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Nmero de publicacin: OFICINA ESPAOLA DE

19

PATENTES Y MARCAS

Int. Cl.:

51

2 264 146

C12N 15/62
(2006.01) (2006.01) (2006.01) (2006.01)

C12N 15/14
ESPAA

C12N 15/18 C07K 14/765 C07K 14/61

(2006.01)

12

A61K 38/27
(2006.01) (2006.01) (2006.01)

A61K 38/38 C07K 19/00 T 3

TRADUCCIN DE PATENTE EUROPEA

86 86 87 87
Nmero de solicitud europea: 96942515 .6 Fecha de presentacin : 19.12.1996 Nmero de publicacin de la solicitud: 0870039 Fecha de publicacin de la solicitud: 14.10.1998 recombinantes de fusin respecto a hormona de crecimiento y albmina de suero. 54 Ttulo: Protenas

73 3

Titular/es: Novozymes Delta Limited Castle Court 59, Castle Boulevard Nottingham NG7 1FD, GB

4
1 6

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Inventor/es: Ballance, David, James

4 5

Fecha de la publicacin del folleto de la patente: 16.12.2006

74

E S 2 2 6 4 1
V e

4 6 T 3

En el pl a z o

Agente: Urizar Anasagasti, Jos Antonio dcontar desde la como efecha de formulada publicacin en el una vez que nBoletn europeo se haya ude patentes, de la realizado el emencin de pago de la vconcesin de la tasa de epatente europea, oposicin cualquier persona (art. 99.1 del m podr oponerse Convenio eante la Oficina sobre sEuropea de concesin ePatentes a la de Patentes spatente Europeas). aconcedida. La oposicin deber

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DESCRIPCIN Protenas recombinantes de fusin respecto a hormona de crecimiento y albmina se suero.

15 Campo de la invencin
La presente invencin se relaciona con protenas recombinantes de fusin, una hormona de crecimiento (GH), una albmina de suero y a la produccin de protenas en levadura.
1 0

Antecedentes de la invencin, y estado anterior de la tcnica La albmina de suero humano (HSA) es una protena de 585 aminocidos, que es responsable de una proporcin significativa de la presin de osmtica de suero y tambin funciona como un portador de ligandos endgenos y oxgenos. Actualmente, HSA es producido para uso clnico desde extracciones de sangre humano. La produccin de HA de recombinante (rHA) en microorganismos ha sido descubierto en EP 330 451 y EP 361 991.
El papel de albmina como una molcula portadora y su naturaleza inerte son las propiedades deseables para ser usado como un estabilizador y transportador de polipptidos. El uso de albmina como un componente de una protena de fusin para otras protenas estabilizadoras ha sido descubierto en WO 93/15199, WO 93/15200, y EP 413 622. El

1 5

20

uso de fragmentos N - terminal de HSA para fusiones de polipptidos tambin ha sido descubierto (EP 399 666). La fusin para dichos polipptidos es lograda por manipulacin gentica, de forma que el ADN que codifica para HSA, o un fragmento de ella, es unido al ADN que codifica para dicho polipptido. Un hospedero apropiado es luego
transformado o transfectado con la secuencia del nucletido fusionado, tal arreglo sobre un plsmido apropiado para expresar un polipptido de fusin. Nomura y col. (1995) intent expresar la apolipoprotena E humana en S. cerevisiae como una protena de fusin con HSA o fragmentos de HSA, usando una pre-secuencia de HSA por secrecin directa. Mientras la fusin para HSA a longitud completa result en la secrecin de niveles bajos de la protena en el medio (se cosecha mximo 6.3 mg/L), la fusin para HSA (1-198) HSA (1-390) no result en la secrecin en al medio.

25

Lo hormona de crecimiento humana (examinada por Strobl y Thomas, 1994) consta de un polipptido simple de

30

35

191 aminocidos, internamente entrelazado por dos puentes disulfuro. Dos molculas de receptor hGH (Hormona de crecimiento humano, siglas en su expresin inglesa) obligan que cada molcula de hGH facilite la seal de transduccin (Cunningham y col., 1991; de Vos y col., 1992). El C - terminal de la molcula de hGH est involucrado en la unin de primera molcula del receptor, pero en la extensin del N - terminal no es conocido que este involucrado en la unin con el receptor. La hormona es segregada de la glndula pituitaria anterior bajo el control de hipotlamo, y es responsable el N - terminal en un amplio rango de los efectos de promocin del crecimiento en el cuerpo. Clnicamente, el hGH es usado en el tratamiento del enanismo de hipopituiaria, la insuficiencia renal crnica en la infancia, fracturas de hueso y quemaduras. Los mtodos en curso para la produccin de hGH para uso teraputico son por la extraccin de la glndula pituitaria humana, por expresin en Escherichia coli recombinante como fue descubierto en EP 127 305 (Genentech) en cultivos de clulas de mamferos (Zeisel y col., 1992).
Adems, la hGH ha sido expresada intracelularmente en levadura (Tokunaga y col., 1985) y este organismo puede proporcionar medios alternativos de la produccin como fue descubierto en EP 60 057 (Genentech). Tsiomenko y col. (1994) reporta sobre el papel de la secuencia de prepro de MF -1 de la levadura en la secrecin de hGH. El adjunto de la secuencia pre-pro para el gene de hGH result en la acumulacin de hGH en el periplasma y en las vacuolas,

40

45 mientras el adjunto de la parte pro de hGH result en la expresin de un precursor no glicosilado

50

localizado dentro de la clula. Solamente cuando ambas partes de la secuencia leader fueron fijadas al gen de hGH fue secretado la hGH en el medio de cultivo. La otra seal de secrecin (pre- secuencias) fueron tambin menos efectivas que la secuencia pro usada y obtenida de la levadura, sugiriendo que tal secuencia pro es usada como crtica en la secrecin eficiente de la hGH en la levadura.
En los seres humanos, la hGH es secretada a la sangre en pulsos, y en la circulacin tiene un tiempo de vida media menor de 20 minutos (Haffner y col., 1994). La eliminacin de la hormona es principalmente va el metabolismo en el hgado y los riones y es ms rpido en los adultos que en los nios (Kearns y col., 1991). El tratamiento para la deficiencia de hGH dura de 6 a 24 meses, durante la que se administra la hGH tres veces por semanas intramuscular-

55

mente o diariamente en general subcutneamente. Tal rgimen de administracin frecuente es necesario debido a la corta vida de la molcula.
Poznansk y col. (1988) incrementan el tiempo de vida de la hormona de crecimiento porcina por la conjugacin con albmina de suero porcina o humana (HSA) para formar un conjugado relativamente grande de aproximadamente 180

60

kD. La reaccin qumica usando el reactivo glutaraldehdo result por trmino medio, en dos molculas de albmina complejas con seis molculas de hormona de crecimiento. El conjugado de 180 kD que da como resultado fue encon-trado tener un tiempo de vida prolongada en la circulacin de ratas de 2 a 3 horas, comparado con los 5 minutos para la hormona de crecimiento no conjugada. El ensayo de actividad muestra que el conjugado retenido completamente conserva la actividad completa, y posiblemente aumenta la actividad in vitro, pero es inactivo in vivo.

