

PN PI

300 mm (1 kg)
PN PI

450 mm (2,25 kg)

PN PI

300 mm (1 kg)
PN PI

450 mm (2,25 kg)

PN PI

Investissement (%) Phase stationnaire (%) Phase mobile (%) Fonctionnement (%) (dont main d'uvre) Total (k$) Cot par kg de produit brut ($)

37 2

34 11

38 5

33 26

41 7

33 34

Investissement (%) Phase stationnaire (%) Phase mobile (%) Fonctionnement (%) (dont main d'uvre) Total (k$) Cot par kg de produit brut ($)

31 2

32 10

28 4

30 23

26 5

29 30

8 53

5 50

20 37

10 31

26 26

12 21

21 46

10 48

42 26

19 28

52 17

23 18

138 276

147 284

216 108

250 125

342 76

419 93

161 80

156 78

300 37

278 35

532 30

484 27

K. Jones, 1988.