Microbiologa General y de los Alimentos 2013

BIOQUIMICA BACTERIANA
I. OBJETIVOS

Aprender a identificar a las bacterias de acuerdo a las reacciones metablicas que tienen frente a los diferentes reactivos o medios de cultivo. Aprender a interpretar algunas de las pruebas bioqumicas de identificacin bacteriana de mayor utilidad.

II.

FUNDAMENTO La identificacin bacteriana se realiza tras el estudio de las caractersticas tintoriales, morfolgicas y bioqumicas de los microorganismos. La identificacin bioqumica se basa en la habilidad de las bacterias para producir enzimas fcilmente detectables, en las caractersticas metablicas especificas de cada microorganismo.

III.

MARCO TEORICO Como la mayor parte de los seres vivos, las bacterias son capaces de modificar el ambiente que las roda, captando sustancias necesarias para su multiplicacin y liberando al medio productos de desecho, enzimas, exotoxinas, etc. Las interacciones que cada tipo bacteriano establece con el entorno son propias y caractersticas. Esta especificidad depende del genotipo de la bacteria y se expresa en un determinado equipo enzimtico. Por ello la caracterizacin de dichas enzimas es una til herramienta para la identificacin y clasificacin bacteriana. Pruebas bioqumicas: Prueba Citocromo C oxidasa: Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reaccin de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromo oxidasa que activa la oxidacin del citocromo que es reducido por el oxgeno molecular que produce agua o perxido de hidrgeno segn la especie bacteriana. El oxgeno acta por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones. Por lo general, el sistema citocromo oxidasa slo se encuentra en los organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algn microaerfilo (Vibrio fetus), pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa. Asimismo, la presencia de oxidasa va ligada a la produccin Bioqumica Bacteriana Microbiologa 1

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de catalasa, ya que sta degrada el perxido de hidrgeno que se produce como consecuencia de la reduccin del oxgeno y cuya acumulacin es txica. La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para
Identificar todas las especies de Neisseria (+) Diferenciar Pseudomonas de los miembros oxidasa negativos de las

enterobacterias.

Prueba de la Catalasa: En los ambientes acuosos que contienen oxigeno disuelto, como el citoplasma de las clulas, aparecen formas toxicas derivadas del oxigeno. las bacterias que viven en ambientes aerobios necesitan un equipo enzimtico capaz de neutralizar estas formas toxicas. Entre estas enzimas se encuentra la catalasa, que convierte el perxido de Hidrogeno en agua y oxigeno molecular. PRUEBA DE LA CATALASA 2 H202 2 H20 + BURBUJAS DE O2

La prueba de la catalasa es positiva cuando se ponen una bacteria con actividad catalasa con perxido de Hidrogeno al 3 % y producen burbujas de oxigeno. Esta prueba se emplea para diferenciar los gneros Staphylococcus (catalasa positivo) de Streptococcus (catalasa negativo)

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Reduccin de Nitratos a Nitritos Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de un microorganismo para reducir los nitratos a nitritos o gas nitrgeno libre, una caracterstica que a menudo tiene valor diferencial. La reduccin de nitrato a nitrito se determina por el agregado de acido sulfanlico y el alfanaftilamina. El acido sulfanlico y el nitrito reaccionan para formar una sal diazonio, a continuacin la sal de diazonio se une con alfanaftilamina para producir un colorante azoico rojo hidrosoluble.

Prueba del Indol : Esta prueba se emplea para detectar la presencia de la enzima triptofanasa en las bacterias. Esta enzima degrada el aminocido triptfano a Indol, que es el compuesto que se detecta en este ensayo. Para la realizacin de esta prueba la bacteria se cultiva en un caldo de triptona con NaCl al 0.5% (este digerido de protenas animales es especialmente triptfano). Si la bacteria posee triptofanasa al aadir al medio el reactivo de Kovacs se pro ducir un anillo de color rojo en la superficie del caldo y la prueba ser considerada positiva.

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Prueba del Citrato de Simmons: Este medio indica la capacidad de las bacterias de metabolizar citrato. Contiene citrato como nica fuente de carbono, fosfato de amonio y azul de bromotimol como indicador de pH. nicamente las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrn multiplicarse en este medio, y al hacerlo, utilizaran los fosfatos presentes liberando iones amonio. Esta liberacin de iones bsicos junto con la eliminacin del citrato (acido) genera una fuerte basificacin del medio que ser aparentemente por cambio de color del indicador de pH, de verde a azul.

