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Calidad microbiolgica y anlisis de patgenos (Shigella y Salmonella) en lechuga

Kenia Barrantes* y Rosario Ach Seccin Infeccin-Nutricin, Instituto de Investigaciones en Salud (INISA), Universidad de Costa Rica. * Correspondencia: E-mail: kenia.barrantes@ucr.ac.cr Resumen: Se analiz la calidad microbiolgica en 37 muestras de lechuga variedad criolla (Lactuca sativa var. Capitata L.) de distintos intermediarios en las provincias de San Jos y Cartago, en Costa Rica. Las muestras se recolectaron mediante muestreo no probabilstico por seleccin intencional. Se cuantific Escherichia coli (NMP/g) como indicador de contaminacin fecal y se determin la presencia de patgenos especficos (Shigella y Salmonella), por cultivo y por PCR-Mltiple. En el 65% de las muestras analizadas se detect E. coli, aunque no se encontr Shigella ni Salmonella por PCRMltiple o cultivo. Una posible explicacin es que los niveles de contaminacin de Shigella y Salmonella estn por debajo de los lmites de deteccin de ambos mtodos (menos de 104 UFC/g para Shigella y menos de 102 UFC/g para Salmonella). Estos resultados establecen una base importante para continuar con este tema de investigacin y analizar otras fuentes de transmisin de Shigella y Salmonella, dado que ambos patgenos son frecuentes en la regin. Palabras clave: Shigella, Salmonella, PCR, lechuga, Escherichia coli. Microbiological quality and pathogen analysis (Shigella and Salmonella) of lettuce Abstract: The microbiological quality of 37 lettuce samples of the creole variety (Lactuca sativa var. Capitata L.) obtained from different intermediaries at the provinces of San Jos and Cartago, in Costa Rica was analyzed. The samples were collected through a non-probabilistic sampling with intentional selection. Escherichia coli (NMP/g) was quantified as indicator of fecal contamination and the presence of specific pathogens (Shigella and Salmonella) was determined by culture and MultiplexPCR. In 65% of the samples analyzed we detected E. coli, even though we did not find Shigella or Salmonella by Multiplex-PCR or culture. A possible explanation is that the Shigella or Salmonella contamination levels may have been under the detection limits for both methods (less than 104 CFU/g for Shigella, and less than 102 CFU/g for Salmonella). These results establish an important basis for continuing with this research subject and analyzing other sources of transmission of Shigella and Salmonella contamination, since both pathogens are frequent in the region. Keywords: Shigella, Salmonella, PCR, lettuce, Escherichia coli. Recibido 12 de diciembre de 2010; aceptado 10 de mayo de 2011 Introduccin Las Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETA) han sido catalogadas por expertos de la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) como el problema de salud

pblica ms diseminado en el mundo contemporneo, causa importante del descenso de la productividad econmica mundial [1,2]. La OMS estim que slo en el ao 2005 murieron aproximadamente 1,8 millones de personas debido a enfermedad diarreica, asociada a la ingesta de agua o alimentos contaminados [3]. La shigelosis y la salmonelosis son infecciones de alto impacto para la salud humana, con alta mortalidad en grupos vulnerables de la poblacin [4]. La contaminacin con Shigella y Salmonella se da no slo por la va directa, sino tambin por aguas y alimentos contaminados. En EE. UU., en el perodo 1996-2006, Salmonella y Shigella fueron patgenos frecuentemente relacionados con ETA, asocindose los brotes de shigelosis al consumo de lechuga, perejil y cebollas y de salmonelosis a tomate, col de Bruselas, sanda y meln [5,6]. En este pas, slo durante el 2005 y 2006 se registraron 4 brotes por consumo de tomate, con 459 casos de salmonelosis confirmados por cultivo, mientras que en el ao 2006 se registraron 121 brotes, con ms de 3 300 casos [7,8]. En Europa, entre 1990-1992, Salmonella fue responsable del 83 al 87% de los brotes de ETA registrados. Su presencia se detect en vegetales frescos de exportacin (lechugas, mostaza, albahaca, tubrculos, etc), con una frecuencia de 1,9% hasta 8,0% [9]. Se considera que desde la dcada de los 90 a la fecha, Salmonella es uno de los patgenos ms persistentes causantes de ETA en el mundo [3]. En Costa Rica, durante el ao 2005 se registraron 23 brotes de diarrea, y se observ que Shigella y Salmonella fueron los patgenos con mayor incidencia durante este perodo [10]. Para el ao 2006, de 1.267 casos de ETA registrados, ms de la mitad fueron causados por intoxicaciones alimentarias sin precisar su tipo; Shigella fue la segunda causa con una incidencia de 33,4% (423 casos), seguido de Salmonella con un 5,2% (66 casos) [10]. Ambas infecciones son de notificacin obligatoria en este pas, desde el ao 2003 [11]. Sin embargo, en este registro no se especifica si la fuente de infeccin es directa, o por agua o alimentos, por lo que se desconoce que tan frecuentes son estas vas en la transmisin de ambos patgenos, ni cuales alimentos se asocian a los brotes registrados. Los alimentos de consumo crudo, como la lechuga, presentan un mayor riesgo para la transmisin de stos y otros enteropatgenos, pues no existe una etapa de procesamiento posterior que elimine las cargas microbianas iniciales [3,12,13]. Tradicionalmente, la deteccin de bacterias patgenas en alimentos, como Shigella y Salmonella, se realiza por cultivo convencional, cuya baja sensibilidad, demora la obtencin del resultado final y, la complejidad en su procesamiento, es similar al anlisis de muestras clnicas [14,15]. La identificacin por cultivo se fundamenta en la caracterizacin fenotpica de reacciones bioqumicas del microorganismo en estudio, sin embargo la caracterizacin mediante el perfil fenotpico de las bacterias no es infalible dada la posibilidad de variacin de los perfiles bioqumicos que presentan las cepas bacterianas in vitro. Actualmente, se cuenta con otras alternativas diagnsticas para la deteccin de microorganismos patgenos, como las tcnicas de biologa molecular, fundamentalmente los mtodos basados en la Reaccin en Cadena de la Polimerasa