65

La WO 94/03/98 descubri formulaciones estabilizadas de hGH que contenan un agente tensioactivo no inico. La EP 314 641 descubri el uso de seal de secrecin de albmina para obtener la secrecin de polipptidos en levadura. La WO 93/15199 descubre fusiones de albmina y varios polipptidos.

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Resumen de la invencin
La invencin se relaciona con protenas formadas por la fusin de una molcula de albmina, o variantes o fragmentos de ella, una molcula de hormona de crecimiento o variantes o fragmentos de ella, protenas de fusin que

15 tienen un aumento en el tiempo de vida circulatorio sobre la hormona de crecimiento no fusionada. Por conveniencia,
haremos referencia a albmina humana (HA) y a hormona de crecimiento humana (hGH), pero la albmina y las hormonas de crecimiento de otros vertebrados son incluidas tambin. Preferentemente, la protena de fusin comprende HA, o una variante o fragmento de ella, como la parte N - terminal, con hGH o una variante o fragmento de ella, como la parte C terminal para minimizar cualquier efectos en contra posibles sobre la unin del receptor. Por otra parte,

10

una protena de fusin que comprende HA, o una variante o fragmento de ella, como la parte C - terminal, con hGH o una variante o fragmento de ella como la parte N - terminal, podra ser tambin capaz de una seal de transduccin. En general, el polipptido tiene solamente una regin derivada HA y una regin derivada GH.
Adems, las protenas de fusin de la invencin podran incluir un pptido de enlace entre las dos partes unidas

15 para proporcionar una separacin fsica ms grande entre los dos mitades y maximizar la disponibilidad
de la parte de hGH, para unir el receptor de hGH. El pptido enlace podra constar de aminocidos de forma que es flexible o ms rgido.
La secuencia de enlace podra estar anclada por una proteasa o qumicamente producir la mitad de la hormona

20

de crecimiento relacionada. Preferentemente, la proteasa es una que se produce naturalmente por el hospedero, por ejemplo la proteasa kex2 de S. cerevisiae o proteasas equivalentes. Por lo tanto, un aspecto adicional de la invencin es proporcionar un proceso para preparar hormona de crecimiento o una variante o fragmento de ella expresando a

un polinucletido que codifica un polipptido de la invencin en un hospedero apropiado, que se puede dividir para producir el compuesto tipo GH y recuperar el compuesto tipo GH desde el cultivo del hospedero en una forma ms
25

pura. Nosotros hemos descubierto que los polipptidos de la invencin son significativamente ms estables en solucin que la hGH. El ltimo rpidamente se convierte inactivos cuando se guarda en solucin a 4C por ms de un mes. La hGH actualmente comercializable se vende como un polvo liofilizado.
Convenientemente, los polipptidos de fusin son producidos como molculas recombinantes por secrecin desde levadura, microorganismos como bacterias lnea de clulas de humanos o levadura. Preferentemente, el polipptido es secretado del hospedero. Hemos descubierto que uniendo la secuencia de codificacin de la hGH a la secuencia de codificacin de HA, al extremo 5 o al 3, es posible secretar la protena de fusin desde la levadura sin el requerimiento

30

35

de una secuencia pro derivada de la levadura. Esto fue sorprendente, ya que otros autores han descubierto que la secuencia pro derivada de levadura es necesaria para la secrecin eficiente de la hGH en levadura. Por ejemplo, Hiramitsu y col. (1990, 1991) descubri que la parte N - terminal de la secuencia pro Mucor pusillus rennin fue importante. Los otros autores, usan la seal de MF-1, que tienen siempre incluido la secuencia pro de MF-1 cuando

se secreta la hGH. La secuencia pro se cree que ayuda al plegamiento de la hGH cuando acta como un chaperone

40 intramolecular. La presente invencin muestra que la HA o los fragmentos de HA pueden desempear

una funcin similar.
Por tanto, una realizacin particular de la invencin consta de una construccin de ADN que codifica una secuencia seal efectiva para direccionar la secrecin en levadura, particularmente una secuencia seal derivada de la levadura

45

(especialmente una que es homologa al hospedero de la levadura), y la molcula fusionada del primer aspecto de esta invencin, siendo la secuencia pro no derivada de la levadura entre la seal y el polipptido maduro.

Saccharomyces cerevisiae es un ejemplo preferido de una seal derivada de levadura.

50 Conjugados de esta naturaleza fueron preparados por Poznansky y col. (1988), en el que no son considerados

los polipptidos preparados por separado que son unidos por acoplamiento qumico.
La albmina la hGH podran ser una variante de HSA / rHA normal (llamada en lo adelante como HA) hGH, respectivamente. Por Variantes se incluyen las inserciones, las deleciones y las sustituciones, ya sean con-

55

servadas o no conservadas, donde no se alteran considerablemente los cambios en una o ms presencia de tumores, convenientemente las propiedades de unin al ligando y no inmunogenidad de la albmina o, en el caso de la hGH,

60

es su no inmunogenicidad y la capacidad de ligar y activar el receptor de hGH. En lo particular, incluimos variantes polimorficas que ocurren naturalmente de la albmina humana y fragmentos de albmina humana, por ejemplo esos fragmentos revelan en EP 322 094 (concretamente HA (1 - n), donde n es 369 hasta 419). La albmina o la hormona de crecimiento pueden ser de cualquier vertebrado, especialmente cualquier mamfero, por ejemplo humano, vaca, ovejas, cerdo, gallina o salmonas. La albmina y las partes de la GH de la fusin pueden ser de animales diferentes. Por Sustituciones conservadas se entienden los intercambios previstos dentro de los grupos tales como Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; y Phe, Tyr. La variante de GH tendr al menos 75%

65

(preferentemente al menos 80%, 90%, 95% o 99%) de la secuencia idntica con hormona de crecimiento humana en cuanto la excepcin se hace para las deleciones y las inserciones como se acostumbra en el estado de la tcnica. Una variante de HA tendr secuencia de identificacin al menos el 75% de los dos dominios enteros de HA, por ejemplo de dominios 1 + 2 (1-387), 2 + 3 (195-585) o 1 + 3 (1-194, + 388-585). Cada dominio en s se hace de dos
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subdominios homlogos nombrados 1-105, 120-194, 195-291, 316-387, 388-491 y 512-585, concretamente con un subdominio flexible de regiones de enlace que consta de los residuos Lys106 hasta Glu199, Glu292 hasta Val315 y Glu492 hasta Ala511. La variante de hGH que debe tener actividad de GH, y de al menos 150, 180 191 aminocidos preferentemente manteniendo sus cistenas para ambos puentes disulfuro internos.
5

