Marco Teorico Tisis

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RESUMEN El propsito del presente trabajo fue obtener antioxidantes naturales a partir de Solanum spp para emplearlos en la conservacin de aceites vegetales y otros alimentos. Para ello se realizo una zonificacin de la regin andina del Departamento de Cochabamba, con el fin de encontrar una comunidad que posea la mayor cantidad de variedades de papas nativas y que el cultivo sea completamente orgnico, seleccionando a la comunidad de Challviri B de la provincia Bolvar. De las 16 variedades nativas recolectadas, se seleccionaron mediante screening fitoquimico tres variedades, seleccionando las variedades Y, A, S a cuyos extractos se les realiz una estandarizacin respecto a su extraccin, pH y consistencia. La extraccin se realizo por agitacin a 600 rpm por 30 minutos seguida de una maceracin de 2horas, filtrado y concentrado a bao mara a una temperatura de 35C hasta obtener un 10% de humedad e inmediatamente regular el pH en un rango de 2,8-3,5. Las muestras concentradas se guardaron en frascos ambarados a una temperatura de 4C, hasta el momento de medir su actividad antioxidante. La actividad antioxidante se midi mediante el mtodo DPPH de Brand Williams, empleando como solventes de los extractos, agua y etanol a distintas concentraciones. Obteniendo una actividad antioxidante alta para el extracto al 70GL de la muestra Sc, con un porcentaje de inhibicin de 87,02% a 1000ug/ml y una menor actividad antioxidante para la muestra Ac al 96GL, obteniendo un porcentaje de inhibicin de 3,29% a 1000ug/ml.
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Respecto a la muestra Y se observ una mejor actividad a una concentracin de 1000ug/ml con un porcentaje de inhibicin de 78,41% y un IC50 de 247,8809mg/ml. La muestra A se observ una mejor actividad a una concentracin de 1000ug/ml con un porcentaje de inhibicin de 64,05 % y un IC50 de 456,6243mg/ml. Respecto a la muestra S se observ una mejor actividad a una concentracin de 1000ug/ml con un porcentaje de inhibicin de 87,02% y un IC50 de
112,5267mg/ml. Las muestras seleccionadas se aplicaron a aceites, despus de realizar pruebas de exposicin trmica, se realiz pruebas bromatolgicas para determinar el ndice de perxidos de cada muestra, obteniendo mejores resultados con las muestras Yc, Ac, con un ndice de perxido de 4 meq/1000, mientras que la muestra sin extracto presento un ndice de perxido de 3 meq/1000, resultados que se encuentran dentro de los valores permitidos de acuerdo a la NB34055. En el caso de las carnes con extracto estas se conservaron por un periodo e 4 das, mientras que el control solo estuvo apto para el consumo por 2 das. Todos estos resultados muestran que los antioxidantes presentes en las Solanun spp (papa nativa) son tiles para conservar alimentos.
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ABSTRAC propsito del presente trabajo fue obtener antioxidantes naturales a partir de Solanum spp para emplearlos en la conservacin de aceites vegetales y otros alimentos. Para ello se realizo una zonificacin de la regin andina del Departamento de Cochabamba, con el fin de encontrar una comunidad que posea la mayor cantidad de variedades de papas nativas y que el cultivo sea completamente orgnico, seleccionando a la comunidad de Challviri B de la provincia Bolvar. De las 16 variedades nativas recolectadas, se seleccionaron mediante screening fitoquimico tres variedades, seleccionando las variedades Y, A, S a cuyos extractos se les realiz una estandarizacin respecto a su extraccin, pH y consistencia. La extraccin se realizo por agitacin a 600 rpm por 30 minutos seguida de una maceracin de 2horas, filtrado y concentrado a bao mara a una temperatura de 35C hasta obtener un 10% de humedad e inmediatamente regular el pH en un rango de 2,8-3,5. Las muestras concentradas se guardaron en frascos ambarados a una temperatura de 4C, hasta el momento de medir su actividad antioxidante. La actividad antioxidante se midi mediante el mtodo DPPH de Brand Williams, empleando como solventes de los extractos, agua y etanol a distintas concentraciones. Obteniendo una actividad antioxidante alta para el extracto al 70GL de la muestra Sc, con un porcentaje de inhibicin de 87,02% a 1000ug/ml y una menor actividad antioxidante para la muestra Ac al 96GL, obteniendo un porcentaje de inhibicin de 3,29% a 1000ug/ml.
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Respecto a la muestra Y se observ una mejor actividad a una concentracin de 1000ug/ml con un porcentaje de inhibicin de 78,41% y un IC50 de 247,8809mg/ml. La muestra A se observ una mejor actividad a una concentracin de 1000ug/ml con un porcentaje de inhibicin de 64,05 % y un IC50 de 456,6243mg/ml. Respecto a la muestra S se observ una mejor actividad a una concentracin de 1000ug/ml con un porcentaje de inhibicin de 87,02% y un IC50 de
112,5267mg/ml. Las muestras seleccionadas se aplicaron a aceites, despus de realizar pruebas de exposicin trmica, se realiz pruebas bromatolgicas para determinar el ndice de perxidos de cada muestra, obteniendo mejores resultados con las muestras Yc, Ac, con un ndice de perxido de 4 meq/1000, mientras que la muestra sin extracto presento un ndice de perxido de 3 meq/1000, resultados que se encuentran dentro de los valores permitidos de acuerdo a la NB34055. En el caso de las carnes con extracto estas se conservaron por un periodo e 4 das, mientras que el control solo estuvo apto para el consumo por 2 das. Todos estos resultados muestran que los antioxidantes presentes en las Solanun spp (papa nativa) son tiles para conservar alimentos.
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2.1 ANTECEDENTES La utilizacin de la papa se remonta a casi trece mil aos atrs, los conquistadores espaoles encontraron la papa ya en estado domestico, es decir que poda ser sembrada y cosechada, almacenada o transformada para servir de reserva alimentaria. Se adaptaba a todos los terrenos con distintas variedades, moradas, amarillas, blancas. La papa junto con los granos andinos, la quinua, la kiwicha, el tarwi, conformaban la base del sustento de los habitantes estables y de las tropas mviles del imperio de los Incas. Toda su extensin posea una red de almacenamiento a distancias estratgicas en lugares climticamente aptos, generalmente a alturas bien ventiladas. Las zonas donde casi todos los investigadores aseveran el origen de este
tubrculo, es el altiplano andino que comprende los actuales territorios de Per, norte de Chile, Bolivia preponderantemente y Noroeste Argentino. Es donde se han encontrado las ms diversas variedades y se dice que eso se debe a la permanencia de la especie. (Galeano, 2006) 2.2 HISTORIA DE LA PAPA EN BOLIVIA En toda la tierra fra del denominado en tiempos coloniales Alto Per hoy en da Bolivia, por su abultamiento orogrfico en la cordillera de los Andes hace que este Pas tenga todas las condiciones para el brote de este tubrculo. El miembro del instituto agronmico de Francia Mr. Claude Verne quien por primera vez vino a Bolivia para buscar regenerarlas en Francia. Desde la conquista espaola y de la introduccin de muestra patata en Europa, pasaron mas de dos siglos, antes que se usara la papa como articulo alimenticio. semillas de papa, con el fin de
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Muchos se declararon contra su uso declarndola como venenosa, por ser perteneciente a la familia Solanos, fue en 1813 que Antonio Agustn Parmentier quien logro hacerla conocer como til para el hombre. (Ballivian Manuel, 1941) 2.3 PAPA NATIVA EN BOLIVIA El altiplano y las zonas altas por encima de los 3000 msnm estn entre las principales regiones productoras de papa en Bolivia ,pero el potencial productivo de esta zona se halla fuertemente limitado por diversos factores, siendo los ms importantes los de ndole climtico y entre ellos las heladas y las sequias. Se estima que los daos ocasionados por heladas y sequia pueden provocar prdidas en el rendimiento entre 40-100%, dependiendo del estado de desarrollo del cultivo, frecuencia, intensidad y severidad de los factores medio ambientales adversos. En los sistemas de produccin donde la papa es la principal actividad agrcola, se tiene la tendencia de buscar solamente la rentabilidad de este cultivo, dejando de lado principios necesarios para preservar el potencial productivo de los suelos. (Alfaro, 1998) 2.3.1 Importancia de la papa para la poblacin boliviana Alimento de la canasta familiar Nutritivo: la papa provee mas K-cal./Ha que la cebada, el arroz y la quinua Existen centenares de variedades nativas, con potencial para el mercado interno y externo Es un alimento de fcil digestibilidad y sabores agradables. (Zeballos, 2008)
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2.4 BIODIVERSIDAD En los departamentos productores del altiplano y valles interandinos: Amplia presencia y diversidad de papas nativas Existen municipios con fuerte concentracin de variedades nativas, entre los que sobresalen Cercado, Achacachi, Patacamaya en La Paz, con 72, 39 y 56 variedades respectivamente. Caracollo y Eucaliptus en Oruro, con 27 y 22 variedades. Llallagua y Jachijo en Potos con 70 y 126. (MRAC, 2011) El municipio de Bolvar, en el departamento de Cochabamba el 43% de su
produccin agrcola es papa. l municipio de Tacopaya el 20.4% es la produccin de papa. (CIPOTATO ORG, 2010) De acuerdo al catalogo de papas nativas elaborado por PROIMPA (1994) existen diferentes variedades de papa nativa que se muestra en el siguiente cuadro: TABLA 1: Variedades de papa nativa encontradas en Bolivia
Solanum stenotomum Katari papa
Solanum ajanhuiri Janqò Ajahuiri Lunku Ajahuiri
x Solanum phureja
Solanum goniocalyx Chaska Zapallo
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Solanum juzepczukii Laram qàysalla Qeto Luki Gendarme Imilla Blanca Imilla Negra Lunka Imilla Malkacho Polonia Qòyllu Sani Imilla Sani Runa Saqanpaya Waicha Wila Imilla Canastilla Blanca x Solanum chaucha x Solanum tuberosum andigena Solanum ssp. curtilobum Luki Negra Janqo Choque Pitu
Fuente: IBTA-PROIMPA, 1994
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2.5 PROCESO DE CULTIVO El programa de innovacin de papas nativas y races andinas PIC-Cochabamba (2009) describe el siguiente proceso: Las papas nativas deben ser consideradas como un cultivo diferente al de las papas mejoradas (convencionales). Las papas nativas tienen mejor calidad culinaria y alto porcentaje de materia seca. Generalmente se cultivan sobre los 3,000 m de altitud y sus requerimientos de suelos son muy especficos y son ms susceptibles a enfermedades como roa, carbn, verruga, rancha y a insectos como la polilla y el gorgojo. (Catacota, 2009) 2.5.1 Cosecha, Pos cosecha y Comercializacin En general, las papas nativas son sembradas cercano sobre los 3,500 m de altura y por lo tanto su cosecha es muy estacional. La mayora de los productores venden sus papas nativas a granel o trueque con otros productos, en pocos casos seleccionada y lavada. Casi todos los agricultores que producen papas nativas y papas mejoradas, almacenan sus productos en cantidades distintas pero sin ninguna tcnica probada, lo cual se detecta cuando estas salen a la venta con signos de daos por plagas o enfermedades, con brotes y con altas prdidas por
almacenamiento. Existe un gran nmero de variedades de papas nativas, pero no todas estas variedades son conocidas en los mercados y por tanto, no son comerciales en el corto plazo. Tambin existen algunas variedades mejoradas de papas andinas, las cuales tienen gran importancia comercial como es la variedad Waycha y otras similares, por lo que se constituyen en la base de la economa de los productores de papas de zona alta .La pos cosecha comprende todas las actividades, desde la
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cosecha de los tubrculos hasta su comercializacin al consumidor final. En este caso, se pueden distinguir los siguientes pasos: el manejo de la cosecha, pre clasificacin, transporte al centro de acopio,
almacenamiento, seleccin, lavado, empacado, embalaje, etiquetado y transporte al mercado. En la prctica, muchas de estas actividades no se llevan a cabo, ni siquiera respecto a las papas comerciales mejoradas. Se debe tener en cuenta que los tubrculos son rganos vivos sujetos a cambios continuos despus de la cosecha. La mayor parte de estos cambios no son deseables, tales como: el brotamiento, la conversin del almidn en azcares, la prdida de agua y por lo tanto la prdida de materia seca. (Catacota, 2009) 3.6 EFECTO DEL CLIMA SOBRE LAS PAPAS NATIVAS Algunas estimaciones sobre los efectos del cambio climtico a nivel mundial en el cultivo de papa nativa, durante los prximos 50 aos se proyectan que la reduccin del rendimiento puede oscilar entre 18% y 32 % si las variedades no tiene una adaptacin adecuada. La causa principal de esta disminucin se atribuye hasta el momento nicamente al cambio de la temperatura. Los efectos del cambio climtico son complejos, si la temperatura est por encima de 17C la tuberizacin disminuye, en tanto que si es menor a 0C los daos en los cultivos pueden llegar a ser bastantes severos. El incremento de dixido de carbono (CO2) en el ambiente tambin puede producir diferentes respuestas en el rendimiento de cultivo de papa nativa; una alta concentracin de CO2 en el ambiente, reduce el contenido de clorofila de la planta, as como el rea especfica de la hoja, tambin se produce la sescencia de la hoja, lo que podra deberse a una mayor tasa de fotosntesis y al mayor uso de nitrgeno para la produccin de carbohidratos. (Gutierrez)
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2.7 DESCRIPCIN FSICA DE PAPAS NATIVAS Entre las formas bsicas de la papa se puede encontrar tubrculos
redondos, largos y ovalados, adems de una serie de formas intermedias como la forma de un dedo, cilndrica, arrionada y de pera. En cuanto al color de la piel, este es uno de los caracteres ms fijos en el tubrculo de papa y, en la mayora de los casos, su presencia es posible an bastante antes de que ste alcance su completa madurez .El color de la piel del tubrculo puede variar desde blanco hasta coloreado, respondiendo a diferentes matices de rojo, prpura o violeta. (Moenne-Locoz, 2008) Adems, los tubrculos pueden presentar la piel de tinte uniforme o desuniforme, es decir, manchada. (Moenne-Locoz, 2008) 2.7.1 PRINCIPALES VARIEDADES ENCONTRADAS EN BOLIVIA 2.7.1.1 Imilla Negra (Ch'iyar Imilla, Yana Imilla) Especie: Solanum tuberosum ssp. Andigena Ploida: 2n = 4x = 48 2.7.1.2 Caracteres morfolgicos Color de la flor: Azul morado con jaspes violetas. Forma del tubrculo: Redondo con ojos profundos. Color de la piel: Negro. Color de la pulpa: Blanco
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FIGURA 1: Tubrculo Imilla negra
Fuente: Catalogo PROIMPA, N2, 1994
2.7.1. 3 Calidad de tubrculo Peso especfico: 1.095 Materia seca total: 23.1 % Almidn: 16.60 % Calidad culinaria: Excelente para ser consumida como papa hervida y en pur. Glicoalcaloides: Bajo contenido (no amarga).
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2.7.1.4 Zonas de cultivo Alturas entre 3000 a 4000 msnm de los departamentos de La Paz, Potos, Oruro, Chuquisaca y Cochabamba. (IBTA-PROIMPA, 1994) 2.7.2 Lunku Ajahuiri Especie: Solanum x ajanhuiri Ploida: 2n = 2x = 24 2.7.2 .1 Caracteres morfolgicos Color de la flor: Violeta. Forma del tubrculo: Elptico concertinado, con ojos profundos. Color de la piel: Morado con reas de color negro. Color de la pulpa: Crema. FIGURA 2: Tubrculo Lunku Ajahuiri
Fuente: Catalogo PROIMPA N21994
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2.7.2 .2 Calidad de tubrculo Peso especfico: 1.100 Materia seca total: 24.00 % Almidn: 17.48 % Calidad culinaria: Buena, consumida como papa hervida y chuo. Glicoalcaloides: Bajo contenido (no amarga). 2.7.2 .3 Zonas de cultivo Alturas entre 3500 a 4000 msnm de los departamentos de Oruro, La Paz, Cochabamba y Potos. (IBTA-PROIMPA, 1994) 2.7.3 Q'oyllu Especie: Solanum tuberosum ssp.andigena Ploida: 2n = 4x = 48 2.7.3 .1 Caracteres morfolgicos Color de la flor: Lila con jaspes violetas. Forma del tubrculo: Redondo con ojos medianamente profundos. Color de la piel: Negro. Color de la pulpa: Crema con reas moradas.
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FIGURA 3: tubrculo Q'oyllu
Fuente: Catalogo PROIMPA N2, 1994
2.7.3 .2 Calidad de tubrculo Peso especfico: 1.093 Materia seca total: 22.6 % Almidn: 16.07 % Calidad culinaria: Excelente para ser consumida como papa wayku (en quechua: papa hervida y consumida con piel). Glicoalcaloides: Bajo contenido (no amarga). 2.7.3 .3 Zonas de cultivo Alturas entre 3400 a 3900 msnm de los departamentos de Cochabamba, La Paz y Potos. (IBTA-PROIMPA, 1994)
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2.8 COMPOSICIN QUMICA DE PAPA NATIVA La papa nativa est constituida por un 75% de agua , 3% otros y un 18% de hidratos de carbono ,siendo el almidn el principal componente de estos
ltimos y adems presenta un elevado contenido de vitamina C de alrededor de 20 mg/100 g de papa ; es decir un 2% aprox. Los hidratos de carbono (que incluyen almidn, celulosa, glucosa, sacarosa y pectinas), junto con las protenas, grasas y sales minerales corresponden a la materia seca de la papa. Siendo el almidn el mayor constituyente de la materia seca de los tubrculos, que puede variar entre 60-85% de la materia seca, por lo que variedades con alto contenido de materia seca tendrn un alto contenido de almidn. (Moenne-Locoz, 2008) TABLA 2: Principales componentes de la papa, considerando rangos y medianas porcentuales
Componente
Rango (%)
Media (%)
Agua Slidos totales Protena (Nitrgeno total*6.25) Materia grasa Azucares reductores Carbohidratos totales Fibra cruda
63.2-86.9 13.1-36.8 0.7-4.6
75.05 23.7 2.0
0.02-0.20 0.0-5.0 13.3-30.53
0.12 0.3 21.9
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cidos orgnicos Ceniza Glicoalcaloides (Solanina) Vitamina C Compuestos fenolicos 0.17-3.48 0.4-1.0 0.44-1.9 0.2-41 1.0-54 5-30 0.71 0.6 1.1 3-10 10-25 ------
Fuente: Moenne-Locoz, 2008 2.9 FLAVONOIDES Los flavonoides son un gran grupo de sustancias vegetales que fueron descubiertas por el premio Nobel en Bioqumica Dr. Albert Szent-Gyorgi, quien les denomin como "vitamina P". El Dr. Szent-Gyorgi descubri que los flavonoides favorecen la funcin de la vitamina C, mejorando su absorcin y protegindola de la oxidacin. Los flavonoides comprenden varias clases de sustancias naturales, entre las cuales estn muchas de las que les confieren colores amarillo, naranja, rojo, violeta y azul, a muchas flores, hojas y frutos. (Martinez, 2005) 2.9.1 Caractersticas qumicas Para los qumicos los flavonoides tienen una estructura qumica muy definida. Puede observarse que de manera general son molculas que tienen dos anillos bencnicos ( aromticos, para los qumicos orgnicos) unidos a travs de una cadena de tres tomos de carbono, puesto que cada anillo bencnico tiene 6 tomos de carbono, denominado simplemente como compuestos C6C3C6. (Martinez, 2005)
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FIGURA 4: Ion flavilio
Fuente: Ocampo Rogelio, 2008
2.10 ANTOCIANINAS Las antocianinas son pigmentos que se encuentran en algunas frutas que van del color rojo al azul o morado como los arndanos, las frambuesas, las cerezas o las uvas. Su labor fundamental es la proteccin de los capilares de la retina, desempaando un papel fundamental en la conservacin de la buena vista. Adems parecen tener propiedades antivirales, hemostticas, por lo que pueden desempaar un papel positivo en las infecciones y en la detencin del sangrado. Protegen al corazn de las enfermedades cardiovasculares y tienen como el resto de flavonoides, un valor antioxidante.
