SABERES INTEGRADOS

MARCO TERICO

1. PLANTAS DEL GNERO Vasconcella (Carica papaya) En este apartado se puede apreciar informacin general sobre el origen de la papaya, caracterizacin de la planta, propagacin y cultivo de la papaya, descripcin de las diferentes variedades de papaya, composicin qumica, importancia y usos potenciales en Venezuela informacin que era desconocida para los investigadores y que integra la parte exploratoria del tema con la que se identifico y caracterizo la planta y el fruto con el que se trabajo en el rea experimental. 1.1. ORIGEN Y DISPERSIN La papaya (Carica papaya), es una especie originaria de Amrica Tropical, en especial de Amrica Central y de la Costa Occidental de Amrica del Sur, siguiendo los valles hmedos de la cordillera Andina. En ellos, Colombia y Ecuador presentan el mayor nmero de especies pertenecientes a la familia de las caricceas, entre las que se destacan la papaya y los llamados papayuelos de clima clido, medio y fro. Actualmente se cultiva en todas las zonas tropicales y subtropicales del mundo, entre los 32 grados de latitud norte y sur del Ecuador, como consecuencia de la dispersin realizada por los marinos espaoles y portugueses, pocos aos despus del descubrimiento de Amrica. Fue descrita por primera vez por el cronista espaol Oviedo en 1526 en la Costa Caribe de Panam y Colombia. A Panam lleg en 1535, a Puerto Rico en 1540 y unos aos despus, a Cuba. En 1611 se cultivaba en la India y a partir de 1800 fue ampliamente distribuida en las islas del sur del Ocano Pacfico. (Scheldeman y Van Damme, 2005). 1.2. TAXONOMA

El gnero Vasconcella, que incluye 21 especies, fue definido como tal en el ao 2000 y es el ms importante de la familia Cariccea (Scheldeman y Van Damme, 2005). En la Tabla 1.1, se detalla la clasificacin taxonmica de este gnero.

Tabla 1. Clasificacin taxonmica del gnero Vasconcella. Reino Subreino Superdivisin Divisin Clase Subclase Orden Familia Gnero Plantae Tracheobionta Spermatophyta MagnolioPhyta Magnoliopsida Dilleniidae Violales Caricaceae Vasconcella

La papaya es una planta dicotilednea, perteneciente a la familia Caricaceae. Esta pequea familia tiene 4 gneros con 71 especies. Un elevado nmero de especies del gnero Carica son nativos de Amrica Central y la zona noroccidental del Amrica del Sur, principalmente de los valles hmedos de los Andes. El fruto es una baya de tamao, peso y forma variable, dependiendo de la variedad o seleccin. Mide de 10 a 60 cm de largo y llega a pesar varios kilogramos. El color de la pulpa tambin depende de la seleccin, normalmente amarilla o rojo-anaranjada, de textura suave y de un espesor de 3 a 5 cm. La superficie del fruto suele tener 5 surcos poco profundos. La cscara se torna de verde oscuro a verde claro y luego amarillo-dorado. Las semillas estn en la cavidad interna del fruto. La planta puede producir unos 100 frutos por ao. Las semillas son esfricas, pequeas y negras. Estn envueltas en una capa

mucilaginosa llamada sarcotesta o cubierta. Un fruto bien polinizado llega a tener de 300 a 700 semillas. La papaya pertenece a un grupo de especies de plantas conocidas como plantas laticferas. Estas plantas contienen una serie de clulas ramificadas e interconectadas que forman una matriz de tubos complejos, dispersos a lo largo de la mayora de los tejidos de las plantas, que secretan una sustancia conocida como ltex. En conjunto, estos compuestos se cree que estn implicados en la defensa de la planta contra una amplia variedad de plagas y herbvoros. (Scheldeman y Van Damme, 2005).

1.3. MORFOLOGA 1.3.1. RAZ El sistema radical es pivotante. La raz principal es desarrollada y ramificada en forma radial y puede crecer hasta 1.5 metros de profundidad, dependiendo de las limitaciones fsicas qumicas del suelo donde se siembre. Las races secundarias son de color blanco-crema y se encuentran distribuidas en los primeros 30 centmetros del suelo. (Salazar, C.R. 1988). 1.3.2. TALLO

El tallo generalmente es nico, no ramificado, algo lignificado en la base y puede alcanzar alturas hasta de 12 metros. Con el transcurso de los aos el tronco tiende a volverse ms fibroso y hueco; a medida que envejece va tomando una coloracin griscea y se notan unas cicatrices triangulares en los puntos de insercin de las hojas ya cadas. Cuando el brote terminal ha sido afectado por una causa extraa se presenta la ramificacin del tallo. (Salazar, C.R. 1988).

1.3.3. HOJAS Las hojas son de pecolos largos y huecos; de color verde, morado o una combinacin de stos dos colores; la lmina foliar es grande, gruesa, algo coricea, de

forma palmeada, hendida y palminervia. El haz es de color verde oscuro, lampio; el envs es ms claro y en l se observan las nervaduras protuberantes. Las hojas aparecen en forma alterna a lo largo del tallo; una cada cuatro das aproximadamente, para un total de 100 hojas por ao. (Salazar, C.R. 1988). 1.3.4. FLORES Las flores nacen en la axila de cada hoja y pueden ser pistaladas, estaminadas o pistilo-estaminadas, dando lugar a plantas femeninas, masculinas o hermafroditas, respectivamente. Son blancas cuando estn maduras, de cinco ptalos, de corola carnosa y ausentes de nctar. El papayo es una especie polgama, por presentar tres tipos sexuales primarios: plantas estaminadas o masculinas, pistaladas o hembras y bisexuales o hermafroditas. 1.3.4.1. FLOR ESTAMINADA O MASCULINA

Se forma en plantas machos y se encuentran en ramilletes sobre largos pednculos que nacen en las axilas de las hojas. La flor es pequea de forma tubular; posee un cliz muy reducido, gamospalo y de color verde claro; la corola es gamoptala, con cinco ptalos color blanco-cremoso y alargado. Posee diez estambres agrupados en la parte superior de la corola y un pistilo rudimentario con ovario vestigial. Esta flor no produce frutos, aunque algunas flores terminales del racimo pueden desarrollar un pistilo y por esta razn se pueden encontrar plantas machos produciendo frutos que por lo general son deformes, alargados o curvados y de mala calidad.

1.3.4.2.

FLOR PISTALADA O FEMENINA

Se forma en el tallo principal de las plantas hembras, en las axilas de las hojas sobre un pednculo corto. Es por lo general solitaria, aunque puede presentarse en racimos de hasta cinco flores pero generalmente solo se desarrolla una. Son flores grandes de forma acampanada; el cliz es gamaspalo y la corola posee cinco ptalos grandes, de color blanco-cremoso, ligeramente carnosos, libres o soldados en su base. Ovario superior, grande y de forma redondeada; termina en una estigma, sentado y dividido en cinco lbulos en forma de abanico. En su interior posee una gran cantidad de vulos de placentacin

parietal. Carece de estambres y rganos masculinos por lo que necesita para ser polinizada de plantas masculinas o hermafroditas. Esta flor produce frutos globosos. 1.3.4.3. FLOR HERMAFRODITA

Se encuentra solitaria o en pequeos racimos sobre un pednculo corto y en la axila de las hojas de plantas hermafroditas. Se diferencia de la flor hembra en su forma, ya que presenta un cuello o cintura por encima de su base, aunque, dependiendo del tipo de flor, tambin puede ser acampanada. Flores de cinco a diez estambres, de filamentos coitos y anteras de una coloracin amarillo naranja, localizados en la cara inferior de los ptalos. El ovario es de tipo alargado o cilndrico; los ptalos estn unidos hasta la mitad de su longitud. 1.3.4.4. FLOR PENTANDRIA

La corola se compone de cinco ptalos unidos en su base; el ovario es globoso y con cinco lbulos marcados. Posee cinco estambres con filamentos largos adheridos a la base de la corola. Los estambres se encuentran pegados a la pared del ovario, dejando claramente marcados cinco surcos longitudinales, los cuales son fcilmente visibles cuando el fruto se desarrolla. Esta flor es muy parecida a la flor hembra y slo se diferencia de ella, por la presencia de los estambres. Al igual que la flor hembra, produce frutos globosos, pero con surcos ms pronunciados. 1.3.4.5. FLOR ELONGATA

Es una flor alargada y con un cuello o cintura visible encima de la base. La corola est formada por cinco ptalos unidos ms o menos en una tercera parte de su longitud. Tiene diez estambres, colocados en dos series de cinco cada uno, adheridos al tubo de la corola. El ovario es alargado, por lo que produce frutos de la misma forma. 1.3.4.6. FLOR INTERMEDIA

Es un tipo intermedio entre la pentandria y la elongata; sus ptalos estn unidos en una tercera parte de su longitud, a veces lo sobrepasa, lo que hace que el tubo de la corola

vare de tamao. El nmero de estambres vara de cinco a diez, colocados irregularmente en el tubo de la corola. Los filamentos de los estambres se funden con la pared del ovario y causan deformaciones del fruto al crecer al tiempo con l, produce frutos alargados y deformes, conocidos como "cara de Gato"' los cuales no son comerciales. 1.3.4.7. FLOR ESTRIL

Son flores muy parecidas a las masculinas y se diferencian de ellas en que se encuentran unidas al tallo por un pednculo corto. Al igual que las masculinas, su corola es gamoptala, por lo que presenta forma tubular. No posee ovario frtil. Este es filamentoso y no funcional. Como las flores machos, no producen frutos. La presencia de flores intermedias e irregulares, aun cuando son de carcter gentico, se presenta por cambios ambientales, especialmente de temperatura y humedad del suelo.