Las molculas fusionadas de la invencin en general tienen un peso molecular de al menos 100 kD, por ejemplo menor que 90 kD o 70 kD. Son por lo tanto mucho ms pequeas que los conjugados de 180 kD de (Poznansky y col. (referidos arriba), que eran inactivo in vivo. La mayora cae dentro de un rango de peso molecular de 60-90 kD.
10 Un segundo aspecto principal de la invencin es proporcionar una levadura transformada para expresar una

protena de fusin.
Adems de las clulas del hospedero transformadas en ella misma, la presente invencin tambin considera un cultivo de esas clulas, preferentemente un cultivo de monoclonales (clonalmente homogneo), o un cultivo obtenido

15

desde un cultivo de monoclonal, en un medio nutriente. Especialmente si el polipptido se secreta, el medio entonces contendr el polipptido, con las clulas, o sin las clulas, si ha sido filtrado o centrifugado.
Muchos sistemas de expresin son conocidos, incluyendo bacterias (por ejemplo E. coli y bacilo sublilis), levaduras (por ejemplo Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis y Pichia pastoris, hongos filamentoso (por ejemplo

20

Aspergillus), clulas de planta, clulas de animal y clulas de insecto. La protena deseada se produce de manera convencional, por ejemplo desde una secuencia de codificacin que es insertada en el cromosoma del hospedero o en un plsmido libre.

25 Las levaduras son transformadas con una secuencia de codificacin para la protena deseada en cualquiera de

las maneras acostumbradas, por ejemplo electroporacin. Los mtodos para la transformacin de la levadura por electroporacin son revelados en Becker & Guarente (1990) Methods Enzimol. 194, 182.
Las clulas con xito transformadas, es decir las clulas que contienen una construccin de ADN de la invencin

30

actual, puede ser identificado por las tcnica conocidas. Por ejemplo, las clulas que resultan con la introduccin de una construccin de expresin pueden ser cultivadas para producir el polipptido deseado. Las clulas pueden ser cosechadas y lisadas y su contenido de ADN se examina la presencia del ADN usando un mtodo tales como describe Southern (1975) J. Mol. Biol. 98, 503 Berent y col. (1985) Biotech. 3, 208. Alternadamente, la presencia de la

35

protena en el sobrenadante puede ser detectado usando anticuerpos.

Los vectores de plsmido de levadura tiles incluyen pRS403-406 y pRS413- 416 y estn en general disponible desde Stratagrene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA. Los plsmidos pRS403, pRS404, pRS405 y pRS406 son plsmidos integrados a la levadura (Yips) y se incorporan marcadores de seleccin de la levadura HIS3, TRP1, LEU2 y URA3. El pRS413 - 416 son de Yeast Centromere (YCps).
Una variedad de mtodos han sido desarrollados para operar la unin del ADN a vectores de va complementaria y cohesiva a terminales. Por ejemplo la regin de homopolmero complementario puede ser adicionando al segmento de ADN e insertar al vector de ADN. El vector y el segmento de ADN son unidos por enlaces de hidrgeno entre las colas de homopolimricas complementarias para formar molculas de ADN recombinante.

40

45

Los enlazadores sintticos que contienen uno ms sitios de restriccin proporcionan un mtodo alternativo de unin al segmento de ADN para los vectores. El segmento de ADN, generado por la digestin de restriccin de endonucleasa, se trata con un bacterigrafo de ADN T4 polimerasa polimerasa I de ADN E. coli, las enzimas que se remueven salen del sitio, extremo terminal de hebra simple 3 con su actividad exonucleoliticas 3- 5 y completa
50

recesa su actividad polimerasa en el extremo 3.

La combinacin de estas actividades genera los segmentos de ADN punta y extremo. Los segmentos punta - extremo son incubados y luego con un exceso molar grande de enlace de las molculas en presencia de una enzima que es capaz de catalizar la ligacin de molculas de ADN punta - extremo, como ADN ligasa bacterifago T4. Por

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lo tanto, los productos de la reaccin son los segmentos de ADN que traen secuencias de enlaces polimricas a sus extremos. Estos segmentos de ADN son cortados luego con enzima de restriccin apropiada y ligados a un vector de expresin que ha sido cortado con una enzima que produce extremos compatibles con sos segmentos de ADN.

Enlaces sintticos que contienen una variedad de sitios de endonucleasas de restriccin estn comercialmente 60 disponibles de varias fuentes incluyendo Internacional Biotechnologies Inc, New Haven, CN, USA.
Una forma deseable de modificar el ADN segn la invencin, por ejemplo, las variantes de HA son y sern prepa-radas, usando la reaccin en cadena de polimerasa como se revela por Saiki y col. en Science 239, 487-491 (1988). En este mtodo el ADN ser amplificado enzimticamente y est flanqueado por dos plantillas de oligonucletido espec-

65 ficas en la que ellos mismos se incluyen en el ADN amplificado. Dicha plantilla especfica podran

contener sitios de reconocimiento de las endonucleasas de restriccin que pueden ser usados para reproducir vectores de expresin que usando mtodos conocidos en el estado de la tcnica.

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Los ejemplos de gneros de levadura que se contemplan y son tiles en la prctica de la presente invencin como hospederos para expresar las protenas de fusin son Pichia (Hansenula), Saccharomyces, Kluyveromyces, Candi-da, Torulopsis, Torulaspora, Schizosaccharomyces, Citeromyces, Pachysolen, Debaromyces, Metschunikowia, Rhodosporidium, Leucosporidium, Botryoascus, Sporidiobolus, Endomycopsis, y semejantes. Los gneros preferidos son

15 aquellos

seleccionados del grupo que consta de Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia y To-rulaspora. Ejemplos de Saccharomyces spp. S. cerevisiae, S. italicus y S. rouxii. Ejemplos de Kluyveromyces spp. son K. fragilis, K. lactis y K. marxianus. Una especie de Torulaspora apropiada es T. Delbrueckii. Ejemplos de Pichia (Hansenula) spp son P. Angusta (antes H. polimorpha), P. Anomala (antes H. anomala) y P. Pastoris.

10 Los mtodos para la transformacin de S. cerevisiae son enseados en general en EP 251 744, EP 258 067 y

WO 90/01063, todas estn incluidas por esto en las referencias.

Los promotores apropiados para S. cerevisiae incluyen aquellos relacionados con el gen PGK1, gen GAL1 o GAL10, CYC1, PHO5, TRP1, ADH1, ADH2, los genes para gliceraldehdo-3-fosfato dehidrogenasa, hexoquinasa,

15

piruvato decarboxilasa, fosfofructoquinasa, fosfato triosa isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, glucoquinasa, factor mating feromona, factor a-mating feromona, el promotor PRB1, el promotor GUT2, el promotor GPD1, y los promotores hbridos que involucran hbridos de las partes de las regiones reguladores de 5 con partes de las regiones reguladoras de 5 de otros promotores o con sitios de activacin agues arriba (por ejemplo el promotor de EP-A - 258

20

067).

