Transferencia de Embriones en El Ganado Bovino

Manual de Transferencia de Embriones en el Ganado B
Octubre de 2006
Gobierno del Estado de Chiapas

Lic. Pablo Salazar Mendiguchia Gobernador Constitucional del Estado Ing. Javier Antonio Ruiz Morales Secretario de Desarrollo Rural Dr. Fidelfo Rodriguez Fernandez Subsecretario de Ganaderia MVZ. Rafael Gonzalez Castellanos Director de Fomento Ganadero
MVZ. Oscar Moguel Delarbre Jefe de Departamento de Vinculaci6n

Ing. Napoleon Orantes Solorzano Coordinador General D.P.A.I.
Secretaria de Agricultura, Ganaderia, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentacion

MVZ. Jose Angel Del Valle Molina Delegado Estatal Ing. Israel de Jes6s G6mez Torres Subdelegado Agropecuario Ing. Carlos Antonio Toledo Culebro Jefe de Fomento Pecuario
Fundacidn Produce Chiapas A.C.

Sr. Hipolito Pedrero Alegria Presidente Ejecutivo Dr. Jorge Luis Zuarth Macias Secretario C.P. Araceli Ramirez Martinez Tesorera
Universidad Aut6noma de Chiapas

MC. Jorge Ordofiez Ruiz Rector Dr. Hugo GuillCn Trujillo Secretario General Dr. Carlos Eugenio Ruiz Hernandez Secretario Academico Dr. Jos6 Alfredo Medina Melendez Director General de Extension
MVZ. Adizain Alegria C6rdova Director de la FMVZ

MVZ. Alfredo Castellanos Coutifio Secretario Acaddmico MC. Roberto R. Coutifio Ruiz Director de la Facultad de Ciencias Agron6micas Dr. Ramiro Ruiz Najera Secretario Academico MVZ. EPA Oscar Leon Velasco Coordinador General de Vinculacibn y Extensibn Universitaria
Coordinadores y Responsables del Curso Cuerpo AcadCmico "BIOTECNOLOG~A Y MEJORAMIENTO GENETICO ANIMAL"
Dr. Horacio Lebn Velasco MC. Horacio Ruiz Hernandez MVZ. Alfonso Ruiz Moreno MVZ. Alfonso Villalobos Enciso
Colaboradores en la elaboraci6n del material didactic0

MVZ. Oscar Miguel Dominguez Galdimez Juan Luis Orantes Arrazate William Esponda Hernandez
I.. INTRODUCCION .................................................................................... 1