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Parece ser que algunos de estos principios se pierden cuando los frutos son conservados en frio, por lo que sera recomendable tomarlos frescos en la temporada de produccin. Tambin se ha comprobado que las antocianinas aumentan en un fruto determinado a medida que este madura, por lo que no conviene comerlos verdes. (Plantas, 2012) 2.11 TANINOS Los taninos son compuestos polifenlicos de estructura qumica diversa que la propiedad de ser astringentes, es decir precipitan las protenas y su capacidad de curtir la piel. El curtido es el establecimiento de enlaces, tipo puente de hidrgeno, entre las fibras de colgeno. Son muy abundantes en el mundo vegetal, especialmente en algunas familias (Fagceas, Rosceas, Fabceas, Mirtceas, etc.) y en diversos rganos: racesrizomas (ruibarbo), cortezas (quina, roble), leo (catec), hojas (hamamelis), frutos (cinorrodones). Combinados con alcaloides y protenas y desempean una funcin defensiva frente a insectos: agallas, maduracin de frutos. 2.11.1 Composicin qumica Desde el punto de vista qumico se clasifican en: Taninos hidrolizables o hidrosolubles (piroglicos). En estos se distinguen los taninos glicos. Las drogas de inters por su contenido en taninos hidrolizables se pueden mencionar: los ptalos de la rosa roja (Rosa gallica), con taninos glicos (15%) y muy empleada para gargarismos, colutorios y lociones astringentes; hojas y corteza de hamomelis (Hamamelis virginiana) con taninos glicos, muy usada por va interna como
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externa; la sumidad florida de salicaria (Lythrum salicaria) con taninos elgicos (10%), muy utilizada como antidiarrica y vulneraria. Taninos condensados: no hidrosolubles, tienen una estructura similar a la de los flavonoides y carecen de osas en su molcula. Destacan los taninos catquicos (formados por 2 o ms molculas de 3-flavanoles) y los leucoantocianos o procianidoles (formados por 2 o ms molculas de 3,4flavandioles). En este grupo se pueden mencionar la raz de ratania (Krameria triandra) astringente-antidiarrica y el combreto (Combretum micranthum). Tambin se clasifican en este grupo la corteza de pino resinero (Pinus pinaster) y los estrbilos del ciprs (Cupressus sempervirens) de accin venotnica. Los taninos son sustancias amorfas solubles en agua, que forman soluciones coloidales, en alcohol y en acetona. Son insolubles en solventes apolares. Precipitan con numerosos reactivos (sales de hierro, plomo, cobre), alcaloides y protenas. (Hierbitas, 2011) 2.12 BIOSISNTESIS DE LOS COMPUESTOS FENOLICOS Metabolismo secundario, este termino agrupa a todas las reacciones bioqumicas y productos (metabolitos secundarios) que no son indispensables para la supervivencia del ser vivo. A diferencia del primario, que se halla casi invariable en toda la naturaleza, el secundario presenta una gran variabilidad.
En el siguiente esquema simplificado se muestra la interconexin existente entre el metabolismo primario y secundario, en este caso los metabolitos secundarios se dividen a grandes rasgos y considerando nicamente los grupos de mayor importancia, en tres grupos: compuestos terpenicos, compuestos fenlicos y compuestos con nitrgeno
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FIGURA 5: Biosntesis de metabolitos secundarios
Fuente: Villagmez Rodrguez, 2008 En la anterior figura tambin puede distinguirse que las siguientes rutas: Ruta del MEP (metileritritolfaosfato), ruta del MVA (cido mevalnico), ruta del cido malnico y la ruta del cido siquimico (en ingles shikimico). Es igual de
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importarte la participacin de aminocidos tanto alifticos como aromticos, ya que son la fuente biosintetica principal de nitrgeno. Cada una de estas vas esta relacionada de la siguiente manera con el metabolismo primario: La ruta del cido siquimico, es originada por el fosfoenolpiruvato y la eritrosa-4-fosfato, su vez este cido es precursor de los aminocidos aromticos. Los aminocidos alifticos son obtenidos a partir del ciclo de krebs (ciclo del cido ctrico). Las rutas malnica y mevalnica, a partir de la Acetil-CoA. La ruta MEP se origina del piruvato y del gliceraldehido-3-fosfato.
2.12.1 Relaciones existentes entre estas rutas y los grupos de metabolitos secundarios son las siguientes: Los compuesto terpenoides se biosintetizan por las rutas MEP o MVA. Los compuestos fenlicos por la ruta del cido siquimico, a partir los aminocidos aromticos o por la ruta del cido malonico. Estos vas pueden actuar solas o combinarse de las siguientes maneras: ruta cido siquimico-aminocidos aromticos y aminocidos aromticos-ruta cido malonico. Los compuestos de nitrgeno fundamentalmente provienen de los aminocidos aromticos y/o alifticos. En la siguiente figura se muestra de manera mas detallada los metabolitos secundarios y las rutas metablicas que le dan origen. (Villlagomes, 2008)
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FIGURA 6: Rutas metablicas
Fuente: Villagmez Rodrguez, 2008
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2.13 ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Los antioxidantes son sustancias de diverso tipo, que previenen o demoran el dao molecular producido por los radicales libres, que son micro partculas negativas y positivas que no se encuentran interiormente neutralizadas por lo que daan las membranas de nuestras clulas. Los antioxidantes naturales se encuentran en todas las partes de las plantas. Estos antioxidantes incluyen carotenoides, vitaminas, fenoles, flavonoides,
metabolitos endgenos, entre otros. La capacidad antioxidante de una mezcla no viene dada solo por la suma de las capacidades antioxidantes de cada uno de sus componentes; tambin depende del microambiente en que se encuentra el compuesto. Los
compuestos interactan entre si pudiendo producirse efectos sinrgicos o inhibitorios. (Fuenzalida, 2008) 2.14 FLAVONOIDES Y SU ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Su potencial antioxidante es dependiente del nmero y de la posicin de los grupos hidroxilos y su conjugacin, as como de la presencia de electrones donadores en el anillo estructural, debido a la capacidad que posee el grupo aromtico de soportar el desapareamiento de electrones por desplazamiento del sistema de electrones-p. (E. Marta KuskoskiI, Asuero, Garca-Parilla, Troncoso, & Fett, 2004) . La actividad antioxidante de los flavonoides resulta de una combinacin de sus propiedades quelatantes de hierro y secuestradoras de radicales libres (RL), adems a la inhibicin de oxidasas, como la lipoxigenasa (LO), la ciclooxigenasa (CO), la mieloperoxidasa (MPO), la NADPH oxidasa y la xantina oxidasa (XO); evitando la generacin de especies reactivas del oxgeno (ERO) in vivo, as como de hidroperxidos orgnicos. Por otra parte, se ha podido conocer que tambin inhiben enzimas involucradas indirectamente en los procesos oxidativos, como la
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fosfolipasa A2 (FLA2),al mismo tiempo que estimulan otras con reconocidas propiedades antioxidantes, la catalasa (CAT) y la superxido dismutasa (SOD). De esta forma los flavonoides interfieren en las reacciones de propagacin de RL y en la formacin del radical en s. (Trueba, 2003) Los flavonoides inhiben tambin los efectos degradativos provocados por el H2O2. La quercetina y la catequina eliminaron la citotoxicidad del H2O2 en clulas V79 de hmsters chinos, a travs de un ensayo de formacin de colonia en Salmonella TA 104 y en E. coli PQ 37. Los flavonoides impidieron la disminucin en el nmero de colonias provocadas por H2O2 y O2-. En estas clulas. Los grupos OH de las posiciones 3' y 4' en el anillo B y un doble enlace entre los carbonos 2 y 3, unido al grupo carbonilo de la posicin 4 en el anillo C, son cruciales para la actividad protectora. (Trueba, 2003) 2.15 LAS ANTOCIANINAS Y SU ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Los antocianos, pigmentos flavonlicos, tienen una estructura qumica adecuada para actuar como antioxidantes, pueden donar hidrgenos , o electrones a los radicales libres o bien atraparlos y desplazados en su estructura aromtica . Una actividad antioxidante ptima se relaciona con la presencia de grupos hidroxilos en las posiciones 3' y 4' del anillo B, los cuales confieren una elevada estabilidad al radical formado . Los grupos hidroxilos libres en las posicin 3 del anillo C y en la posicin 5 del anillo A, junto con el grupo carbonilo en la posicin 4 son donadores de electrones . La diversidad estructural contribuye favorablemente a la existencia natural de unos 300 antocianos con diferentes sustituciones glucosdicas , en la estructura bsica del ion fenil-2-benzopirilio o flavilio, representado en la los
principales antocianos. (E. Marta KuskoskiI, Asuero, Garca-Parilla, Troncoso, & Fett, 2004)
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FIGURA 7: Estructura de las antocianinas
Fuente: Olga de Loc,1994.
2.16
RELACIN
ENTRE
LA
ACTIVIDAD
ANTIOXIDANTE
LA
CONSERVACIN DE ALIMENTOS. La mejora en la calidad de los productos alimentarios es una demanda actual del consumidor, as como del incremento de la vida til de stos. Existe una continua necesidad de mejora de las propiedades intrnsecas de los envases y de los alimentos mismos. Este hecho, unido a la reticencia por parte de los consumidores de la adicin de conservantes u otro tipo de aditivos directamente sobre los alimentos, especialmente los de origen sinttico. Sin embargo, en las ltimas dcadas estn emergiendo nuevas tecnologas de conservacin de alimentos basadas en potenciar o aprovechar las posibles interacciones del envase con el producto y/o el ambiente que lo rodea, la adicin de antioxidantes naturales o inhibidores bacterianos.
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Por otra parte, los compuestos fenlicos se incluyen dentro de los llamados fitoqumicos, que son aquellas sustancias de origen vegetal que, aunque no tienen una funcin nutricional clsicamente definida, y por lo tanto no son consideradas esenciales para la vida, pueden tener un impacto significativo en el curso de alguna enfermedad y son indispensables a largo plazo para nuestra salud. Numerosos estudios aportan datos que apoyan una correlacin negativa entre la ingesta de fitoqumicos y el riesgo de padecer determinadas enfermedades como las cardiovasculares, cerebrovasculares y el cncer, adems de Alzheimer, cataratas y algunas otras disfunciones asociadas a la edad. Esta intensa actividad biolgica de los fitoqumicos confiere la denominacin de alimentos funcionales a aquellos a los que son aadidos. El boom de los alimentos funcionales surge en el momento en que el consumidor muestra su inters por contribuir a mantener una buena salud a travs de la alimentacin. (Clusteren, 2009) 2.17 USO DE ANTIOXIDANTES NATURALES EN LA CONSERVACIN DE ALIMENTOS. El Grupo de Investigacin en Ciencia y Tecnologa de la Carne, el Pescado y sus Productos de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Zaragoza viene trabajando en la bsqueda de sistemas naturales para retrasar los fenmenos oxidativos causantes de la alteracin del color, olor y sabor de los alimentos envasados. El uso de antioxidantes naturales como los extractos de romero, organo, pimiento, tomate y semillas de borraja, han demostrado ser eficaces. Si su accin se une a sistemas que eviten la incidencia de la radiacin UV, se consigue una considerable extensin de la vida til de los alimentos envasados y dispuestos para su venta, en particular de las carnes frescas. La mezcla antioxidante de romero ms vitamina C y sistemas de iluminacin libres de radiacin UV dobla la vida til de la carne La investigacin que lleva a cabo actualmente el Grupo de Ciencia y Tecnologa de la Carne, el Pescado y sus Productos en la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Zaragoza est encaminada a la bsqueda de sistemas naturales que permitan alargar la vida til
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de las carnes envasadas. Entre los sistemas investigados destaca por su eficacia el uso de diversos antioxidantes naturales. Entre ellos se cuentan antioxidantes vitamnicos (acido ascrbico o vitamina C, tocoferol o vitamina E); antioxidantes musculares (carnosina, carnitina, taurina); y antioxidantes procedentes de extractos de plantas (extractos de romero y organo, extractos de tomate rico en licopeno, pimiento dulce y picante, pimienta blanca y negra, extractos de t verde y harina desengrasada de semillas de borraja). (Roncales, 2003) Todas estas sustancias ejercen su efecto por medio de dos mecanismos diferentes, aunque relacionados entre s. Por una parte, inhiben la oxidacin de la mioglobina, con lo que protegen el color rojo brillante de la carne fresca. Por otra, inhiben la oxidacin de los cidos grasos, con lo que se frena la aparicin de olores y sabores de carne no fresca. Destacan entre los antioxidantes la borraja, los pimientos dulce y picante, el organo y el romero, que incrementan la vida til hasta un 200%; es decir, multiplican por 3 el tiempo de conservacin del color y olor de la carne fresca. Por otra parte, los recuentos microbianos realizados a lo largo de este tiempo, si la refrigeracin es adecuada, quedan por debajo de los lmites permisibles. (Roncales, 2003) Sin embargo, tanto la harina de borraja como los pimientos confieren algo de color, aroma y sabor no tpicos de la carne fresca, por lo que los ms indicados para su uso comercial parecen ser los extractos de organo y romero, y en particular este ltimo. Sin embargo, es obligado hacer nfasis en el efecto antioxidante de la harina de semillas de borraja. As, la borraja no slo ejerce un efecto mayor que el romero, sino que inhibe totalmente la oxidacin de lpidos. Este efecto puede ser tenido en cuenta para su aplicacin en otros alimentos o sistemas que requieran un potente antioxidante. Conviene aadir que la adicin conjunta de vitamina C con cada uno de los antioxidantes mejora su actividad, por lo que es recomendable utilizar siempre esa mezcla. Por otra parte, aunque caiga fuera del mbito de esta investigacin, no hay que olvidar el beneficioso efecto de
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la ingestin de antioxidantes en la dieta sobre todas las funciones del organismo, tanto desde el punto de vista nutricional como de la salud, en particular en todos los procesos relacionados con el envejecimiento celular. (Roncales, 2003)
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III.METODOLOGA
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3.1 TIPO DE ESTUDIO En el presente trabajo es analtico, experimental y longitudinal. Analtico.-Se evaluara la relacin actividad antioxidante-conservacin en aceites vegetales y otros alimentos Mtodo experimental.-La metodologa empleada es experimental dado que se manejan variables como: las muestras vegetales en estudio, los solventes de extraccin. Mtodo longitudinal.- El presente trabajo se realizara de forma continua, esto debido a que los procedimientos empleados as lo requieren. 3.2 ZONIFICACIN La zonificacin se realizo en base a encuestas realizadas en la regin andina del departamento de Cochabamba comprendida por los municipios de Bolvar, Tapacar, Mizque, Arque, Tacopaya. Seleccionando al municipio de Bolvar, la comunidad indgena de Challviri B por los resultados obtenidos. (Ver anexo 2)
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FIGURA 8: Ubicacin de la comunidad Challviri B en el municipio de Bolvar
CHALLVIRI B
Fuente: PDM municipio de Bolvar, 2011
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3.2.1 criterios de Inclusin Se tomo en cuenta comunidades que de acuerdo con sus informes en los PDMs municipales cumplan con los siguientes requisitos: Ser cultivos netamente orgnicos Sistemas de riego empleados, este deben ser cuenca Numero de variedades nativas, mayor de 10 variedades Procedencia de semillas, deben ser netamente de la comunidad y no obtenidas por trueque o compra externa. Participar voluntariamente
3.2.2 Criterios de Exclusin Se excluyeron aquellas comunidades que no cumplan con los criterios de inclusin y que adems presentaban las siguientes condiciones: Pertenecer a algn programa de mejoramiento de suelos y semillas Comunidades que continen con el sistema de mercadeo denominado trueque 3.3 COLECTA DEL MATERIAL VEGETAL Se realizo en el municipio de Bolvar en la comunidad indgena de Challviri B que se encuentra ubicada al sudeste del departamento de Cochabamba entre los paralelos 1753 1808 de latitud Sud y entre los meridianos 6625 y 6652 de longitud oeste del meridiano de Greenwich, a una altura de 4000 a 4600 msnm, a 161 kilmetros de la capital del departamento y a 80 kilmetros del departamento de Oruro. (PDM, 2011) La toma de muestra se efectu en tres etapas en los meses de abril, mayo y junio. La eleccin de fechas se realizo en base a una encuesta realizada a los habitantes de la comunidad de Challviri B, los cuales indicaron de acuerdo a sus
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conocimientos ancestrales, los mejores meses para la cosecha de la materia prima.(Ver anexo 2) El transporte y almacenamiento de la materia prima se realiz protegiendo a esta de la luz y de la humedad excesiva. 3.4 DETERMINACIN DE CARATERISTICAS ORGANOLEPTICAS Una vez trasladada toda la materia prima al laboratorio se realizo un muestreo por cuarteo, se selecciono este mtodo dado que una seleccin al azar nos llevara a tener errores visuales en la obtencin de una muestra representativa para la caracterizacin. A cada muestra representativa, resultado del muestreo se midieron las siguientes caractersticas: Color de piel Color de pulpa Numero promedio de ojos Profundidad promedio de ojos Tamao promedio Sabor
3.5 TRATAMIENTO DE LA MUESTRA Lavado.- Se realizaron 3 ciclos de lavado con agua potable. Desinfeccin.- Se realiz la desinfeccin con hipoclorito de sodio en una concentracin de 80 ppm. Dejando actuar esta solucin por 15 min. Pelado.- Se retir la piel con un cuchillo, para separar la materia prima en dos grupos; con y sin piel. (Ver anexo 3) A las 16 variedades se las codifico de la siguiente manera:
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TABLA: 16 variedades nativas recolectadas
Numero
Variedad
Sub-grupos
cascara
Pulpa
Sa
SaC
Sap
Ch
Chc
Chp
Al
Alc
Alp
Yc
Yp
Lc
Lp
Pa
Pac
Pap
Pr
Prc
Prp
Paz
Pazc
Pazp
Gga
Ggac
Ggap
10
Ggr
Ggrc
Ggrp
11
Pi
Pic
Pip
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12 Chl Chlc Chlp
13
Sc
Sp
14
Sa
Sac
Sap
15
Ac
Ap
16
Yw
Ywc
Ywp
Fuente: Elaboracin propia, 2012 3.6 PREPARACIN DE EXTRACTOS PARA EL SCREENING FITOQUIMICO Para la preparacin de extractos se sigui le metodologa de Olga de Lock , se prepararon extractos hidroalcohlicos a 70GL ,de las 16 variedades recolectadas, separando pulpa y cascara en una relacin 1:10 p/v , se filtro y se concentro hasta una humedad de 20% en un rota evaporador marca Fisatom a presin reducida de 1 atm ,600rpm y una temperatura de 35C, condiciones que de acuerdo a revisin bibliogrfica son las adecuadas para la conservacin de compuestos fenlicos. (Lock, 1994)
3.6.1 Screening fitoquimico preliminar Se realiz este tamizaje Fitoquimico a las 16 variedades recolectadas separadas en dos sub-grupos con y sin cscara, realizandose dos pruebas para identificar cada grupo de metabolitos secundarios (Ver anexo 4).Para esto se sigui el siguiente esquema:
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FIGURA 9: Screening fitoquimico preliminar
Extracto concentrado
Identificacion de Flavonoides
Prueba de Shinoda Prueba con H2SO4 Prueba con Cl3Fe Prueba gelatina al 1% Prueba de Mayer Prueba de Draguendorf
Identificacion de Taninos
Identificacion de Alcaloides
Fuente: Elaboracin propia, 2013
A partir de las cuales se seleccionaron 3 variedades en base a los siguientes criterios: Mayor cantidad de flavonoides Mayor cantidad de taninos Menor cantidad de alcaloides
3.7SCREENING FITOQUIMICO POR FRACCIONAMIENTO A las tres variedades seleccionadas se realizo el Screening fitoquimico por fraccionamiento, siguiendo el mtodo de Olga Lock empleando una serie de solventes y diversos reactivos especficos para cada metabolito secundario .A continuacin se describe esquemticamente todo el proceso.
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FIGURA 10:Screening fitoquimico por fraccionamiento
Macerar 5g de muestra con 50 ml de metanol
20 horas
Reflujar por 4 horas
Filtrar en caliente
El resto llevar a sequedad, extraer con 15ml de HCl al 1% a 50C
Fraccin A
Lavar con agua,, secar, agregar 5ml de CHCl3
Fraccin insoluble
Fraccin acida
Flavonoides Shinoda, Taninos Cl3Fe , gelatina al 1%,
Filtrar sobre columna de sulfato de sodio, enrasar a 5ml con CHCl3
Filtrar, enfriar, alcalinizar con NH3
Extraer con CHCl3 (2x25ml) Saturar con sal anhidra (0,1gr por por ml)
Fase cloroformica Fraccin B
Fase acuosa
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Lavar con agua ,secar , extraer con 50ml de CHCl3
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Extraer con solucin CHCl3: EtOH (3:2)
Esteroides Rx. Liebermann Burchard Quinonas Rx. Bortrager
Fraccin C Fase cloroformicaetanolica