1.4. PROPAGACIN Y CICLO DE CULTIVO Las especies del gnero Vasconcella, generalmente, son propagadas por semillas, aunque en algunas especies es posible la propagacin vegetativa por esquejes. La germinacin de las semillas puede ser lenta (de aproximadamente 30 das) y difcil, pero siempre mejora si se aplica una inmersin previa de 24 horas en cido giberlico (GA3). En el caso del hbrido natural Vasconcella heilbornii, la propagacin mediante esquejes es sencilla; sin embargo, con el propsito de ampliar la variabilidad de las nuevas plantas, se puede utilizar GA3 para estimular la germinacin de las semillas viables que se encuentren en los frutos. Tambin es posible realizar injertos entre especies, sobre todo con el fin de evitar algunos hongos y nemtodos de las especies sensibles (Harling, 1990). La determinacin del sexo solo puede efectuarse en la primera floracin, de manera que es aconsejable realizar una plantacin mltiple y luego de la primera floracin, seleccionar las plantas femeninas. Sin embargo, en especies dioicas, es necesario mantener algunos polinizadores masculinos para una adecuada frutacin.

En el caso de los frutos partenocrpicos de Vasconcella heilbornii, su propagacin por esquejes da como resultado campos homogneos de plantas femeninas. La floracin comienza, segn la especie, algunos meses despus del trasplante y los primeros frutos pueden ser cosechados 6 meses ms tarde (Scheldeman y Van Damme, 2005).

1.5. VARIEDADES DE PAPAYAS 1.5.1. SOLO Variedad de tipo hermafrodita, producida en Hawai y la ms conocida y sembrada a nivel mundial, por su calidad y tamao de la fruta. Las plantas hermafroditas producen frutos en forma de pera, con un peso promedio de 450 gramos, con pulpa amarilla rosada intensa, dependiendo de la seleccin. 1.5.2. CARIFLORA Variedad recientemente creada en la Florida, de tipo dioico. Las plantas hembras son altamente productivas, de porte intermedio, de dos a tres frutos por axila, casi esfricos y de un peso entre 500 y 750 gramos. La pulpa es de color amarillo intenso y de buena calidad. 1.5.3. MARADOL Es una variedad hermafrodita originaria de Cuba, con dos selecciones de frutos con pulpa amarilla y roja, ambos de excelente calidad y resistencia al transporte. Los frutos son alargados, con un peso promedio de 1500 g. Esta variedad est siendo sembrada ampliamente en Mxico uno de los pases mayores productores de papaya. CORPOICA la est utilizando para la produccin de hbridos con lneas dioicas avanzadas que presentan tolerancia a enfermedades causadas por virus.

1.5.4. ZAPOTE

Es un tipo de papaya que se cultivaba en la Costa Atlntica y que mantuvo sus caractersticas hasta que se iniciaron siembras de otras variedades tipos. Es de tipo hermafrodita, de porte alto y muy productiva. Sus frutos son globosos alargados, dependiendo del sexo de la planta, de tamao grande, hasta de tres kilos. Pulpa de color rosado intenso al que debe su nombre y de buena calidad para el mercado nacional.

1.5.5. MELONA Igual que la anterior, es un tipo de papaya que en la actualidad est mezclada con otras variedades y tipos. Ha sido ampliamente sembrada en Santander del Sur y en los Llanos Orientales. Sin embargo, los virus han limitado su cultivo en estas zonas, ya que es muy susceptible, llegando a reducirse el rea sembrada hasta un 50%. Es de tipo hermafrodita, de porte intermedio a alto. Produce frutos que alcanzan hasta cinco kilos de peso, de calidad variable y pulpa amarilla. Dependiendo del sexo de la planta, los frutos son globosos o alargados, siendo preferidos los ltimos en el mercado nacional. 1.6. OTRAS VARIEDADES Las variedades 'Carica VP-1' y 'Carica VP-2', son las primeras variedades mejoradas de papaya obtenidas por el ICA en Colombia, en el Centro de Investigaciones de Palmira. Son de tipo "dioico", es decir, presentan solamente plantas machos y hembras (50% de cada sexo). 1.6.1. CARICA VP-1 Es medianamente precoz. Florece entre los 70 y 80 das despus del trasplante y produce 170 das despus. Tiene tallos morados y utos redondos de pulpa amarilla de un peso aproximado de 1.200gramos.

1.6.2. CARICAVP-2

Es ms precoz. Florece entre los 50 y 60 das despus del trasplante e inicia produccin 150 das despus. Las plantas son de tallo verde y sus frutos son pequeos de unos 800 gramos, ligeramente alargados y de pulpa rosada. 1.6.3. CATIRA I Al igual que las anteriores, fue producida en Palmira por el ICA, como parte del programa de mejoramiento iniciado en 1963. Fue introducida y evaluada en 1989 en los Llanos Orientales, destacndose por su excelente comportamiento respecto a virus, productividad y calidad de la fruta. Es de tipo dioico, muy precoz y productiva; produce comercialmente cerca de 70 toneladas por hectrea durante un ao de cosecha bajo condiciones de suelos frtiles bien drenados y con riego. Es de porte mediano y de tallo verde con suaves pintas moradas. Sus frutos son ligeramente alargados, de corteza firme y de pulpa color anaranjado intenso, con un peso promedio de 1.050 gramos; su corteza es lisa y suave, de color verde oscuro en estado inmaduro y amarillo anaranjado cuando ha logrado su completa madurez. La pulpa presenta un grosor promedio de 3.0 cm y su color es anaranjado intenso. La cavidad seminal es mediana y de forma angular. Contiene un nmero promedio de 1.100 semillas. El contenido de azcares es alto, con un promedio de 14 grados Brix completamente maduro. Los frutos se cosechan pintones, es decir cuando aparezcan las primeras manchas amarillas en su base. Su textura firme y el mayor tiempo que tarda en madurarse el fruto, aproximadamente 10 das desde la cosecha hasta lograr la completa maduracin, la hace ideal para el transporte a sitios alejados y para almacenamientos prolongados. (Salazar, C.R. 1988). 1.7. COMPOSICIN QUMICA Y VALOR NUTRICIONAL DE LA PAPAYA Dentro de su composicin qumica debemos destacar su riqueza en vitaminas C y en provitamina A, en forma de carotenos dentro de las cuales tiene principalmente: betacarotenos, gamma carotenos, psilon carotenos y criptoxantina, un compuesto que adems de transformarse en vitamina A en nuestro organismo, presenta propiedad antioxidante, atribuyndosele accin preventiva frente al cncer y la enfermedad cardiovascular. Tambin destaca la presencia de vitaminas del grupo B como son vitamina

B1, B2 y B3. En cuanto a los minerales, la papaya es rica en potasio y contiene cantidades apreciables de calcio, magnesio, fsforo y hierro. La papaya contiene una alta proporcin de agua, siendo por el contrario su contenido en nutrientes energticos (hidratos de carbono, protenas y grasa) muy bajo. (http://www.lapapaya.info/cat/la-papaya/1). En papayas de pulpa roja, el pigmento o colorante natural ms importante es el licopeno. En papayas de pulpa ms amarillenta, los pigmentos ms abundantes son el grupo de las criptoxantinas. La intensidad del color depende de la concentracin del pigmento, la cual vara de una localidad a otra. En pulpas rojizas, los carotenos constituyen un 10% de los pigmentos, mientras que en pulpas anaranjadas alcanzan un 30%. La pulpa contiene muy pocos cidos orgnicos (0.099%) y stos son una mezcla de 50% de cido ctrico y 50% de cido mlico. (Gua tcnica. Cultivo de lechosa). En la Tabla 2 se presentan los contenidos de humedad, protenas, carbohidratos, lpidos, minerales y vitaminas de la papaya. (Gua tcnica. Cultivo de lechosa). Tabla 2. Contenido de nutrientes en 100 g de pulpa fresca de papaya.

Los compuestos voltiles determinan el olor y el sabor de las frutas. Se han detectado unos 134 compuestos voltiles en la papaya, la mayora identificados desde 1985. Los compuestos voltiles ms importantes de la pulpa de la papaya son el linool, el bencil isotiocianato y el cido butanico en la pulpa, encontrndose otros 20 compuestos de menor importancia. (Gua tcnica. Cultivo de lechosa). El bencil isotiocianato le da a la papaya su olor fuerte caracterstico. El linool es responsable del sabor y el aroma de la pulpa madura. Casi todos estos compuestos se encuentran conjugados en el fruto, liberndose cuando las clulas se rompen durante el corte o consumo de las frutas. (Gua tcnica. Cultivo de lechosa). 1.8. PRINCIPALES PASES PRODUCTORES DE PAPAYA Tabla 3. Principales pases productores de la papaya (periodo 1990-1997).