11.. ANTECEDENTES DE LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES ........... 3 2.1 . Fisiologia de la reproduccion ....................................................... 6 2.2.. Mecanismo de selection ......................................................... 13 2.3.. Agentes superovulatorios.................................................... 16 2.4.. Metodos de sincronizacion de estros ......................................... 17 2.5.- Tecnicas de Superovulacion .................................................... 21 2.6.- Deteccion de Estro .................................................................... 24 2.7.. Insemination de las vacas donadoras y superovuladas ............ 24
Ill.. MEDIOS PARA LA COLECCION DE EMBRIONES ..............................26 3.1. Congelacion ............................................................................... 27 28 3.1.1.-Molaridad.................................................................................. 3.1.2.- Funcion de 10s crioprotectores ................................................. 29 3.1.3.- Velocidad de enfriamiento ....................................................... 30 3.1.4.- Clasificacion de 10s crioprotectores ......................................... 31 3.1.5.- Funcion del glicerol .................................................................. 33 3.1.6.- Funcion del etilenglicol ............................................................ 33 3.1.7.- Congelacion de embriones con glicerol ................................... 34 3.1 .8.- Congelacion de embriones con etilenglicol .............................. 36 .... 38 3.1.9.- Descongelacion de embriones con glicerol ...................... . 3.1.10.- Descongelacion de embriones con etilenglicol ...................... 41 42 3.1 . 11.- Preparacion de medios .......................................................... IV.. COLECCION DE EMBRIONES.......................................................... 43 4.1 . Evaluacion Embrionaria .............................................................. 44 4.1 .1. Embriones transferibles ........................................................... 45 47 4.1.2.. Lavado de 10s embriones ............................................................ 4.1.3.- Transferencia de embriones ........................................................ 47 4.1.4.- Bipartition de embriones ............................................................. 49 4.1.5.- Micromanipulador .........................................................................49 4.1.6.- Division artificial de 10s embriones ............................................... 49 4.1.7.- Ventajas de la biparticion de embriones ...................................... 51 4.1 .8.- Mellizos ........................................................................................52 4.1.9.- Mecanismo de gemelacion .......................................................... 52 4.1.10.- Tasas de gemelacion en ganado lechero.................................. 53 4.1.11.- Freemartinismo .......................................................................... 54 V.. LITERATURA CITADA..............................................................................57
La reproduccion en 10s animales domesticos se ha incrementado su desarrollo gracias a la manipulacion de biotecnologias como la inseminacion artificial (IA) y la transferencia de embriones (TE). La eficiencia de estos procedimientos y de la posibilidad de mantener viables las celulas germinativas desde el momento de la coleccion hasta su aplicacion, desde el punto de vista cientifico cobra gran importancia. En este sentido, la congelacion de estas celulas ofrece una solucion practica para el almacenamiento prolongado de las mismas sin perder su viabilidad. La criobiologia tiene como objetivo el estudio de las causas de dafios celular durante la congelacion y descongelacion, asi como la implementacion de metodos disefiados para reducir o evitar ese dafio; de tal forma, que las celulas Sean capaces de continuar en forma normal su desarrollo completo despues de la descongelacion. La transferencia de embriones es una herramienta para el mejoramiento genetico del ganado y tiene como objetivo incrementar la tasa reproductiva de las hembras de alto valor genetico. La transferencia de embriones consiste en inducir un embrion en etapa de preimplantacion en el utero de la hembra denominada receptora, la cual se encargara de gestarlo y llevarlo al nacimiento. El embrion transferido puede ser fresco o congelado. Esta tecnica consiste en un tratamiento hormonal que se aplica a las hembras donadoras para inducir la maduracion y ovulation de un gran numero de ovulos (superovulacion). La congelacion de celulas embrionarias tiene por objeto interrumpir el metabolismo de forma reversible permitiendo de ese modo, su conservation durante un tiempo indefinido en estado solido, manteniendose la viabilidad del embrion despues de la descongelacion. La supervivencia depende esencialmente de las condiciones de cambio de fase del agua celular y de la eficacia de 10s crioprotectores. Con el uso de crioprotectores como el etilenglicol y el glicerol se podran definir nuevas estrategias, tanto en la congelacion de embriones como en el programa de transferencia de embriones en el ganado bovino.
OBJETIVOS.
1.- Actualizar y capacitar a 10s profesionales y estudiantes de la Medicina Veterinaria en Biotecnologia Reproductiva especificamente en transferencia de embriones en el ganado bovino como una herramienta para el mejoramiento genetic0 de la ganaderia.
2.-Promover la transferencia de tecnologia en materia de transferencia de embriones a 10s productores pecuarios y vincular la Universidad Autonoma de Chiapas con el subsector agropecuario del pais.
11.-ANTECEDENTES DE LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES
La historia de la transferencia de embriones se remonta a 1890 cuando el ingles Walter Heape, realizo con exito la primera transferencia embrionaria en conejos. A partir de entonces se han informado transferencias embrionarias exitosas en todo tip0 de animales de granja. La comercializacion de tecnologia para la transferencia embrionaria comenzo en America del Norte. Una hembra (donadora) puede aumentar su numero de crias durante su vida al concebir de manera repetida y mediante la recuperacion de embriones al inicio de la gestacion y la transferencia de estos a 10s aparatos reproductores de otras hembras (receptoras) para completar la gestacion. Este procedimiento depende por completo de la disponibilidad de una fuente de embriones de calidad adecuada y el medio uterino propicio de la receptora al momento de la transferencia embrionaria (sincronia) (Hafez, 2000). El principal objetivo del transplante de embriones es incrementar la tasa reproductiva de una hembra de excelentes caracteristicas, fecundada con un tor0 de alta genetica (Aspron, 1992). La transferencia embrionaria se ha aplicado muy extensamente en la vaca; en consecuencia, la tecnologia ha avanzado con mas rapidez en esta especie. En 10s arios 60, la anestesia general y la laparotomia eran necesarias para la coleccion y transferencia de embriones bovinos, y en el Reino Unido y America del Norte esta tecnica se utilizo sobre todo para la rapida multiplication razas exoticas de carne importadas (Palomino eta/., 1998). La utilization de embriones junto a la inseminacion artificial en 10s programas de mejora genetica es una practica que ha venido difundiendose en forma creciente en 10s ultimos 20 aiios. Sin embargo, esta tecnologia que tiene un enorme potencial de mejora genetica, no ha tenido la difusion masiva que debiera en funcion de tal potencialidad. Las limitantes han sido tanto 10s altos costos de la misma, como la enorme variabilidad en la respuesta de 10s animales destinados a producir tales embriones. Lo anterior parece marcar limites economicos y biologicos en la tecnologia que no han podido ser superados en 10s ultimos 20 atios y que limitan su desarrollo.
La transferencia de embriones es una tecnica de rnanipulacion genetica y dentro del campo de la reproduccion tiene como proposito servir como herramienta en el mejoramiento genetic0 del ganado e incrementar el potencial reproductivo de hembras sobresalientes en lineas especificas de la reproduccion.
Estro
11
Transferencia
ESQUEMA 1.- S E L E C C I ~ N DE DONADORAS Y RECEPTORAS PARA LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN EL GANADO BOVINO.
El utilizar embriones congelados permite aprovechar al maximo el potencial de una hembra; en virtud, que es posible congelar todos 10s embriones de excelente y buena calidad, ser transportados a cualquier pace del mundo en forma facil y economica. Por esto, la TE ha tenido un impact0 considerable sobre 10s programas de reproduccion en paises desarrollados desde 10s aAos 70's, esta influencia ha sido principalmente dentro del sector de razas puras con el objeto de aumentar el potencial reproductivo de hembras superiores y donde el alto valor comercial de sus crias ha justificado el gasto involucrado. Existen tres metodos de coleccion de embriones, dos quirurgicos y uno no quirurgico, el primer0 requiere de medicos, anestesistas y cirujanos, lo cual hace de esta tecnica algo impractico quedando en desuso. El segundo metodo consiste en una laparotomia por uno de 10s flancos usando anestesia regional y local. El tercer metodo es el no quirljrgico o transcervical, que actualmente es el mas usado. Con el desarrollo del metodo de coleccion de embriones no quirurgico, existe la posibilidad de la dispersion de esta tecnologia dentro de paises desarrollados. Una de las principales razones para el uso de la TE es el mejoramiento genetico y se puede superar algunas formas de infertilidad que puede surgir a consecuencia de fallas de fertilization debido a altas temperaturas. Este proceso puede ser usado para establecer bancos de embriones congelados y permitir la importancia de 10s mismos y por lo tanto la introduccion y transferencia del nuevo material genetico.
LAVADO DE VACAS DONADORAS PARA LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES (METODO NO QUIRURGICO 0 TRANSCERVICAL).
Ciclo estral del ganado bovino. El ciclo estral es una serie de eventos hormonales que ocurren desde un period0 de estro hasta la manifestacion del siguiente. El estro es comunmente referido con el dia cero en el ciclo estral de la vaca, momento en el cual la vaca es sexualmente receptiva al toro. El ciclo estral en el ganado bovino tiene una duracion aproximada de 21 dias, con un interval0 de 17 a 24 dias para que sea considerado como normal. En el caso de las vaquillas el ciclo estral dura menos que en las vacas. El ciclo estral puede ser dividido en dos fases: la primera, llamada fase folicular que se caracteriza por que durante este tiempo ocurren las fases finales de desarrollo folicular. Esta fase es relativamente corta y dura aproximadamente de 4 a 5 dias, iniciandose con la regresion del cuerpo luteo (CL) y culminando con la ovulacion. La segunda o fase Iutea, es caracterizada por el desarrollo del CLy tiene una duracion de 16 a 17 dias. Los cambios anatomicos y fisiologicos que sufren 10s organos reproductivos durante estas fases son regulados por hormonas entre las que se encuentran. a) GnRH. Hormona liberadora de gonadotropinas que es producida a nivel hipotalamico. b) LH y FSH. Hormona luteinizante y foliculo estimulante respectivamente sintetizadas a nivel hipofisiario. c) Inhibina, estrogenos y progesterona que son producidos por el ovario. d) PGF, . Prostaglandina F, alfa-sintetizadosen el endometrio. e) IGF-I. Factor de crecimiento parecido a la insulina numero 1 sintetizado en el higado. La duracion del estro en el ganado cebu es alrededor de 10 horas (h) per0 tiene un amplio rango de variacion que va de 2.2 a 18.4 h. Es conveniente mencionar que la duracion del ciclo estral puede verse alterada debido a ciertos factores como son; 10s cuerpos luteos de vida corta que son precedidos por foliculos deficientes en su desarrollo, asi como a las fallas que ocurren por muerte embrionaria temprana. Caracteristicas de la conducta estral Ademas de 10s tratamientos y tecnicas utilizados en la sincronizacion de estros, es importante considerar tambien que existen problemas para detectar con precision la
manifestacion de conducta estral, debido a la composicion, tamafio y orden social que se tenga en un grupo de hembras bovinas. Se ha observado que existe una relacion entre conducta estral y jerarquia en las hembras, cuando se encuentran en estro dentro de un grupo. Ademas del nljmero de estas que presentan estro al mismo tiempo. En efecto, una o varias hembras pueden presentar una conducta de dominancia sexual ante el grupo; es decir, presentar comportamiento activo, que consiste en conductas estrales hacia otras hembras. En un hato con vacas Indubrasil, se observo que el 60% de montas fueron realizadas por hembras que presentaban mayor jerarquia; sin embargo, aunque en menor proporcion, las hembras dominantes pueden ser montadas por hembras consideradas como inferiores dentro del orden social. De acuerdo a investigaciones realizadas, se ha observado que la vaca que monta, generalmente domina a la que es montada, encontrando que se pueden presentar 5.3 montas por una hora en vacas que se encuentran en pastoreo; en contraste, con 8.7 montas en promedio que presentaron hembras que se encontraban en condiciones de estabulacion. Esto puede ser un efecto de que al tener una alteracion de las condiciones ambientales en hembras que se encuentran en pastoreo, estas pueden suprimir la manifestacionde conducta estral. Asimismo, se ha observado que las hembras con una mayor dominancia dentro del grupo, inhiben el comportamiento sexual de sus compaAeras, dando como resultado que las primeras presenten mayor indice de comportamiento estral y social; ademas de interactuar con sus compafieras que son racialmente semejantes. Las variaciones que se pueden presentar en el comportamiento social y jerarquico, dependen de la hora en que se aplique el tratamiento para sincronizar, la hora en que se manifieste la mayor actividad sexual y de la observacion de estro. Ademas, existen efectos que controlan la forrnacion de grupos homosexuales, en donde una hembra podria dejarse montar por una de sus compafieras y no por la presencia de un macho. Otra variacion que se puede presentar en ganado Cebll cuando se encuentra en etapa estral, es un comportamiento de agresividad en algunas vacas, manifestando con topeteo, el cual puede ser de tipo no agresivo con la presentacion de caracteristicas como
bramido, lamer los genitales, roce corporal u oler otras regiones corporales de su compaAera que en ese momento tambien presenta estro. Ademas, las hembras tienden a presentar signos como inflamacion de vulva, hiperemia del vestibulo vaginal, eliminacion de moco filamentoso y arborizacion del moco cervical. Por otra parte, algunos investigadores tambien describen un efecto de bioestimulacion, dada por feromonas que se encuentran en el moco cervico-vaginal de las hembras que se encuentran en estro y que pueden estimular a otras hembras anestricas. Esto se corrobora con un posterior estudio realizado por Wright et a/. (1992) quienes demuestran que al manifestarse estro un grupo de hembras sincronizadas, estas pueden estimular la actividad ovarica de hembras no tratadas, acortando la duracion de anestro posparto.
Efecto ambiental en la conducta de estro. Se ha observado que se presenta un alto indice de estros en hembras lndubrasil durante el transcurso de horas oscuridad, que en las primeras horas de luz. Sin embargo, la presencia de comportamiento estral en Bos taurus, es mas frecuente durante las horas de oscuridad y las primeras horas de luz, entre 1.30 y 7:00 horas.
Por otra parte, las condiciones climatologicas elevadas al tropico, se pueden presentar en el ciclo estral con mayor regularidad en primavera que en otras estaciones del aAo, observando que la determinacion de estros, solo puede presentarse alrededor del 30%. Esto se confirma con lo observado por Lozano et a/. (1987) quienes indican un porcentaje similar en la deteccion de estros en 10s meses en que se incrementa el fotoperiodo. Particularmente en el ganado de tip0 Bos indicus y Bos taurus, se ha observado una actividad reproductiva continua durante todo el aAo; aunque 10s cambios fisiologicos parecen alterarse, al efecto climatic0 de la estacion y fotoperiodo del aAo. En cambio, Rice (1988) menciona que vaquillas de la raza 60s indicus, son mas afectadas por el clima que el ganado de tip0 Bos taurus. Ciclos estrales cortos
Al reanudar la actividad ciclica despues del parto, 10s animales presentan uno o dos ciclos cortos, 10s cuales contribuyen a problemas de infertilidad durante 30 a 40 dias despues del parto. Cuando 10s ciclos estrales cortos ocurren, el cuerpo luteo regresa erroneamente antes de que se pueda enviar la seiial de que la gestacion ha comenzado. Esta regresion prematura del cuerpo luteo, aparentemente se debe a que durante este tiempo se presentan niveles altos de prostaglandinas F, alfa (PGF, ) producidos por el ljtero como parte de 10s mecanismos normales de la involuciisn uterina, por lo que la presencia de ciclos cortos y la involution uterina se encuentran intimamente ligados.
Desarrollo folicular durante el ciclo estral.
Dentro de un ovario, 10s foliculos se encuentran en diferentes estadios de desarrollo y han sido clasificados acorde al nllmero de capas de celulas que rodean al oocito, asi como por la presencia del antro. La clasificacion mas comljn divide a 10s foliculos en:
a) Foliculo primordial. Estos foliculos se encuentran en gran numero en el ovario antes del nacimiento. En estos foliculos el oocito se encuentra rodeado por u n a
b)
c)
d)
e)
capa de celulas foliculares aplanadas, llamadas tambien celulas de epitelio folicular escamoso. El diametro de 10s oocitos en la vaca varia entre 79 y 120 micrometros. Foliculo primario. El oocito se encuentra rodeado por una simple capa de celula cuboidales o poliedricas. Este foliculo, tiene un diametro aproximado de 150 micras. Foliculo secundario. El oocito esta rodeado por varias capas de celulas poliedricas o cuboidales, momento en el cual, las celulas de la granulosa desarrollan receptores para FSH y estrogenos. Foliculo terciario. El oocito esta rodeado por varias capas de celulas granulosas y el antro folicular esta formado. En vacas, la formacion antral inicia cuando el foliculo tiene un diametro aproximado de 0.5 mm. Foliculo de Graff. Este tip0 de foliculo se forma como resultado de la acumulacion de fluido folicular y hace que se extienda el antro, el oocito se ubica en la periferia del foliculo y se rodea por una acumulacion de celulas de la granulosa. El foliculo preovulatorio corresponde a esta clasificacion folicular. Debido a su talla, el foliculo grafiano maduro, emerge desde el ovario a la superficie en forma de ampula.
Etapas del ciclo estral Estro. En esta etapa la hembra acepta la monta del macho o de una compariera de hato. Esta
conducta es determinada por un increment0 significativo de las concentraciones de estradiol, que es consecuencia del desarrollo de un foliculo y por la ausencia de un cuerpo Iuteo. En este momento las concentraciones de progesterona se encuentran en niveles basales ya que tuvo que haber ocurrido la regresion del cuerpo Iuteo. Durante el estro la hembra esta inquieta e interactua con sus comparieras (conducta homosexual). Por efecto de 10s estrogenos 10s genitales externos se edematizan y hay produccion de moco cervical. La duracion del estro es variable fluctuando de 8 a 18 h y es afectada por el tip0 de ganado y por las condiciones ambientales. El ganado tipo Bos taurus la conducta estral es muy repetible; sin embargo, factores ambientales tales como instalaciones con pisos de cement0 provocan que el estro se acorte y sea menos intenso. En contraste el piso de tierra permite una mayor actividad estral. En el ganado tip0 Bos indicus es mas variable la conducta y la duracion del estro.
SIGNOS Y CONDUCTA ESTRAL EN EL GANADO BOVINO