(PCR por sus siglas en ingls), que no se afectan por cambios en los perfiles bioqumicos; los resultados se obtienen ms rpidamente y la sensibilidad es mayor. En el Instituto de Investigaciones en Salud (INISA), de la Universidad de Costa Rica (UCR), se cuenta con mtodos moleculares (PCR-Mltiple) desarrollados en el laboratorio, para la deteccin de Shigella y Salmonella en lechuga variedad criolla (Lactuca sativa var. Capitata L.) [16-18]. Para Shigella, el mtodo de PCR-Mltiple utilizado es especfico de dos regiones de virulencia importantes: la regin ial (por invasion associated locus) presente en el plsmido de invasin, cuyo producto es de 320 pb [10] y est codificado en el opern mxi-spa del SSTT (esencial en el fenotipo invasor) y el gen ipaH, codificado tanto en el pINV como en el cromosoma, con un producto de 600 pb [19-22]. Ambos mtodos fueron desarrollados y validados en el INISA para la deteccin de estos patgenos en la matriz alimenticia especfica [17,18]. Para Salmonella, el mtodo molecular utilizado detecta el gen invA por medio de una banda de 389 pb. Este gen est codificado en el cromosoma bacteriano, en la SPI1 y es esencial para la virulencia en modelos celulares y animales [22-26]. El objetivo del presente estudio fue analizar la calidad microbiolgica y la presencia de Shigella y Salmonella por mtodos moleculares y cultivo, en 37 muestras de lechuga variedad criolla (Lactuca sativa var. Capitata L.). Las lechugas fueron recolectadas en expendios de vegetales y puestos ambulantes, ubicados en las provincias de San Jos y Cartago (rea Metropolitana), en Costa Rica. Materiales y mtodos Recoleccin y transporte de muestras: Se recolectaron 37 lechugas variedad criolla por medio de un muestreo no probabilstico por seleccin intencional, durante la poca seca del ao 2009 (meses de enero a mayo). Los sitios de muestreo fueron 14 puestos ambulantes y 23 expendios de vegetales, ubicados en las provincias de San Jos (cantn central, Goicoechea y Tibs) y Cartago (cantn central). Los sitios de muestreo fueron seleccionados por mala infraestructura (deterioro y suciedad de las instalaciones cuando el local cuenta con techo, pared y piso; en el caso de los puestos ambulantes, los alimentos se venden directamente en la calle, en sitios de alto trnsito de personas y vehculos) y condiciones que propician el riesgo de mala manipulacin y contaminacin de los alimentos (carencia de lavamanos o servicio sanitario, local atendido por una sola persona, la cual manipula tanto el alimento como el dinero directamente con sus manos, los alimentos se almacenan a temperatura ambiente, en bandejas o anaqueles sucios, en algunos casos estas bandejas estn colocadas directamente en el piso). Los muestreos se realizaron mensualmente, iniciando con lechugas provenientes de puestos ambulantes ubicados en la provincia de San Jos, durante los meses de enero y febrero. Posteriormente se recolectaron las muestras de expendios de vegetales ubicados en San Jos (meses de marzo y abril), para finalizar con los expendios ubicados en Cartago (mes de mayo). Las muestras fueron transportadas en fro (hielero con hielo gel) al laboratorio de Microbiologa de Alimentos y Aguas del INISA y fueron analizadas el mismo da del muestreo. Cultivo y bacterias utilizadas: Se utilizaron como control positivo Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella enterica serovariedad Enteritidis ATCC 13076 y Shigella flexneri (INISA-01).

En todas las muestras se analiz la presencia de Shigella y Salmonella en 25 g y se cuantific Escherichia coli (NMP/g). El cultivo de Shigella, Salmonella y la cuantificacin de E.coli se realiz conforme al protocolo de referencia de la Asociacin Americana de Salud Publica [15,27-29], sin realizar modificacin alguna, excepto para el anlisis de Salmonella, el cual es un ensayo acreditado en el INISA bajo la norma INTE-ISO/IEC 17025:2005 ante el Ente Costarricense de Acreditacin (ECA) (referirse a www.eca.or.cr; alcance LE-059). Para la cuantificacin de E.coli, se pesaron 25 g de la muestra, a la cual se le agregaron 225 mL de buffer triptona 0,1% y se homogeniz por 3 min a 230 rpm (Stomacher 400 Circulator Seward). A partir de esta dilucin inicial (10-1) se realizaron diluciones seriadas decimales de 10-2 y 10-3. De cada una de estas diluciones se inocul 1 mL en una serie de 3 tubos con 9 mL de caldo lauril triptosa (OXOID) en campana Durham, incubndose por 48 h a 35 C. Posteriormente, los tubos que mostraron turbidez y gas, se reinocularon en tubos con caldo EC-MUG (OXOID), que se incubaron a 44,5 C por 24 h. Se consideraron positivos los tubos que mostraron turbidez, gas y fluorescencia con luz UV. Para la deteccin de Shigella, se pesaron 25 g de la muestra, la cual se incub con 225 mL de caldo GN (Hajna-BBL) y se homogeniz por 3 min a 230 rpm (Stomacher 400 Circulator Seward). Luego, muestras y controles se incubaron a 37 C por un perodo de 20 h. Posteriormente, se inocularon en agar T7 agar xilosa lisina desoxicolato (XLD) y agar desoxicolato citrato (DC) (OXOID) y se incubaron por 24 horas a 35 C. La lectura se realiz por presencia de UFC similares o sospechosas de Shigella. Para Salmonella, se pesaron porciones de 25 g de lechuga, a las cuales se les agreg 225 mL de caldo lactosado (OXOID). Luego de una incubacin por 24 h a 35 C, se cultiv en caldos tetrationato (T) y Rappaport Vassidialis (RV). Las muestras y controles se incubaron a 35 C por 24 h, con posterior inoculacin en agar XLD, Hektoen (HK) y sulfito de bismuto (SB) (OXOID). Las placas se incubaron por 24 h a 35 C y luego se realiz lectura de UFC sospechosas. Las colonias sospechosas de Shigella o Salmonella se analizaron por su perfil bioqumico (TSI, LIA, urea, citrato, indol, movilidad, catalasa, oxidasa), confirmado por API 20E (BIOMERIEUX) y serologa. Extraccin del ADN: Para la extraccin del ADN de controles y muestras se utiliz la tcnica de fenol-cloroformo descrita por Wilson [30]. El ADN de las muestras se extrajo a partir del botn celular del caldo de cultivo (GN para Shigella y Caldo Lactosado para Salmonella) posteriormente a su incubacin [17,18]. El ADN fue cuantificado por espectrofotometra utilizando un biofotmetro (Eppendorf 6132) y se almacen a -70 C hasta el momento de su utilizacin. PCR-Mltiple: Se utiliz el mtodo de PCR-Mltiple Shigella (ipaH, ial) y Salmonella (invA), previamente estandarizado y validado en el INISA [17,18]. La secuencia de los iniciadores (Innovagen, Suecia) para los genes ipaH, ial (Shigella) e invA (Salmonella) y el tamao de los productos de amplificacin se detallan en la tabla 1.