4ml secar + 0.2ml de CHCl3 , Rx de Kedde, Rx Liebermann B. Evaporar + 2ml de HCl 1% Rx alcaloides
Fase acuosa remanente
Lavar con agua ,secar , extraer con 50ml de CHCl3
Fraccin E
Fraccin D
Shinoda, Rosenheim,Kedde,Liebermenn B. y alcaloides Evaporar +2ml de EtOH Shinoda, Rosenhein
3.8 CROMATOGRAFA CAPA FINA Para la realizacin de la cromatografa capa fina se emplearon placas TLC de 20x20 con UV . Para la utilizacin de las placas TLC estas se activaron a una temperatura de 110C por una hora, una vez fras se procedi al sembrado con un capilar con una distancia de 0,5cm entre cada punto de siembra.
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La eleccin del sistema se realizo experimentalmente modificando solventes como pH, Siendo el sistema de eleccin Acetato de Etilo: ter 3:10:10 el cual se introduce en una cmara cromatogrfica cantidad necesaria para cubrir un centmetro de la base de la placa. El revelado de las placas se realiz con acido sulfrico al 5% y cloruro frrico al 1% en metanol. Seguidamente se calcularon los Rf de cada muestra Rf = Distancia recorrida de la mancha /Distancia recorrida del solvente 3.9 PREPARACIN DE EXTRACTOS PARA LE DETERMINACIN DE COMPUESTOS ANTIOXIDANTES Se prepararon un total de 9 extractos etanlicos de las variedades YC,SC y AC , a una concentracin de 96, 70, 50 GL y 3 extractos acuosos, todos en una
relacin 1:3 p/v. Se licu en una licuadora marca Philips por 5 minutos, luego se procedi a agitar por 15 minutos a 600 rpm en un agitador magntico marca Wepose .Pasando el tiempo se filtr y se procedi a controlar el pH acidificando hasta un pH de 3, con cido clorhdrico concentrado con el propsito de estabilizar los extractos. Para concentrar se llevo a bao mara marca Fisatom a una temperatura de 35C, hasta una consistencia de miel con una humedad del 10%. Se guardaron en oscuridad a una temperatura de conservacin de 4C.
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FOTO 1: Proceso de obtencin de Extracto
B A C
A: proceso de licuado, B: proceso de agitacin, C: maceracin Fuente: Elaboracin propia, 2013 3.10 ESTANDARIZACIN DE EXTRACTOS Se determino los parmetros fsico-qumicos de control de calidad, segn la Norma Ramal Cubana (NRSP-312 1992) para extractos vegetales(Ver anexo 5), as como las propiedades organolpticas (olor y color), pH, ndice de refraccin, y contenido de slidos totales 3.10.1 Determinacin de pH El pH se determin mediante un pH metro digital marca Chek-Mite el cual tiene un error de 0.01
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3.10.2 Determinacin de solidos totales Se sigui el mtodo gravimtrico estandarizado en el PROFAC, donde se peso la capsula vaca previamente secada en la estufa por 4 horas, se le aadi 1ml de muestra, se volvi a pesar y se llevo a la estufa por 6 horas. Una vez transcurrido el tiempo se peso cada hora hasta obtener un peso constante, cada determinacin se realizo por triplicado. Los datos obtenidos se remplazaron el la siguiente formula:
%H=
x 100
Donde: %H: porcentaje de humedad Pm: peso de la muestra fresca Pms: peso de la muestra seca ST: 100-%H Donde: ST: Solidos totales %H: Porcentaje de humedad.
3.11 DETERMINACIN DE BIOACTIVIDDAD Se sigui la metodologa del CYTED, el bioensayo con Artemia Salina es un mtodo que permite determinar la bioactividad en la larva de este crustceo que es altamente sensible a una gran variedad de sustancias qumicas.
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Da 1 Se preparo agua de mar diluyendo 3,8 gramos de sal de mar en 100 ml de agua destilada y se procedi a filtrar. Se pesaron aproximadamente 50mg. De huevo de Artemia, se los introdujo en el agua de mar preparada y se incubo bajo la luz de una lmpara por 48 horas.
Da 2 Se diluyeron 20mg de extracto punto miel en 2ml de agua destilada, a partir de esta solucin de prepararon diluciones a 1000, 100 y 10ppm por triplicado, tambin se preparo un control el cual solo contena agua destilada. A cada vial se agregaron 10 nauplios y el volumen necesario de agua destilada hasta completar los 5ml por cada vial. A cada vial se le agrego una gota de una suspensin de levadura (3mg de levadura seca en 5ml de agua) como alimento. Da 3 Despus de 24 horas se cont el numero de sobrevivientes por cada dilucin, los datos obtenidos fueron analizados por el programa de computadora Firney(DOS) (CYTED) 3.12 DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE 3.12.1 Curva de calibracin Se prepar una disolucin de DPPH 0.1 mM en etanol absoluto. A partir de esta disolucin, se preparan cinco disoluciones de un volumen de 10 mL de concentraciones 0.02, 0.04, 0.06, 0.08 y 0.1 mM. Adems, se prepar un BLANCO que nicamente tiene 10 mL de disolvente. Se midi la
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absorbancia de estas disoluciones a una longitud de onda de 517 nm en un espectrofotmetro Gennesys 10s. 3.12.2 Lectura de controles Se emplearon dos controles: Acido Ascrbico a unas concentraciones de 200, 100, 50 y 25 ug/ml en extracto acuoso Butil hidroxi tolueno (BHT) a unas concentraciones de 200,100,50, 25, 10,5 ug/m en extracto metanlico Todas las soluciones preparadas de los controles se dejaron en oscuridad por 30 minutos, para posteriormente medir sus absorbancias a 517 nm en el espectrofotmetro Gennesys 10s. 3.12.3 Lectura de muestras Con los extractos ya estandarizados se prepararon soluciones a 1000, 500, 200,100 y 50 ug/ml de concentracin, todas las soluciones se dejaron en reposo, en oscuridad por 30 minutos para posteriormente ser ledas en el espectrofotmetro Gennesys 10s, a una longitud de onda de 517nm. Los resultados fueron expresados como porcentaje de decoloracin de DPPH utilizando la siguiente formula: %Decoloracion DPPH= (1 _ Am - Abm) x 100 A DPPH Am = absorbancia de la mezcla de reaccin Abm = blanco de muestra A DPPH = absorbancia de la solucin DPPH
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3.12.4 Anlisis estadstico de datos Los datos obtenidos fueron analizados en el centro de estadstica aplicada (CESA) de la facultad de Tecnologa de la Universidad Mayor de San Simn. El anlisis estadstico fue realizado con el programa Minitab y al prueba utilizada para relacionar el tipo de solvente, las concentraciones, y la actividad antioxidante fue el anlisis de Varianza de dos factores basado en la desviacin estndar agrupada. Para comparar la actividad antioxidante de los extractos en relacin a los controles positivos el acido Ascrbico y el BHT, se utilizo el programa estadstico ANOVA. Para calcular el IC50 se empleo el paquete Excel de Microsoft Office 2010, que por interpolacin lineal, entre las concentraciones por encima y por debajo de la inhibicin de 50% en la curva de calibracin, nos da los mg/ml necesarios para decolorar el 50% del reactivo DPPH. La frmula para el IC50 estn incorporados en el mdulo IC50 clculo, empleando la siguiente formula:
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3.13 APLICACIN EN ALIMENTOS Una vez realizadas las pruebas y los anlisis estadsticos de los datos obtenidos se procedi a aplicar los extractos a diferentes alimentos. Los extractos (los cuales tienen mayor porcentaje de inhibicin, flavonoides, taninos y otros pigmentos), se aplic a alimentos tales como: aceites y carne de vacuna. 3.13.1. Aceites Los aceites comerciales ya presentan conservantes, es por esa razn que se seleccion un aceite que no tenga vitamina A, se emple aceite FINO de Girasol-Soya, al cual se le midi su ndice de refraccin para descartar adulteraciones, para ello se empleo un refractmetro tipo ABBE temperatura de 25C. Se emple el sistema modelo de la emulsion. Al aceite comercial se filtro con oxido de aluminio en una relacin 2:1,4 para retener los antioxidantes del aceite, sin tener que usar ningn disolvente. (Aparicio, 2003) Seguidamente se centrifug a 3500 rpm, quedndonos nicamente con el sobrenadante. Del aceite libre de antioxidante, se tomaron alcuotas de 50ml, a las cuales se aadi 1g de extracto semilquido, el extracto se aadi juntamente con 0,75ml de tween 80 y se agito. Este procedimiento se realizo con los extractos Yc 70, Sc 70, Ac 70. a una
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FOTO 2: Aceites con extracto
Vaso A: muestra control, Vaso B: muestra con extracto Fuente: Elaboracin propia, 2013 Se verti en placas Petri 30ml de aceite de la siguiente manera: TABLA 4: Dosificacin de extractos en aceites
Numero
Aceite
Extracto
Tween 80
30ml
1gr Sc
0,75ml
30ml
1gr Ac
0,75ml
30ml
1gr Yc
0,75ml
30ml
----------
0,75ml
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Todas las muestras fueron sometidas a 105C por 2horas, esto con el objetivo de acelerar trmicamente la oxidacin del aceite, transcurrido ese tiempo se tomaron fracciones de 10ml por cada una de las muestras para realizar pruebas bromatolgicas y organolpticas. El restante se introdujo nuevamente a la estufa por una hora ms, para ir comparando la oxidacin trmica vs tiempo. Se repiti este procedimiento hasta que los aceites tomen una coloracin negruzca. 3.13.2 Carne vacuna La carne vacuna se cort en filetes de 15 x 15 cm y 1cm de alto, los extracto Yc 70, Sc 70, Ac 70 se aplicaron en forma de barniz con la ayuda de una jeringa dosificadora de tal manera que se cubra toda la superficie que tenga contacto con al ambiente, repitiendo el procedimiento cada 24 horas, hasta observar signos de descomposicin. 3.14 PRUEBAS DE CONSERVACION La realizacin de pruebas de estabilidad depender del tipo de alimento, a los cuales se les realiz dos pruebas bromatolgicas de conservacin, comparando siempre con un blanco y un control (el alimento intacto sin modificaciones). 3.15 ACEITES Se realizo ndice de perxidos para de esta manera cuantificar el grado de oxidacin y as su conservacin.
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3.15.1 ndice de perxidos Esta prueba permite determinar los miliequivalentes de oxigeno activo contenidos en un kilogramo de grasa, calculados a partir del yodo liberado del yoduro de potasio. Se peso 10gr de aceite se aadi 10ml de cloroformo, seguidamente se adiciono 15ml de acido actico glacial y 1ml de la solucin saturada de yoduro de potasio. Se agito por un minuto y dejo en reposo en la oscuridad por 5 minutos, por ultimo se aadi 75ml de agua destilada, agitar y se titulo con tiosulfato de sodio 0.01N, utilizando almidn como indicador. Los ml gastados son remplazados en la siguiente formula:
IP meq/1000g = Donde:
V: Volumen de la solucin de tiosulfato de sodio empleado en la valoracin de la muestra, en ml. V: Volumen de la solucin de tiosulfato de sodio empleado en la valoracin Del blanco, en ml. N: Normalidad de la solucin utilizada m: peso de muestra utilizada
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FOTO 3: Determinacin de IP
A: Pesado
B
B: Adicin de indicador
C: Titulacin
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Con el objetivo de dar veracidad a los resultados obtenidos las muestras fueron nuevamente procesadas por un laboratorio de referencia, el laboratorio LAN dependiente dela facultad de Bioqumica y Farmacia de la Universidad Mayor de San Simn. (Ver anexo ) 3.16 CARNE VACUNA Se evalu cada 24 horas las caractersticas organolpticas adems de ello se realizaron pruebas bromatolgicas detalladas a continuacin. 3.16.1 Reaccin al tornasol Se introdujo una tira reactiva de pH al interior de cada una de las muestras con el objeto que esta se humedezca y as medir su pH, esta operacin se la realiz cada 24 horas. 3.16.2 Ensayo de EBER Determina la presencia de amoniaco y acido sulfrico, los cuales son signos de descomposicin y putrefaccin. En un tubo de ensayo se coloc 3ml del reactivo de EBER (1 parte de HCl, 3 de Etanol y 1 de ter) y se introdujo un trozo de la muestra hasta una altura de 2cm por encima de la superficie del reactivo y se observo la cantidad de humos blancos desprendidos. Esta prueba se realizo cada 24 horas.
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FOTO 4: Ensayo de Eber
Fuente: Elaboracin propia, 2013 3.16.3 Prueba de isonitrilo Determina la presencia de amoniaco, mediante un tratamiento alcalino. En una capsula de porcelana se coloco 3gr de papilla de cada una da las muestras, se aadi 5ml de se OHNa al 10% y 3-5 gotas de cloroformo, se calent moderadamente y se cualifico la intensidad del olor nauseabundo. Esta prueba se realizo cada 24 horas.
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FOTO 5: Prueba isonitrilo
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IV.RESULTADOS
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4.1 ZONIFICACIN
Respecto a la zonificacin en base a las encuestas realizadas los resultados son: GRAFICO 1: cultivo de papa nativa
Distribucion del cultivo de papa : Region Andina Cochabamba