Metaestro
10
Durante del metaestro ocurre la ovulation y se desarrolla el cuerpo luteo pasando por el estadio intermedio conocido como cuerpo hemorragico, el cual es un estado de transicion entre el foliculo recien ovulado y el cuerpo Iuteo. En esta etapa las concentraciones de progesterona comienzan a incrementarse hasta que alcanzan concentraciones mayores de 1 nglml, momento a partir del cual se considera que termina el metaestro y comienza el diestro. La duracion del metaestro es de 4 - 5 dias. Un evento hormonal que se destaca en este period0 consiste en la presentacion del segundo pic0 de secrecion de FSH que
mantiene una relacion directa con el inicio de la primera onda de desarrollo folicular Algunas vacas presentan un sangrado conocido como sangrado metaestral.
PROCESO DE O V U L A C I ~ N (METAESTRO).
Diestro
El diestro es la etapa de mayor duracion del ciclo estral, en promedio de 12 -14 dias. Durante esta etapa el cuerpo lljteo mantiene su plena funcionalidad, 10s niveles de progesterona se mantienen arriba de 1 nglml. Concomitantemente a la funcion lljtea se observa una dinamica folicular intensa, ya que durante esta etapa se presentan ondas de desarrollo folicular con sus caracteristicas fases (reclutamiento, selection y dominancia); por este motivo durante el diestro se observan foliculos de diferente tamafio. Despues de 12 - 14 dias de exposicion a progesterona el endometrio comienza a secretar PGF, alfa en un patrori luteolitico, el cual termina con la vida del cuerpo luteo y con la etapa de diestro. En terminos endocrinos cuando el cuerpo luteo pierde su funcionabilidad, es decir, cuando las concentraciones de progesterona disminuyen por debajo de 1 nglml termina el diestro y comienza el proestro. Cabe mencionar que durante esta etapa la LH se secreta con una frecuencia muy baja, y la FSH tiene incrementos que coinciden con el inicio de las ondas de desarrollo folicular.
:.,;e". ,
DIFERENTES ESTRUCTURAS OVARICAS (CUERPO HEMORRAGICO Y CUERPO LUTEO)
El
Proestro:
Etapa cuya duracion es de 3 a 4 dias, llamada tambien fase de crecimiento folicular, etapa en la que un nuevo foliculo empieza a madurar y con ello inicia el crecimiento de produccion de hormonas FSH y LH, que al actuar nuevamente a nivel del ovario ocasiona el desarrollo de un nuevo foliculo, este a su vez produce 10s estrogenos para desencadenar un nuevo estro.
ESTRO
METAESTRO
DIESTRO
PROESTRO
ESTRO
Foliculo ovulatorio
0 , 6 & QQ
ovulaclon Cuwpo hernorragico
Cuerpo luteo y foliculos
8B
@ @
Foliculo y cuerpo luteo en
Foliculo
4
FSH 1.H
Progcstcrona Estradiul
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 DlAS DEL ClCLO
18
19
20
PCF2 alfa Olcada folicular
Foliculos subordinadus
Foliculos atr6sicos
a)Foliculo don~inante
ESQUEMA 2.- CAMBlOS OVARICOS Y HORMONALES DURANTE EL ClCLO ESTRAL DE LA VACA
2.2.- SELECCION DONADORAS Es el principal paso a dar para el inicio del programa de transferencia de embriones y para esto se utilizan dos criterios intimamente ligados. El primero, el cual desea el productor es la eficiencia productiva del animal seglln su finalidad zootecnica y ligado a su capacidad genetica; per0 el mas importante es el criterio elegido por el tecnico el cual consiste en que el animal donante provenga de lineas fertiles, tenga un aparato reproductor y ciclo estral normal, sin antecedentes de partos distocicos y retenciones placentarias, no mas de dos servicios por concepcion y tener una edad de 3 a 10 atios (Elsden, 1980). En el aspect0 sanitario deberan de estar libres de enfermedades, especialmente aquellas que afectan la funcion reproductiva; segun la region deberan estar sometidas a un estricto programa de vacunacion y desparasitacion para garantizar un buen estado de salud. En el caso de las receptoras, practicamente seguimos 10s mismos puntos que en las donadoras, per0 se pueden emplear animales de cualquier raza o cruza (el cruzamiento aumenta la fertilidad), sin importar su procedencia, per0 teniendo en cuenta que se traten de animales jovenes, sanos con buen desarrollo corporal, especialmente la pelvis (ya que muchas veces tendran que parir becerros muy pesados), en perfecto estado nutricional, dociles y faciles de manejar y con una produccion de leche suficiente para criar hasta el destete su becerro (Aspron, 1992). La donadora puede ser una vaca o vaquilla, si se escoge una vaca esta debe de tener por lo menos 3 a 4 meses posparto. Si la futura donadora no se encuentra ciclando, se le puede inducir al estro con un implante de Norgestomet por 7 -10 dias y aplicandole400 U.I. de gonadotropina serica de la yegua pretiada (eCG) al momento del retiro del implante. El primer ciclo de este tratamiento generalmente es de corta duracion, per0 el siguiente ciclo es de duracion normal. Una buena decision es que la vaca tenga por lo menos dos ciclos normales antes de comenzar el programa de superovulacion. En el caso de que se desee superovular una vaquilla, es necesario que esta tenga un peso vivo por lo menos de 350 kg, y que ya este ciclando normalmente. No es recomendable utilizar implantes de norgestomet en vaquillas de por lo menos de 350 kg. que aun no hayan empezado a ciclar, ya que cabe la posibilidad de que entre en anestro prolongado (Canseco, 1999).
C;,
SELECCI~N DE DONADORAS
Seleccion y manejo de Receptoras

Las hembras receptoras deben de cumplir con determinadas caracteristicas sanitarias, nutricionales y reproductivas. Para la selection de esta se requiere de un balance entre las caracteristicas raciales y de factibilidad economica. La raza parece no tener una consideracibn significativa aunque 10s animales cruzados son mas fertiles (Elsden et a/., 1986). La receptora debe ser una vaca con uno a tres partos o vaquillas bien desarrolladas de la raza y tip0 que se disponga, fertilidad probada capacidad materna, preferentemente de buena talla y con una historia de partos normales, de facil manejo, con condiciones de desarrollo corporal aceptables, deben de estar ciclando y por lo menos de 80 dias despues del parto (Reagan, 1993), control de sanidad y programas de concentraciones de receptoras de diversas explotaciones; es necesario establecer una cuarentena o en programas en particular en una explotacion es necesario examinar cada animal para algunas enfermedades como la Tuberculosis, Brucelosis, Anaplasmosis, Lengua Azul, y vacunar 10s animales nuevos contra Rinotraqueitis lnfecciosa Bovina, Diarrea Viral bovina, Leptospirosis y Clostridiasis. Ademas de controles de parasitos internos y externos (Elsden eta/., 1986).
En el aspect0 nutricional las receptoras deberan estar sometidas a un regimen alimenticio que permita el increment0 gradual de 500 a 900 g al dia y sales minerales a libre acceso ( Elsden eta/., 1986; Reagan, 1993). Las vacas receptoras preseleccionadas se determina su estado de salud y reproductiva, deben para lo cual es necesario una identificacion visible y permanente en el animal (arete, fierro marcador o tatuaje). Para posteriormente levantar controles por medio de tarjetas individuates de sus eventos reproductivos (Reagan, 1993). La palpacion rectal de las hembras se realiza para determinar su estado reproductivo, preferentemente anormalidades del cervix, cuernos uterinos, ovarios y diagnosticos de gestaciones tempranas y tomar decisiones del metodo para implementar el programa. En resumen Elsden y Seidel(1986), Reagan (1993) citan que una receptora debe cumplir con 10s siguientes criterios. Buena condicion corporal. Vacas jovenes de 1 a 3 partos 6 vaquillas bien desarrolladas. Cruzas de Bos indicus y Bos taurus (FI), esta ultima de preferencia de razas lecheras. Fertilidad probada y el cervix debe ser pasable facilmente. Habilidad materna y que tengan un diagnostico previo de no preAez. Suficiente aporte de nutrientes, minerales y vitaminas liposolubles principalmente ADE. Deben ser identificadas con arete, fierro quemador o tatuaje. Programa de vacunacion y de desparasitacion con fundamento a 10s resultados del laboratorio de diagnostico. Libre de enfermedades infectocontagiosas Brucelosis, Tuberculosis, Leptospirosis, Tricomoniasis, Campilobacteriosis, Rinotraqueitis lnfecciosa Bovina
(IBR) y DiarreaViral Bovina (DVB).