Se utiliz un control interno de amplificacin (CIA) de 100 pb, cuya secuencia se obtuvo a partir del producto de ipaH en Shigella [17]. La mezcla de reaccin fue la siguiente: buffer 1X, MgCl 2,0mM, Taq polimerasa 0,5 U (Promega), 0,2 mM de cada dNTP (Applied Biosystems), 0,12 pM de los iniciadores, 0,1 ng del CIA, 5% de DMSO como adyuvante y 5 l del ADN patrn. Esta mezcla se coloc en el termociclador (Verity, Applied Biosystems) y se utiliz la variante de PCRtowchdown o de gradiente de temperatura. Este protocolo const de 30 ciclos; 10 ciclos iniciales (1 min a 94 C, 30 s a 65 C disminuyendo hasta 55 C, y 1 min a 72 C) y los ltimos 20 ciclos en PCR estndar (1 min a 94 C, 30 s a 55 C y 1 min a 72 C). Se adicion un paso de extensin por 5 min a 72 C al final de la reaccin [17,18]. Se utilizaron como controles Salmonella enterica serovariedad Enteritidis ATCC 13076, Shigella flexneri (INISA-01) y Escherichia coli ATCC 25922. El mtodo molecular tiene una probabilidad de deteccin del 100% para Shigella, en el rango de 2,7 x 104 hasta 8,0 X 107UFC/mL, y para Salmonella, de 5,6 x 102 hasta 5,5 x 107 UFC/mL, con una probabilidad mayor o igual al 90%. Asimismo, cuenta con una selectividad del 100%, exactitud relativa del 100%, especificidad relativa del 100%, sensibilidad relativa para Shigella del 100% (a partir de 104 UFC/g) y para Salmonella del 68% (a partir de 10 UFC/ml). El anlisis de muestras se realiz a partir del ADN extrado del botn celular del caldo de enriquecimiento (Caldo GN). Los productos de PCR se detectaron por electroforesis en gel de agarosa al 2% con tincin de bromuro de etidio (0,5 g/mL), por 45 min a 140 mV. Las bandas correspondientes a ipaH (600 pb), ial (320 pb) e invA (389 pb) se visualizaron con un transiluminador UVITEC (Cambridge, UK). Resultados y discusin En esta investigacin se analiz la contaminacin microbiolgica de lechuga variedad criolla por medio de cultivo convencional y un mtodo molecular previamente estandarizado y validado en la matriz en estudio [17,18]. Este tipo de lechuga es de amplia distribucin y consumo en el pas, existiendo zonas productoras en las provincias de Cartago y San Jos [31].

En la mayora de las muestras analizadas se detect contaminacin fecal. El 65% (24/37) mostr E.coli en un rango desde 4 hasta 460 NMP/g, conforme se detalla en la tabla 2. Los valores ms altos (>102 NMP/g) correspondieron a muestras provenientes de un puesto ambulante y 4 expendios de vegetales, todos ubicados en la provincia de San Jos.

Sin embargo, a pesar de estos resultados, en ninguna de las muestras se detect Shigella ni Salmonella, tanto por PCR-Mltiple como por cultivo convencional. Para todas las reacciones el desempeo de los controles (control interno de amplificacin o CIA, control de reactivos, control negativo, control positivo y control positivo de extraccin) fue el esperado, como se muestra en la figura 1.

Para los alimentos de consumo crudo, como frutas y hortalizas, se mencionan entre las principales causas para la contaminacin fecal: la irrigacin con aguas de mala calidad (aguas residuales no tratadas), el uso de fertilizantes a base de excremento, el contacto con animales, la mala manipulacin y el almacenamiento inadecuado [32,33]. En la regin latinoamericana, otros estudios evidencian tambin la contaminacin fecal y con ello, el riesgo de Enfermedad de Transmisin Alimentaria (ETA) por consumo de hortalizas que se venden en mercados y expendios de vegetales [34-36]. Adems de constituir un problema para la salud pblica, las ETA tambin son un gasto econmico substancial, que afecta a individuos, familia, industria, sistemas de salud y comunidades enteras. En pases no desarrollados el problema va en detrimento de la economa nacional, pues una epidemia de ETA afecta negativamente tanto al turismo como al comercio interno. Como ejemplo, slo para el perodo 2004-2005, se registraron 3645 rechazos de alimentos provenientes de Amrica Latina y el Caribe con mercado a EEUU, siendo el 77% de los rechazos atribuibles a problemas de inocuidad [37]. Dos condiciones comnmente observadas en muchos de los expendios muestreados para este estudio fueron la mala manipulacin y almacenamiento; por ejemplo, estos alimentos as como otros vegetales de consumo crudo, se mantenan a temperatura ambiente, en bandejas o anaqueles sucios; en algunos casos estas bandejas se encontraban en el piso y el alimento era manipulado con las manos directamente. Este criterio se utiliz para la seleccin de las muestras con el fin de aumentar la probabilidad de muestras positivas por Shigella y/o Salmonella, sin embargo no se obtuvieron resultados positivos por ninguno de los mtodos utilizados. Lo anterior sugiere que los niveles de contaminacin por Shigella y Salmonella en lechuga variedad criolla, proveniente de estos puestos ambulantes y expendios, estn por debajo de los niveles de deteccin ya establecidos durante la estandarizacin y evaluacin del desempeo del mtodo molecular (menos de 10 4 UFC/g para Shigella y menos de 102 UFC/g para Salmonella). Otro estudio desarrollado en el INISA mostr resultados similares luego del anlisis de un mayor nmero de muestras (n=164) utilizando un diseo de muestreo probabilstico (simple al azar) aplicado a la Gran rea Metropolitana (provincias de San Jos, Alajuela, Heredia y Cartago) (datos sin publicar). Esta conclusin se respalda dado el ptimo desempeo analtico y