Los promotores regulables convenientes para el uso en Schizosaccharomyces pombe son el promotor del gen repre-sor de tiamina desde el gen nmt como se describe por Maundrell (1990) J. Biol Chem. 265, 10857-10864 y el promotor del gen fbpl represor de glucosa como describe Hoffman & Winston (1990) Genetics 124, 807-816.
25 Los mtodos de transformacin de Pichia para la expresin de genes forneos son enseados, por ejemplo,

Cregg y col. (1993), y varias patentes de Phillips (por ejemplo US 4 857 467, incorporada esta en la referencia), y el equipo de expresin de Pichia comercialmente disponible son Invitrogen BV, Leek, Netherlands and Invitrogen Corp., San Diego, California. Los promotores apropiados incluyen AOX1 y AOX2.

30 Gleeson y col. (1986) J. Gen. Microbiol. 132, 3459-3465 incluye la informacin sobre los vectores de Hansenula,

transformacin y los promotores apropiados siendo MOX1 y FMD1; mientras que en EP 361 991, Fleer y col. (1991) y otras publicaciones de Rhone-Poulenc Rorer ensean cmo expresar protenas franeas en Kluyveromyces spp., siendo un promotor apropiado PGK1.

35 La seal de terminacin de transcripcin es preferentemente la secuencia de flanqueo 3 de un gen eucariota

40

que contiene las seales propias para la terminacin de la transcripcin y poliadenilacin 3. Las secuencias de flan-queo apropiadas podran ser aquellos genes unidos a la secuencia de control de la expresin usada naturalmente, por ejemplo, podra corresponderse con la del promotor. Por otra parte, podran ser diferentes y en tal caso la seal de terminacin del gen ADH1 de S. cerevisiae es preferida.
La protena de fusin deseada puede ser expresada inicialmente con una secuencia gua efectiva de secrecin, que puede ser cualquier gua efectivo en la levadura escogida. Guas tiles de S. cerevisiae incluyen desde el polipptido del factor de apareamiento (MF-1) y el gua hbrido de la EP-A-387 319. Tales guas (o seales) son cortados por la levadura antes de que la albmina madura sea liberada en el entorno circundante. Adems tales guas incluyen aquella

45

invertasa S. cerevisiae (SUC2) que revel en JP 62-096086 (conferida como 91/036516), cido fosfatasa (PHO5), la pre- secuencia de MF -1, glucanasa (BGL2) y toxina asesina; glucoamilasa II de S. diastaticus; -galactosidasa de S carlsbergensis (MEL1); toxina asesina de K. lactis; y glucoamilasa de Candida.
La protena de fusin de la invencin o una formulacin de ella misma puede ser administrada por cualquier mtodo convencional incluyendo la parenteral (por ejemplo subcutnea o intramuscular) la inyeccin o la infusin intravenosa. El tratamiento podra constar de una sola dosis o una pluralidad de dosis durante un perodo de tiempo. Mientras es posible que una protena de fusin de la invencin se administre a solas, es preferible presentarlo como una formulacin farmacutica, con uno o ms portadores aceptables. El portador (s) debe ser Aceptable para

50

55 el sentido de ser compatible con la protena de fusin y no nocivo a los receptores de ella. Tpicamente,
los portadores son el agua o salina que ser estril y libre de pirgenos. La formulacin debe ser no inmunognica; formulaciones tipo vacuna que involucran adyuvantes no son consideradas.
Las formulaciones pueden ser presentadas en la forma de dosis unitaria convenientemente y pueden ser preparados

60

por alguno de los mtodos conocidos en el arte de farmacia. Tales mtodos incluyen el paso de traer la protena de fusin en la asociacin con el portador que constituye uno ms ingredientes de accesorios. En general las formulaciones son preparadas uniformemente e ntimamente traen en asociacin el ingrediente activo con el portador lquidos o slidos finamente divididos o ambos, y luego, si es necesario, dar forma al producto.
Las formulaciones apropiadas para administracin parenteral incluyen soluciones acuosas no acuosas de inyec-cin estriles que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostatos y solutos que dan la formulacin isotnica con la sangre del receptor futuro; y suspensiones estriles acuosas y no acuosa que pueden incluir agentes suspendi-dos y agentes espesante. Las formulaciones pueden ser presentadas en dosis unitaria o contenedores multidosis, por 5

65

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ejemplo ampolletas selladas y viales, pueden ser almacenadas en una condicin liofilizada que requiere solamente la adicin del portador lquido estril, por ejemplo el agua para inyecciones, inmediatamente antes del uso. Soluciones de inyeccin extemporneas y suspensiones pueden ser preparadas como polvos estriles.
5 Las formulaciones de dosis unitaria preferidas son aquellas que contienen una dosis diaria o unidad la subdosis

diaria o una fraccin apropiada de ella misma, de un ingrediente activo.

Las protenas de fusin de la invencin pueden ser usadas en el tratamiento de cualquier condicin en la que la hormona de crecimiento es muestrada por ejemplo la deficiencia de hormona de crecimiento aislada, panhipopituitarismo,

10

irradiacin craneal (por ejemplo en el tratamiento de la leucemia o los tumores cerebrales), el sndrome de Turner, el sndrome de Down, el retardo de crecimiento intrauterino, la deficiencia de crecimiento idioptico, la insuficiencia renal crnica, acondroplasia, varios trastornos catablicos como infertilidad del sexo femenino. Tambin pueden ser usados en la estimulacin del crecimiento, y/o aumento de la proporcin de carne sin grasa, en animales de granja

15

como vacas, ovejas, cabras y cerdos. La protena de fusin puede ser administrada junto con factores de crecimiento como insulina (IGF-I).
La dosis puede ser calculada sobre la base de la potencia relativa de la protena de fusin en comparacin con la potencia de la hGH, mientras tomamos en cuentas la prolongacin del tiempo de vida en suero de las protenas

20

de fusin comparadas con la hGH nativa. La hormona de crecimiento es administrada tpicamente de 0,3 a 30,0 IU/kg/semana, por ejemplo 0,9 a 12,0 IU/kg/semana, en tres o siete dosis divididas por un ao ms. En una protena de fusin que consta de la HA fusionada completa unida a la GH completa, la dosis equivalente en trmino de unidades, representa un peso mayor pero la frecuencia de dosis puede ser reducida, por ejemplo a dos veces a la semana, una

25

vez a la semana menos. Los ejemplos preferidos de la invencin sern descritos en forma de ejemplo con las referencias a las figuras que lo acompaan, en el cual:
Figura 1 muestra la secuencia de cADN de la hormona de crecimiento humana, codificando para la hGH madura;