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SELECCI~N DE RECEPTORAS
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E 5
2.3.-Agentes superovulatorios
La superovulacion es la induction de ovulaciones multiples mediante la disminucion de la atresia folicular con el uso de hormonas. Existen varios productos comerciales que se pueden usar en 10s programas de superovulacion, la mayoria estan basados en la de estimulacion folicular (Mombiela, 2000). En 10s bovinos la superovulacion puede ser provocada por diferentes preparados de actividad gonadotropica siendo 10s principales: la gonadotropina corionica equina (eCG) y la hormona foliculo estimulante de origen porcino (FSH-P) (Caral eta/.,1986). Segun Elsden (1980) el tratamiento mas utilizado en la actualidad es el de la aplicacion decreciente de FSH-P durante cuatro dias a una dosis de 280 mg. a 400 mg tomando como primer dia, el decimo a partir de la aparicion de estro y aplicando prostaglandinas sinteticas (PGF, alfa) el tercer dia de superovulacion (Cuadro 1).
CUADRO 1.- SlSTEMA DE SUPEROVULACI~N CON FSH EN DOSlS DE CRECIENTE Dia am Actividades Pm ESTRO FSH FSH FSH + PGF2x FSH ESTRO FSH FSH FSH + PGIS:! FSH ESTRO
0 = ESTRO
10 11 12
13
14 14
I.A
I.A
La hormona FSH-P induce una respuesta superovulatoria mas uniforme y preferible que la lograda con la eCG(Elsden, 1978).
2.4.- Metodos de sincronizacion de estros
Como se menciono las inyecciones exogenas de FSH (eCG o FSH) tiene uso difundido en 10s programas de superovulacion multiple y transferencia embrionaria para incrementar la disponibilidad de embriones provenientes de animales de merito genetic0 superior. Las inyecciones subcutaneas o intramusculares de eCG o FSH por lo general estimula el crecimiento adicional de foliculos 10s cuales ovularan de manera espontanea sin necesidad de LH o hCG exogena en el ganado bovino. En virtud de que la FSH tiene una vida media mas corta (2 a 2.5 horas) que la eCG (24-72 horas). Por lo general es necesario dividir la dosis total, inyectar a intervalos de 12 horas durante tres a cuatro dias para estimular la misma cantidad de crecimiento folicular que resultaria de una sola inyeccion de eCG. Pese a la superioridad de la FSH, la eCG continlja utilizandose sola o combinada con antisueros, 10s cuales se unen y bloquean a cualquier exceso de eCG en la circulacion despues del inicio del estro. Sin embargo, el suero anti-eCG no tuvo ningun efecto importante en las cantidades de cuerpos luteos ode embriones (Hafez, 2000). Durante 10s ljltimos 10 aAos la Prostaglandina F, alfa y su analogo el Cloprostenol han contribuido de manera importante a la superovulacion, ya que la PGF, alfa no solo aumenta la flexibilidad para programar la superovulacion sino tambien representa un tratamiento excelente para la produccion de gran nljmero de embriones normales. El tratamiento superovulatorio puede iniciarse en cualquier momento entre el dia 6 del ciclo estral y la regresion natural del cuerpo lirteo; sin embargo, el mejor momento para el tratamiento en el ganado bovino es entre 10s dias 8 y 12 del ciclo estral (Hafez y Hafez, 2004).
Prostaglandinas
Las prostaglandinas derivan de 10s acidos grasos esenciales por oxidacion catalizada por enzimas, son agentes paracrinos de vida corta cuyas acciones estan mediadas por receptores especificos de la membrana plasmatica. Estas hormonas median la secrecion de GnRH, ovulacion, regresion del cuerpo Iuteo, maduracion del cuello uterino y el parto. Las prostaglandinas derivan del acido araquidonico, presentan 20 atomos de carbon0 y un anillo ciclopentano, las que se encuentran mas relacionadas con la reproduccion es la PGF2a y prostaglandina E,. Son transportadas en la sangre para actuar en un tejido blanco lejos del lugar de su produccion, ademas es el agente luteolitico natural que finaliza
la fase lutea del ciclo estral y permite el inicio de un nuevo ciclo estral en ausencia de fertilization.
PROSTAGLANDINA NATURAL (DINOPROST TROMETAMINA)
El proceso de luteolisis inicia con 10s estrogenos, estos preparan receptores para oxitocina en la mucosa del endometrio, evento que se da en la etapa del del diestro del ciclo, el cuerpo luteo (CL) en el dia 16 y 17 comienza a liberar oxitocina, esta se dirige a la membrana celular localiza su receptor y se lleva a cab0 el proceso de reacciones enzimaticas como la fosfolipasa A , para la sintesis de PGF,a e inician 10s pulsos que van de 6 a 8, 10s cuales llegan por via local o general y destruyen (lisis) al CL disminuyendo la concentracion de progesterona hasta hacerlo desaparecer.
Existen prostaglandinas naturales y sintetica, las naturales son aquellas que tienen su estructura quimica y biologica parecidas a las que se producen en un ser vivo, ejemplo de esto se tiene (Lutalyse, Lab. Pfizer) las sinteticas su estructura quimica y biologica son modificadas a las que se produce en el organism0 animal Luprostiol (Prosolvin, Lab, Intervet). Esta hormona solo funciona cuando existe un cuerpo luteo funcional. Es importante realizar un diagnostic0 por palpacion o ultrasonografia para detectar la estructura y poder aplicar la PGF,a.
LUPROSTIOL (ANALOGO SINTETlCO DE LA PROSTAGLANDINA F,ALFA)
Progesterona natural y progestagenos
Ireland y Roche (1982), citado por Montiel (1996) indican que la progesterona y 10s progestagenos sinteticos suprimen el estro y la ovulacion, actuando a traves de un mecanismo de retroalimentacion negativa sobre la liberacion de la hormona luteinizante (LH), por lo mismo probablemente se reduce la frecuencia de 10s pulsos de esta hormona y se impide que algljn foliculo ovarico complete su desarrollo y ovule. Al retirar la hormona 10s foliculos de todas aquellas vacas tratadas completaran su desarrollo al mismo tiempo lo que provoca el estro sincronizado. lnicialmente la progesterona se aplicaba en inyecciones diarias haciendo poco practico el sistema. Mas tarde, Christian y Casida (1980) demostraron que las inyecciones de progesterona prolongaban la etapa del diestro por tanto tiempo como fueran aplicadas, al termino las hembras entraban en estro y ovulaban en forma sincronizada. Posteriormente se descubre 10s progestagenos via oral administrados en el alimento, el inconveniente es que no existe control precis0 del consumo de las dosis diaria para cada animal, lo que ocasiona respuestas variables en la sincronizacion.
Aplicacion via oral
El uso de progestagenos en el alimento como acetato de flurogestona (FGA): 30 6 45 mg por dosis total, acetato de melengestrol (MGA): 11 a 60 mgldia, simplifica la administracion de la hormona, pudiendo controlar el final del tratamiento mediante el retiro del progestageno de la mezcla del alimento. La duracion puede ser de 7 a 14 dias de aplicacion. La desventaja seria que no todos 10s animales comen la misma cantidad de alimento y como consecuencia de la hormona.
Dispositivos intravaginales
En el mercado se encuentran dos productos: uno de ellos es el dispositivo en forma de espiral de acero inoxidable de liberacion controlada (PRID) con el 9% de progesterona del laboratorio Sanofi Animal Helt y el dispositivo liberador de droga interna (CIDR) con 1.9 g de progesteronadel laboratorio Pfizer., ambos se aplican por periodos de 9 a 10 dias.
PROGESTERONA NATURAL - CIDR. LAB-PFIZER
El porcentaje de vacas que entran en estro despues del tratamiento con el CIDR, depende de la etapa del ciclo estral en que se encuentre. Asi, el porcentaje que entra en estro es mayor si el animal se encuentra en el diestro tardio y mas bajo en el diestro temprano ya que en el retiro del CIDR algunas vacas todavia presentan un cuerpo lljteo funcional. lmplantes auriculares Se coloca debajo de la piel de la oreja, entre cartilago y piel en forma subcutanea durante 9 dias. El principio activo es el Norgestomet de 3 mg por dosis total, mas valerato de estradiol: 5 mg intramuscular (Crestar, Lab. Intervet), este llltimo se modifica, en algunos casos se aplica en otros no. El norgestomet ejerce un efecto sobre el aparato reproductivo y el hipotalamo, suprime la conducta estral y la ovulacion, Al retiro del implante se presenta la conducta estral y la ovulacion. Los animales presentan estro dentro de las 100 horas posteriores al retiro del implante.
NORGESTOMET MAS VALERATO DE ESTRADIOL
El mecanismo de accion del progestageno junto con el estradiol es el de suprimir el estro por medio del implante de norgestomet y la inyeccion con valerato de estradiol. El valerato de estradiol causa atresia del foliculo antral, regresion del cuerpo lute0 y provoca el reclutamiento de un nuevo grupo de foliculos de 4-5 dias de la aplicacion del tratamiento, el norgestomet por si solo no afecta la forrnacion y funcion del cuerpo Iuteo natural ni la gestacion.
2.5.- Tecnicas de Superovulacion
La respuesta superovulatoria depende de muchos factores, como son: raza, condicion corporal, epoca del aAo, produccion lactea, edad, numero de parto, hormona, dosis, regimen de colecta, dia del ciclo, superovulaciones previas y factor de individualidad del animal. Algunos factores pueden ser controlados, aunque parcialmente, en tanto otros no, lo que dificulta asignar una dosis adecuada a cada animal y predecir la respuesta.
GANADO CON BUENA CONDIC16N CORPORAL PARA LA SUPEROVULACI~N.
La superovulacion consiste en inducir el crecimiento extra de foliculos ovaricos mediante la aplicacion de gonadotropinas. La aplicacion de este tipo de hormonas permite rescatar de la atresia a un numero determinado de foliculos ovaricos de manera que estos puedan seguir su crecimiento y llegar a la ovulacion. Las gonadotropinas mas utilizadas son la hormona foliculo estimulante (FSH) y la
gonadotropina corionica equina (eCG). Tambien se han utilizado en forma experimental extractos hipofisiarios de equino (HAP).
GONADOTROPINA CORldNlCA EQUINA (eCG) CON ACTIVIDAD DE LA HORMONA FOL~CULO ESTIMULANTE (FSH).
La FSH esta compuesta por glucoproteinas, dos subunidades diferentes que contienen carbohidratos y que se hallan asociadas por uniones no covalentes, estas subunidades se denominan a y p, esta ultima le confiere la actividad biologica a esta hormona. La expresion de las gonadotropinas es modulada por factores hipotalamicos como la hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH), por factores intrahipofisiarios . . _ __ __ - - --*---a: ---prlnclpalrnenre 10s peprlaos acrlvlna y rollsrarlna y por rerroallrnenraclon gonaaal ranro ae hormonas esteroides como de peptidos. Los receptores de las gonadotropinas son
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suDunlaaaes ae las gonaaorroplnas proceae ae la rraauccron ae las suDunlaaaes ae 10s RNArn, de modificaciones postraduccionales de las subunidades precursoras y del plegamiento y la combinacion de las subunidades, del empaquetamiento de la hormona madura y la secrecion de la hormona (Yen et a/., 2001). La hormona tiene un peso molecular de 33,000 daltons, actua en las celulas de la granulosa, celulas de Sertoli e hipotalamo, su funcion es el crecimiento folicular, mitosis de las celulas de la granulosa e interviene en la maduracion del foliculo y del ovocito. La FSH ha sido uno de las mas hormonas ensayadas para superovular y con las que se tienen mejores resultados. En general, se trata de extractos hipofisiarios proveniente de ovino y porcino parcialmente purificados, tiene una actividad biologica corta en el torrente circulatorio, no mayor de 3 horas, por lo que para que ejerza su efecto se tiene que aplicar cada 12 horas durante4 6 5 dias. El Folltropin-V (Lab. Vetrepharm-Canada) es un product0 comercial que tiene una purificacion en proporcion de LHlFSH de 1:5, con dosis de 280 a 400 mg dependiendo la talla del animal ha demostrado proporcionar buenos resultados. La FSH producida por ingenieria genetica esta exenta de contaminacion con LH y no varia dependiendo del lote. La dosis total de FSH se divide en 8 fracciones en forma decreciente.
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ESQUEMA 3. DIAGRAMA DE LA S I N C R O N I Z A C ~ ~SUPEROVULACI~N N, Y COLECCldN DE EMBRIONES EN LAS VAQUILLAS DONADORAS.
La eCG antes conocida como PMSG (Gonadotropina serica de la yegua preriada), tambien es una de las hormonas mas investigadas para superovular, esta hormona tiene una actividad biologica larga (48 a 72 horas), por su contenido de acido sialico es metabolizado lentamente y por lo mismo se aplica una sola vez. Su dosis varia de 1,500 a 3,000 U.I. y se aplica via intramuscular durante cualquiera de 10s dias del noveno y doceavo del ciclo estral. Esta hormona tiene la desventaja de que despues de haber causado la superovulacion sigue promoviendo el desarrollo de foliculos ovaricos, lo que causa una elevation exagerada de estrogenos que afecta la coleccion y calidad de 10s embriones.
2.6.- Deteccion de estro
En un programa de transferencia de embriones, la deteccion de estros es uno de 10s aspectos mas importantes. Al empezar el programa podria ser suficiente observar calores de 3 6 4 veces a1 dia; sin embargo, al finalizar la superovulacion se debe realizar las 24 horas del dia, tanto para inseminar a tiempo a las donadoras como para poder seleccionar las receptoras que entraron en estro en forma mas sincronizadas con las donadoras.
MANIFESTACION DE ESTRO EN EL GANADO BOVINO.
2.7.- Inserninacion de las vacas donadoras y superovuladas
La recomendacion mas comun es inseminar las hembras donadoras 12 horas despues del inicio del estro y reinseminar 12 horas mas tarde. Esto se debe a que el animal
superovulado las primeras ovulaciones ocurren mas temprano que en las hembras no superovuladas y se requieren de la presencia de semen viable durante el period0 en el que ovulan el resto de 10s foliculos ovaricos. El lapso entre la primera y la ljltima ovulation generalmente es de 12 horas. En algunos protocolos se han usado 2 dosis de semen, en la primera o segunda inseminacion artificial con el objeto de tratar de aumentar la fertilization de 10s ovocitos, aunque frecuentemente el precio de las dosis del semen es limitante. Rivera, ( I 987) indica tres inseminaciones con dosis dobles a interval0 de 12 horas despues de iniciado el estro. Coelho y Acevedo, (1991) mencionan utilizar en vacas superovuladas dos inseminaciones 12 y 24 horas despues de iniciando el estro
INSEMINACI~N ARTIFICIAL EN EL GANADO BOVINO
Ill.-MEDlOS PARA LA COLECCION DE EMBRIONES
La manipulacion de 10s embriones fuera del ambiente uterino significa un gran riesgo, para evitar esto, se busca eliminar 10s cambios bruscos en la constitucion de las sustancias que entran en contact0 con 10s embriones, pretendiendo igualar a las sustancias y secreciones existentes en el ambiente uterino. Las caracteristicas mas importantes en las soluciones utilizadas para este fin son: osmolaridad, pH, esterilidad y toxicidad. La osmolaridad es la medida de la concentracion total de sales y compuestos de peso molecular bajo en la solucion. Debe estar entre 270 a 310 miliosmoles por kilogramo, desviaciones a mayor o menor concentracion pueden causar dafios irreversibles al embrion. El pH debera mantenerse entre 7.2 y 7.6, aunque 10s embriones bovinos toleran desviaciones sustanciales del rango optimo durante cortos periodos de tiempo. La esterilidad de la solucion es muy importante, ya que la gestacion puede verse drasticamente disminuida dependiendo del tipo de microorganismos presentes. La toxicidad de algunos compuestos quimicos organicos o inorganicos puede dafiar y hasta destruir 10s embriones como la presencia de pequefias cantidades de ciertos metales, como plomo y mercurio.
MEDlOS PARA LA C O L E C C I ~ N DE EMBRIONES
El metabolismo de microorganismos contaminantes pueden alterar el medio y volverlo toxico para 10s embriones. La filtration de millipore (0.22 - 0.45 micras), constituye el metodo idoneo para la esterilizacion de 10s medios, utilizando tecnicas y recipientes esteriles, ademas es importante la adicion de antibioticos y antimicoticos. Para lograr el pH fisiologico, algunos medios son amortiguados con carbonatos, es necesaria una atmosfera del5% de CO, para mantener la conservation de carbonatos y con ellos el pH. La solucion Hartmann modificada y solucion buferada fosfatada (PBS) Dulbecco, son las soluciones que constituyen 10s medios mas practicos para su uso en la transferencia de embriones en bovinos.
3.1.-Congelacion
El agua es el constituyente principal de 10s fluidos biologicos, responsable del transporte interno de las sustancias quimicas esenciales. El agua pura se congela y forma cristales a OC, mientras que esta misma que contiene iones y otras sustancias en solucion lo hace a temperaturas mas bajas, dependiendo de la concentracion de tales sustancias. Conforme el agua de una solucion se congela, 10s cristales de agua pura que se forman van dejando mayores concentraciones liquidas de aquellas sustancias que estan en solucion. Este hecho aumenta la presion osmotica del resto del soluto, lo que puede determinar las lesiones de las celulas. Las principales consecuencias fisicas y quimicas de la congelacion son la separacion del agua pura de la solucion para formar hielo y la mayor concentracion de soluto resultante en el liquido residual. Estos hechos y sus efectos sobre las celulas se hallan influidos por el nivel y 10s tipos de agentes crioprotectores, por la osmolaridad y el pH del diluyente y por la rapidez de congelacion. Desde que Whittingham et a/. (1972) y Wilmut (1972) quienes usaron escalas de velocidad de enfriamiento lento (0,l-0.3C/min) desde temperatura ambiente hasta -60 o 80C, se han hecho grandes modificaciones en las curvas de enfriamiento. En casi todos 10s trabajos publicados ultimamente se colocan 10s embriones directamente a -7"C, permanecen 10 minutos, se enfrian a 0.5-0.6"CImin hasta -35C y se sumergen en nitrogen0 liquido. Este avance hoy dia es aplicado por todas las empresas e investigadores en el proceso de congelamiento de embriones el cual reduce el tiempo de congelacion a no mas de una hora.
ESQUEMA DE LOS EVENTOS F~SICOS OCURRIDOS EN EL CONGELAMIENTO (HEXAGONOS REPRESENTAN CRISTALES DE HlELO DE DIFERENTE TAMAflO SEGUN LA VELOCIDAD DE ENFRIAMIENTO).
El mol, es la unidad de medida basica del sistema internacional de unidades, definida
como la cantidad de una sustancia que contiene tantas entidades elementales (atomos, moleculas, iones, electrones u otras particulas) como atomos hay en'0.012 kg (12 g) de carbono 12. Esa cantidad de particulas es aproximadamente de 6.0221 X 1o * ~ el , llamado nimero de Avogadro. Por lo tanto, un mol es la cantidad de cualquier sustancia cuya masa expresada en gramos es numericamente igual a la masa atornica de dicha sustancia.
La molaridad se define como la cantidad de sustancia de soluto, expresada en moles,
contenida en un cierto volumen de disolucion, expresado en litros, es decir: M = nlv. El nljmero de moles de soluto equivale a1cociente entre la masa de soluto y la masa de un mol (masa molar) de soluto. Por ejemplo, para conocer la molaridad de una disolucion que se ha preparado disolviendo 70 g de cloruro de sodio (NaCI) hasta obtener 2 litros de disolucion, hay que calcular el nirmero de moles de NaCI; como la masa molar del cloruro de sodio es la suma de las masas atomicas de sus elementos, es decir, 23 + 35.5 = 58.5 glmol, el nljmero de moles sera 70158.5 = 1.2 por tanto, M = 1.2/2= 0.6 M. La molaridad se define por la siguiente ecuacion:
M = Molaridad = moles de soluto litros de disolucion