Prueba del Acido Fenil Pirvico (APP) Esta prueba determina la capacidad de un organismo para desaminar el aminocido fenilalanina en cido fenilpirvico por su actividad enzimtica de fenilalanina desaminasa, con la consiguiente acidez resultante. Esta actividad enzimtica es caracterstica de todas las especies del gnero Proteus y del grupo Providencia por lo que se usa para separar ambos gneros de otras enterobacterias Se cultiva el microorganismo en agar fenilalanina sembrando la superficie del slant con abundante inculo e incubando durante 12-16 horas. Seguidamente se aade 0,2ml de una solucin de cloruro frrico al 10% de manera que inunde todo el crecimiento. La presencia de cido fenilpirvico (prueba positiva) se manifiesta por la aparicin de un color caracterstico verde oscuro o verde-azulado.

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Descarboxilacin de la Lisina(LIA) Esta prueba se utiliza para determinar si un bacilo Gram negativo descarboxila o desamina la lisina y forma acido sulfhdrico (H2S). el agar hierro (LIA) contiene lisina, peptonas, una pequea cantidad de glucosa, citrato de amonio frrico y tiosulfato de sodio. Cuando se produce fermentacin de la glucosa el fondo del medio se acidifica (amarillo). Si el microorganismo produce lisina descarboxilasa se forma cadaverina, que neutraliza los cidos orgnicos formados por la fermentacin de la glucosa y el fondo del medio vuelve al estado alcalino (violeta). Si no se produce descarboxilasa el fondo permanece acido (amarillo).

IV.

PARTE EXPERIMENTAL Materiales, Equipos y Reactivos: Tubos de prueba Aguja y asa de Kolle Placas Petri Gradilla Mechero Algodn Estufa a 37 C Caldo nutritivo Agar nutritivo Reactivo de Kovacs Agar citrato de Simmons Cloruro frrico Agar LIA Sol Perxido de Hidrogeno Bioqumica Bacteriana Microbiologa 5

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Prueba de la Citocromo C- Oxidasa Colocar una varilla indicadora en una palca Petri

Con una asa de Kolle tomar una porcin de cultivo en agar nutritivo y hacer una estra sobre la superficie de la varilla

La reaccin positiva se traduce por la aparicin de un color violeta oscuro en menos de 3 minutos Escherichia coli

No hubo cambio de coloracin por lo tanto se determina que la prueba de la Citocromo COxidasa es negativa (-)

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Pseudomona aeroflica Se observo una coloracin violeta por lo tanto se determina que la prueba de la Citocromo C-Oxidasa es positiva (+)

Prueba Catalasa Embeber un portaobjeto con Perxido de Hidrogeno

Tomar una asada a partir de un cultivo puro y llevar a la zona embebida La efervescencia de oxigeno indica la prueba positiva

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Resultados: Escherichia coli

Se observo un burbujeo por lo tanto se determina que la prueba de Catalasa es positiva (+)

Reduccin de Nitratos a Nitritos Sembrar a partir de cultivos puros en un medio de caldo nitrato

Incubar a 37 C durante 24 horas

Leer aadiendo 0,5 mg de reactivo: 1 % de alfa- naftalamina, 10 5 de cido sulfanlico y 89 % de acido tartrico. Agitar y observar el color. El color rojo es indicativo de reaccin positiva

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Escherichia coli

Se observo la formacin de una coloracin roja en todo el tubo por lo que se determina que la prueba de Nitratos a Nitritos es positiva (+)

Prueba de Indol Sembrar los tubos de caldo triptona a partir de cultivos puros

Incubar los tubos a 37 C por 24 horas

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Leer adicionando gotas del reactivo de Kovacs Considerar como positivo a la formacin de un anillo de color grosella-rojo en la parte superior del tubo y como negativo de color amarillo

Resultados:

Escherichia coli

Se observo la formacin de un anillo coloracin roja en la parte superior del medio por lo que se determina que la prueba de Indol es positiva (+)

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Observacin de la prueba de Indol en otras bacterias en el laboratorio Bacterias Salmonella tiphy Staphylococcus aureus

Resultados obtenidos

Prueba de Indol

Negativo (-)

Negativo (-)

Prueba del Citrato de Simmons Sembrar en tubo con agar citrato de Simmons con cultivos puros

Incubar el tubo a 37 C por 24h-48h Considerar como resultado positivo el crecimiento visible acompaado de cambio de color del medio del verde al azul y negativo por la falta de crecimiento.

