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Qwertyuiopasdfghjklzxcvbnmqw ertyuiopasdfghjklzxcvbnmqwert yuiopasdfghjklzxcvbnmqwertyui BENEMERITA UNIVERSIDAD opasdfghjklzxcvbnmqwertyuiopa AUTONOMA DE PUEBLA CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD sdfghjklzxcvbnmqwertyuiopasdf ghjklzxcvbnmqwertyuiopasdfghj klzxcvbnmqwertyuiopasdfghjklz xcvbnmqwertyuiopasANALISIS dfghjklzxcvbnmqwertyuiopasdfg

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25/06/2013 E. Ninive Ordaz Reyes, Mara de Jess Perales Lara, Karina Meja Larrainzar, Nancy Estrada Garca

Cromatografa por afinidad


Esta tcnica se basa en interacciones inespecficas gracias a las cuales la columna de AFC absorbe nicamente de la muestra los componentes que presentan afinidad con los ligandos acoplados al soporte cromatografico. Cuando el compuesto retenido es eluido, se consiguen niveles de pureza extraordinarios, gracias a la elevada selectividad de estas interacciones de afinidad.

Es una cromatografa que utiliza la alta especificidad de las reacciones biolgicas del tipo antgeno-anticuerpo, hormona-receptor Para ello un ligando de afinidad se une al soporte de la FE. Cuando la muestra atraviese la columna solo se retendr la sustancia capaz de reaccionar con dicho ligando. Una vez concluida la separacin hay que provocar la salida de la sustancia que dio la reaccin especfica.

La cromatografa de afinidad tiene una serie de caractersticas generales que la distinguen de otros tipos de cromatografa lquidas Alta selectividad en el mecanismo de retencin Campo de aplicacin restringido Separacin de un solo soluto analito Empleo de sistema de baja presin Columnas cortas de escasa eficacia cromatogrfica

Etapas: 1. Inmovilizacin del ligando 2. Adsorcin de la muestra 3. Desorcin

Tipo especial de cromatografa de adsorcin solido-liquido donde sustancias de naturaleza bioqumica denominadas

ligando de afinidad se enlazan qumicamente en soportes


solidos adecuados, reteniendo a los solutos tambin de naturaleza bioqumica de manera reversible y selectiva.

Un volumen no muy
grande de muestra de naturaleza nbiologica se intriduce enla columna que contiene un soporte polimerico inerte que retiene a la sustancia activa que se denomina ligando de afinidad, por un enlace covalente. Solo existe interaccion especifica entre este ligando y un solto-analito de la muestra insertada que queda retenido (absorbido). Luego se procede a la elucin de los dems componenetes de la muestra

mediante una primer fase mvil que no influye en el acoplamiento.

A continuacin se introduce una nueva fase mvil que


desactiva el acoplamiento por alteracin reversible de los sitios activos del inhibidor-ligando, del soluto(protena) o de ambos.

Generalmente se utiliza un cambio de pH que


modifica las caractersticas de los sitios activos; se eluye asi el soluto de inters.

Una vez finalizada la separacin, se procede a la regeneracin de la columna, lo que generalmente se

hace mediante el empleo de la primera fase mvil


constituyendo una etapa rpida.

Etapas:

1. Inmovilizacin del ligando


2. Adsorcin de la muestra 3. Desorcin

Distincin de otras cromatografas:

Alta selectividad en el mecanismo de retencin


Campo de aplicacin restringido Separacin de un soluto analito Empleo de sistema de baja presin

Columnas cortas
Ligandos de afinidad: Son las molculas bioqumicas que se encuentran ancladas qumicamente sobre el soporte solido inerte, y son las responsables de la adsorcin especfica de los solutosanalitos.

Segn su naturaleza: Macromolculas biolgicas

Segn su actuacin: selectividad de la retencin

Ligandos especficos:

Ligandos generales:

Soporte:
Material sobre cuya superficie activada se establece e enlace covalente con el ligando de afinidad. Debe poseer propiedades como:

Tener una gran superficie Tamao del grano controlable Porosidad controlable Carcter suficientemente hidrofilico para evitar adsorciones no especificas. Estabilidad mecnica, en especial para trabajar a alta presin

Inmovilizacin del ligando


Los ligando de afinidad se inmovilizan mediante el establecimiento de enlaces qumicos covalentes con el soporte solido activado y un grupo reactivo del ligando. El objetivo de la inmovilizacin consiste en obtener una capa estable y densa del ligando bioqumico que conserve su actividad con plenitud.

Activacin del soporte:


Consiste en el ataque qumico con diferentes reactivos, de la superficie de los soportes antes mencionados, que se caracterizan por poseer grupos oxhidrilos superficiales.

Luego sigue el anclaje qumico del ligando que se da mediante la reaccin de grupos amino del mismo, fundamentalmente con el soporte activado.

Mtodos de elucin:
Elucin bioespecifica: la fase mvil contiene un modificador, que es un ligando de bajo peso molecular, capaz de desplazar a la macromolcula del sitio activo de la FE. Elucin bioespecifica normal: interaccin inhibidor-muestra Elucin bioespecifica inversa: interaccin inhibidor-ligando de afinidad. Elucin no especifica: la fase mvil provoca la desnaturalizacin de la muestra, del ligando de afinidad o de los otros dos.