30

Figura 2 muestra un mapa de enzima de restriccin del pHGH1;

Figura 3 muestra un mapa de enzima de restriccin de pBST (+) y la secuencia de ADN del policonectador;

35

Figura 4 muestra la construccin de pHGH12; Figura 5 muestra la construccin de pHGH16;

Figura 6 muestra la secuencia de ADNc de HSA, ms particularmente la regin que codifica para la protena 40 madura; Figura 7 muestra la construccin de pHGH14; Figura 8 muestra la construccin de pHGH38; Figura 9 muestra la construccin de pHGH31;
45

Figura 10 muestra la construccin de pHGH58 o pHGH59 (ejemplo 7); Figura 11 es un esquema para formular construir separadores que tienen fusiones (ejemplo 7); y
50

Figura 12 muestra los resultados de un estudio farmacocintico mostrando que la eliminacin de rHA - hGH marcada con I comparndola con la inyeccin IV en ratas. Los datos son de dos ratas en cada grupo, e incluyen la radiactividad total y la radiactividad que podan ser precipitada por TCA, es decir que esta relacionada con la protena preferentemente como 125I libre. El perodo de vida calculado para la hGH es aproximadamente 6 minutos, comparado con los aproximadamente 60 minutos para la protena de fusin de rHA - hGH. Ver ejemplo 3.

55

- N de hGH (conteo totales) - hGH (conteo TCA precipitado)

60

t - rHA - hGH (conteo totales) s - rHA - hGH (conteo TCA precipitado). Descripcin detallada de la invencin

65

Todos los procedimientos de ADN recombinante usados como se describe en Sambrook y col. (1989) a menos de otra manera por lo dems. Las secuencias de ADN que codifican HSA fueron obtenidas desde el ADNc revelado en la EP 201 239.

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Ejemplo 1 Clonacin del ADNc de hGH
5 El ADNc de la hGH fue obtenido de una librera de ADNc de glndula pituitaria humano (nmero de catlogo

HL1097v, Clontech Laboratories, Inc) por la amplificacin de PCR. Dos oligonucletidos apropiados para la am-plificacin de PCR del ADNc de hGH, HGH1 y HGH2, fueron sintetizados usando un Applied Biosystems 380B Oligonucleotido Synthesiser.

10

HGH1: 5 - CCAAGAATTCCCTTATCCAGGC - 3 HGH2: 5 - GGGAAGCTTAGAAGCCACAGGATCCCTCCACAG - 3.

Las HGH1 y HGH2 son diferidos de la parte equivalente de la secuencia de ADNc de la hGH (Figura 1, Martial

15

y col., 1979) por dos y tres nucletidos, respectivamente, de forma que despus de la amplificacin de PCR a un sitio de EcoRI se introduce en el extremo 5 del ADNc y un sitio de BamHI sera introducido en el extremo 3 del ADNc. Adems, la HGH2 contena un sitio HindIII inmediatamente aguas abajo de la secuencia de la hGH.
La amplificacin de PCR usando un Perkin-Elmer-Cetus Thermal Cycler 9600 and a Perkin-Elmer-Cetus PCR kit,

20

fue llevada a cabo usando una plantilla de ADN de una sola hebra aislada desde partculas de fage de una librera de ADNc de la siguiente manera: 10 L de partculas de fago fueron rotas por la adicin de 10 L de tampon de ruptura pa-ra fago (280 g/mL de protenasa k en tampon TE) y la incubacin a 55C durante 15 minutos seguido por 85C por 15

25

minutos. Despus de la incubacin de 1 minuto sobre hielo, debris de fago fue comprimido por centrifugacin a 14,000 rpm durante 3 minutos. La mezcla de PCR conteniendo 6 L de esta plantilla de ADN, 0,1 M de de cada plantilla y 200 M de cada deoxiribonucletido. El PCR fue llevado a cabo por 30 ciclos, desnaturalizando a 94C por 30 s, y endureciendo a 65C por 30 s y extendiendo a 72C por 30 s, incrementando el tiempo de extensin por 1 s por ciclo. El anlisis de la reaccin por electroforesis en gel muestra un solo producto con el tamao esperado (589 pares de bases).

El producto de PCR fue purificado usando como Wizard PCR Preps DNA Purification System (Promega Corp) y

30

luego digerido con EcoRI y el Hind III despus de la purificacin posterior del fragmento EcoRI - HindIII por gel de electroforesis, el producto fue clonado en pUC19 (GIBCO BRL) digerido con EcoRI e HindIII, para dar pHGH1 (Figura 2). Secuencia de ADN de la regin EcoRI - HindIII muestra que el producto de PCR era idntico a la secuencia de la hGH (Martial y col., 1979), excepto en los extremos 5 y 3, donde los sitios de EcoRI y BamHI son introducidos,

35

respectivamente. Ejemplo 2 Expresin del ADNc de hGH

40 La secuencia del polilinker del fagomidio pBluescribe (+) (Stratagene) fue reemplazado insertando un oligonu-

clotido de enlace, constituido alineacin de dos oligonucletidos 75 mer, entre los sitios de EcoRI y lo HindIII para formar pBST (+) (Figura 3). El nuevo polilinker incluye un sitio de NotI nico (la secuencia completa en la regin del polilinker es dada en la Figura 3).

45 La

expresin del cartucho NotI HSA de pAYE309 (EP 431 880) consta de el promotor de PRB1, secuencia de ADN que codifica la secuencia lider hbrida de HSA / MF -1, la secuencia que codifica ADN de la HSA y el terminador ADH1, fue transferido a pBST (+) para formar pHA1 (Figura 4). La secuencia de codificacin de HSA fue retirada desde este plsmido por la digestin con HindIII seguida por religacin para formar pHA2 (Figura 4).

50 Clonar el ADNc de hGH, como se describe en Ejemplo 1, proporciona la regin de codificacin de hGH que

55

carece de la secuencia pro-hGH y los primeros 8 pares de basa (bp) de la secuencia desde la hGH madura. Para construir un plsmido de expresin para la secrecin de la hGH de levadura, un promotor de levadura, muestra un pptido seal y los primeros 8 bp de la secuencia de hGH fueron fijadas al extremo 5 de la secuencia de hGH clonada de la siguiente manera:

El fragmento HindIII - SfaNI desde pHA 1 fue fijado al extremo 5 del fragmento EcoRI - HindIII de pHGH1 va dos oligonucletidos sintticos, HGH3 y HGH4: GH3: 5 - GATAAAGATTCCCAAC - 3
60

HGH4: 5 - AATTGTTGGGAATCTTT - 3.