Una disolucion 1.46 molar de glucosa, escrita como 1.46 M contiene I .46 moles de soluto de glucosa en un litro de la disolucion, una disolucion de 500 ml que contiene 0.730 moles de glucosa tambien tiene una concentracion de 1.46 M. La unidad de molaridad es moles por litro, por lo que una disolucion de 500 ml que contiene 0.730 moles de glucosa equivale a 1.46 mollLo 1.46 M. La disoluciones son las mezclas homogeneas de dos o mas sustancias, la sustancia presente en mayor cantidad suele recibir el nombre de disolvente y a la de menor cantidad se le llama soluto y es la sustancia disuelta. El soluto puede ser un gas, un liquido o un solido y el disolvente puede ser tambien un gas, un liquido o un solido. El agua con gases un ejemplo de un gas (dioxido de carbono) disuelto en un liquido (agua). Existen distintas formas de expresar la concentracion de una disolucion, per0 las dos mas utilizadas son: gramos por litro (gll) y molaridad (M). Los gramos por litro indican la
masa de soluto expresada en gramos, contenida en un determinado volumen de disolucion, expresado en litros. Asi, una disolucion de cloruro de sodio con una concentracion de 40 g/l contiene 40 g de cloruro de sodio en un litro de disolucion. 3.1.2.- Funcion de 10s crioprotectores Estos compuestos muy hidrofilos (en general polialcoholes) tienen la capacidad de penetrar facilmente en la celula por simple difusion (osmosis), sus moleculas retrasan la formacion de cristales de hielo por el descenso del punto de congelacion. Por otra parte, limitan 10s efectos de la solucion, eliminando una parte del agua intracelular por elevacion de la presion osmotica extracelular. En 1973 se dio a conocer la primera gestacion en bovinos producida con un embrion congelado/descongelado. Desde entonces se han publicado miles de articulos sobre experimentos que tratan diferentes aspectos de la criobiologia embrionaria, que han conducido, no solo a una mejora sustancial de 10s procedimientos para la congelacion embrionaria, sin0 aun mejor entendimiento de 10s fundamentos de la respuesta de 10s embriones a 10s procesos de congelacion y descongelacion de embriones. La criopreservacion y el almacenamiento de embriones a bajas temperaturas (nitrogen0 liquido) presentan numerosas ventajas, tanto desde el punto de vista biologico como desde el comercial.
TERM0 DE N I T R ~ G E N O LIQUID0 PARA CONGELAMIENTO YALMACENAMIENTO DE EMBRIONES.
Permite una reduccion de costos derivados de la aplicacion de las tecnologias reproductivas. Facilita una disociacion de todas estas tecnicas de la actividad reproductiva ciclica que presentan las especies mamiferas de interes, consiguiendose una
independencia temporal del estado fisiologico de 10s animales (hembras receptoras). Elimina las patologias que normalmente se asocian a1 mantenimiento de animales vivos. Posibilita la conservacion de razas o especies en riesgo de extincion mediante la creacion de bancos de embriones congelados, manteniendo intact0 el patrimonio genetico.
La criopreservacion esta influida por un elevado nljmero de variables, de forma que ninguna aproximacion que contemple solo uno o parte de 10s aspectos implicados garantiza una eficacia total. A pesar de esto y con independencia del sistema utilizado, 10s principios basicos persiguen una proteccion de las celulas frente a 10s principales efectos perjudiciales del proceso, como la formacion de hielo intracelular, deshidratacion y efectos toxicos de 10s crioprotectores.
3.1.3.- Velocidad de enfriamiento.
El agua atraviesa con facilidad las membranas para diluir las soluciones, per0 usualmente es mas dificil que las sales atraviesen las membranas. El medio usado para la estancia de 10s embriones tiene una concentracion de sales de 270 a 320 mOsmIkg y la mayoria es cloruro de sodio. A esta concentracion, las sales fuera de las celulas balancean a las proteinas del interior, que son demasiado grandes para pasar por las membranas semipermeables. De igual manera, las moleculas grandes de algunos aditivos crioprotectores, incluyendo 10s azljcares, son incapaces de atravesar las membranas celulares.
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CURVAS DE SOBREVIVENCIA DE C ~ L U L A S SEGUN LA VELOCIDAD DE CONGELACI~N.
Si el enfriamiento es demasiado rapido, el agua intracelular no puede salir en cantidad suficiente, formandose en medida considerable cristales de hielo en el interior de las celulas, cristales que aumentaran de tamaAo, durante la congelacion y la descongelacion, con perjuicio de las estructuras celulares. Si por el contrario, el enfriamiento es muy lento, la deshidratacion progresiva de las celulas determina una elevacion sensible de la concentracion de electrolitos en el medio celular, modificando sus propiedades fisicoquimicas (efecto de solucion) fenomeno que comporta la perdida de viabilidad de las celulas.
3.1.4.- Clasificacion de 10s crioprotectores.
Los crioprotectores se clasifican en penetrantes y no penetrantes, dentro de 10s compuestos penetrantes se encuentra el glicerol, dimetilsulfoxido (DMSO), propilenglicol, polivinilpirrolidona, etanol, etilenglicol y otros alcoholes. En 10s no penetrantes se encuentran la sacarosa, glucosa, trialosa y rafinosa.
Penetrantes.
Protegen a las celulas de 10s efectos dariinos de la alta concentracion de soluto producido en el medio exterior durante la congelacion. La cinetica de entrada y salida de estos crioprotectores esta caracterizado por algunos factores como cociente de permeabilidad, cociente de temperatura y cociente de reflexion. Durante la adicion de un crioprotector penetrante las celulas se reducen transitoriamente hasta un nivel que depende de 10s factores antes mencionados, ademas de la velocidad de adicion. Si el crioprotector es eliminado despues de la descongelacion por dilucion, las celulas se hidratan transitoriamente hasta un nivel que depende de la velocidad de dilucion. La adicion al crioprotector consiste en pasar el embrion por diferentes concentraciones crecientes de esta sustancia, partiendo de la solucion buferada fosfatada (PBS) hasta una .4 M mas PBS (Solano, 1988). El glicerol a 1.4 concentracion final del crioconservador de I M permite obtener un elevado porcentaje de viabilidad cuando 10s embriones son congelados a una velocidad de 0.3"Cl minuto hasta -30 o -35C; sin embargo, tiene la desventaja que al exponer el embrion a la solucion de glicerol para que este penetre y tambien despues de la descongelacion para su elimination, se necesita varios pases que consume mucho tiempo.
En un principio se empleaban 4 pases incrementando la concentracion del crioprotector, con intervalos de 10 minutos cada uno, este metodo era tan prolongado que afectaba la viabilidad de 10s embriones debido a la constante manipulacion. Posteriormente se redujeron a 3 pases, hasta que en 1982 se demostro que 10s embriones pueden ser congelados en un solo pase al crioprotector. Algunos estudios han descrito ventajas de 10s glicoles en la crioconservacion de embriones porque sus moleculas son mucho mas permeables. Se utilizan de forma exitosa, tambien en soluciones vitrificantes, debido a que su peso molecular es menor que el del glicerol, propilenglicol y DMSO. De esta forma, la suficiente penetracion del etilenglicol en el embrion tiene el lugar en corto tiempo y es eliminado rapidamente durante la dilucion, resultando en una disminucion de la toxicidad embrionaria.
No penetrantes.
Son agentes que mantienen una presion osmotica alta en el medio extracelular durante la eliminacion del crioprotector. Esto evita 10s choques osmoticos debido a la difusion del glicerol hacia fuera despues de la descongelacion. Si se aiiade sacarosa a la solucion de glicerol, despues de equilibrados 10s embriones, el tamatio de 10s mismos se reduce en un 30 a 4O0/0 en comparacion con 10s equilibrados solo en glicerol. Cuando se descongelan embriones en presencia de sacarosa, se limita el movimiento del agua a traves de las membranas y asi se evita la lisis de las celulas embrionarias durante la eliminacion del glicerol. Este beneficio de la sacarosa se debe a sus propiedades osmoticas, estando involucrado tambien el transporte activo de iones a traves de la membrana. Este proceso es controlado por el sistema Na+ y K ATPasa, el cual es inhibido en presencia del glicerol. Si esto se aplica a embriones bovinos, la utilizacion de sacarosa en el medio de congelacion que contiene glicerol, permite restaurar el equilibrio quimico durante la congelacion. Actualmente hay una mayor tendencia hacia la combinacion de 10s crioprotectores penetrantes con 10s no penetrantes, brindando la oportunidad de congelar 10s embriones en la misma explotacion ganadera y dejarlos a la disposicion del tecnico quienes pueden transferirlos a las vacas en el momento apropiado.
3.15.-Funcion del glicerol
En general el glicerol, en la congelacion de embriones continua siendo el patron de comparacion para cualquier agente crioprotector (Elsden et a/., 1986; Nljriez y Solano, 1996). Se dice que el glicerol actlja mediante un mecanismo de tamponamiento salino (Lovelock, 1953). El glicerol se une con el agua y disminuye acentuadamente el punto de congelacion de las soluciones, se forma en su presencia menos hielo a cualquier temperatura dada (Stein, 1962; Farrant, 1964). En consecuencia, la concentracion de solutos en el liquido residual se reduce correspondientemente. La influencia perjudicial de 10s solutos concentrados parece depender de la temperatura de aqui que el glicerol, al reducir la temperatura al que se obtienen tales concentraciones de soluto, disminuye sus efectos perjudiciales. Con base a esto, el nivel optimo de glicerol de un diluyente aumenta conforme incrementa la tonicidad del mismo.
GLICOLES PARA LA CRlOPRESERVACldN (GLICEROL)
3.1 -6.- Funcion del etilenglicol