(FAO. 1999. Production Yearbook). 1.9. IMPORTANCIA DE LA PAPAYA EN VENEZUELA En la Venezuela Rural antes de la aparicin del petrleo el pas basaba su economa en una agricultura de subsistencia donde se desarrollaban diferentes rubros agrcolas para asegurar la alimentacin de sus pobladores, aprovechando y explotando al mximo sus espacios agrarios. En Venezuela hay extensas reas que se ajustan a las necesidades edafoclimticas de una amplia gama de especies, pero el escaso nmero de frutas comercialmente explotadas, el empleo de un referencial tecnolgico tradicional y la

ausencia de Normas de Calidad, inciden negativamente en la productividad y en la mayor participacin de nuestro pas en los mercados internacionales. En Venezuela es un problema la falta de Asociaciones de productores en base a un determinado cultivo como lo hay en otras naciones de Latinoamrica. En el estado Lara los productores de frutas y hortalizas se organizaron en asociaciones, y esta experiencia les demostrado la importancia de formar cooperativas. Son movimiento que a la larga permiten un buen desarrollo y comercializacin de los productos.

Tabla 4. Empresas procesadoras de frutas en Venezuela.

Empresa Frutos Procesados (Fruproanca).

Ubicacin Los Andes, Estado Mrida.

Logo

Funcin Deshidratacin de frutas. Procesamiento de frutas y hortalalizas. Procesamiento de frutas y hortalizas. Procesadora de frutas (pulpa de frutas)

Cideri Finca Lagunaja Profumeca

Estado Bolvar.

Estado Aragua Estado Carabobo

1.10.

USOS POTENCIALES DE LA LECHOSA EN VENEZUELA

El dulce de lechosa, es un dulce tradicional de Venezuela, formando parte de la gastronoma tpica de este pas, se conforma de las laminas o cortes del fruto conocido como lechosa en su pas de origen o papaya. Este plato se realiza en distintas regiones venezolanas y tiene un consumo ms alto y tpico en la poca de Navidad, siendo uno de los elementos caractersticos de estas fiestas y en las mesas los 24 y 31 de diciembre.

Este dulce se elabora teniendo como elemento principal la pulpa en laminas o cortes de la lechosa verde o que no este madura, siendo estos diferentes cortes de formas segn la regin o el gusto de quien lo prepare, se puede realizar entonces con largas lonjas, pequeos trocitos, finos o gruesos cortes de mediano tamao de la fruta en cuestin. Los otros ingredientes que conforman este dulce son el papeln como originalmente se prepara o se puede utilizar en cambio el azcar como muchos hoy en da lo hacen, esto se complementa con una cucharada de bicarbonato, clavos de olor y agua. Luego Las tiras o cortes de lechosa son rociadas con el bicarbonato y se dejan as por unas horas y posteriormente esto pasa a ser cocinado generalmente en una olla grande donde se adiciona el azcar o papeln y se coloca un poco de agua, se ponen los clavos y luego se dejan en una lenta coccin hasta que la lechosa se cristalice y se ablande al gusto. La fruta liberara ms lquido por lo que no es necesario agregar mas agua. Al estar lista se deja reposar y se sirve en frascos o envases de vidrios para ser guardados en la nevera donde tomaran su temperatura adecuada para poder ser degustados. El dulce de lechosa sirve como regalo, merienda, postre o como el clsico dulce de la poca decembrina venezolana, pudiendo realizarse tanto en las cocinas convencionales como en los fogones de lea de las distintas regiones Venezuela, sobre todo en la oriental del pas.

Figura 1. Dulce de lechosa.

2. GENERALIDADES DE LAS ENZIMAS

Esta seccin se dedico a conocer sobre las enzimas, propiedades de las enzimas, clasificacin, especificidad y condiciones que afectan la actividad enzimtica, temas pertenecientes al rea de la de la bioqumica, de total innovacin en la malla de procesos qumicos y que permiti definir las condiciones en la que se trabajo as como el ambiente propicio para el mejor aprovechamiento de la enzima. 2.1. DEFINICIN DE ENZIMA Una enzima es una molcula proteica globular capaz de catalizar y acelerar reacciones qumicas especficas, en un factor de 1012 a 1020 respecto a las reacciones no catalizadas enzimticamente (Madigan y col., 1999; Whitaker, 1994).La actividad molar de las enzimas es muy alto; una molcula de enzima puede transformar hasta 600,000 molculas de sustrato por segundo, como es el caso de Anhidrasa carbnica, 12,500 para lactasa y 700 para invertasa (Fennema, 1993).

En una reaccin catalizada por una enzima: a) La sustancia sobre la que acta la enzima se denomina sustrato. b) El sustrato se une a una regin especfica de la enzima, llamada centro activo

y forma un estado intermedio denominado complejo enzima-sustrato. El centro activo comprende un sitio de unin formado por los aminocidos que estn en contacto directo con el sustrato y un sitio cataltico, formado por los aminocidos directamente implicados en el mecanismo de la reaccin. c) Una vez formados los productos, la enzima regresa a su forma inicial y puede comenzar un nuevo ciclo de reaccin (Boyer, 2000).

2.2. PROPIEDADES Por tener una estructura proteica, las enzimas poseen una conformacin natural ms estable que las dems conformaciones posibles, en la cual son funcionales, de modo que los

cambios en la conformacin de las enzimas suelen ir asociados con alteraciones en su actividad cataltica. Las enzimas son catalizadores especficos, cada enzima cataliza un solo tipo de reaccin y casi siempre acta sobre un nico sustrato o sobre un grupo muy reducido de ellos. Tienen una alta eficiencia y no se consumen en las reacciones, por tales razones, con poca cantidad de ellas se pueden transformar en producto grandes cantidades de sustrato. En las reacciones reversibles, las enzimas pueden actuar tanto en un sentido de la reaccin como en el otro, dependiendo de la concentracin del sustrato (Boyer, 2000). 2.3. CLASIFICACIN DE LAS ENZIMAS Muchas enzimas se han nombrado aadiendo el sufijo asa al nombre del sustrato o a una palabra que describe su actividad. As la ureasa cataliza la hidrlisis de la urea y la DNA polimerasa cataliza la sntesis de DNA. Otras enzimas, tales como la pepsina y la tripsina tienen nombres que no se refieren a sus sustratos. A veces la enzima tiene dos o ms nombres, o dos enzimas diferentes tienen el mismo nombre. Debido a tales ambigedades y al nmero siempre creciente de enzimas descubiertas, se ha adoptado por acuerdo de la Unin internacional de Bioqumica un sistema de nomenclatura y clasificacin de enzimas (Tabla 5). Este sistema distribuye las enzimas en seis clases principales, cada una de ellas con diferentes subclases, segn el tipo de reaccin catalizada (Lehninger, 1993).}

Tabla 5. Clasificacin internacional de enzimas (Lehninger, 1993).

N Clase Reaccin catalizada

1 2 3

Oxireductasas Transferasas Hidrolasas

Transferencia de electrones (iones hidruros o tomos de H) Reacciones de transferencia de grupos Reaccin de hidrlisis (transferencia de grupos funcionales del agua) Adicin de grupos a dobles enlaces, o formacin de dobles enlaces por eliminacin de grupos Transferencia de grupos dentro de la molcula dando formas isomricas Formacin de enlaces C-C, C-S, C-O y C-N,

Liasas

Isomerasas

Ligasas

mediante reacciones de condensacin acopladas a la rotura de ATP

2.4. PROTEASAS Las proteasas, conocidas tambin como peptidasas o enzimas proteolticas, catalizan reacciones de hidrlisis, que rompen los enlaces peptdicos de las protenas o de las cadenas polipeptdicas y dan como resultado pptidos ms pequeos o aminocidos libres. Las proteasas que se encuentran en los organismos vivos, estn implicadas en una gran variedad de reacciones fisiolgicas; desde la digestin de las protenas de los

alimentos hasta procesos altamente regulados, como la coagulacin sangunea, la muerte celular y la diferenciacin de tejidos (Gonzlez, 2004). 2.5. PAPANA La papana es una enzima proteoltica que se obtiene del ltex de frutos verdes de papaya (Carica papaya). Posee un peso molecular de 23 kDa y est formada por una cadena peptdica de 211 residuos de aminocidos.