65 (WO 90/01063). El cartucho de expresin NotI contenido en pHGH2, que incluye el terminador ADH1

El fragmento HindIII formado fue clonado en pHA2 digerido por HindIII para hacer pHGH2 (Figura 4), de forma que el ADNc de hGH fue colocado aguas abajo del promotor PRB1 y la secuencia lder de fusin de HSA / MF-1

aguas abajo del ADNc de hGH, fue clonada en pSAC35 digerido por NofI (Sleep y col., 1990) para hacer pHGH12 (Figura 4). Este plsmido consta del plsmido entero 2 m para proporcionar las funciones de replicacin y el gen LEU2 para la seleccin de transformantes.

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El pHGH12 fue introducido en S. cerevisiae DB1 (Sleep y col., 1990) por la transformacin y transformantes individuales fueron crecidas por 3 das en 30C en 10 ml de medio YEPD (1% w/v extracto de levadura, 2% w/v peptone, 2% w/v de dextrosa). Despus de la centrifugacin de las clulas, los sobrenadantes fueron revisados por (SDS - PAGE) gel de electroforesis de SDS - poliacrilamida y fue encontrado que contiene protena, el que era del

15 tamao esperado y que fue reconocida por antiserum anti-hGH (Sigma, Poole, R.U.) sobre manchones
occidentales. Ejemplo 3 Clonacin y expresin de una protena de fusin de HSA - hGH
10

Para unir el ADNc de HSA al extremo 5 del ADNc de hGH, el fragmento de HindIII - Bsu361 de pHA1 (contiene la mayor parte del ADNc de HSA) se une al fragmento EcoRI - HindIII de pHGH1 (contiene la mayor parte del ADNc de hGH) va los dos oligonucletidos, HGH7 y HGH8:

15

HGH7: 5 - TTAGGCTTATTCCCAAC - 3 HGH8: 5 - AATTGTTGGGAATAAGCC - 3.

El fragmento HindIII formado fue clonado en pHA2 digerido con HindIII para formar el pHGH10 (Figura 5), y el

20 cartucho de expresin NotI de este plsmido fue clonado dentro de NotI digerido en pSAC35 para hacer
el pHGH16 (Figura 5).
El pHGH16 usado para transformar S. cerevisiae DB1 y sobrenadantes de las cultivos fueron analizados como en el Ejemplo 2. Una banda predominante se observa que tiene un peso molecular de aproximadamente 88 kD, corres-

25 pondiendo a la masa combinada de HA y hGH. El ensayo de Western blot usando un antisuero anti-HSA
y anti-hGH (Sigma) confirma la presencia de los dos partes componentes de la protena de fusin.
La protena de fusin fue purificada desde el sobrenadante de cultivo por cromatografa de intercambio catinico, seguida por cromatografa de intercambio aninico y cromatografa de gel filtracin. El anlisis de N - terminal de la
30

protena por secuencia de aminocido confirma la presencia de la secuencia de albmina esperada.

El ensayo de actividad de la hormona de crecimiento in vitro (Ealey y col., 1995) muestra que la protena de fusin posee actividad de hGH completa, pero que la potencia fue reducida comparada con el padrn de hGH. En un modelo de aumento de peso de la rata hipofisectomisado, efectuado esencialmente como se describe Farmacopea Europea

35

(1987, monografa 556), la molcula de fusin es ms potente que la hGH cuando el mismo nmero de unidades de actividad se administra diariamente (sobre la base del ensayo in vitro anterior). Los experimentos posteriores en los que la protena de fusin fue administrada una vez cada cuatro das mostraron un rendimiento similar en la respuesta al crecimiento para la administracin diaria de hGH. Los experimentos farmacocinticos en la que la protena marcada

con 125I se administra a ratas demuestra un aumento aproximadamente diez veces en el tiempo de vida circulatorio 40 para la protena de fusin comparado con la hGH (Figura 12). Un plsmido similar se construye en el que la secuencia lider de ADN que codifica para la invertasa de S. cerevisiae (SUC2) se reemplaza la secuencia para el lder hbrido, de forma tal que el lder codificado y el cruce con la secuencia de HSA es como sigue:

45

50

55

Sobre la introduccin en S. cerevisiae DB1, este plsmido direcciona la expresin y la secrecin de la protena de fusin en un nivel similar al que se obtiene con pHGH16. El anlisis de N - terminal de la protena de fusin demuestra el anclaje preciso y eficiente de la secuencia lder de la protena madura. Ejemplo 4 Clonacin y expresin de una protena de fusin de hGH - HSA
Para unir el ADNc de hGH al extremo 5 del ADNc de HSA (Figura 6), el ADNc de HSA primero se modifica por

60 mutagenesis dirigida por el sitio cercano EcoNI se introduce en la regin que codifica al extremo 5. Esto
LEU4: 5 - GAGATGCACACCTGAGTGAGG - 3
65

fue hecho por el mtodo de Kunkel y col. (1987) que usa una plantilla de ADN de una sola hebra preparada desde pHA1 y un oligonucletido sinttico, LEU4:

La mutagnesis dirigida al sitio usando este oligonucletido cambia la secuencia de codificacin del ADNc de HSA de

Lys4 para Leu4 (K4L). Sin embargo, este cambio fue reparado cuando el ADNc de hGH fue unido posteriormente 8

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al extremo 5 por unin del fragmento NofI - BamHI de pHGH2 con el fragmento EcoNI - NofI del pHA1 mutado, va los oligonucletidos HGH5 de y HGH6: HGH5: 5 - GATCCTGTGGCTTCGATGCACACAAGA - 3
5

HGH6: 5 - CTCTTGTGTGCATCGAAGCCACAG - 3.
El fragmento NotI formado es clonado en pSAC35 digerido por NotI para hacer pHGH14 (Figura 7). El pHGH14 fue usado para transformar S. cerevisiae DB1 y el sobrenadante de cultivo fue analizado como en el Ejemplo 2. Una

10 banda predominante ser observa que tiene un peso molecular de aproximadamente 88 kD,
correspondiendo a la masa combinada de hGH y HA. El ensayo de Western blot usa antisuero de antiHSA y anti-hGH y confirma la presencia de los dos partes componente de la protena de fusin.
La protena de fusin fue purificada desde el sobrenadante de cultivo por cromatografa de intercambio catinico,

15

seguida por cromatografa de intercambio aninico y cromatografa de gel filtracin. El anlisis de l N - terminal de la protena por secuencia de aminocido confirma la presencia de la secuencia de hGH esperada.
Los estudios in vitro muestra que la protena de fusin conserva la actividad de hGH, pero es significativamente menos potente que una protena de fusin que consta de la HA normal completa (1-585) tanto la parte de N- terminal

20 y la hGH como la parte C - terminal, se describe en el

Ejemplo 3. Ejemplo 5 Construccin de plsmidos para la expresin de fusiones de hGH para dominios de HSA
25

30

Los polipptidos de fusiona se hacen en el que la molcula de hGH fue unida a los primeros dos dominios de HA (residuos 1 a 387). La fusin al N - terminal de hGH se consigue uniendo el fragmento HindIII - SapI de pHA1, que contiene la mayor parte de la secuencia de codificacin para los dominios 1 y 2 de HA, al fragmento EcoRI - HindIII de pHGH1, va los oligonucletidos HGH11 y HGH12: HGH11: 5 - TGTGGAAGAGCCTCAGAATTTATTCCCAAC - 3 HGH12: 5 - AATTGTTGGGAATAAATTCTGAGGCTCTTCC - 3.