En algunos trabajos han descrito ventajas de 10s glicoles en la criopreservacion de embriones porque sus moleculas son mucho mas permeables. Se utilizan de forma exitosa tambien en soluciones vitrificantes, debido a que su peso molecular es menor que el del glicerol, propilenglicol y DMSO. De esta forma el etilenglicol es sumamente permeable en corto tiempo y es eliminado rapidamente durante la dilucion, resultando en una disminucion de la toxicidad embrionaria.
GLICOLES PARA LA CRIOPRESERVACI~N (ETILENGLICOL)
3.1.7.- Congelacion de embriones con glicerol
En la actualidad existen diferentes maquinas congeladoras de embriones. Las de tipo manual o de campo y automaticas programadas para la congelacion. Tambien se disponen de cuatro procedimientos de congelacion: 1) metodo convencional de congelacion lenta y controlada, 2) congelacion ultrarrapida, 3) congelacion a un paso y 4) vitrification. La congeladora de tip0 manual denominada Peter Elsden, consiste en un barril de acero donde se colocan las pajillas que contienen 10s embriones, conectado a un termocoplex para el control de la temperatura. El embrion evaluado y lavado se pasa a una solucion que contiene PBS + alblimina serica bovina (ASB) + 10% glicerol (1.4 M), mientras tanto se rotulan las pajillas francesas de 0.25 ml con 10s datos de la donadora y el semental, con la ayuda de una jeringa de 1 ml se acopla a la pajilla francesa se succionan tres o cuatro columnas de medio separadas por burbuja de aire, de manera que el embrion quede colocado en la ultima columna, inmediatamente se coloca en la congeladora de embriones a temperatura de 0C , se baja gradualmente 1C por minuto hasta 10s -7C donde se efectua la cristalizacion, que consiste en inducir la formacion de cristales en el medio interior de la pajilla. Esto se realiza facilmente tocando la pajilla con una pinza enfriada en nitrogen0 liquid0 en la columna donde se encuentra el embrion. La formacion progresiva de cristales de hielo en el medio que rodea a 10s embriones produce un aumento de la concentracion de 10s electrolitos en la fraccion todavia liquida de la solucion. A consecuencia del aumento de la presion osmotica se produce la salida por difusion de una parte del agua intracelular y el embrion comienza a deshidratarse. Despues de la cristalizacion, el embrion permanece 10 minutos a -7 "C. A partir de esta temperatura el enfriamiento se producira a un ritmo de 0.5 "Clminuto hasta 10s -30" C, llegando a esta
34
temperatura las pajillas con 10s embriones se sumer'gen directamente en el nitrogeno liquido.
TECNICA DE CONGELAMIENTO (PETER ELSDEN)
En otros estudios N~liiezy Solano (1996) mencionan que una vez colocados 10s embriones en las pajillas en un equipo programable que alcanza una temperatura de -5 a -7 "C a una velocidad de 1 a 5"CIminuto. En este equipo se induce la formacion de cristales de hielo en la parte superior de la pajilla durante 5 minutos, posteriormente la temperatura es descendida a 0.3"CIminuto hasta -30C o -35C temperatura a la que se sumergen las pajillas en nitrogeno liquido para su almacenamiento
Algodon + Polivinilico
Aire
Aire
*
+
Glicerol
Glicerol Embrion
Sello
LLENADO DE PAJILLA FRANCESAS DE 0.25 ML CON EL SlSTEMA DE GLICEROL
CUADRO 2. EMBRIONES CONGELADOS CON EL SISTEMA DE (ADAPTACI~N DE PETER ELSDEN, 1977).
GLICEROL
0C
I "C x Imin. 4
-
Se colocan las pajillas en la congeladora a 0C Se inicia el connelado gradual 1C x minu Cristalizacion (Seeding) durante 10 minutos Se continira el congelado gradual con escala 1"C x 2 minutos hasta -32C
-7C
1 "C x 2 min?
-32C
Termina el congelado gradual
lnmediato
-1960C
Se sumerge la pajilla a nitrogen0 liquid0 en forma inmediata a -1 96C
3.1.8.- Congelacion de embriones con etilenglicol
En la ultima decada del siglo XX se hizo una importante innovacion con base al descubrimiento de que se puede congelar embriones con ciertos aditivos crioprotectores que no necesitan extraerse al descongelamiento y permiten la transferencia directa del embrion a la vaca receptora. El metodo utilizando es conocido como transferencia directa, iniciado porvoelkel y Hu, 1992, haciendo que la transferencia sea muy parecida a la inseminacion artificial. La transferencia directa de embriones es el resultado de un avance tecnologico en la criopreservacion, que permite que la transferencia de un embrion sea como una inseminacion artificial. Esto es posible porque el agente crioprotector que se usa en 10s embriones de transferencia directa permite que el embrion sea rehidratado dentro de la receptora eliminando asi la necesidad del microscopio y el embriologo que se usan cuando se descongelan embriones congelados de manera tradicional. Observaciones realizadas por varios investigadores sugieren que la permeabilidad de 10s embriones ovinos y bovinos (estadios de morulas y blastocistos) al etilenglicol y a 1
propilenglicol es mayor que la permeabilidad al glicerol. Otros han referido metodos de transferencia directa que utilizan como crioprotectores al glicerol, propilenglicol y el etilenglicol mezclados o no con sacarosa. Massip y Zwalmen (1984) quienes trabajaron con glicerol 1.5 M y sacarosa 0.25 M como crioprotectores utilizando el procedimiento de un paso y transfiriendo directamente 10s embriones en el ljtero a la receptora. Suzuki et a/. (1990) quienes utilizaron propilenglicol 1.6 M lo cual que permite que el embrion se rehidrate directamente en el medio materno, encontrandose resultados satisfactorios de porcentajes de prefiez. No obstante, Cseh et a/. (1994) sugieren que la transferencia directa de embriones con el uso de sacarosa en la pajilla puede ser aplicada en la practica con buenos resultados especialmente para transferir embriones de baja calidad. Los embriones se exponen a una solucion de etilenglicol al 1.5 M por 5 minutos a temperatura ambiente (25 a 30C), para estabilizarlos y se envasan en pajillas francesas de 0.25 ml de la siguiente manera: se realizan 3 columnas de medio de mantenimiento (PBS + 10% de ASB) de 2.5 cm cada uno, mas una columna de etilenglicol.de 2 cm donde se coloca el embrion, las columnas van separados con espacios de aire. lnmediatamente se coloca la pajilla francesa con el embrion en la congeladora manual a - 6"C, donde se esperan 5 minutos para realizar la cristalizacion donde el embrion permanece 10 minutos a esa temperatura, para luego realizar el enfriamiento a un ritmo de 0.5"C por minuto hasta 10s -32C. Al alcanzar esta temperatura se sumerge la pajilla directamente en el nitrogen0 liquido a -1 96OC
Sol. Hartmann Etilenglicol + Embridn
Sol. Hartmann
LLENADO DE PAJlLLA FRANCESAS DE 0.25 ML CON EL METODO DE ETlLENGLlCOL
CUADRO 3. CONGELACION DE EMBRIONES BOVINOS CON EL METODO DE ETILENGLICOL
- 6C
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Se deja hat
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ultima pajilla
-7C
Cristalizacion (Seeding) durante 10 minutos
I"C x 2 min.
4
-32C
Se continlia el congelado gradual con escala 1C x 2 minutos hasta -32C Termina' el congelado gradual
lnmediato
-196C
Se sumerge la pajilla a nitrogeno liquido en forma inmediata a -1 96C
3.1.9.- Descongelacion de embriones con glicerol