La papana se activa mediante agentes reductores, como cistena, cianuro de sodio o sulfitos y es inactivada por agentes oxidantes, como los iones de metales pesados e incluso el oxgeno atmosfrico. El pH ptimo de esta proteasa se encuentra entre 6 y 7; mientras que su punto isoelctrico corresponde a un pH de 9,6 (Worthington, 2008). La temperatura ptima para la accin de la papana es de 65 C (Sigma, 2008). La papana, en forma de suspensin, es estable a 5 C durante 6 a 12 meses. El EDTA, la cistena y el dimercaptopropanol son agentes estabilizadores. La actividad de la papana puede ser determinada mediante la velocidad de hidrlisis de una protena o de sustratos sintticos de bajo peso molecular, tales como steres o amidas derivadas de aminocidos (lvaro y otros, 2002). La papana es empleada en varias industrias de gran importancia, como en la industria cervecera, para la prueba de enfriamiento de la cerveza; en la industria farmacutica como sustancia auxiliar de la digestin, en tratamientos de enfermedades de la piel y en diversas preparaciones medicinales. Tal vez su uso industrial ms importante es como ablandador de carne. Tambin se la emplea en el desgomado de la piel, para la elaboracin de cueros; en detergentes; en la elaboracin de quesos y panes; en preparados de protenas modificadas para alimentacin humana y animal; en el procesamiento de fibras textiles y en el tratamiento de efluentes industriales (Glibota y otros, 2000). Su importancia econmica es considerable puesto que representa las dos terceras partes del mercado de enzimas. El crecimiento del negocio relacionado con ella ha sido tal en los ltimos aos, que en la actualidad se calcula en unos 100 millones de dlares anuales, de los cuales el 70% pertenece a las industrias relacionadas con la alimentacin (Hernndez, 2007). 2.6. QUIMOPAPANA La quimopapana, con caractersticas similares a la anterior, est constituida por 218 aminocidos y es la cisteinproteasa ms abundante en el ltex de la papaya. Segn se recoge en Martindale: es una enzima proteoltica aislada del ltex de la papaya (Carica papaya) que se diferencia de la papana en la movilidad electrofortica, la solubilidad y la especificidad del sustrato.

2.7. BROMELINA La bromelina es una cisteno proteinasa aislada y purificada a partir de los rganos de plantas de pia (Ananas comosus), que pertenece a la familia de la papana (Rowan y otros, 1990). El peso molecular de la bromelina es de aproximadamente 33 kDa. El punto isoelctrico de la bromelina de tallo es 9,5 el de la bromelina de fruta es relativamente ms bajo. La cistena y el cianuro de sodio funcionan como activadores de la bromelina. El pH ptimo de esta enzima es de 7 y la temperatura ptima es 60 C (Hernndez y otros, 2005). Con respecto al almacenamiento, esta enzima se mantienen estable a -20 C, en forma seca (Brenda, 2007). La bromelina posee diversas aplicaciones industriales. Esta enzima es utilizada en la obtencin de hidrolizados de protenas para alimentacin animal y humana. En la industria alimenticia se emplea para ablandar las envolturas de las salchichas. Puede sustituir a la papana en el tratamiento para clarificacin y almacenamiento de cerveza, para ablandar carne y para la hidrlisis de gelatina (Hernndez y otros, 2005).

2.8. FICINA La ficina es una enzima proteoltica que se obtiene del ltex de los rboles del gnero Ficus, como Ficus glabrata, Ficus elstica y Ficus carica. Tiene caractersticas similares a la papana, con respecto a sus condiciones ptimas de pH, temperatura y estabilidad (lvaro y otros, 2002). La cistatina y el cido iodoactico son inhibidores de la ficina, mientras que la cistena y el mercaptoetanol son activadores de esta enzima. El pH ptimo de la ficina es 7,5. A un pH de 5,0 esta enzima tiene un 50% de su actividad mxima y a un pH de 9,0 tiene un 55% de su actividad mxima (Brenda, 2008). Las soluciones acuosas de ficina pierden actividad despus de prolongados periodos de almacenamiento, en estado congelado. Mientras que, a temperatura ambiente, pierde un 10% de su actividad por ao (lvaro y otros, 2002).

La ficina puede ser empleada en todas las industrias que usan otras proteasas vegetales. En Per, el producto se conoce como leche de oje, y se usa como antihelmntico humano, por su accin proteoltica (Giove, 1996).

2.9. CARICANA Tambin conocida como papaya peptidasa II, la caricana digiere las protenas, rompiendo los enlaces peptdicos. Comparado con otras enzimas presentes en la papaya, la caricana se considera extremadamente alcalina. Al igual que otras enzimas de la papaya, la caricana es un antiinflamatorio y es eficaz para romper protenas complejas en simples aminocidos.

2.10.

CONDICIONES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

Entre las condiciones que afectan la actividad enzimtica de las enzimas se encuentran las siguientes: a) Concentracin de la enzima b) Concentracin del sustrato c) pH d) Temperatura. 2.10.1. CONCENTRACIN DE LA ENZIMA Y EL SUSTRATO Algunas enzimas permanecen libres en condiciones bajas de sustrato y no se alcanza la mxima velocidad. Cuando el sustrato se encuentra en exceso, toda la enzima se transforma en ES y la reaccin se realiza a su mxima velocidad. Finalmente la reaccin entra en equilibrio cuando no ocurren ms cambios. Sin embargo si el producto P se quita despus de que se produjo impedir el establecimiento del equilibrio; por lo tanto el sustrato S se seguir convirtiendo en producto P .En la Figura 2 (a) se observa el efecto de la concentracin del sustrato sobre el ndice de la actividad enzimtica. El ndice aumenta rpidamente con incremento inicial en el sustrato; incrementos posteriores en las concentraciones del sustrato no tienen efecto sobre el ndice; ya que este

se vuelve independiente de la concentracin del sustrato, el mismo efecto ocurre con un incremento de la concentracin de la enzima, como se aprecia en la Figura 2.8 (b).

Grafico 1. (a) El efecto de la concentracin del sustrato y (b) el efecto de la concentracin de la enzima en la actividad enzimtica. (Lehninger, 1993).

2.10.2. EFECTO DEL PH La mayora de las enzimas poseen un pH caracterstico en el cual la actividad es mxima; por encima o por debajo de este pH la actividad disminuye. Aunque los perfiles de las curvas de actividad en funcin del pH de muchas enzimas son acampanados, pueden variar considerablemente de forma (Figura 2). La relacin entre el pH y la actividad de cualquier enzima depende del comportamiento cido base de la enzima y del sustrato, ya que este afecta el grado de ionizacin de los aminocidos del sitio activo tanto del sustrato como del complejo enzima-sustrato, e influyendo en la afinidad que tenga la enzima por el sustrato (Badui, 2000). La forma de la curva de actividad - pH vara con la concentracin del sustrato, ya que el valor de KM de muchas enzimas varan con el pH (Whitaker, 1994). Estas curvas son mucho ms significativas si la enzima se mantiene saturada con el sustrato en todos los valores de pH a los que se experimenta. En muchos estudios de cintica enzimtica, el pH se mantiene constante al, o muy prximo pH ptimo.

El pH ptimo de una enzima no es necesariamente idntico al pH de su entorno intracelular normal, el cual puede hallarse a su vez en la pendiente de su curva ascendente o descendente. Grafico 2. Efecto del pH sobre la actividad enzimtica.

2.10.2.1. EFECTO DEL PH EN LA ESTABILIDAD DE LA ENZIMA El pH influye directamente en la estabilidad de la enzima respecto al tiempo (Figura 3), es decir, en el pH ptimo de la enzima, sta suele ser razonablemente estable a lo largo de los ensayos enzimticos, pero fuera de este rango de pH hay una prdida, como se muestra en la Figura 3, para el caso de la pepsina, la enzima proteoltica del estmago, cuyo pH ptimo es de 2.0 pero se desnaturaliza rpidamente a pH mayor a 8.0 (Whitaker, 1994).

Grafico 3. Representacin esquemtica de la velocidad d inactivacin de las enzimas a diferentes valores de pH.

2.10.3. EFECTO DE LA TEMPERATURA Al igual que ocurre con la mayora de las reacciones qumicas, la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas se incrementan en general con la temperatura, dentro del intervalo en que la enzima es estable y permanece totalmente activa. La velocidad de muchas reacciones se duplica, aproximadamente por cada 10 C de aumento de temperatura (Q10 = 2.0). Sin embargo el coeficiente de temperatura Q10, vara de una enzima a otra segn la energa de activacin de la reaccin catalizada, es decir, de la altura de la barrera de energa para pasar al estado de transicin. Aunque las reacciones catalizada por las enzimas parecen con frecuencia, poseer una temperatura ptima como se muestra en la Figura 4, donde se representar la actividad cataltica frente a la temperatura, estas enzimas al ser protenas, se desnaturalizan por la accin del calor y se inactivan cuando la elevacin de temperatura sobrepasa un cierto punto. La aparente temperatura ptima es por tanto, la resultante de dos procesos: 1) el incremento habitual de la velocidad de reaccin con la temperatura. 2) el incremento de la velocidad de desnaturalizacin trmica de la enzima al sobrepasar una temperatura crtica. Aunque la mayora de las enzimas se inactivan a una temperatura comprendidas entre 55 y 60C, algunas de ellas son completamente estables y conservan su actividad a temperaturas muy superiores, por ejemplo las enzimas de diversas especies de bacterias termfilas. En cambio temperaturas extremadamente bajas, detienen la actividad enzimtica pero no las destruyen. Muchas enzimas se pueden conservar mantenindolas a 0C o temperaturas ms bajas.