100 porcentaje 50 0 BOLIVAR TACOPAYA TAPACARI TACOPAYA 25 18 Cul. Org. Pro.papa nativa ARQUE TAPACARI 50 34 ARQUE 35 20
Pro.papa nativa Cul. Org.
BOLIVAR 60 100
Seleccionando al municipio de Bolvar ya que el 60% de su produccin agrcola se centraba en el cultivo de papa y el 100% de esta era cultivo netamente orgnico, en el que segn las encuestas realizadas utilizaban como abono heces de Ovejas, y Llamas, el cultivo se realiza una vez al ao, para la eleccin de la poca de siembra se emplean los llamados marcadores naturales, mediante los cuales
determinan el tiempo de siembra, heladas, riego, etc. En el caso de seleccin de la comunidad se obtuvieron los siguientes resultados:
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GRAFICA 2: Distribucin de las variedades de papa en el municipio de Bolvar
20 15 10 5 0
16
15 12 3 6 2 3 5 1 3 7 3 2 7 2 52 6 2
VAR. NATIVAS
VAR. COMERCIALES
La comunidad de Challviri B posee un nmero de 16 variedades de papa nativa, la segunda comunidad con ms variedades es Champojo, seguida de Janchallavini, pero el acceso a estas comunidades es dificultoso, los terrenos agrcolas se encuentran alejados de las casas comunales. La razn ms importante para descartar trabajar con estas comunidades es que las mismas no estaban de acuerdo en la forma de trabajo del proyecto. Las variedades nativas son las mismas en todas las comunidades, con la diferencia que algunos optan por no cultivarlas debido a la delicadeza de la semilla de muchas de ellas.
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4.2 CARACTERIZACIN MORFOLGICA Y MACROSCPICA DEL MATERIAL VEGETAL Esta caracterizacin se la realizo con la ayuda y gua de PROIMPA. Por muestreo se selecciono un promedio de 16 papas por variedad recolectada, a las cuales se les realizo la caracterizacin, y se saco una media por variedad. Obteniendo los siguientes resultados: TABLA 5: Caracterizacin de las variedades recolectadas
MUESTRA
FORMA
COLOR
ASPECTO
TAMAO
OLOR
SABOR
N OJOS
PROF. DE OJOS
OBS.
Sa
Ovalada elevada
Negro plateado
liso
3.5x5.3
Caract .
Caract
9-10
0.208
Cascara tiene granulacione s amarillas
Ch
Redondo irregular
Amarillo verdoso
Rugoso
3.9x3.8
Caract .
caract
11-12
0.518
Aspecto rugoso por la profundidad de ojos
Al
Alargada
rojo vino liso
3.1x4.8
Caract
Astring
6-7
0.001
achatada amarillo A Alargada morada Liso opaco Y L Redonda ovalada negro Amarillo palido Pa Ovalada Amarillo opaco rugoso Liso opaco Liso rugoso 3.8x7.2 caract caract 17-18 0.208 Presenta pulpa blanca 2.5x8.5 3.8x5.7 caract caract caract caract 12-14 10-12 3.8x5.7 caract caract 10-12 ---0.510 ----
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Pr Ovalada aplanada Paz Ovalada aplanada Gga Redondo irregular Ggr Redondo irregular morado irregular 3.6x4.8 Caract Amargo 12-14 0.301 La pulpa presenta una coloracin morada amarillo irregular 4.5x6 Caract Leoso 12-14 0.312 morado Liso 3.7x4.8 caract Caract 9-11 ----rojo liso 3.5x4.9 caract Caract 11-12 0.206 Presenta pulpa blanca Se decolora al ser lavado Pulpa blanca
Pi
alargada
negro
liso
4.2x8.5
Caract
Astring
7-8
0.208
Despigmenta cin al ser lavado
Chl
alargada
Morado opaco
liso
4.2x8.6
Caract
Amargo
10-12
0.101
Aspecto granular de pigmentacin amarilla
Sa
redonda
Amarillo con morado
irregular
5.1x5
Caract
Caract
6-8
0.414
De pocos ojos profundos pulpa amarilla
Yw
Alargada
Amarillo verdusco dorado
liso
3.5x8.5
Caract
Caract
4-6
0.101
Poca cantidad de ojos
Alargada
Negro brilloso
Liso brillante
3.4x5.7
Caract
Caract
7-8
0.102
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4.3 SCREENING FITOQUMICO PRELIMINAR Se empleo esto mtodo con el fin de descartar algunas variedades nativas, quedarnos solamente con tres de ellas. Los resultados obtenidos son:
TABLA 6: Resultados screening preliminar pulpa
Variedad
Alcaloides Mayer
Taninos Dragendorf Cl3FE
flavonoides Gelatina Shinoda 1% H2SO4
Antocianinas Acido pcrico Acetato de plomo ----+ ----+ + ---
Sap Chp Alp Ap Yp Lp Pap Prp Pazp Ggap Ggrp Pip Chlp
++ + ++ + + ++ ---+++ +
++ + ++ + + ++ ---+++ +
+++ ++ + + ++ ++ ++ -++ + + +
+++ ++ + + ++ ++ ++ -++ + + +
--+ + + --++ ---
--+ + + --++ ---
----+ ----+ + ---
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Sp Sap Ywp ++ + ++ + ++ + + ++ + + ++ --++ --++ ---++ ---
Fuente: Elaboracin propia, 2012 Respecto a los extractos de las pulpas se observa que las variedades Sp, Yp presentan una regular cantidad de taninos flavonoides, las variedades Sp ,Yp, Ap, Ggrp y las muestras Pap, Pip gran
presentan gran cantidad de
alcaloides, as mismo las variedades Sp, Yp, Ggrp, Ggap presentan antocianinas. Tambin se realizo screening preliminar a la cascara de cada una de las variedades recolectadas de la comunidad de Challviri B, donde los resultados obtenidos fueron:
TABLA 7: Screening preliminar cascara