Durante el proceso de congelamiento de 10s embriones a -196C se forma inevitablemente una cierta cantidad de hielo en las celulas. Para evitar un aumento destructivo del tamaAo de 10s pequefios cristales por aglomeraci6n durante la descongelacion, el proceso de recalentamiento debe ser tambien lo mas rapido posible (del orden de 2000C/minuto). Las pajillas extraidas del nitrogeno liquido se descongelan en agua de baAo maria a 37C durante 15 a 20 segundos. lnmediatamente despues de la descongelacion es indispensable eliminar el crioprotector para la supervivencia del embrion. No obstante, las celulas que presentan una conservacion elevada de crioprotectores no deben ser colocadas directamente en un medio isotonico. En tal caso, las diferencias de presion osmotica provocaria una entrada
demasiada rapida de agua en la celula con el riesgo de reventar. Es necesario proceder a la eliminacion progresiva del crioprotector, de manera que 10s flujos de salida de crioprotector y de entrada de agua Sean compatibles con la permeabilidad de la membrana plasmatica. La eliminacion del crioprotector por efecto de la sacarosa es por principio acelerar el flujo de salida de este. La sacarosa de peso molecular elevado no penetra en la celula por simple difusion. Su presencia en el medio crea un aumento de la presion osmotica del medio extracelular, favoreciendo la difusion masiva del crioprotector en el cornpartimiento celular.
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I
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Pozo 2 Sacarosa + 50% Medio de Transferencia
Pozo 3 Medio de Transferencia
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Pozo 4 Se sube el embrion en la Z
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EL~M~NAC DEL ~ ~GLICEROL N E H~DRATAC~ DEL ~NE M B R ~ ~ UTlLlZANDO N LA CAJA MULTIWELDISCH.
El glicerol puede ser removido de varias formas: 1). Pasar al embrion por cuatro soluciones permitiendo una estancia de 5 minutos por
solution. a) PBS mas 10% de suero fetal bovino (SFB), con 6% de glicerol, mas 10% de sacarosa (0.3 M). b) PBS mas 10% SFB, con 3% de glicerol mas 10% de sacarosa (0.3 M). c) PBS mas 10% SFB, con 0% de glicerol mas 10% de sacarosa (0.3 M). d) PBS mas 10% SFB, sin glicerol sin sacarosa.
2). Eliminacion del crioprotector en forma inversa, se pasan 10s embriones por bafios de concentracion decreciente, ejemplo: etilenglicol 1.5 M, despues 1.0 M, 0.5 M y por ultimo
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0 M. La duracion de cada baiio es de 5 a 10 minutos. 3). Retiro del crioprotector en tres pasos, por el metodo decreciente utilizando glicerol: 1.4 M, 0.93 M y 0.45 MI posteriormente medios para hidratar y transferir el embrion PBS + 10% SFB.
4). Saito (1994) recomienda una combinacion de 10% de sacarosa (0.3 M) con solucion
de PBS mas 20% de caseina serica bovina (CSB), con reposo de 5 a 10 minutos cada paso. Este mismo autor realiza un proceso decreciente para esto utiliza glicerol: 10, 6.6 y 3.3% con un reposo de 5 minutos en cada paso, en el ljltimo paso PBS + 20% CSB con un reposo de 10 minutos. 5). Concentraciones decrecientes de sacarosa: 10% de sacarosa + PBS con un reposo de 10 minutos, 5% de sacarosa + PBS + 10% SFB con reposo de 5 minutos, 2.5% de sacarosa + PBS + 10 % SFB 5 minutos y el ultimo paso PBS + 10% SFB, quedando listo para realizar la transferencia. Tambien hace referencia del retiro del crioprotector de un paso utilizando soluciones de sacarosa al 10% durante 5 minutos, luego se hidrata en PBS + 10% SFB y se trasfiere el embrion a la receptora.
Aire
Aire
Medio de Tran sferencia
Embrion + Medio de Transferencia
Medio de Transferencia
LLENADO DE PAJILLA FRANCESA DE 0.25 MLPARA REALIZAR LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES.
3.1 .lo.- Descongelacion de embriones con etilenglicol
En 1972, 10s cientificos descubrieron un nuevo crioprotector, el etilenglicol al 1.5 M, este tiene una gran ventaja sobre el glicerol y es el de ser sumamente permeable. Una de las mayores ventajas de 10s embriones congelados con etilenglicol es el de poder ser transferidos de manera directa al utero de las receptoras, sin la necesidad de utilizar diluyentes ni el microscopio para observar 10s embriones. Esto representa por si misma una ventaja para la industria ganadera. Los veterinarios, tecnicos inseminadores con experiencia son ahora candidatos para transferir embriones en forma directa al ser estos congelados con etilenglicol. Las receptoras seran animales sincronizados o buen trasferidos despues de la presentacion natural del estro. Todo esto considerado dentro de la industria ganadera da un nuevo mercado para la transferencia embrionaria representa un gran avance para el mundo cientifico en beneficio de la ganaderia. El protocolo para descongelar y transferir embriones de transferencia directa es el siguiente: La receptora debe haber sido detectada en estro siete dias antes de la transferencia. Debe existir un buen cuerpo luteo funcional. Aplicar anestesia por via epidural de 4 a 6 ml de lidocaina al 2% a la altura de la ultima vertebra sacra y la primera coccigea alrededor del cordon medular. ldentificar el embrion leyendo el rotulado en la parte superior. Sacar la pajilla del termo de nitrogen0 Iiquido y mantenerlo al aire por 12 segundos. Sumergir la pajilla en agua a 35C por 20 segundos. Sacar la pajilla del agua, secarlo con servilleta, realizar el corte en la parte donde fue sellada hermeticamente a calor o alcohol polivinilico. Colocar la pajilla en el aplicador de transferencia de embriones. Montar la funda azul sobre la pistola, apretar firmemente para asegurarse que la pajilla este bien colocada, usar el anillo de plastic0 para fijar la funda sobre la pistola. Pistola yfunda se protege dentro de la camisa sanitaria. Una vez que la pistola este cargada, debe mantenerse en posicion horizontal. Esto hace que el embrion se quede en el centro de la columna de liquido. Para transferir el embrion pasar la pistola suavemente por el cervix hasta el cuerno
uterino correspondiente a lado del ovario que contiene el cuerpo lirteo. El embrion se coloca a 10s 13 a 18 cm dentro del cuerno uterino. Si esto no fuera posible, depositar el embrion lo mas profundo posibleen el cuerno.
3.1 .I1.-Preparacion de medios
Durante la tecnica de coleccion de embriones se utilizan dos tipos de medios que son el medio de coleccion y el medio de mantenimiento y de transferencia de embriones. El medio de coleccion es adicionado con 1% de suero sanguineo o proteina serica con la finalidad de lograr un siliconizado evitando con ello que 10s embriones se adhieran al material con que entran en contact0 durante su coleccion, debido a la presencia de macromoleculas como es la albljmina serica bovina.
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Para el medio de mantenimiento se adiciona el 10% de suero sanguineo o proteina serica para dotarlo de algunos factores nutricionales, ademas de evitar con ello que 10s embriones floten o se adhieran, pueden emplearse suero fetal bovino, suero de oveja menor de un atio, suero de becerro recien nacido, suero de novillo de 185 a 205 dias de edad o bien alblimina serica bovina. Si el suero se obtiene de animales sanos y procesado en forma adecuada 10s resultados seran sirnilares con cualquiera de ellos siempre y cuando Sean tratados con calor (56OC130 minutos) para termoinactivar o destruir el complemento, de no ser asi daiiaria a 10s embriones ya que es embriotoxico, ademas se debe esterilizar porfiltracion con poros de 0.45 micras.
Actualmente la tecnica. mas usada en bovinos en la coleccion no quirurgica (transcervical). Esta consiste en la lavar varias veces el cuerno uterino con el medio de coleccion. Esto se consigue introduciendo el cateter de Foley a traves del cervix hasta la curvatura mayor del cuerno, lugar donde se fija inflando el globo del cateter, el cual se une a la manguera tygon. Por un lado de la bifurcacion entra el medio al utero, cada vez que se llena este se le da un masaje, posteriormente se extrae el medio el cual sale hacia el filtro colector de embriones. Una vez lavado un cuerno, se saca el cateter y se repite la operacion en el cuerno opuesto. El momento indicado para realizar la coleccion es entre el dia 6.5 a 7 de iniciado el estro debido al tipo de estructuras que se encuentran en estos dias considerando de que 10s embriones pasan del oviduct0 al cuerno uterino en el cuarto o quinto dia. Despues de la coleccion embrionaria las donadoras reciben una inyeccion de prostaglandinas F2 a (25 mg de Dinoprost trometamina) con el objeto de inducir la regresion de 10s cuerpos Iuteos, evitar una posible gestacion, incluso multiple y acortar el period0 entre colecciones.
LAVADO DE LAS VACAS DONADORAS Y DE C O L E C C I ~ N DE EMBRIONES.
4.1 .- Evaluacion Embrionaria Los embriones se clasifican de acuerdo con dos criterios: gradode desarrollo y calida
La Sociedad lnternacional de Transferencia de Embriones (IETS), han designado un
numero progresivo para 10s diferentes estadios de desarrollo y para la calidad del embrion,
EVALUACI~N DE EMBRlONARlA (LABORATORIO DE B~OTECNOLOG~A
Y MEJORAMIENTO G E N ~ T I C O ANlMAL - FMVZ- UNACH)
CUADRO 4. CRlTERlOS DE CLASIFICACION PARA EMBRIONES BOVINOS Grado de desarrollo Clave Edad del bridn
-
No. de celulas
6vu10 2 a 16 blastomeros Morula temprana Morula compacta Blastocito temprano Blastocito maduro Blastocito expandido Blastocito en eclosion Embrion eclosionado
2
3
4
2 - 4 dias
2-16
> 16
5 dias
6 dias
32 - 64
5
6
7 dias
7 dias
8 dias
160 180 200