diagnstico de los mtodos validados, en los cuales se defini una probabilidad de deteccin especfica para el alimento analizado [17,18]. Sin embargo, una muestra negativa por PCR o cultivo analizada con esta metodologa no implica necesariamente una ausencia del riesgo para el caso de Shigella, cuya dosis infectante est por debajo del nivel de deteccin analtico. Para Salmonella, la dosis infectante conocida es detectable por ambos mtodos, aunque, se ha descrito la replicacin de este patgeno a niveles de 102 a 104 UFC/g a partir de un inculo de menos de 1 NMP/g en vegetales de consumo crudo como la alfalfa, y la persistencia de forma viable en tomate hasta por 49 das y en lechuga y perejil desde el momento de la siembra en el campo hasta algunos das posteriores a su cosecha [32,38]. No se puede descartar tampoco el riesgo de transmisin de otros patgenos, pues la deteccin de E. coli evidencia contaminacin fecal. En relacin a estos resultados, en investigaciones posteriores se ampliar el tamao de la muestra, dado que la frecuencia estimada es baja y adems se utilizar esta herramienta diagnstica para el anlisis de otro tipo de muestras (alimentos y aguas), que puedan relacionarse con un riesgo mayor para la transmisin de estos y otros enteropatgenos. La baja frecuencia detectada puede reflejar, en parte, el efecto de estrategias de control de la inocuidad que se han promocionado en Costa Rica en los ltimos aos. La promocin de buenas prcticas agrcolas, buenas prcticas de manufactura, exigir que todo manipulador de alimentos que trabaje en el pas se capacite en el tema de inocuidad alimentaria y adquiera un carn que lo acredite como tal, por mencionar algunos ejemplos, son parte del cdigo alimentario costarricense, contemplados en decretos y reglamentos tcnicos. La implementacin de estas polticas relacionadas con la inocuidad alimentaria incide en mejoras sobre la calidad microbiolgica y disminuye la probabilidad la transmisin de patgenos, particularmente en alimentos de consumo crudo como frutas y hortalizas. Los hallazgos del presente estudio establecen una base importante para continuar con este tema de investigacin, dado que a nivel mundial, Shigella y Salmonella son patgenos frecuentes en brotes de origen alimentario e hdrico [10,39]; sin embargo, no se cuenta con informacin en Costa Rica sobre su transmisin por alimentos especficos a pesar de los brotes registrados. Salmonella se ha aislado de gran variedad de alimentos como huevo, pollo, pavo, cerdo, agua, camarn, culantro coyote, t de limn y alimentos para aves y cerdos [10]. Para Shigella, se han publicado trabajos que sealan la posible asociacin de esta bacteria a brotes de origen hdrico [10,39,40]. Por lo anterior, se deben desarrollar ms investigaciones que establezcan el riesgo asociado al consumo de alimentos especficos y la presencia de estos patgenos. Referencias 1. Unicef & United Nations. Special session on children. Pollution-related diseases kill millions of children a year. Disponible en: www.unicef.org/specialsession/press/02pr25diseases.htm. Acceso 19 de abril, 2011. 2. World Health Organization. Foodborne diseases. Possibly 350 times more frequent than reported. Press release WHO/58. 13 August 1997. Press Release WHO/58. Disponible en: https://centre.icddrb.org/images/jddr152_press-release-who.pdf. Acceso 21 de abril del 2011.

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APLICACIN DE BUENAS PRCTICAS DE MANUFACTURA Y DETERMINACIN DE AGENTES CONTAMINANTES EN HAMBURGUESAS EXPENDIDAS EN SALTA (ARGENTINA)
Andrea Paula Cravero, Adriana Noem Ramn, Bruno Bocanera, Marta Beatriz Gimnez y Carolina Gabriela Ruiz Alvarez. Consejo de Investigacin, Facultad de Ciencias de la Salud. Universidad Nacional de Salta, Repblica Argentina E-mail: andicravero@hotmail.com; ramon@unsa.edu.ar Introduccin Asegurar la calidad bromatolgica y nutricional de los alimentos que se ofertan al consumidor, no es una tarea sencilla de concretar. Los emparedados de carne son medios de cultivo ideales para el desarrollo de microorganismos patgenos causantes de Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETA). Los factores que contribuyen a los brotes de ETA son la refrigeracin inadecuada, la falta de higiene en la manipulacin e incorrecto recalentamiento de comidas preparadas, entre otros (1, 2, 3), los cuales son considerados dentro de las Buenas prcticas de Manufactura (BPM). Las BPM, constituyen un conjunto de procedimientos, herramientas o actividades que se llevan a cabo para asegurar la calidad e inocuidad de los alimentos (4) desde su produccin hasta su venta. Fueron implementadas por primera vez en los Estados Unidos en 1969, recomendadas luego por el Codex Alimentarius y contempladas tambin en el Reglamento Tcnico del MERCOSUR (Resolucin GMC MERCOSUR N 80/96). La aplicacin de las mismas en los locales elaboradores o expendedores de alimentos, en especial puestos, ferias y carros en la va pblica de pases subdesarrollados, es todava un tema por analizar, ya que la mayora de ellos, no las cumplen o lo hacen de manera insatisfactoria (5). Las hamburguesas son consumidas por nios, adolescentes y adultos en forma masiva, siguiendo una moda de la que nadie puede escapar", atrapados por un mundo de sabores, con regalos sorpresas, cajitas felices y publicidad desmedida acerca de las propiedades de un alimento rico, sano y econmico pero que en realidad puede resultar peligroso desde el punto de vista de la salud. Los lmites microbiolgicos permitidos para el consumo de este tipo de producto son: Recuento de Aerobios Mesfilos 10 5 UFC/g; Coliformes, Enterobacterias, S.aureus 102 UFC/g y E.coli (157: H7) negativa (6) respectivamente. E. coli manifiesta distintas caractersticas de patogenecidad, sndrome clnico y epidemiologa segn la clase a la que pertenece. Una de las ms temibles es E.coli (157: H7) o enterohemorrgica por ser la causante del Sndrome Urmico Hemoltico o Colitis Hemorrgica, conocida tambin como el mal de las hamburguesas. Dicha entidad afecta principalmente a nios menores de 2 aos por el consumo de carnes mal cocidas, leches o aguas contaminadas y transmisin de persona a persona. Sin embargo, el resto de la poblacin tambin queda expuesta ante esta temible enfermedad que en Argentina, es endmica siendo su incidencia la ms alta del mundo ya que se registran entre 300 y 350 casos nuevos por ao.