Variedad Alcaloides Mayer Taninos Dragendorf Cl3FE flavonoides Gelatina Shinoda 1% H2SO4 Antocianinas Acido pcrico Acetato de plomo ---+++ +++ ---
Sac Chp Alc Ac Yc Lc Pac
---+ --+
---+ --+
++ -+ + ++ ++
++ -+ + ++ ++ +++ +++ ---+++ +++ -----
---+++ +++ ---
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Prc Pazc Ggac Ggrc Pic Chlc Sc Sac Ywc + ++ + ---+ -+ ++ + ---+ -++ + -+ + + ++ +++ ++ ++ + -+ + + ++ +++ ++ ++ +++ -++ + -++ + ++ ++ +++ -++ + -++ + ++ ++ +++ + + --+++ + + ++ +++ + + --+++ + +
Fuente: Elaboracin propia, 2012 De los resultados obtenidos resalta la gran cantidad de flavonoides presente en las variedades Sc, Yc, Ac, Pazc, la gran cantidad de taninos en las variedades Sac, Yc, Ac y la ausencia de alcaloides en las variedades Yc, Alc y Sc. 4.4 SCREENING POR FRACCIONAMIENTO DE LAS VARIEDADES
SELECCIONADAS
TABLA 8: Resultados Screening por fraccionamiento MUESTRAS Ap AC Yp Yc Sp Sc
FRACCION A GELATINA CLORURO FERRICO +++ + +++ +++ ++ +++ +++ +++ + +++ +++
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SHINODA +++ ++ ++ +++
FRACCION B LIEBEERMAN BORTRAGER -
FRACCION C KEDDE LIEBERMAN MAYER + + + + + -
DRAGUENDORF ++
FRACCION D SHINODA ROSENHEIN KEDDE LIEBERMAN MAYER + + + -
DRAGUENDORF ++ REINECKATO +
FRACCION E SHINODA ROSEHEIN + + + + ++ + ++ ++
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Al analizar los resultados obtenidos del screening por fraccionamiento se destaca que las muestras Sc, Ac y YC presentan gran cantidad de flavonoides, taninos, leucoantocianinas ; y poco o nada de alcaloides. Mientras que los extractos Sp, Ap y Yp presentan poco o nada de taninos , flavonoides, leucoantocianinas ; y escasa y/o regular cantidad de alcaloides. 4.5 CROMATOGRAFIA CAPA FINA
FOTO 6: Realizacin de cromatografa capa fina
Fuente: Elaboracin propia, 2012 Los Rf obtenidos son : comparar con autor 0,1 cm 0,2 cm 0,3 cm 4.6 ESTANDARIZACIN DE EXTRACTOS
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4.6.1 Caractersticas organolpticas TABLA 9: Caractersticas organolpticas de los extractos CARACT. 50% COLOR OLOR SABOR Violeta caracterstico astringente 70% Violeta oscuro caracterstico astringente Lmpido Muestra Ac 50% COLOR OLOR SABOR Rojizo caracterstico astringente 70% Rojizo oscuro caracterstico astringente Lmpido Muestra Yc 50% COLOR OLOR SABOR violeta caracterstico astringente 70% Violeta oscuro caracterstico astringente Lmpido 96% violeta caracterstico astringente Lmpido Acuoso violeta caracterstico astringente Lmpido 96% Rojizo caracterstico astringente Lmpido Acuoso Rojizo caracterstico astringente Lmpido Muestra Sc 96% violeta caracterstico astringente Lmpido Acuoso violeta caracterstico astringente Lmpido
ASPECTO Lmpido
ASPECTO Lmpido
ASPECTO Lmpido
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Fuente: Elaboracin propia, 2012 Dentro de las caractersticas organolpticas un aspecto relevante es el sabor, este posiblemente se deba a la presencia de taninos en todos los extractos, otro caracterstica sobresaliente es el color, que a medida que pasaba en tiempo, este iba cambiando y el extra se volva cada vez mas turbio; razn por la cual se modifico el pH.
4.5.2 Modificacin de pH TABLA 10: modificacin de pH CARACT. SC 50% 70% 96% Acuoso pH inicial 5,12 5,78 6.03 5,89 pH final 3 3,17 2,56 2,39 AC 50% 70% 96% Acuoso 5,38 5,45 5,83 5,96 2,40 2,39 3,10 3,13
CARACT. SC 50% 70% 96% Acuoso pH inicial 5,74 5,96 6,17 6,69 pH final 3,56 3,73 3.52 3
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Se estabilizo todos los extractos en un rango de pH de 2,39 a 3,52, lo cual hizo que los extractos cambien de color esto debido a que los compuestos fenlicos, flavonoides y antocianinas sufren modificaciones de color por efecto de la modificacin de pH, esta operacin a su vez coadyuva a que el extracto se conserve debido al medio acido.
4.6.3 ndice de refraccin TABLA 11: ndice de refraccin CARACTERISTICA SC 50% 70% 96% Acuoso ndice refraccin de 1.35 1,36 1,37 1,34 AC 50% 70% 96% Acuoso 1,35 1,36 1,37 1,34
CARACTERISTICA
YC 50% 70% 96% Acuoso
ndice refraccin
de 1.35 1,36 1,37 1,34
Fuente: Elaboracin propia, 2012 4.7 DETERMINACIN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE
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4.7.1 Curva de calibracin Se elabor una curva de calibracin con e objeto de conocer el comportamiento del radical DPPH en el medio de la reaccin, empleando diferentes concentraciones (0,02; 0,04; 0,06; 0,08mM), obteniendo un coeficiente de correlacin de R2=0,9983
GRAFICA 3: Curva de calibracin de reactivo DPPH
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CURVA PATRON
Abs
1.200
y = 13.3150x + 0.0205 R = 0.9983