Grfico 4. Efecto de la temperatura en la actividad enzimtica.

2.10.3.1. EFECTO DE LA TEMPERATURA EN LA ESTABILIDAD DE LA ENZIMA Cabe mencionar, que an las enzimas estando en su aparente temperatura ptima suelen perder actividad enzimtica dependiendo de la duracin del ensayo (Patnaik, 2002). La estabilidad trmica puede determinarse incubando la enzima en ausencia del sustrato, a diferentes temperaturas, de esta se toma una alcuota en la cual de determina su actividad enzimtica a diferentes tiempos. Dando los resultados que se muestran en la Figura 5. Donde la enzima es completamente estable (o al menos el % de prdida es menor) en un rango de 20 a 30C, pero a temperaturas mayores de 40C las enzimas pierden un % de actividad, siendo ms notorio a temperaturas como 60 y 70C. (Pandey y col, 2003; Whitaker, 1994). Grfico 5. Efecto de la temperatura en la estabilidad de las enzimas.

2.11.

OTRAS

CONDICIONES

QUE

AFECTAN

LA

ACTIVIDAD

ENZIMTICA

2.11.1. OXIDACIN QUMICA Agentes oxidantes como yodo, bromo, perxido de hidrgeno, el oxgeno y los metales pesados inactivan la enzima. Esto se explica debido a la participacin de

sulfhidrilos en la accin cataltica de la enzima, que se activa en estado reducido y se inactiva al oxidarse. 2.11.2. OXIDACIN POR LUZ Se inactiva con luz ultravioleta, oxidndose rpidamente por exposicin a los rayos solares y el oxgeno. 2.11.3. CRECIMIENTO MICROBIANO Debido a la naturaleza proteica del ltex y a la forma de recoleccin, est propenso a contaminacin por micro-organismos, que realizan sobre ste accin putrefactiva. 2.11.4. MTODOS DE SECADO Al ser la papana un compuesto fcilmente alterable por agentes tales como el oxgeno, la luz solar y la temperatura, el sistema de secado determina la calidad de la enzima. El secado solar, rinde un producto de baja actividad proteoltica, por lo que no se recomienda utilizar. El secado por corrientes de aire caliente, rinde un producto de mejor calidad que el mtodo anterior, ms claro y con mayor actividad proteoltica. El secado al vaco, rinde un producto de alta actividad proteoltica, blanco, cremoso. Su actividad es mayor debido a que durante el proceso de secado, el producto no est en contacto con el aire. La papana en polvo secada por aspersin es de alta calidad aunque es ms susceptible a la prdida de actividad proteoltica si se almacena por largos periodos de tiempo. El secado por liofilizacin permite obtener un producto con una actividad proteoltica superior a los mtodos anteriores.

2.12.

ESPECIFICIDAD DE LAS ENZIMAS

Las enzimas son altamente especficas para las reacciones que catalizan. Esto es que cada enzima cataliza un nico tipo de reaccin qumica, es decir, su intervalo de accin se limita a un determinado tipo de compuestos que deben reunir ciertas caractersticas para que puedan ser usados como sustrato. Esta especificidad est relacionada con la estructura tridimensional de la molcula enzimtica, as como la interaccin entre el sustrato y la enzima a travs del centro activo, dependiendo de la naturaleza de las interacciones entre estos, normalmente de las fuerzas dbiles, tales como puentes de hidrgeno, fuerzas de Van Der Waals e interacciones hidrfobicas (Madigan y col, 1999).

2.12.1. TIPOS DE ESPECIFICIDAD DE LAS ENZIMAS Los tipos de especificidad de las enzimas se han dividido en cuatro grupos, stos son: baja especificidad, especificidad de grupo, especificidad absoluta y especificidad estereoqumica. 2.12.1.1. BAJA ESPECIFICIDAD Se denomina como enzima de baja especificidad cuando la enzima no discrimina entre sustratos, sino que se muestra especfica nicamente para el enlace a atacar (Badui, 2000). 2.12.1.2. ESPECIFICIDAD DE GRUPO La especificidad de grupo se presenta cuando las enzimas actan sobre un sustrato que contiene un determinado enlace y un grupo qumico especfico al lado de ste; por ejemplo la Tripsina es especfica para los enlaces pptido en el lado carboxilo de la arginina y la lisina; igualmente las proteasas vegetales (papana y ficina) hidrolizan la unin adyacente a aminocidos bsicos, leucina o glicina; por su parte, la pepsina acta sobre los enlaces que contienen aminocidos aromticos o cidos dicarboxlicos (Badui, 2000). 2.12.1.3. ESPECIFICIDAD ABSOLUTA

Se habla de especificidad absoluta cuando la enzima slo ataca a un sustrato y cataliza slo una reaccin. La mayora de las enzimas pertenecen a esta categora (Badui, 2000). 2.12.1.4. ESPECIFICIDAD ESTEREOQUMICA La especificidad estereoqumica se refiere a que normalmente utilizan D o L ismeros como sustrato; por ejemplo, todos las monosacridos en la naturaleza son D, mientras que los aminocidos pertenecen a la serie L; esta especificidad se entiende si se considera que las enzimas son polmeros integrados por L-aminocidos y que, consecuentemente, tienen una estructura asimtrica (Badui, 2000).

2.13.

APLICACIONES DE LAS ENZIMAS EN LA INDUSTRIA

Hoy en da la tecnologa enzimtica ocupa un lugar preponderante dentro de la biotecnologa. Alrededor de un 65% de las enzimas proteolticas o proteasas que se producen industrialmente estn de una u otra manera relacionadas con la industria alimentaria, entre los usos mas comunes se encuentra la maduracin de quesos, ablandadores de carnes, produccin de hidrolizados de protena, fabricacin de pan, por mencionar algunos (Mitra y col., 1996; Pandey y col., 2003); aunque es conveniente sealar que con las proteasas alcalinas empleadas en detergentes ocupan 25% del total de la distribucin, el 10% restante corresponde en las reas farmacuticas y analtica (Garca y col., 1993). Actualmente se conoce la existencia de ms de 2,000 enzimas, de las cuales muchas de ellas han sido aisladas, purificadas y cristalizadas gracias a la experiencia ganada en este terreno (Prave y Faust, 1987). En la Tabla 5 se muestran algunas enzimas de uso industrial, as como sus aplicaciones (Prave y Faust, 1987; Bakir y col., 2001, Garca y col., 1993).

Tabla 6. Enzimas de uso industrial.

Las bacterias producen principalmente proteasas alcalinas mientras que las proteasas provenientes de hongos pueden ser cidas, neutras y alcalinas; lo que ofrece una gran ventaja ya que pueden crecer tanto en medio slidos como lquidos. Gracias a que los hongos como Aspergillus oryzae y Rhizopus oryzae son productores de proteasas alcalinas as como de - amilasas, glucosamilasas, lactasas, celulasas, lipasas y pectinasas; estos crecen naturalmente en medios slidos y se pueden emplear en la fermentacin en medio slido utilizando generalmente salvado de trigo como soporte, adems que las enzimas que se extraen de este sistema son de mejor calidad y se necesitan menos solventes para extraerlas (Prave y Faust, 1987). Para la aplicacin industrial de proteasas se recurri inicialmente a la produccin de preparados enzimticos provenientes, en su mayora de tejidos animales y vegetales, al incrementarse la demanda de proteasas como consecuencia de su aplicacin como aditivo

en detergentes utilizados a nivel industrial y domstico, se desarrollaron tecnologas para producir proteasas de origen microbiano, ya que renen propiedades deseables como gran estabilidad en intervalos de pH y temperatura de procesos, as como de la elevada actividad en presencia de compuestos que normalmente inhibiran a las de origen animal y vegetal, adems de ser ms factible su produccin a partir de micro organismos que a partir de tejidos (Cheftel, 1989; Pandey y col., 2003).

3. DESCRIPCIN Y CARACTERIZACIN DEL LTEX DE LAS PLANTAS DEL GNERO Vasconcella. En esta seccin definimos, caracterizamos el ltex, las etapas para la extraccin y purificacin del mismo, e inclusive las distintas pruebas que se le aplicaron a la enzima antes y despus de purificar, cabe destacar que muchas de estas fueron vistas en las catedras de Laboratorio Qumica general (familiarizacin con los equipos, preparacin de soluciones, titulaciones, entre otros), laboratorio de aguas (prueba de jarras, solidos totales, mtodo de muestreo, entre otros) y laboratorio de tcnicas de anlisis (operacin de espectrofotmetros) pertenecientes al pensum de la carrera de procesos qumicos en donde resaltamos que son conocimientos bsicos y que la gran mayora de los mtodos aplicados al estudio de la enzima como tal fueron visto por primera vez en la ejecucin de este proyecto.