La carne picada se debe cocinar a temperaturas superiores a 70 C para destruir esta bacteria debido a que en este tipo de producto, se cuece la parte superficial permaneciendo cruda en su interior que es donde se aloja el germen. Las hamburguesas son la fuente principal de contaminacin en los nios. Por otra parte, si el almacenamiento y envasado de los emparedados son inapropiados, permiten la autooxidacin de grasa por exposicin a temperaturas, aire y luz originando compuestos qumicos (perxidos y malonilaldehdo) que producen prdida del valor nutritivo, desarrollo de sabores u olores extraos y en el organismo, deterioro de lpidos tisulares, inactivacin de enzimas, destruccin de membranas e inhibicin de sntesis de prostaglandinas que aumentan la coagulacin de la sangre en el proceso de aterognesis, an en bajas concentraciones, lo que constituyen un enorme peligro para la salud humana (7, 8, 9). Los perxidos son derivados por el ataque del oxgeno sobre determinados componentes de los alimentos generando radicales libres que dan cuenta de vitaminas liposolubles y reaccionan con uniones sulfhidrilo de las protenas, disminuyendo as el contenido de aminocidos azufrados. Tambin se acelera la velocidad de turnover de vitamina E en el organismo, lo que acrecienta sus requerimientos (10). El lmite mximo permitido de perxidos en los alimentos para el consumo, segn el Cdigo Alimentario Argentino (CAA), es de 10 mEq de O2 / Kg. de grasa (11). Por su lado, el MDA es un dialdehdo voltil formado por descomposicin de hidroperxidos, aldehdos y otros derivados carbonlicos (12, 13). La susceptibilidad de las heterogneas grasas a la rancidez oxidativa vara segn el nivel de instauracin de los cidos grasos, existencia de metales como el hierro o cobre, y la presencia y disponibilidad de antioxidantes (14). Los factores que apresuran la oxidacin son entre otros la luz, temperatura, absorcin de oxgeno y algunos envases que intervienen sobre la estabilidad de las grasas (15, 16). Los efectos del consumo de grasas rancias conllevan manifestaciones como van desde diarreas, arteriosclerosis e hipertrofia del hgado, entre otros aspectos (17). Por lo mencionado anteriormente, el objetivo de este trabajo fue determinar la presencia de agentes contaminantes biolgicos y txicos (microorganismos patgenos y productos derivados de oxidacin de grasas), a fin de evaluar su interrelacin con la aplicacin o no de BPM (prcticas de elaboracin, almacenamiento y venta) de emparedados de carne molida y moldeada (hamburguesas), vegetales, huevo y aderezos como fuente de peligro potencial para la salud de los consumidores. Material y Mtodos Se seleccionaron al azar 25 locales de elaboracin y venta de hamburguesas habilitados por el Ente Regulador Oficial de Alimentos de la Provincia de Salta, Repblica Argentina, en los que se realizaron encuestas por entrevista estructurada a travs de un formulario impreso con preguntas abiertas y cerradas acerca del emplazamiento, estructura edilicia e higiene de la planta fsica, higiene y hbitos del personal en diferentes etapas de procesamiento (elaboracin, almacenamiento y venta). Tambin se observaron otras variables relacionadas a las BPM como la contaminacin cruzada, el uniforme o indumentaria de trabajo y conductas laborales de los operarios. Se trabaj con 25 muestras de emparedados compuestas por: pan tipo viena, tomate en rodajas finas, lechuga, aderezos (mayonesa y Ketchup), carne picada y moldeada(hamburguesa) y huevo (frito). Las mismas fueron tomadas en el lugar de expendio de las manos del vendedor (bajo las mismas condiciones de venta al pblico) en bolsas de polietileno estriles, rotuladas y refrigeradas (4 2 C) hasta su procesamiento. Se pesaron y tomaron 30 g para su homogeneizacin en Multiprocesador Moulinex AV4, y se suspendieron en 120 ml de solucin fisiolgica estril durante 1hora 30 minutos, para luego realizar las diluciones correspondientes a fin de realizar los anlisis microbiolgicos. stos ltimos se llevaron a cabo en cuarto de siembra, con luz ultravioleta y fueron los siguientes:

Recuento Total de Aerobios Mesfilos (Recuento Estndar en Placa, Agar nutritivo; 10-4, 10-5 y 10-6 a 37C/24 Hs); Coliformes (Lactosa Bilis Verde Brillante al 10-3, 10-4 , 10-5 a 42C /24 Hs); Enterobacterias (Mc Conkey, 10-3, 10-4 a 37C /24 Hs);

Staphylococcus aureus (Manitol Salado, 10-3, 10-4 a 37 C/48 Hs) Escherichia coli (O157: H7): Pruebas IMViC (18). En laboratorio de alimentos se realiz la extraccin de grasa por Mtodo Directo con Solventes (ter de Petrleo) segn AOAC (19) y posterior valoracin del contenido porcentual de grasa por diferencia; ndice de Perxidos, para lo cual se pesaron 1 0,005 g de grasa y diluyeron con solvente (cido Actico Glacial / Cloroformo 2 / 1) e Ioduro de Potasio Saturado para su posterior titulacin con Tiosulfato de Sodio 0,01N segn AOAC (20); y Malonilaldehdo (MDA) mediante la prueba del cido Tiobarbitrico (ATB) (21), para valorar el deterioro oxidativo de las grasas (rancidez) y formacin de compuestos txicos secundarios respectivamente. El anlisis estadstico se realiz mediante pruebas no Paramtricas: Rho de Sperman con el programa estadstico SPSS versin 7.0. (22). Resultados