1.000
0.800
0.600
0.400
0.200
0.000 0 0.02mM 0.04mM 0.06mM 0.08mM 0.1mM
Conc
4.7.2 Actividad antioxidante de la muestra Ac
TABLA 14: Resultados anlisis estadsticos MUESTRA _Ac
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MUESTRA Ac Porcentaje de inhibicin Concentracin Acuosa Al 50% 1000 500 200 100 26,89 26,26 16,26 15,06 42,84 39,62 35 27,08 64,05 48,67 34,11 22,78 Al 70% Al 96% 0 0 0 0 33,445 28,6375 21,3425 16,23 Medias
Fuente: Elaboracin propia, 2013 En relacin a los resultados de la actividad antioxidante de cada una de las muestras se consideraron la actividad de extractos obtenidos con diferentes solventes, en nuestro caso se usaron Acuosa, al 50%, al 70%, al 96% y las diferentes concentraciones utilizadas de 1000, 500, 200, 100ppm.
TABLA 15: ANOVA de dos factores para la muestra Ac Fuente Concentracin Muestra Error Total GL 3 3 9 15 SC 699,24 MC 233,08 F 4,01 P 0,046
4267,52 1422,51 24,48 0,000 522,9 5489,66 58,1
S = 7,622
R-cuad. = 90,47%
R-cuad.(ajustado) = 84,12%
Los resultados del anlisis estadstico de la varianza nos muestran que existen diferencias significativas entre las medias de la concentracin
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(concentracin) en relacin a su actividad antioxidante. Por lo tanto las medias No son iguales para las diferentes concentraciones.
Los resultados del anlisis estadstico de la varianza nos muestran que existen diferencias significativas entre las medias de la muestra (Muestra) en relacin a su actividad antioxidante. Por lo tanto las medias No son iguales para las diferentes concentraciones. Con un nivel de confianza del 95%. A continuacin se muestra un grafico en el que se observa el comportamiento antioxidante de las muestras Ac y sus porcentajes de inhibicin
GRAFICA 4: Porcentaje de inhibicin muestra Ac
Fuente: Elaboracin propia, 2013 De acuerdo a la grafica observamos que existe un mayor porcentaje de inhibicin a 1000ppm en todas las muestras, mientras que comparando
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cada una de las muestras por sus extractos, se tiene un porcentaje de inhibicin mayor con el extracto hidroalcohlico al 70% en todas las concentraciones y un menor porcentaje de inhibicin para los extractos al 96% en todas sus concentraciones.
4.7.3 Actividad antioxidante de la muestra Yc
TABLA16: Resultados anlisis estadsticos MUESTRA _Yc MUESTRA Y Concentracin Acuosa Al 50% 1000 500 200 100 25,5 34,62 19,55 7,46 60,56 43,86 27,65 23,6 Al 70% 78,41 77,08 58,48 31,51 Al 96% 3,29 0 0 0 41,94 38,89 26,42 15,6425 Medias
Fuente: Elaboracin propia, 2013 En relacin a los resultados de la actividad antioxidante de cada una de las muestras se consideraron la actividad de extractos obtenidos con diferentes solventes, en nuestro caso se usaron Acuosa, al 50%, al 70%,al 96% y las diferentes concentraciones utilizadas de 1000, 500, 200, 100 ppm.
TABLA 17: ANOVA de dos factores: Fuente GL SC MC F P
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Concentracin Muestra Error Total 3 3 9 15 1753,8 7921,4 934,6 10609,8 584,61 5,63 0,019
2640,48 25,43 0,000 103,84
S = 10,19
R-cuad. = 91,19%
Los resultados del anlisis estadstico de la varianza nos muestran que existen diferencias significativas entre las medias de la concentracin (concentracin) en relacin a su actividad antioxidante. Por lo tanto las medias No son iguales para las diferentes concentraciones. Los resultados del anlisis estadstico de la varianza nos muestran que existen diferencias significativas entre las medias de la muestra (Muestra) en relacin a su actividad antioxidante. Por lo tanto las medias No son iguales para las diferentes concentraciones. Con un nivel de confianza del 95%. A continuacin se muestra un grafico en el que se observa el comportamiento antioxidante de las muestras Yc y sus porcentajes de inhibicin
GRAFICA 5: Porcentaje de inhibicin muestra Yc
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De acuerdo a la grafica observamos que existe un similar porcentaje de inhibicin a 500 y 1000ppm en todas las muestras, mientras que comparando cada una de las muestras por sus extractos, se tiene un porcentaje de inhibicin mayor con el extracto hidroalcohlico al 70% en todas las concentraciones y un menor porcentaje de inhibicin para los extractos al 96% en todas sus concentraciones.
4.7.4 Actividad antioxidante muestra Sc
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TABLA 18: Resultados anlisis estadsticos MUESTRA _S MUESTRA S Concentracin Acuosa Al 50% 1000 500 200 100 25,88 14,62 0 0 80,37 78,67 58,41 45,75 Al 70% 87,02 85,63 71,26 58,67 Al 96% 73,67 40,18 0 0 66,735 54,775 32,4175 26,105 Medias
Fuente: Elaboracin propia, 20113 En relacin a los resultados de la actividad antioxidante de cada una de las muestras se consideraron la actividad de extractos obtenidos con diferentes solventes, en nuestro caso se usaron Acuosa, al 50%, al 70%,al 96% y las diferentes concentraciones utilizadas de 1000, 500, 200, 100ppm.
TABLA 19: ANOVA de dos factores: Fuente Concentracin Muestra Error Total GL 3 3 9 15 SC 4333,2 11446 1312,5 17091,7 MC 1444,4 F 9,9 P 0,003
3815,35 26,16 0,000 145,83
Fuente: Elaboracin propia, 2013 Los resultados del anlisis estadstico de la varianza nos muestran que existen diferencias significativas entre las medias de la concentracin (concentracin) en relacin a su actividad antioxidante. Por lo tanto las medias No son iguales para las diferentes concentraciones.
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Los resultados del anlisis estadstico de la varianza nos muestran que existen diferencias significativas entre las medias de la muestra (Muestra) en relacin a su actividad antioxidante. Por lo tanto las medias No son iguales para las diferentes concentraciones.
Con un nivel de confianza del 95%. A continuacin se muestra un grafico en el que se observa el comportamiento antioxidante de las muestras Sc y sus porcentajes de inhibicin
GRAFICO 6: Porcentaje de inhibicin muestra Sc
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De acuerdo a la grafica observamos que existe un similar porcentaje de inhibicin a 500 y 1000ppm en todas las muestras, mientras que comparando cada una de las muestras por sus extractos, se tiene un porcentaje de inhibicin mayor con el extracto hidroalcohlico al 70% en todas las concentraciones y un menor porcentaje de inhibicin para los extractos al 96% y acuoso en todas sus concentraciones.
4.7.5 Comparacin de muestras al 50% VS patrn positivo
TABLA 20: Resultados anlisis estadsticos MUESTRA _A (50%)
Concentracin
%_inhibicin acido_ascorbico
%_inhibicion _BHT
%_inhibicion _Ac
%_inhibicion_ Yc
%_inhibicion_ Sc
A_50 A_50 A_50
200 100 50
86,58 84,17 76,26
88,98 88,79 88,48
35 27,08 1,58
27,65 23,6 8,16
58,41 45,75 7,91
Fuente: Elaboracin propia, 2013 TABLA 21: ANOVA unidireccional: % inhibicin vs. MUESTRA 50%
Fuente MUESTRA_50 Error Total
GL 4 10 14
SC
MC
13341 3335 14,75 0,000 2261 15602 226
S = 15,04
R-cuad. = 85,51%
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Los resultados del anlisis estadstico de la varianza nos muestran que existen diferencias significativas entre las medias para la MUESTRA_50% con respecto a las inhibiciones entre los controles con relacin a las inhibiciones de cada muestra: Ac, Sc, Yc.
GRAFICO 7: Porcentaje de inhibicin muestra 50% VS controles positivos
Los resultados del grafico nos muestra que existen diferencias entre las cajas que hacen referencia a los controles con relacin a las muestras: (Ac, Sc, Yc) para la MUESTRA_50%.
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MARCO TEORICO 2013
TABLA 22: Resultados anlisis estadsticos MUESTRA _A (70%)
Concentracin
%_inhibicin acido_ascorbico
%_inhibicion _BHT
%_inhibicion _Ac
%_inhibicion _Yc
%_inhibicion _Sc
A_70 A_70 A_70
200 100 50
86,58 84,17 76,26
88,98 88,79 88,48
34,11 22,78 7,59
58,48 31,51 1,58
71,26 58,67 50,56
Fuente: Elaboracin propia, 2013 TABLA 23: ANOVA unidireccional: % inhibicin_2 vs. MUESTRA 70 %
Fuente MUESTRA_70% Error Total
GL 4 10 14
SC
MC
10863 2716 12,07 0,001 2250 13114 225
S = 15,00
R-cuad. = 82,84%
Los resultados del anlisis estadstico de la varianza nos muestran que existen diferencias significativas entre las medias para la MUESTRA_70% con respecto a las inhibiciones entre los controles con relacin a las inhibiciones de cada muestra: Ac, Sc, Yc.
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GRAFICO 8: Porcentaje de inhibicin muestra 70% VS controles positivos
Fuente: Elaboracin propia, 2013 Los resultados del grafico nos muestra que existen diferencias entre las cajas que hacen referencia a los controles con relacin a las muestras: (Ac, Sc, Yc) para la MUESTRA_70%.
Estas muestras no se compararon debido a que solo presentaban porcentaje de inhibicin en concentraciones altas, y los resultados no tenan relacin con los controles positivos. La misma situacin ocurri en el caso de los extractos acuosos.
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4.7.8 Determinacin del IC50 Se determino el IC 50 por interpolacin, considerando que el IC50, es la concentracin necesaria para disminuir la absorbancia del radical DPPH en un 50%. TABLA 24: IC 50 de muestras en estudio
Muestra IC50 ug/ml Yc 50 517,9475
Yc70
247,8809
Yc 96 Sc 50
>1000 132,6665
Sc70
112,5267
Sc96
612,6869
Ac 50 Ac70
>1000 456,6243
Ac96 Acuoso Ac
>1000 >1000
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Acuoso Yc Acuoso Sc Vit C >1000 >1000 47,6648
BHT
10,0068
Fuente: Elaboracin propia, 2013 El IC50 se relaciona con el porcentaje de inhibicin, considerando que mayor porcentaje de inhibicin menor IC50.
Respecto a las muestras en estudio se observa el menor IC50 es para la muestra Sc70 con 112,5267 ug/ml, seguido de la muestra Sc50 con 132,6665ug/ml. Comparando todas las muestras se tienen los menores IC50 para las muestras Sc en todos los extractos y los mayores IC50 par las muestras acuosas (Ac, Sc, Yc) 4.8 APLICACIN EN ALIMENTOS 4.8.1 Pruebas de conservacin para Carnes TABLA 25: Control de caractersticas organolpticas de carnes CARACTERISTICAS SC Das 1 COLOR OLOR ASPECTO 2 3 4 5 1 2 3 4 5 YC
R R R C C C
RO RO R R R LF LF SS C C C
RO RO LF F S
C C SS SS
C C SS SS
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MARCO TEORICO 2013
CARACTERISTICAS AC Das COLOR 1 2 3 4 5
BLANCO
R R RO RO RO R R OLOR ASPECTO C C LF C C SS F SS F S C LF
RO RO RO F F S F S
C SS S
R: rojizo
RO: Rojo Oscuro
C: Caracterstico
LF: Ligeramente ftido
F: Ftido
SS : Semiseco
S: Seco
Fuente: Elaboracin propia, 2013 Como se observa en la tabla 25, la carne con extracto Sc mantuvo sus caractersticas organolpticas por ms tiempo, mientras que la carne con extracto Ac mantuvo menos tiempo sus caractersticas organolpticas, sin embargo el blanco que no tena ningn extracto al segundo da de prueba ya se perciba mal olor y aspecto. 4.8.1.1 Prueba del tornasol Esta prueba no permite verificar si la carne se encuentra apta o no apta por su consumo, ya que la norma Boliviana indica que una carne en buenas condiciones se encuentra en un rango de pH de 6,1-6,4; un pH de 6,5indica consumo inmediato.
83
MARCO TEORICO 2013 GRAFICO 9 :Prueba del Tornasol