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Resultados:

Escherichia coli

Se observo que permaneci la coloracin verde caracterstica del agar citrato de Simmons por lo tanto se determina que la prueba Citrato de Simmons es negativa (-)

Observacin de la prueba de Citrato de Simmons en otras bacterias en el laboratorio

Bacterias

Salmonella tiphy

Staphylococcus aureus

Resultados obtenidos

Prueba de Citrato de Simmons

Positiva (+)

Negativa (-)

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Prueba del Acido Fenil Pirvico (APP) Sembrar un tubo con agar nutritivo con medio inclinado

Incubar el tubo a 37 C por 24 h- 48 h

Agregar gotas de Cloruro Frrico Considerara positivo si le medio cambia al color verde

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Resultados:

Escherichia coli

Se observo una ligera coloracin verde en la superficie sembrada por lo tanto la prueba del Acido Fenil Pirvico es positiva (+)

Descarboxilacin de la Lisina (LIA)

Sembrar la cepa en el agar LIA, incubar a 37 C durante 24 horas y observar (el color violeta purpura indicara que la prueba es positiva)

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Resultados:

Escherichia coli

Se observ una acentuacin en la coloracin purpura caracterstica del medio, por lo tanto la prueba Descarboxilacin de la lisina es positiva (+)

V.

DISCUSIONES El libro Diagnostico Microbiolgico escrito por el autor Betty A. Forbes dice lo siguiente: Si el microorganismo produce lisina descarboxilasa se forma cadaverina, que neutraliza los cidos orgnicos formados por la fermentacin de glucosa y el fondo del medio vuelve al estado alcalino (violeta) - Se observo en el laboratorio que la prueba de la Descarboxilacin de la lisina para la bacteria Escherichia coli fue positiva por lo cual se determina que a pesar de que esta bacteria fermente glucosa, esta posee una lisina descarboxilasa la cual neutraliza los cidos haciendo alcalino nuevamente al medio. El libro Diagnostico Microbiolgico escrito por el autor Betty A. Forbes dice lo siguiente: La prueba oxidasa permite distinguir algunos gneros de bacilos Gram negativos, como Aeromonas (+), Pseudomonas (+), Vibrio (+) y Alcaligenes (+), de las enterobacterias (-). Se usa tambin para diferenciar cocos o cocobacilos Gram negativos, como Neisseria (+) y Moraxella (+) de Acinetobacter (-). La mayor parte de las bacterias Gram positivas son oxidasa negativas. Bioqumica Bacteriana Microbiologa 15

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En el laboratorio trabajamos con Escherichia coli y la Pseudomona aeroflica dndonos como resultado oxidasa positiva para la Pseudomona y oxidasa negativa para Escherichia coli (a pesar de que esta bacteria es un bacilo Gram negativo es perteneciente al grupo de las enterobacterias)

El libro Manual Practico de Microbiologa escrito por el autor Ramn Daz dice: la prueba del Citocromo c oxidasa permite diferenciar al grupo Enterobacteriaceae (que carecen de citocromo C) del genero Pseudomonas (que poseen citocromo C) En la experiencia en el laboratorio trabajamos con la bacteria Escherichia coli dndonos como resultado oxidas negativa (-) , esta cita nos confirma un resultado correcto ya que esta bacteria es Gram negativa perteneciente al grupo Enterobacteriaceae.

VI.

CONCLUSIONES La bacteria Escherichia coli posee la enzima triptofanasa la cual degrada el triptfano, dando como resultado al Indol (uno de los productos) hacindose esta reaccin visible por la formacin de un aro rojo en la superficie del medio. La bacteria Escherichia coli posee la enzima catalasa la cual degrada el perxido de hidrogeno en hidrogeno y agua haciendo la reaccin visible mediante un burbujeo (efervescencia) la cual indica la liberacin del oxigeno (O2). La bacteria Escherichia coli no posee enzimas oxidasas ya que no hay oxidacin del citocromo, esto se hace visible al no obtener la coloracin violeta caracterstica de la prueba de la Citocromo c oxidasa positiva. La bacteria Escherichia coli no es capaz de metabolizar citrato. La bacteria Escherichia coli posee lisina descarboxilasa. La bacteria Escherichia coli es capaz de desaminar la fenilalanina produciendo Acido fenil pirvico

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VII.

BIBLIOGRAFIA Roger Y. Stainer, John L. Ingraham, Mark L. Wheelis, Page R. Painter. Microbiologa. Espaa: Editorial Reverte, 1992. Ramn Daz. Manual Practico de Microbiologa. Barcelona: Masson; 1999 Quevedo Fernando. Microbiologa General: Practicas de Laboratorio. Per : Universidad Nacional Federico Villarreal, 1967 Jean F. Mac Faddin. Pruebas Bioqumicas para la Identificacin de Bacterias de Importancia Clnica. Argentina: editorial Panamericana, 2003. Antonio Caballero Oliver, Luis Silva Garca, Nicols Fernndez De La Fuente, Carmen Silva Garca, Jos Garca Bermejo. Tcnico especialista en laboratorio de atencin primaria del instituto Cataln de Salud. Espaa: editorial MAD, 2006 Evelyn Rodrguez Cavallini. Bacteriologa General: Principios Y Prcticas de Laboratorio. Editorial Universidad de Costa Rica. Betty A. Forbes. Diagnostico Microbiolgico. Argentina: Editorial Panamericana, 2009

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