35

El fragmento HindIII formado fue clonado en pHA2 digerido por HindIII para hacer el pHGH37 (Figura 8) y el cartucho de expresin Nod de este plsmido fue clonado NorI digerido pSAC35. El plsmido da como resulta-do, el pHGH38 (Figura 8), que contiene un cartucho de expresin que fue descubierto para direccionar la secre-cin del polipptido de fusin en el sobrenadante cundo se transform en S. cerevisiae DB1. El ensayo de western blot usa antisuero anti-HSA y anti-hGH confirma la presencia de las dos partes de componente de la protena de

40

fusin.
La protena de fusin es purificada desde el sobrenadante de cultivo por cromatografa de intercambio catinico seguida por cromatografa de gel filtracin. Los estudios in vivo con protena purificada muestran que el tiempo de vida en circulacin es ms largo que la de hGH, y similar a la protena de fusin que consta de HA normal completa

45 (1-585) como la parte N - terminal y la hGH como la parte C - terminal, como se describe en Ejemplo 3.
Los estudios in vitro muestran que la protena de fusin conservaba la actividad de hGH.
Usando una estrategia similar como se detallade arriba, una protena de fusin que consta del primer dominio de HA (residuos 1-194) como la parte N - terminal y la hGH como la parte C - terminal, fue clonada y expresada en S.

50 cerevisiae DB1. El western blot correspondiente al sobrenadante de cultivo usa antisera anti-HSA y antihGH y se confirma la presencia de las dos partes componente de la protena de fusin. Ejemplo 6
55

Expresin de hGH por introduccin de un sitio de anclaje entre HSA y hGH La introduccin de una secuencia de pptido que es reconocida por la proteasa de Kex2, entre la protena de fusin de HA - hGH, admite la secrecin de hGH. Una secuencia de codificacin Ser Asp Lys Arg de fue presentado usando dos oligonucletidos, HGH14 y HGH15: HGH14: 5 - TTAGGCTTAAGCTTGGATAAAAGATTCCCAAC - 3 HGH15: 5 - AATTGTTGGGAATCTTTTATCCAAGCTTAAGCC - 3.

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65

Estos fueron usados para unir el fragmento HindIII - Bsu36I de pHA1 al fragmento EcoRI - HindIII de pHGH1, los que fueron clonados luego en pHA2 digerido por HindIII para hacer el pHGH25 (Figura 9). El cartucho de expresin NotI en la que de este plsmido fue clonado en pSAC35NotI - digerido para hacer el pHGH31 (Figura 9).
9

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S. cerevisiae DB1 transformado con pHGH31 se encuentra para ocultar dos especies muy importantes, como se determina por el anlisis de SDS - PAGE de sobrenadantes de cultivo. Las dos especies tienen pesos moleculares de aproximadamente de 66 kD, correspondiendo para HA (la longitud completa), y 22 kDa, corresponden a la (la longitud completa) de la hGH demostrando el anclaje de la protena de fusin in vivo por la proteasa de Kex2, o una

15 actividad equivalente. El ensayo de western blot usando antisuero anti-HSA y anti-hGH confirma la
presencia de las dos especies por separado. El anlisis de secuencia N - terminal de la mitad de la hGH confirma el anclaje preciso y eficiente de la mitad de HA.
La mitad de la hGH se purifica desde el sobrenadante de cultivo por cromatografa de intercambio aninico seguida

10 por cromatografa de gel filtracin. Los estudios in vitro con la hGH purificada muestran que la protena
es activa y completamente potente.
Usando una estrategia similar, protenas de fusin que constan con el primer dominio de HA (residuos 1-194) o los primeros dos dominios de HA (residuos 1-387), seguida de una secuencia reconocida por la proteasa Kex2p, seguida

15

por el ADNc de la hGH, se clonan y expresan S. cerevisiae DB1. El ensayo de western blot del sobrenadante de cultivo que usa el antisuero anti-HSA y anti-hGH confirma la presencia de las dos especies por separado.

Ejemplo 7
20

Fusin de HSA para la hGH usando una secuencia de unin flexible Uniones flexibles, que consta de unidades repetitivas de [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser] n, donde n es 2 3, se introducen entre el HSA y la protena de fusin de la hGH por clonacin de los oligonucletidos HGH16, HGH17, HGH 18 y HGH 19: HGH16: 5 - TTAGGCTTAGGTGGCGGTGGATCCGGCGGTGGTGGATCTTTCCCAAC - 3 HGH17: 5 - AATTGTTGGGAAAGATCCACCACCGCCGGATCCACCGCCACCTAAGCC - 3

25

30 HGH18: 5 - TTAGGCTTAGGCGGTGGTGGATCTGGTGGCGGCGGATCTGGTGGCGGTGGATCCTTCC CAAC -

3 HGH19: 5 - AATTGTTGGGAAGGATCCACCGCCACCAGATCCGCCGCCACCAGATCCACCACCGCCT AAGCC - 3.

35

La fusin de HGH16 con HGH17 resulta en n = 2, mientras que el HGH18 fusionado para HGH19 resulta n = 3. Despus de la fusin, el oligonucletidos de doble trenza se clona con el fragmento aislado EcoRI - Bsu361 desde pHGH 1 en pHGH10 Bsu361 digerido para hacer el pHGH56 (donde n = 2) y pHGH57 (donde n = 3) (Figura 10). El cartucho de expresin de NotI desde estos plsmidos se clonan en NotI digerido pSAC35 para hacer pHGH58 y
40

pHGH59, respectivamente.
Clonar los oligonucletidos para hacer pHGH56 y pHGH57 presenta un sitio de BamHI en las secuencias de enlace, como muestra la Figura 11. Por lo tanto es posible construir las secuencias de enlace en que n = 1 y n = 4, uniendo el fragmento HindIII - BamHI desde pHGH56 para el fragmento BamHI - HindIII de pHGH57 (hace n = 1),

45 o el fragmento de HindI - II - BamHI de pHGH57 al fragmento BamHI - HindIII de pHGH56 (hace n = 2).

Clonando stos fragmentos en el sitio de HindIII de pHA2 (descrito en Ejemplo 2), resulta en el pHGH60 (n = 1) y pHGH61 (n = 4) (ver Figura 11). El cartucho de expresin de NotI de pHGH60 y pHGH61 son clonados en pSAC35 digerido para hacer pHGH62 y pHGH63, respectivamente.
secretan los polipptidos de fusin en el sobrenadante.