8 7 6 5 pH 4 3 2 1 0 DIA 1 DIA 2 DIA 3 DIA 4 DIA 5 AC SC YC BLANCO
Fuente: Elaboracin propia, 2013 Como se observa en la grafica la carne al momento de la toma de muestra tenia un pH de 6, al momento de aplicar el extracto este bajo hasta 5, a medida que pasaron los das el pH fue aumentando, siendo para el blanco el da 3 donde ya se mostraron signos de descomposicin mientras que para las carnes con extracto se observaron signos de descomposicin a partir del 4 da para la muestra Ac y el da 5 para la muestras Yc y Sc.
4.8.1.2 Ensayo de Eber Este ensayo se realizo a todas las muestras, cada 24 horas, con el objeto de determinar el da de inicio de la descomposicin. TABLA 26: Resultados Ensayo de Eber Das Muestra Ac 1 2 N N Muestra Sc N N Muestra Yc N N N + Blanco
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MARCO TEORICO 2013

3 4 5 + ++ +++ N + ++ N + ++ ++ +++ +++
N: Negativo
+:
Ligero
olor ++: Regular olor +++:Intenso olor nauseabundo nauseabundo
nauseabundo
Fuente: Elaboracin propia, 2013 Analizando todos los datos obtenidos de las pruebas de conservacin podemos decir que el extracto de cscara de Solanum spp, posee antioxidantes capaz de conservar la carne por unos das mas, que cuando no tiene conservantes. 4.8.1.3 Prueba de isonitrilo Este mtodo al igual que el ensayo de Eber nos permite determinar cualitativamente el inicio de la descomposicin.
TABLA 27: Resultados prueba isonitrilo Das Muestra Ac 1 2 N + Muestra Sc N N Muestra Yc N N N + Blanco
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MARCO TEORICO 2013