3.1. DEFINICIN LTEX El ltex es un fluido lechoso compuesto por un suero lquido que contiene en suspensin o en solucin, una mezcla compleja de componentes. Los botnicos designan el ltex como el citoplasma de los laticferos (las clulas vivas especializadas que lo contienen) y por lo tanto, ste presenta una variedad de organelas celulares, como ncleos mitocondrias, ribosomas, plastidios, vacuolas, aparato de Golgi y retculo endoplasmtico y molculas orgnicas como enzimas, terpenos, alcaloides, vitaminas, carbohidratos, lpidos y aminocidos libres. Los laticferos se encuentran bajo presin positiva, por lo cual, una incisin sobre stos, resulta en una rpida emisin del ltex hacia el exterior. La Figura 6 presenta una fotografa de una papaya a la que se le han realizado varias incisiones para obtener su ltex.

Figura 2. Ltex exudado de papaya. 3.2. PROPIEDADES Y FUNCIN Los principios activos del ltex, responsable de su valor en muchas aplicaciones industriales, son las enzimas proteolticas papana y quimopapana. Se ha demostrado que la conversin de la forma inactiva a la activa, ocurre cuando el ltex es expelido y alcanza un mximo de actividad proteoltica en menos de dos minutos, despus del corte o

pinchazo en la superficie del fruto. Paralelamente a este proceso, se hacen visibles los sntomas de coagulacin del ltex, lo que evidencia que este elemento es un factor de primera lnea de defensa en plantas, pues los cogulos de ltex sellan las heridas y evitan el ingreso de patgenos. El ltex desecado constituye lo que se denomina papana cruda constituida por una mezcla de enzimas proteolticos, papana propiamente dicha, quimopapanas y en menor proporcin papaya proteinasa W y otros. 3.3. PURIFICACIN Y CARACTERIZACIN DE LAS ENZIMAS Un proceso general de purificacin y caracterizacin de enzimas consta de las siguientes etapas: a) Preparacin de la muestra. b) Extraccin de la protena. c) Purificacin primaria.

d) Purificacin secundaria. Cada una de estas etapas se realiza de una forma especfica, de acuerdo con el tejido o muestra del que se parte, la ubicacin de la protena, que puede ser intra o extracelular, la consistencia del extracto enzimtico que se obtenga, la presencia de partculas diferentes a las enzimas de inters y las caractersticas de las enzimas proteolticas que puedan usarse para una purificacin, como peso molecular, punto isoelctrico, entre otras. Por tal razn, la purificacin de enzimas a partir de ltex, deben ser realizados a travs de un proceso determinado por las caractersticas especficas de la fuente, del ltex y de las enzimas que l contiene.

3.3.1.

SELECCIN DE LA FUENTE

Para una adecuada seleccin de la fuente de las enzimas, es necesario considerar los siguientes criterios: a) Tener la cantidad suficiente de tejido o secrecin de la cual se va a aislar la

protena. b) Escoger un tejido o secrecin que contenga un porcentaje significativo de enzimas. c) Determinar las mejores condiciones para la extraccin del tejido o la secrecin vegetal; tales como estado de madurez de la planta o el rgano vegetal, temperatura de extraccin, presencia de estabilizantes o inhibidores, tiempo de extraccin, etc. Estudios realizados recomiendan seleccionar las plantas que tengan frutos verdes, debido a que en ellos se encuentra una mayor cantidad de ltex, con una elevada actividad enzimtica (Reyes, 2 005). d) Mientras se lleva la muestra al laboratorio y se empieza con el aislamiento de las enzimas, mantener el tejido bajo condiciones que contribuyan a una mejor

conservacin del mismo, que no afecten considerablemente a la actividad enzimtica que se va a recuperar. Adicionalmente, es necesario tener en cuenta las precauciones que deben tenerse cuando se trabaja con enzimas. Por ejemplo, considerar que condiciones extremas de temperatura y pH pueden desnaturalizar a las enzimas o afectar irreversiblemente su actividad. Algo similar sucede con la presencia de ciertas sustancias qumicas o incluso con procesos fsicos, como una excesiva agitacin.

3.3.2.

ACONDICIONAMIENTO DEL LTEX

Por lo general, el ltex se comercializa como producto seco, en forma de polvo; de esta forma, se conserva adecuadamente hasta el momento de su utilizacin, aumenta su vida til y se facilita su manipulacin y almacenaje, con respecto al producto fresco (Alcayaga, 2 004). Para tal efecto puede aplicarse uno de los siguientes mtodos: a) Liofilizacin. b) Secado al vaco. c) Secado en estufa, a temperaturas controladas. Adems, es recomendable tener un conocimiento previo de algunas

caractersticas de las enzimas a ser aisladas, con el fin de llevar a cabo un proceso ms acertado, que afecte lo menos posible a la actividad enzimtica deseada. Por ejemplo, es importante saber que las proteasas, en condiciones de baja fuerza inica, se vuelven inestables. Por esa razn, es necesario regular el pH con el uso de soluciones tampn de concentraciones medias y pH generalmente fisiolgico (Universidad de Carabobo, 2 006). Luego de analizar los factores anteriormente mencionados, se procede a determinar el proceso de homogeneizacin que se va a aplicar. Especial cuidado se debe

tener con el tiempo, la temperatura y el pH de trabajo, as como con las operaciones complementarias que se vayan a utilizar, en caso de ser necesarias, como por ejemplo la centrifugacin o la filtracin.

3.3.3. PURIFICACIN DE LAS ENZIMAS La purificacin de las enzimas es un proceso que debe considerar la poca estabilidad que presentan estos biocatalizadores, la generalmente baja concentracin en la que se encuentran en el material de partida y la presencia de otros elementos en el preparado enzimtico (Ayala, 2 005). Existen dos grupos principales de tcnicas de purificacin: las de baja resolucin y las de alta resolucin. El primer grupo corresponde a tcnicas de purificacin basadas en la diferencia de solubilidad. Con ellas se eliminan los contaminantes ms abundantes y se concentra la protena deseada en el preparado. Estas tcnicas poseen una gran capacidad de

procesamiento, pero un bajo poder resolutivo. Entre ellas se encuentra la precipitacin con solventes orgnicos. Las tcnicas de alta resolucin no permiten una purificacin de la protena en un solo paso. Es necesario combinar, complementariamente, varias de ellas para alcanzar una alta pureza. Estas tcnicas tienen un alto poder resolutivo y una baja capacidad de proceso. Entre ellas se pueden mencionar la cromatografa de filtracin en gel y la cromatografa de intercambio inico (Chvez, 1 990). Estas tcnicas de purificacin pueden ser combinadas para obtener mejores resultados en el producto final.

3.3.4.

PRECIPITACIN CON SOLVENTES ORGNICOS

Los solventes orgnicos miscibles con el agua, como el etanol o la acetona, producen una variedad de efectos que, combinados, permiten la precipitacin de las

protenas, al ser adicionados a una solucin acuosa. El principal efecto es la reduccin del poder de solvatacin del agua, que puede ser explicado en trminos de una reduccin de su constante dielctrica. La estructura ordenada del agua, alrededor de los aminocidos hidrofbicos, es desplazada por el solvente orgnico aadido. El efecto neto de este proceso es la disminucin de la solubilidad de las protenas en el medio, debido a lo cual se agregan y precipitan (Calvo, 2003). Los precipitados son agregados de molculas proteicas en cantidad suficiente, de modo que puedan ser centrifugados a una velocidad razonablemente baja (lvaro y otros, 2002). Para la seleccin de un adecuado solvente orgnico se deben considerar los siguientes criterios: a) El solvente debe ser completamente miscible en agua, b) El solvente no debe producir una reaccin con la protena y c) El solvente debe garantizar una precipitacin alta (lvaro y otros, 2 002).

3.3.5.

DETERMINACIN DE

ESPECTROFOTOMTRICA PROTENA EN LOS

DE

LA

CONCENTRACIN OBTENIDOS

EXTRACTOS

Dentro de un estudio enzimtico es importante determinar la concentracin de protena presente en los extractos obtenidos en cada etapa del proceso de purificacin, con el fin de relacionar esta informacin con la actividad enzimtica y conocer el rendimiento y el grado de purificacin en cada paso. Entre los mtodos utilizados para la determinacin de la concentracin de protena, se encuentra el mtodo de absorcin UV a 280nm. Este mtodo permite estimar cuantitativamente dicha concentracin en una muestra, de acuerdo con la Ley de LambertBeer, puesto que las protenas poseen un mximo de absorcin aproximadamente a una

longitud de onda de 280nm, debido a la presencia de aminocidos aromticos, fundamentalmente tirosina y triptfano (Yez, 2 006). En una muestra que contiene protenas, el solvente no debe absorber la luz a 280nm y la solucin debe ser clara e incolora. La turbidez puede producir resultados errneos; entonces, para emplear este mtodo de manera confiable, puede ser necesario realizar un proceso de filtrado, de centrifugacin o de dilucin de la muestra. Este mtodo es rpido y relativamente sensible. Es utilizado frecuentemente en la deteccin post-columna de protenas. Al ser una tcnica no destructiva, la cantidad de muestra empleada para la estimacin cuantitativa, puede ser devuelta a la muestra original (Yez, 2 006). En ptica, la ley de Lambert-Beer es una relacin emprica que combina la absorcin de luz con las propiedades del material atravesado. La Ecuacin 1.1 expresa la relacin entre la absorbancia y la concentracin de una sustancia en una solucin. A=* c*l Donde: A es la absorbancia.

es el coeficiente de extincin, en (mg/ml)-1 cm-1.

c es la concentracin de la sustancia absorbente en la muestra, en mg/ml. l es la distancia que la luz atraviesa por la muestra, en cm.