El 80% de los locales disponan de energa elctrica, agua potable, gas natural, cloacas. Todos los puestos de venta estaban situados sobre calles transitadas con una alta tasa de polucin y smog dada por el trnsito vehicular y por ende, expuestos a contaminantes fsicos como humo, gases y olores desagradables. El 60% contaban con instalaciones y equipamiento (sectores de elaboracin, venta, almacenamiento y baos) en buenas condiciones de construccin y mantenimiento segn normas vigentes en lo que respecta a planta fsica. Sin embargo, entre el 56 al 68 % cumplimentaban con las mnimas condiciones de higiene en todos los sectores de la fbrica: el 52 % no contaba con un programa de saneamiento adecuado ni organizado y el 20 % no desinfectaba segn lo exigido por organismos competentes. As tambin se observ que el 32% utilizaba insumos de limpieza de marcas no reconocidas, o que no posean etiquetado correspondiente o se encontraban almacenados junto a vveres secos (despensa), lo cual no est permitido por las BPM debido a la gran posibilidad de contaminacin cruzada entre sustancias qumicas voltiles o por derrames (detergente, hipoclorito de sodio, etc) hacia los alimentos de manera accidental o intencional. Con respecto al personal, el 40 % de los operarios no vesta uniforme completo ni limpio (delantal o mandil, gorro o cofia, ni zapatos de uso exclusivo para el trabajo). Se observaron hbitos indeseables como toser, mascar gomas, fumar, rascarse la cabeza, tocarse la nariz, pelos u ojos en el 88 % de los casos. El 56% no contaba con libreta sanitaria ni certificado de buena salud expedido por el mdico. Tampoco credencial habilitante o controles de salud al menos una vez al ao como lo exige la ley. El 80% sin cursos de capacitacin en el rea de BPM, pero con estudios de nivel secundario, lo que indica que la escolaridad es adecuada para entender muy bien los contenidos referentes a las mismas. Las conductas de trabajo fueron regulares en el 40 % de los operarios observados. Se pudieron constatar visitas inoportunas de familiares o amigos en horas de trabajo en el 65 % de las fbricas, lo que constituye un factor de distraccin para el manipulador de alimentos. La contaminacin cruzada fue observada en el 90 % de los locales comerciales por el uso recipientes nicos para procesar diversos ingredientes como vegetales y pan o ste y otros productos. El 80% de los emparedados de hamburguesa estaba contaminado, y de stos, el 95% present Recuento Total positivo con valores que oscilaron entre 103 a 107 UFC/g. 60% con Coliformes (102 a 8 x 105 UFC/g), 10% con Enterobacterias (103 a 6 x 103 UFC/g) y 35% con Sthaphilococcus aureus (3 x 102 a 104 UFC/g) excediendo los lmites permitidos para su consumo, segn las normas vigentes para estos productos y tipo de patgenos encontrados (Ver Figura 1). Figura 1: Porcentaje de muestras contaminadas con microorganismos

E. coli (157: H7) negativa en todas las muestras. Para constatar su presencia se realizaron las pruebas sobre aquellas muestras que presentaron enterobacterias y coliformes positivos. En laboratorio de alimentos, se obtuvo que el 20% de los emparedados presentaron un contenido graso superior a 15 g (entre 16,017 a 20,008 g cada 100g de alimento) y por ende valores de IP mayores a 10 mEqO2 / Kg de grasa (10,44 a 14,53). El 92 % presentaron un contenido de MDA inferior a 0,5 (0,154 a 0,451), pero superando lo permitido por el CAA para el consumo. Del anlisis estadstico de los datos se hall correlacin altamente significativa entre anlisis microbiolgicos y libreta sanitaria (r 2 = 0,813), cursos de capacitacin (r2 = 0,813), conductas de trabajo de los operarios (r2 = 0,759) y contaminacin cruzada (r2 = 0,685). Discusin La aplicacin de BPM en los locales de elaboracin y venta de emparedados de hamburguesas o hamburgueseras es insuficiente. Si bien, algunos cumplimentaron las normas, todava falta mucho camino por recorrer. La correcta implementacin de BPM requiere de la colaboracin de todos los operarios o manipuladores de alimentos como as tambin de los empresarios, industriales o expendedores de materias primas. La multiplicacin, supervivencia, desarrollo o inactivacin microbianas estn influenciados por factores relacionados con el mal manejo de alimentos (higiene y/o temperatura inapropiadas) y con la falta de capacitacin al personal lo que interfiere en la calidad e inocuidad de los productos terminados, poniendo en grave peligro a la poblacin consumidora, lo que en ltima instancia, podra prevenirse con la adecuada aplicacin de BPM, algo sumamente econmico pero efectivo para paliar grandes males. Los microorganismos encontrados estn vinculados a contaminacin de origen fecal ( Enterobacterias) y a un incorrecto procesamiento durante las etapas de preparacin, elaboracin y almacenamiento. El Recuento Total de Aerobios Mesfilos es indicador de tratamiento deficiente y menor tiempo de vida til del producto. Es importante destacar la negatividad de las muestras frente a E. coli, bacteria tan difundida en el medio y tan relacionada a las malas prcticas higinicas, responsable de diarreas leves como la famosa diarrea del viajero a entidades mortales como el Sndrome rmico Hemoltico, del cual ya se habl en prrafos anteriores. Cabe destacar que el almacenamiento prolongado a temperaturas inadecuadas podra contribuir no slo al desarrollo de flora contaminante sino tambin a la formacin de compuestos de oxidacin (Perxidos y MDA) tal como lo demuestran los resultados de los anlisis expuestos anteriormente, los que tambin pueden relacionarse con la composicin qumica (grasa) de los emparedados tanto de la materia prima como de la coccin (sucesivos calentamientos-enfriamientos). Todo esto contribuye en gran medida a poner en riesgo a la poblacin consumidora frente a productos que en apariencia resultan nutritivos, sanos y apetitosos pero que en realidad esconden verdaderos peligros para contraer enfermedades de diversa etiologa infecciosa, txica o con residuos de alto poder acumulativo en el organismo. Resumen