3 4 5 + ++ +++ N + ++ N + ++ ++ +++ +++
N: Negativo
+:
Ligero
olor ++: Regular olor +++:Intenso olor nauseabundo nauseabundo
nauseabundo
Como se observa en la tabla 27 la muestra Ac al segundo da ya presentaba un ligero olor nauseabundo, mientras que para la muestra Sc y Yc este se percibi a partir del cuarto da. 4.8.2 Pruebas de conservacin de Aceites Previo a las pruebas de conservacin se realizo la medicin del ndice de refraccin, esto para verificar si realmente se trata de un aceite de girasolsoya, en el caso de nuestro aceite; ste tiene un ndice de refraccin de 1.472 a 25C, encontrndose dentro del rango (1.467-1.477 para el aceite de girasol-soya) segn la norma Boliviana NB 685.
4.8.2.1 Caractersticas organolpticas del aceite girasol-soya TABLA 28: Caractersticas del aceite en estudio Caracterstica Aceite girasol-soya
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Color Olor Aspecto Sabor Amarillo Caracterstico Lmpido Caracterstico
Fuente: Elaboracin propia, 2013 4.8.2.1 ndice peroxidacin Este mtodo nos permite cuantificar el grado de oxidacin que tiene el aceite despus a de ser sometido a procesos trmicos. El ndice de perxido aumenta a medida que la muestra presenta mas perxidos producto de la oxidacin del aceite.
GRAFICO 10 :Resultados IP
35 30 meq/1000gr 25 20 15 10 5 0 BLANCO 4 HORA 3 HORA 2 HORA 1 HORA 3 3 2.5 2 MUESTA Yc 4 3 3 2.5 MUESTRA Sc 6 5 5 4 MUESTRA Ac 4 4 3 3 MUESTRA SIN AA 12 9 7 5
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Fuente: Elaboracin propia, 2013 Como se observa en el grafico 10, las muestras despus de ser sometidas a procesos trmicos (105C), estas todava presentan un IP dentro del rango permitido (hasta 10 meq/1000) segn la norma Boliviana, sin embargo la muestra libre de AA, a la segunda hora del proceso trmico ya se encontraba fuera del rango de referencia (NB34051).
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MARCO TEORICO 2013
V .DISCUSION
5 .DISCUSION En este trabajo se realiz la determinacin de la actividad antioxidante de Solanum spp. (Papa nativa) por el mtodo qumico DPPH, todas las muestras estudiadas presentaron actividad antioxidante, destacando la muestra Sc y en menor grado la muestra Ac y Yc. El extracto acuoso de la muestra Yc a una concentracin de 1000 ug/ml mostr un porcentaje de inhibicin de 87,02 %, cuyo valor indica que fue el de mayor actividad antioxidante entre las muestra en estudio, es as que un menor valor de porcentaje de inhibicin indica una menor actividad antioxidante, mientras que por el contrario un IC50 bajo indica una mayor actividad antioxidante y un mayor
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valor de IC50 es indicativo de menor actividad antioxidante, ya que el IC50 es la cantidad que se requiere para disminuir el 50% la absorbancia de la solucin DPPH. En relacin al porcentaje de la actividad antioxidante el extracto etanlico de la muestra Sc 70 % a una concentracin de 1000 ug/ml, presento una
actividad de 87,02% y un IC50 de 112,5267ug/ml. En investigaciones realizadas en Chile, el grupo de denominado CITOPOTATO ORG dedicado a investigar todo lo relacionado a las papas nativas, su origen, adaptacin y aplicacin indican que la mayor actividad antioxidante se presenta en los extractos de cascara de las papas nativas. Estos resultados indican que la muestra Sc presenta buena actividad antioxidante. Otro estudio realizado en Chile en la universidad de Austral de Chile, la facultad de Agronoma muestra que tubrculos con piel de genotipo nativo presentan una actividad antioxidante de 64,69 %, mientras que otros genotipos denominados 267, 1550, 1388 presentan 37,21%, 29,86%, 29,08% respectivamente. Respecto a muestro estudio realizado a la misma concentracin El mismo estudio refirindose a la pulpa de los genotipos anteriormente mencionados, muestra que la pulpa de los genotipos nativos presenta un porcentaje de inhibicin promedio de 12%, lo cual muestra la baja actividad antioxidante. Los extractos de la muestra Sc hidroalcohlico al 70GL a las concentraciones de 100 y 500 ug/ml presentaron una actividad antioxidante similar a la del control positivo BHT a las concentraciones de 25, 10 ug/ml y una actividad mayor a 5 ug/ml. Estos resultados demuestran que las papas nativas presentan buena actividad antioxidante. Realizando un anlisis estadstico para comparar todos los extractos a diferentes concentraciones, se encontr una diferencia significativa entre la actividad antioxidante de las muestras Sc, Ac y Yc.
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Comparando la tres muestras, se observo que las muestras hidroalcohlicas al 70GL presentaron una mayor actividad antioxidante, respecto a los otros extractos. Comparando nicamente los extractos al 70GL, la muestra Sc presenta una mayor actividad antioxidante que la muestra Yc y esta a su vez a su vez presenta una mayor actividad que la muestra Ac.
La presencia de flavonoides y antocianidinas tienen relacin con la actividad antioxidante, las antocianidinas son potentes antioxidantes y pueden tener efecto quimioprotector, sin embargo debemos tomar en cuenta que los polifenoles y, en particular, los flavonoides no son todos iguales influyendo as en la actividad antioxidante de los tubrculos en estudio. Cabe destacar que ambos grupos de metabolitos secundarios presentes en los tubrculos estudiados tienen actividad antioxidante debido a la capacidad que tienen de atrapar radicales libres.
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VI. CONCLUSION
6. CONCLUSIONES
Con los resultados obtenidos, de la actividad antioxidante y las pruebas bromatolgicas, se acepta la hiptesis de que las papas nativas presentan antioxidantes capaces de conservar aceites y otros alimentos. Se elaboro una curva de calibracin y se adecuo la tcnica del reactivo DPPH para las condiciones del laboratorio PROFAC (Programa de Frmacos, Alimentos y Cosmticos).
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De las 16 variedades recolectadas de la comunidad Challviri B del Municipio de Bolvar, se seleccionaron 3 variedades nativas, siendo estas Y,S. A. De las tres variedades seleccionadas por criterios de anlisis fitoqumico se decidi trabajar nicamente con las cascaras de los tubrculos
seleccionados. Las tres muestras seleccionadas Sc, Yc y Ac presentaron buena Actividad Antioxidante, siendo la muestra Sc la que presento una mayor actividad antioxidante, seguido de la muestra Yc y esta a su vez presento mayor actividad que la muestra Ac, en todas sus concentraciones. Respecto al solvente se extraccin se obtuvo mejores resultados con la muestra Sc, en extracto hidroalcohlico al 70GL, seguida de la muestra Yc y Ac al 70GL. Respecto a la extraccin acuosa presentaron mayor actividad antioxidante la muestra Ac , seguida de la muestra Yc y Sc respectivamente. Comparando con los controles positivos, las muestras Sc y Yc al 70GL hidroalcohlico presentaron similar actividad antioxidante al control positivo BHT y el acido ascrbico.
Aplicando a los aceites comestibles, despus de procesos trmicos, las muestra con extracto y la muestra sin extracto, presentaron un IP dentro del rango de referencia de acuerdo a la norma Boliviana NB34051. Aplicando al extracto a carne vacuno, esta aumento su tiempo de conservacin hasta en un 100%, esto de acuerdo a los resultados de las pruebas bromatolgicas, Ensayo de Eber, prueba de Isonitrilo.
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VII. RECOMENDACIONES
7. RECOMENDACIONES
Los tubrculos cultivados en la regin andina del Departamento de Cochabamba, Bolivia; presentaron buena actividad antioxidante, por lo que se recomienda el consumo de las mismas para que de este modo los agricultores no dejen de lado el cultivo de estas variedades nativas.
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Se recomienda continuar con el trabajo de investigacin tomando todos los ecos tipos posibles, recolectando muestras de otras regiones de la Regin andina del Departamento de Cochabamba Bolivia.
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Construyendo
el
futuro
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queremos",Rev.N3.Bolivia:MRAC. .2011.12-14p.
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http://www.nutricionyrecetas.com/recetas/infoalimenta/colorantesnaturales.h tm
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VIII.ANEXOS
ANEXO 1: MATERIALES Y REACTIVOS
Recoleccin, desinfeccin Guantes
lavado
y Preparacin de extractos
Tamizaje fitoquimico
Balanza
concenrado
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Bolsas de tela Baadores Papel sabana Cepillo Agua Hipoclorito sodio 80ppm de de electrnica Licuadora Agitador magntico Frascos ambarados Matraz Probeta Agua destilada Alcohol al 96% Balanza electrnica Rotaevaporador Bao mara Equipo de reflujo Gradillas Pipetas Vasos precipitado Baln destilacin Columnas filtrado Ampollas decantacin Reactivos: Mayer Dragandorf Cl3FE al 1% Rvo. 1% Lieberman burchard Kedde Bortrager Shinoda Acido sulfrico Gelatina al de de de de
concentracin
concentrado Acido clorhdrico
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Determinacin AA Espectrofotmetro Balanza analtica Matraz aforado Gradillas Tubos de ensayo Micropipetas Tips Propipetas Agua destilada Reactivo DPPH Metanol Acido clorhidrico pH-metro
Aplicacin aceites Centrifugadora Tubos de ensayo Gradilla Embudo Vasos precipitado Buretas Frascos ambarados Aceite soya Oxido de aluminio Tween 80 Almidn Cloroformo Tiosulfato de sodio girasolde
Aplicacin carnes Vasos precipitado Placas Petri Jeringas dosificadoras Tubos de ensayo Capsulas porcelana Manto calefactor Cloroformo Hidrxido sodio al 10% ter Acetato de etilo de de de
ANEXO 3: PREPARACIN DE REACTIVOS Preparacin de solucin de desinfeccin: A una concentracin de 80ppm.
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80 mg x 1l 5l
x = 400 mg de hipoclorito de sodio 8 % sol. Comercial 8000 mg 400 mg 100 ml 100 ml x
X = 5 ml de hipoclorito (solucin comercial) para 5 litros de agua Preparacin de extractos Formula : V1*C1=V2*C2
Despejando
V1 =V 2 x C2 C1
Reemplazando Obtencin de alcohol al 70% Vc = 500 ml x 70% 96% = 364,58ml
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364,58 ml de alcohol al 96% y enrasar hasta 500ml con agua destilada
Obtencin de alcohol al 70% Vc = 500 ml x 50% 96% 260,42ml de alcohol al 96% y enrasar hasta 500ml con agua destilada. Preparacin de extracto en una relacin 1/10 Si 1gr x 10ml 500ml = 260,42ml
Calculo = 1gr*500ml = 50gr demuestra para 500 ml. 10ml
2.1 Determinacin actividad antioxidante Pesar 3,94 mg de reactivo y enrasar a 100 ml con metanol. Solucin para la curva DPPH : Sol. Dpph alcohol []dpph mM
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2ml 4ml 6ml 8ml 8ml 6ml 4ml 2ml 0,02 0,04 0,06 0,08
ANEXO 4: SCREENING FITOQUIMICO 3.1Flavonoides Shinoda 1ml extracto+trozos de magnesio+gta HCL
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Positivo: coloracin roja Reaccin con H2SO4 1ml de extracto+5gotas de H2SO4 concentrado 3.2 Antocianidinas Precipitacin con metales pesados 1ml extracto+8gta de acido pcrico Positivo: precipitado 1ml extracto+4gotas de acetato de plomo al 1% Positivo: precipitado 3.3 Taninos Reactivo gelatina-cloruro de sodio Muestra +1gota de reactivo Positivo: precipitado Reactivo cloruro frrico Muestra + 1 gota de reactivo Positivo: coloracin azul, verde o negro
3.4 Alcaloides Reactivo Mayer Muestra +reactivo Positivo: Precipitado blanco o verde
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Reactivo Draguendorf Muestra +reactivo Positivo : Precipitado rojo o naranja 3.5 Esteroides Reactivo Lieberman Burchard Muestra + gotas AcH + 3ml ac2O acido sulfrico Positivo: coloracin verde, azul verdosa 3.6 Quinonas Reactivo Bortrager Muestra +NaOH 5 % Positivo : coloracin roja 3.7 Cardenolidos Reactivo Lieberman Burchard Muestra + AcH+3ml ac2O acido sulfrico (50:1) Positivo: coloracin verde
3.8 Estaroides triterpenos Reactivo Lieberman Burchard Muestra + AcH+3ml ac2O acido sulfrico (50:1) Positivo: coloracin verde
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ANEXO 5: DETERMINACIN DE Rf
Formula:
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Mancha 1 Rf= 5 mm/33mm= 0,1 Mancha 2 Rf= 8 mm/33mm= 0,2 Mancha 3 Rf= 12mm/33mm= 0,3
X.GLOSARIO DPPH: 1,1-Difenil-2-picril-hidrazilo Antioxidante: Un antioxidante es una molcula capaz de retardar o prevenir la oxidacin de otras molculas.
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Oxidacin : La oxidacin es una reaccin qumica de transferencia de electrones de una sustancia a un agente oxidante IC50: Cantidad de muestra necesaria para inhibir el 50% del radical DPPH BHT: Butil hidroxi tolueno AA: Actividad antioxidante IP: Indice de peroxido ERO: Especies reactivas de oxigeno NADPH : Nicotinamida-Adenina-Dinucletido-Fosfato
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Solanum stenotomum Katari papa

Solanum ajanhuiri Janq`o Ajahuiri Lunku Ajahuiri

Solanum goniocalyx Chaska Zapallo

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Fuente: IBTA-PROIMPA, 1994

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Fuente: Catalogo PROIMPA, N2, 1994

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Fuente: Catalogo PROIMPA N21994

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FIGURA 3: tubrculo Q'oyllu

Fuente: Catalogo PROIMPA N2, 1994

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63.2-86.9 13.1-36.8 0.7-4.6

75.05 23.7 2.0

0.02-0.20 0.0-5.0 13.3-30.53

0.12 0.3 21.9

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FIGURA 4: Ion flavilio

Fuente: Ocampo Rogelio, 2008

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FIGURA 5: Biosntesis de metabolitos secundarios

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Fuente: Villagmez Rodrguez, 2008

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Fuente: Olga de Loc,1994.

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Fuente: PDM municipio de Bolvar, 2011

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Fuente: Elaboracin propia, 2013

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Macerar 5g de muestra con 50 ml de metanol

Reflujar por 4 horas

El resto llevar a sequedad, extraer con 15ml de HCl al 1% a 50C

Lavar con agua,, secar, agregar 5ml de CHCl3

Flavonoides Shinoda, Taninos Cl3Fe , gelatina al 1%,