La ley establece que existe una relacin exponencial entre la transmisin de luz a travs de una sustancia y la concentracin de la sustancia, as como tambin entre la transmisin y la longitud del cuerpo que la luz atraviesa. Si se conoce el coeficiente de extincin () de una molcula determinada y la distancia (l) que el rayo de luz atraviesa por la muestra, la concentracin de la molcula puede ser calculada al medir la absorbancia de la solucin que la contiene.

Para estas mediciones, se pueden utilizar espectrofotmetros que posean doble haz de luz, con el fin de medir el valor exacto de absorbancia de una muestra, al compararlo directamente con un blanco, en cada medicin. Se debe fijar la longitud de onda en el valor en el cual la sustancia analizada presenta una mxima absorbancia, en el rango del espectro visible (400 a 700nm) o en el ultravioleta (200 a 400nm) (Skoog y otros, 2001).

3.3.5.1. UNIDADES ENZIMTICAS La cantidad de enzima en una muestra puede ser expresada en moles, como la de cualquier otro compuesto qumico, o puede ser cuantificada en trminos de actividad enzimtica. La actividad enzimtica es una medida de la cantidad de enzima activa presente y del nivel de actividad de la misma, por lo que su medida es dependiente de las condiciones de trabajo que deben ser especificadas cuando se dan valores de actividad. La actividad expresa la cantidad de sustrato convertido en producto por unidad de tiempo, en un volumen dado de reaccin. En el Sistema Internacional de Unidades la unidad para la actividad cataltica es el katal (kat), pero es una unidad demasiado grande y suele usarse la unidad de actividad enzimtica (U). Su equivalencia est dada por (Gonzlez, 2004): 1 kat = 1 mol sustrato convertido x s-1 = 6 x 107 U 1 U = 1 mol sustrato convertido x min.-1 = 16,67 nkat Otra unidad comnmente usada es la actividad especfica, que se refiere a la actividad de una enzima por miligramo (mg) de protena y se suele expresar en mol/min mg o U/mg. La actividad especfica da una idea de la pureza de la enzima (Gonzlez, 2004). La papana se vende por las siguientes actividades:

FIP units/mg:1 FIP unidad de papana es la cantidad de enzima que hidroliza bajo condiciones estndares 1 mmol de BAEE por minuto. mU BAPA/mg: Una unidad se define como la cantidad de enzima que hidroliza 1mmol de BAPA por minuto bajo las condiciones de ensayo . USP units/mg: 1 USP unidad de actividad de papana es la actividad que libera el equivalente de 1 g of tirosina de un sustrato especfico de casena bajo las condiciones del ensayo, usando la concentracin de enzima que libera 40 g of tirosina por ml de la solucin de la prueba. FCC-PU: La unidad de papana (PU) se define como la cantidad de enzima que libera el equivalente a 1 microgramo de tirosina por hora bajo las condiciones del anlisis. TU/mg: Una unidad de potencia puede ser definida como la unidad que al actuar sobre el sustrato de casena bajo las condiciones especficas produce un microgramo de tirosina por minuto. MCU/mg: Una unidad de coagulo de leche (MCU) es la cantidad de actividad en un ml que har coagular 5ml de sustrato de leche en 60 segundos a 40C. GDU/mg: Una unidad GDU libera la misma cantidad de 1mg de amino nitrgeno a partir de gelatina en 20 minutos a 45C, pH 4.5. En la Tabla 7 se muestran las equivalencias de las principales unidades de medicin de actividad enzimtica Tabla 7. Equivalentes de las principales unidades de medicin de actividad enzimtica.

3.3.5.2. ENSAYOS ESPECTROFOTOMTRICOS Todos los ensayos enzimticos miden la cantidad de sustrato consumido o la cantidad de producto generado en la reaccin, catalizada por las enzimas, durante un lapso de tiempo. Existen diversos mtodos para medir la concentracin de sustratos y productos, con el propsito de determinar la actividad enzimtica. Entre ellos est el mtodo espectrofotomtrico. En los ensayos espectrofotomtricos puede seguirse el curso de una reaccin mediante la observacin de la cantidad de luz absorbida por la solucin, en la que se est dando la reaccin. Para poder utilizar un ensayo de este tipo, debe haber entre los sustratos o los productos alguno que absorba luz a una longitud de onda determinada, y que sea la nica molcula de la mezcla de reaccin que lo hace a esa longitud de onda; de esta forma, se puede observar el aumento o la disminucin de la absorbancia con el transcurso del tiempo (Casamayor y Gonzlez, 2008). Es conveniente realizar un ensayo testigo o blanco, que permita determinar el efecto real que tiene sobre el avance de la reaccin, la presencia de las molculas de inters. 3.4. PROPIEDADES DE LA PAPANA Nombre Cientfico: Ltex de la papaya verde (Carica papaya). Nombre Ingls: Papain Descripcin: La papana es una enzima proteoltica que se obtiene a partir del ltex de la fruta verde de la papaya antes que comience su maduracin. La papana, se caracteriza por ser un polvo amorfo, granuloso de color blanco, grisceo o parduzco; ligeramente

higroscpico e insoluble en agua y en la mayora de solventes orgnicos. Es soluble en alcohol etlico y metlico. Partes de la planta usada: Ltex del fruto verde. Principales componentes: Enzima proteoltica. Actividad Enzimtica: 55.000 calificada en Unidades de tirosina/mg muestra USP/mg, segn mtodo AOAC 971.16 mtodo BAAE. Regulada de acuerdo a pedido del cliente, segn uso y tipo de industria. Estado: Polvo liofilizado Color: Blanco Solubilidad: Soluble en agua, en cualquier proporcin. soluciones orgnicas. pH: 5.0 5.5 en solucin al 5% Estabilidad Trmica De La Actividad Enzimtica: Invariable por largos periodos con almacenamiento refrigerado. Reduccin de actividad enzimtica inferior a 1% despus de seis meses de almacenamiento a temperatura ambiente de hasta 40 C Test Microbiolgico: Plate count maximum: < 500/gr Salmonella: Negativo E. Coli : Negativo Insoluble en alcohol y otras

Empaque: Contenedores de 0.5 gr. a 20 Kg. - Acordar con cliente Humedad: 2% - 4%

3.5. APLICACIONES DE LA ENZIMA PAPANA

3.5.1. EN LA INDUSTRIA BEBIDAS

Las bebidas alcohlicas generalmente son enfriadas antes de su uso, esto tiende a tener el aspecto turbio debido a la formacin de fenoles proteicos-polihdricos complejos durante la elaboracin de la cerveza (la preparacin) y el enfriamiento. La dificultad es vencida debido al empleo de papana, que degrada estos complejos a pequeas partculas que son demasiado pequeas para enturbiar la cerveza. En USA el 80% de las cervezas son hechas con propiedades anticongelantes a travs del uso de papana. (Fernndez, Javier 2005). 3.5.2. INDUSTRIA DE LA CARNE La papana se usa para tenderizar la carne en diferentes procesos. (Fernndez, Javier 2005). 3.5.3. INDUSTRIA FOTOGRFICA La papana se usa en preparativos para la recuperacin de plata de pelculas gastadas en laboratorios de tratamiento fotogrficos. (Fernndez, Javier 2005). 3.5.4. INDUSTRIA LCTEA Es consumida en la fabricacin de queso, con la que se obtienen productos de excelente calidad y cremosos. (Fernndez, Javier 2005). 3.5.5. INDUSTRIA DERMATOLGICA Se usa en ciertas cremas faciales, limpiadoras y de lifting y tambin se usa en pasta de dientes. (Fernndez, Javier 2005). 3.5.6. INDUSTRIA DEL CURTIDO DE CUEROS La papana se usa para alisar los cueros y para la remocin del pelo. (Fernndez, Javier 2005). 3.5.7. INDUSTRIA DE CEREALES Se usa para enriquecer las protenas de los cereales y de alimentos con alto contenido proteico. (Fernndez, Javier 2005)

3.6. PARMETROS FSICOS-QUMICOS 3.6.1. COLOR Para definir color debemos considerar dos conceptos: Color verdadero: Es el color del agua a la cual se ha eliminado la turbiedad Color aparente: Es el color debido a las sustancia en solucin y en suspensin presente en el agua. El color se determina por comparacin visual de la muestra con discos de color calibrados, con patrones de platino-cobalto de concentraciones conocidas. El mtodo normal para la medicin de color es el platino-cobalto y la unidad de color es la producida por 1 mg/l de platino en la forma de ion de cloro platinado.