El objetivo fue determinar agentes contaminantes (microorganismos patgenos y oxidacin lipdica) en hamburguesas expendidas en la ciudad de Salta, Repblica Argentina. Se observ planta fsica, condiciones higinicas de instalaciones, equipos y personal en 25 establecimientos habilitados (al azar). Se tomaron 25 muestras de emparedados de hamburguesas (pan, carne picada y moldeada, huevo, tomate, lechuga y aderezos) en bolsas estriles. Se realiz: Recuento Total de Aerobios Mesfilos, Coliformes, Enterobacterias, Staphylococcus aureus, Escherichia coli (O157: H7) e ndice de Perxidos (IP) y Malonilaldehdo (MDA). Estadsticamente se realizaron pruebas no paramtricas (Rho de Sperman); Programa SPSS 7.0. El 60% de los locales presentaban instalaciones, equipos y baos en buenas condiciones segn normas vigentes (80/96 Reglamento MERCOSUR). Entre el 56 al 68% tenan mnimas condiciones de higiene en todos los sectores de la fbrica: 52% no contaba con programa de saneamiento o desinfeccin segn lo exigido por organismos competentes. El 40% del personal no vestan uniforme completo ni limpio; el 56% sin libreta sanitaria y el 80% sin cursos de capacitacin en BPM. Los hbitos indeseables fueron observados en el 88% de los casos, con conductas de trabajo regulares (40%) y contaminacin cruzada (90 %). Recuento Total Positivo 95% de las muestras (10 3 a 107 UFC/g); 60% con Coliformes (102 a 8 x 105 UFC/g), 10% con Enterobacterias (103 a 6 x 103 UFC/g) y 35% con Sthaphilococcus aureus (3 x 102 a 104 UFC/g) excediendo lmites permitidos para consumo. E. coli negativa (100%). El 20% con IP mayor a 10mEqO2 / Kg (10,44 a 14,53); el 92% con contenido de MDA inferior a 0,5 (0,154 a 0,451). Correlacin altamente significativa entre anlisis microbiolgicos y libreta sanitaria, cursos de capacitacin, conductas y contaminacin cruzada. La aplicacin de BPM fue insuficiente, lo cual se refleja en la calidad higinico sanitaria de los productos analizados ya que recuentos elevados indican materias primas contaminadas, tratamientos no satisfactorios y condiciones inadecuadas de almacenamiento. Perxidos y MDA excedieron los lmites permitidos constituyendo peligros potenciales para la salud de los consumidores. Palabras Clave: hamburguesas, microorganismos patgenos, ndice de Perxidos, Malonilaldehdo, E. coli. Abstract

The objective was to determine contaminating agents (pathogenic microorganisms and lipidic oxidation ) in hamburgers sold at local restaurants in Salta Capital city, Argentine Republic. Place of elaboration, hygienic conditions of facilities, equipment and staff in 25 authorized establishments were observed (at random). 25 samples of hamburgers (bread, beef, egg, tomato, lettuce and seasonings) were taken in sterile bags. Total recount of Aerobic Mesfilos, Coliformes, Enterobacterias, Staphylococcus aureus, Escherichia coli (O157: H7) and Index of Peroxides (IP) and Malonilaldehyd (MDA) was carried out. Non parametric tests (Sperman RHO) were statistically used; SPSS 7. 0.programs. 60% of the places had facilities, equipment and restrooms in good conditions in accordance with present regulations (80/96 MERCOSUR Regulation ). 56 to 68% met minimum conditions of hygiene in every section of the factory: 52% lacked sanitation program or did not disinfect the place in accordance with present regulations. 40% of the workers did not wear complete nor clean uniforms; 56% lacked a sanitary notebook and 80% had never been trained in the basicas of GMP. Undesirable habits were observed in 88%, regular work behaviors (40%) and crossed contamination (90%). Positive Total Recount in 95% of the samples (103 to 107 UFC/g); 60% with Coliforms (102 to 8 x 105 UFC/g), 10% with Enterobacterias (103 to 6 x 103 UFC/g) and 35% with Sthaphilococcus aureus (3 x 102 to 104 UFC/g) exceeding the allowed limits for consumption. E. coli negative (100%). 20% with IP at 10 (10,44 at 14,53); 92% with content of lower MDA at 0,5 (0,154 at 0,451). Highly significant correlation between microbiologic tests and sanitary notebook, training courses, behaviors and crossed contamination. The application of GPM was insufficient, reflected in the sanitary-hygienic quality of the products analyzed, since a high recount indicates contaminated raw materials , non satisfactory treatment and inadequate conditions of storage. Peroxides and MDA exceeded the allowed limits, potentially hazardous the consumer. Key Words : hamburgers, pathogenic microorganisms , Index of Peroxides, Malonilaldehyd, E. coli Agradecimientos

Se agradece al Consejo de Investigacin y personal de Laboratorios de Microbiologa y Parasitologa, en especial al Tcnico Daniel P. Quipildor, como al Laboratorio de Alimentos (Bioterio) de la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad Nacional de Salta. As tambin muy especialmente a la Profesora Laura Moreno por la traduccin de este manuscrito. Referencias 1. Delfino, R., S. Fanto y S. Delfino. 2000. Calidad Bromatolgica y Nutricional en Alimentos. Editorial Delfino Consultores. 192 pp, 2. Windrantz, P. M.L. Arias 2000. Evaluation of the bacteriological quality of ice cream sold at San Jose, Costa Rica Archivos Latinoamericanos de Nutricin Vol 50(3): 301-303. 3. Rey, A. M. y A. A. Silvestre. 1999. Comer sin riesgos. Editorial Hemisferio Sur S.A. 199 pp 4. Ramn, AN., E. Vargas Ferra y A.P. Cravero 2005. Buenas prcticas de manufactura (BPM): Herramientas tiles para los Manipuladores de Alimentos.17 pp (MS) 5. Delfino, R. et. al. Op. cit. 6. Grupo de Alimentos de la Sociedad Espaola de Microbiologa editores. 2004. Normas Microbiolgicas Espaolas. http://veterinaria.unex.es/sem/normictb.htm 7. Cheftel , JC y H Cheftel 1978. Introduccin a la bioqumica y tecnologa de los alimentos Ed. Acribia (Espaa): 265-290 pp 8. Snchez-Moreno Gonzlez, C y JA Larrauri-Garca 1998. Principales mtodos para la determinacin de la oxidacin lipdica. . Food Sci. Tech. Int. Vol. 4, (6): 391-399 9. Vicario-Romero, IM 1993. El ensayodel cido 2-tiobarbiturico (Atb) para medir la degradacin autooxidativa de aceites vegetales comestibles. Tsis de Doctorado. Universidad de Sevilla (Espaa) 10. Idem. 11. Cdigo Alimentario Argentino. 2001. Training Tec.- IPSA (Eds) Crdoba, Repblica Argentina 12. Nawar, W. W. 1993. Lipidos En [Fennema, O.R] Qumica de los alimentos. Editorial Acribia S.A. Cap. III: 230-239. 13. Universidad Nacional de Salta 2001. Curso Desarrollo de Industrias de grasas y aceites Programa Doctorado del NOA. (Sep) 14. Del Cerro, S. 1989. Determinacin de los niveles de colesterol srico y alteraciones histolgicas segn la naturaleza y modificacin de la grasa. Tesis Licenciatura en Nutricin. Fac. Cs. de la Salud. Universidad Nacional de Salta (Argentina). 80 pp 15. Universidad Nacional de Salta, Op.cit. 16. Del Cerro, S., Op.cit.