50 La transformacin de S. cerevisiae con pHGH58, pHGH59, pHGH62 y pHGH63 resulta en transformantes que

55

El ensayo de western blot usa antisuero anti-HSA y anti-hGH confirma la presencia de las dos partes de componente de las protenas de fusin.
Las protenas de fusin se purifican desde el sobrenadante de cultivo por cromatografa de intercambio aninico, seguido por el intercambio aninico y cromatografa de gel filtracin. El anlisis de N - terminal de las protenas por el secuenciacin de los aminocido confirma la presencia de la secuencia de albmina esperada. El anlisis de las protenas purificadas por espectrometra de masa de destellos confirma un aumento en la masa de 315 Da (n = 1),

60 630 Da (n = 2), 945 Da (n = 3) y 1260 Da (n = 4) comparado con la protena de fusin de HSA - hGH
descrita en el Ejemplo 3, como era de esperar. La protena purificada se encuentra activa in vitro. Referencias

65

Cunningham, B. C. y col. (1991) Science 254, 821-825. De Vos, A. M. y col. (1992) Science 255, 306-312.

10

ES 2 264 146 T3
Ealey y col. (1995) Growth Regulation 5, 36-44. Gleeson y col. (1986) J. Gen. Microbiol. 132, 3459-3465.

15

Haffner, D. y col., (1994) J. Clin. Invest. 93, 1163-1171. Hiramitsu y col. (1990) App. Env. Microbiol. 56, 2125-2132.

Hiramitsu y col. (1991) ibid. 57, 2052-2056.

10

Hoffman y Winston (1990) Genetics 124, 807-816. Kearns, G. L. y col. (1991) J. Clin. Endocrinol. Metab. 72, 1148-1156.

15

Kunkel, T. A. y col. (1987) Methods in Enzimol. 154, 367382. Martial, J. A.y col. (1979) Science 205, 602-607. Maundrell (1990) J. Biol. Chem. 265, 10857-10864.

20

Nomura, N. Y. col. (1995) Biosci. Biotech. Biochem. 59, 532-534. Poznansky, M. J. y col. (1988) FEBS. Lett. 239, 18-22.
25

Saiki y col. (1988) Science 239, 487-491. Sambrook, J y col. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. edition. Cold Spring Harbor Labora-tory Press, Cold Spring Harbor, NY.

30

Slepp, D. y col. (1990) Biol. Technology 8, 42-46. Strobl, J. S. y Thomas, M. J. (1994) Pharmacol. Rev. 46, 1-34. Tokunaga, T. Y. col. (1985) Gene, 39, 117-120.

35

Tsiomenko, A. B. y col. (1994) Biochemistry (Moscow) 59, 1247-1256. Zeisel, H. J. y col. (1992) Horm. Res. 37 (Suppl. 2), 5-13.
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menos dos dominios REIVINDICACIONES enteros de albmina de 1 suero.
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2. Un polipptido que consta de un primer polipptido al menos 95% idntico a la hormona de crecimiento humano madura (GH) fusionada a un segundo polipptido al menos 95% idntico de un suero de albmina que consta de al menos dos dominios enteros de albmina de suero. 3. Un polipptido segn la reivindicacin 1 2, en que dice que el primer polipptido es una variante de la GH humano madura eliminada. 4. Un
polipptido segn una cualquiera de las reivindicaci ones 1 a 3, en el que dicho segundo polipptido es una

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variante de albmina de suero eliminada.

5. Un polipptido segn una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dichos dos dominios enteros de la albmina de suero constan de los aminocidos 1 a 387, 195 a 585,

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1 s a de las reivindicac a e iones 1 a 194 8. U 9, en el y n que el N 388 po terminal a lip del 585 p polipptido de tidconsta de dicho la o segundo se alb polipptido y el g mi n C- terminal na unconsta de dicho de a primer sue cupolipptido. ro. al qu 12. Un ierpolipptido 6 una .a segn cualquiera de de U las n la reivindicaciones poli s precedentes p reique ptidvi adicionalmente o ndconstan de amisegic nocidos n acadicionales u un io otros a necompuestos cuas adicionados a lqui prcualquier final era ecdel polipptido. de ed las en 13. Un reivte polipptido s indi una cac ensegn cualquiera de el ion las qu es 1, e reivindicaciones 2, la precedentes en 4 al el que dicho 5, bpolipptido tiene en miun pptido de el naenlace entre el y qu esprimero e elhusegundo pri m polipptido. me an r a. 14.Un medio de cultivo poli que p 9 consta de ptid un o 1 polipptido es segn una GH 11. U cualquiera hu de las n ma reivindicac no po iones ma lip precedent p dur es. a. tid o se 15.Un 7 polinucle .g n tido que U un codifica n a poli cu un p al polipptid ptidqu o segn o ier una

c p e u a 1 l 18.q La u c ilul e a rho sp a

ed er d o e

20.Un

medio de cultivo que consta de una clula hospedero segn una cualquiera de las reivindicaci ones 16 a 19.

deproceso para la obtener un lreipolipptido que a vi comprende s ndcultivar una ic clula rachospedero i segn una e de in cualquiera 17las v , ienreivindicaciones 16 a 19 y n el purificar el d qupolipptido. ie di c 22. Un chproceso a para a obtener un c icpolipptido que lulcomprende o a purificar un n hopolipptido e spdesde el medio s edde cultivo de las er reivindicaciones o 14 o 20. 1 de 23. Una le a vaformulacin dufarmacutica que 1 ra consta de un 3 es .S.polipptido segn ceuna cualquiera de re las 1 vi reivindicaciones 1 si a 13 o producido 6 .aepor el proceso de . la reivindicacin U na 21 o 22 y un cl 1 portador ula farmaceticament hos e aceptable.
12

21.Un

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24. Uso de un polipptido segn una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 13 o producida por el proceso de la reivindicacin 21 22 en la preparacin de un medicamento para tratamiento a un paciente que tiene una afeccin que es curable con la hormona de crecimiento.
5 25. Un mtodo no teraputico de aumento de la velocidad de crecimiento, o la proporcin de carne sin grasa en

carne grasa, de un animal no humano que consta de administrar al animal un polipptido segn una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 producida por el proceso de la reivindicacin 21 o 22.

26. Un proceso para producir la hormona de crecimiento, que consta de expresar un polinucletido segn la rei10

vindicacin 15 en una clula hospedero, el polipptido codificado as teniendo un sitio entre dicho primer y segundo polipptidos, en que dicha hormona de crecimiento es dicho primer polipptido, en el que el sitio es escindible por

una enzima presente en el hospedero, o por cualquier otra enzima, o qumicamente.

27.
15

Un proceso segn la reivindicacin 26, en el que la clula hospedero es una clula de levadura.

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