3.6.2. TURBIDEZ La turbiedad de las aguas se debe a la presencia de slidos suspendidos, tales como arcilla, limo, materia orgnica finamente dividida, plancton y otros organismos microscpicos. La turbiedad es una expresin de la propiedad ptica de una muestra, que hace que los rayos luminosos se dispersen y absorban, en lugar de transmitirse en lnea recta a travs de ella. El mtodo normal para la determinacin de la turbiedad es el mtodo turbidimtrico que implica el uso de un turbidmetro. La determinacin de la turbiedad es aplicable a cualquier muestra de agua que se encuentre libre de basuras o de sedimentos gruesos que se asiente rpidamente, se obtienen resultados falsos por cristalera sucia, presencia de burbujas y por efectos de vibracin que puedan alterar visibilidad en la superficie de la muestra de agua.

3.6.3. pH El pH es el logaritmo de la reciproca de la concentracin de l ion hidrogeno en moles por litro. El pH interviene en el clculo del carbonato, bicarbonato y dixido de

carbono, as como, en el clculo del ndice de corrosin o estabilidad y en el control de los procesos de tratamiento de agua. La escala de pH comprende a la neutralidad exacta a 25 C. Muestra que los trminos Alcalinidad y Acidez indican la reserva total o capacidad amortiguadora de una muestra. El valor del pH representa la actividad instantnea del ion hidrogeno.

3.6.4. DEMANDA QUMICA DE OXGENO (DQO) Se define como la cantidad de oxigeno necesaria para oxidar la materia orgnica presente en un agua, que puede ser oxidada mediante el uso de un agente qumico oxidante en medio acido. Se puede cuantificar con este mtodo la porcin carbonosa de los compuestos de nitrgeno, pero no hay oxidacin del contenido de amoniaco que se libere de las materia proteicas (excepto en la presencia de cloruros). En desechos con cargas toxicas, es el nico mtodo de que nos permite medir la carga orgnica. Consiste en reflujar una muestra con Dicromato de potasio por un periodo de dos horas, durante la cual se oxida la materia orgnica a dixido de carbono y agua. Luego de la digestin, se valora el excedente de Dicromato de potasio con una solucin estandarizada de sulfato ferroso amoniacal, de all se detecta rpidamente la presencia de la especia Cr2O7 -2 en exceso. Ocurriendo las siguientes reacciones: Cr2O7 -2 + 14 H+ + 6e- 2 Cr+3 + H2O 6 Fe+2 Fe+3 + 6eCr2O7 2 + 6 Fe+2 + 14 H+ 2 Cr+3 + 6 Fe+3 + 7 H2O Las especies crmicas de color verde y naranja pueden ser mediadas tambin colorimtricamente con un fotmetro o con un colormetro siendo este el mtodo ms fcil, rpido y suficientemente seguro para todos los propsitos prcticos. A fin de garantizar una completa oxidacin de los compuestos orgnicos como el cido actico, es necesaria la adicin de sulfato de plata como catalizador. Si la muestra contiene cloruros, estos interfieren en el valor de la DQO, ya que pueden ser oxidados por el Dicromato de potasio de acuerdo a la reaccin:

6 Cl + Cr2O7-2 + 14 H+ 3 Cl2 + 2Cr+3 + H2O Esto se previene aadiendo a la muestra de Sulfato de mercurio, el cual forma un ion complejo con el Cloruro, de acuerdo a la siguiente reaccin: Hg+2 + 2Cl HgCl2

3.6.5. NITRGENO TOTAL El nitrgeno total se determina por el mtodo micro Kjeldahl, este mtodo es aplicable a las muestras que contienen concentraciones altas o bajas de nitrgeno orgnico, pero requiere un volumen de muestra relativamente amplio para las concentraciones bajas. El mtodo Kjeldahl determina el nitrgeno en estado trinegativo, no toma en cuenta el nitrgeno en forma de azida, azina, azno, hidrazona, nitrato, nitrito, nitrilo, nitroso, oxima y semicarbonoza. Si se determina individualmente el nitrgeno Kjeldahl y el amoniacal, se puede determinar el nitrgeno orgnico por diferencia. En presencia de H2SO4, sulfato de potasio (K2SO4) y Sulfato mercrico (HgSO4) como catalizador, el nitrgeno amnico de muchas sustancias orgnicas se convierte en Sulfato de amonio [(NH4)2SO4], despus que se descompone por digestin con sulfato de sodio. El amonio libre y nitrgeno-amonio tambin se convierten en sulfato de amonio [(NH4)2SO4]. Durante la digestin de la muestra se forma un complejo mercurio amonio que luego se descompone por el Tiosulfato de sodio (Na2Sco3). Tras la descomposicin, el amoniaco se destila en medio alcalino y se absorbe en acido brico o sulfrico.

3.7. MTODO DE COAGULACIN DE LECHE (BALLS AND HOOVER)

El mtodo de coagulacin de la leche, es, sin duda, uno de los mtodos ms expeditos para determinar actividad enzimtica de una proteinasa. Se toma como ndice de actividad proteoltica, el tiempo necesario para que una cantidad conocida de enzima

coagule un determinado volumen de solucin de leche. La actividad se expresa en trminos de unidades de leche coagulada por g de preparado enzimtico. La unidad de leche coagulada se la define coma la cantidad en peso de un preparado enzimtico necesario para coagular 5 ml de solucin de leche estndar por minuto, cuando la temperatura es de 40C y el pH 6. La principal desventaja de este mtodo radica en el hecho de no medir la protelisis total, es decir, la hidrlisis de un substrato de protena, pero, por el contrario, mide la actividad de la coagulacin de la leche. Afortunadamente, sin embargo, la coagulacin de la leche parece ser una propiedad caracterstica de los componentes proteolticos de este grupo de enzimas y puede ser usada con seguridad en la medicin proteoltica.

3.8. MTODO DE DETERMINACIN DE PROTENAS EN LECHE Este mtodo se basa en la descomposicin de los compuestos de nitrgeno orgnico por ebullicin con cido sulfrico. El hidrgeno y el carbn de la materia orgnica se oxidan para formar agua y dixido de carbono. El cido sulfrico se transforma en sulfato, el cual reduce el material nitrogenado a sulfato de amonio. El amonio se libera despus de la adicin de hidrxido de sodio y se destila recibindose en una solucin de cido sulfrico 0.1N. Se titula el nitrgeno amoniacal con una solucin valorada de hidrxido de sodio 0.1N. En este mtodo se usa el sulfato de cobre como catalizador y el sulfato de sodio para aumentar la temperatura de la mezcla y acelerar la digestin.

3.9. PRUEBA DE JARRAS La prueba de jarras es un procedimiento comn de laboratorio para determinar las condiciones ptimas de funcionamiento para el agua o el tratamiento de aguas residuales. Este mtodo permite realizar ajustes en el pH, las variaciones en la dosis de coagulante o polmero, alternando velocidades de mezclado, o la prueba de coagulante o diferentes tipos de polmeros, a pequea escala con el fin de predecir el funcionamiento de una operacin a gran escala de tratamiento. Una prueba de jarras simula los procesos de

coagulacin y floculacin que fomentan la eliminacin de los coloides en suspensin y materia orgnica que puede conducir a problemas de turbidez, olor y sabor.

Figura 3. Aparato utilizado para prueba de jarras.

3.9.1. DESCRIPCIN DEL EQUIPO El aparato de prueba de jarra (ver figura 3) contiene seis remos que remover el contenido de seis envases de 1 litro. Un envase acta como un control, mientras que las condiciones de funcionamiento puede variar entre los restantes cinco contenedores. Un medidor de RPM en la parte superior central del dispositivo permite el control uniforme de la velocidad de mezclado en todos los contenedores. 3.9.2. TRATAMIENTO FLOCULACIN La coagulacin se refiere a la formacin de flculos precipitados o incipientes, mediante los cambios fisicoqumicos, que se originan entre el coagulante soluble y la alcalinidad del agua. La operacin consiste en agitar suavemente el agua tratada con el coagulante, durante un periodo de tiempo apreciable, para completar las reacciones de coagulacin, hasta alcanzar las condiciones que permitan que el material floculento se junte y adhiera, formando grandes masas de flculos, los cuales se separan de la solucin sedimentndose DE AGUAS POR COAGULACIN-

en el fondo del recipiente. El termino sedimento se refiere finalmente al depsito elevado de flculos en estanques, especialmente diseados para tal fin. Hay cierto nmero de sustancias qumicas que se emplean como coagulantes. El ms comnmente utilizado es en Sulfato de aluminio, denominado comercialmente alumbre. Las reacciones entre el alumbre y los constituyentes naturales del agua estn influenciadas por muchos factores, es por ello que se considera de gran importancia, determinar las dosis de coagulantes que se requiere para lograr la eficiencia del tratamiento. Por lo general se logran mejores resultados con dosificaciones de alumbre que oscilan entre 10 a 50 ppm, determinndose la dosis ptima mediante la prueba de jarra. Esta tcnica consiste en agregar cantidades conocidas de coagulantes a varias jarras de agua que se van a tratar agitando suavemente las mezclas por un periodo de tiempo determinado y observando despus la calidad y caractersticas de sedimentacin de los flculos (Parra y Truchsess 2010).