17. Vicario-Romero, IM, Op.cit. 18. International Commission On Microbiological Specifications For Food (I.C.M.S.F.) 1982. Microorganismos de los Alimentos. Ed. Acribia: 221-231. 19. American Oil Chemists Society 1986. Official and tentative Methods of the AOAC. 3 ed. Vol 1 Champaign, Illinois: American Oil Chemists. Society. 20. Idem. 21. Vicario-Romero, IM, Op.cit. 22. SPSS. 1998. Programa Estadstico para las Ciencias Sociales. Windows, SPSS Inc., Chicago, Illinois.

http://www.respyn.uanl.mx/viii/4/articulos/practicas_manufactura.htm

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Pan Hamburguesa

Producto horneado de textura blanda y suave. Elaborado a partir de harina fermentada por accin de la levadura al degradar el azcar, que en conjunto con los dems ingredientes logran una masa caracterstica que es colocada en latas preformadas; despus de un tiempo de crecimiento se le aplica el ajonjol y es horneada. La No 5 lleva miga adems del ajonjol.
NOMBRE DEL PRODUCTO
PAN HAMBURGUESA

DENOMINACIONES
PAN HAMBURGUESA, SUPER HAMBURGUESA, HAMBURGUESA No 4 Y No 5

MARCAS COMERCIALES
COMAPAN REGISTRO SANITARIO: RSIAD11M00383

DESCRIPCIN Y ELABORACION
Producto horneado de textura blanda y suave. Elaborado a partir de harina fermentada por accin de la levadura al degradar el azcar, que en conjunto con los dems ingredientes logran una masa caracterstica que es colocada en latas preformadas; despus de un tiempo de crecimiento se le aplica el ajonjol y es horneada. La No 5 lleva miga adems del ajonjol.

CARACTERISTICAS ORGANOLEPTICAS COLOR


La miga es blanco cremoso. La corteza debe ser dorado a ligeramente moreno, con semillas de ajonjol esparcidas uniformemente, no debe estar quemada, ni tener material extrao alguno.

OLOR Y SABOR
Debe ser caracterstico al pan horneado, bien cocido, sin acidez, libre de olores y sabores desagradables.

TEXTURA
La miga debe ser elstica, con poros pequeos distribuidos en forma uniforme, no debe ser desmenuzable, ni pegajosa.

CARACTERISTICAS FISICOQUIMICAS
pH : De 5 a 5,5 Humedad : De 28 a 34 %

CARACTERSTICAS MICROBIOLGICAS
Recuento total de Microorganismos. Bacteria Mesfilas : mximo 30000 UFC Recuento de Hongos y levaduras / g : <200 UFC N.M.P. Coliformes totales / g. : <11 UFC Escherichia Coli / g. : Ausente Recuento de Staphilococus Coagulasa + / g. : 100 UFC

PRESENTACIN Y EMPAQUE
PRODUCTO Hamburguesa x 12 Hamburguesa No 5 X6 Super Hamburguesa PESO X UND 760 gr EMPAQUE EMBALAJE 2 pqte por canastilla 2 pqte por canastilla 4 pqte por canastilla

580 gr

520 gr

Producto empacado en bolsa de polietileno impresa en su exterior y sellada con cinta ata

H. Gigante X 10 Hamburguesa X 6 Hamburguesa No 4 X 6

450 gr

todo.

7 pqte por canastilla 5 pqte por canastilla 5 pqte por canastilla

380 gr

340 gr

FORMA DE CONSUMO
En forma directa para personas con dieta normal de todas las edades o de acuerdo a recomendaciones nutricionales. Como base en la preparacin de hamburguesas , en refrigerios o emparedados.

CONDICIONES DE MANEJO Y CONSERVACIN


Este producto se puede mantener a temperatura ambiente sin exceder temperaturas mayores a 27C y humedad relativa a 75% se puede apilar mximo 2 unidades, para evitar el dao por deformacin y desmoronamiento. El producto no debe tener contacto directo con el piso en ningn momento. no dejar el empaque abierto o el producto afuera. No se debe colocar cerca de sustancias qumicas que contaminen el producto con su olor o sabor como detergentes, jabones, aromatizantes, derivados de hidrocarburos (gasolina, ACPM, ceras, etc).

VIDA TIL ESPERADA


20 das en condiciones normales de almacenamiento.

IDENTIFICACION DEL LOTE


Compuesto por nmeros y letras indica el nmero del lote, hora de empaque, cdigo del empacador y fecha de vencimiento.

http://comapan.com.co/sitio/index.php?option=com_content&task=view&id=16&Itemid=28

http://www.slideshare.net/jotape74/clase-n-6-plan-de-negocio

Bacteria Mesfilas : mximo 30000 UFC Recuento de Hongos y levaduras / g : <200 UFC N.M.P. Coliformes totales / g. : <11 UFC Escherichia Coli / g. : Ausente Recuento de Staphilococus Coagulasa + / g. : 100 UFC pH : De 5 a 5,5 Humedad : De 28 a 34 %

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