> 200
7
8
9
9 dias
4.1.1.- Embriones transferibles
Con base a sus caracteristicas morfologicas, cada embrion recibe una clasificacion por su edad y calidad. a) Morula compacta. Debido a la compactacion, las uniones de 10s blastomeros han formado una masa celular, de manera que ya no se aprecian 10s blastomeros individuates. El embrion ocupa del60 al70% del espacio perivitelino.
MORULA COMPACTA
Blastocito temprano. En la masa celular aparece una pequeiia cavidad llena de b) liquid0 llamado blastocele. Aqui las celulas empiezan a diferenciarse. El embrion ocupa del 70 al 8O0/0 del espacio perivitelino. La diferencia visual entre el trofoblasto y la masa celular es apreciable.
BLASTOCITO TEMPRANO
E 5
c) Blastocito maduro. Se observa las celulas del tabique embrionario (disco embrionario), que originan al embrion y a las celulas del trofoblasto. El embrion tiene apariencia de anillo y ocupa el 90% del espacio perivitelino.
BLASTOCITO MADURO
d) Blastocito expandido. El diametro del embrion aumenta 1.2 a 1.5 veces y la zona pelucida sufre un adelgazamiento. Estos embriones con frecuencia se colapsan sin que se aprecie el blastocele; sin embargo, la zona pelucida permanece adelgazada.
BLASTOClTO EXPANDIDO
e) Blastocito en eclosion. El embrion tiene fisurada la zona pelljcida por donde eclosiona paulatinamente hasta salir totalmente de ella, el embrion puede tener ya sea la forma esferica de un blastocito expandido o bien estar colapsado.
BLASTOClTO EN E C L O S I ~ N
CUADRO 5.- CLASIFICACI~N DE LOS EMBRIONES DE ACUERDO A SU MORFOLOG~AY CALIDAD

Calidad del embrion Clave Morfologia
'
Excelente Bueno Pobre o regular No transferible
1 2
Esferico, simetrico, celulas uniformes, buen color lmperfecciones ligeras, blastomeros extruidos, vesiculas. Alteraciones mas severas, vesiculas, celulas degeneradas. Alteraciones graves, signos de degeneracion, vesiculas.
3
4
4.1.2.- Lavado de 10s embriones.
Despues de evaluados 10s embriones se procede a lavarlos, lo cual consiste en 10 pases sucesivos en medio de mantenimiento esteril, procurando tomar a 10s embriones en la pipeta con la menor cantidad de medio de un paso al siguiente y cambiando la pipeta en cada paso. Esto permite eliminar posibles contaminantes (impurezas, celulas, sangre, bacterias o virus) y ofrece la garantia de poder ofrecer un embrion sano. Algunos paises exigen este tip0 de lavados por la importacion de embriones, incluso hasta la utilizacion de tripsina.
4.1.3.- Transferencia de embriones.
El punto de evaluation de la transferencia de embriones es la formacion de un cuerpo lllteo (CL) funcional. La aparente ausencia del CL puede significar que la receptora estuvo en estro, per0 no existio ovulation y si ocurrio per0 el CLfracaso en su formacion o se form6 per0 no fue detecfado. Sin embargo, las receptoras que califican en todas estas categorias pueden ser presentadas para ser transferidas.
TRANSFERENCIA DE EMBRIONES POR
VIATRANSCERVICAL
El metodo de transferencia de embriones no quirurgica es un procedimiento rapido y relativamente barato. Es el metodo de mayor eleccion en gran parte de 10s programas de TE en explotaciones comerciales. La evolution mas reciente en relacion a la TE, es el almacenar embriones en pajillas congeladas con etilenglicol, que permite su transferencia en forma directa despues del descongelamiento, haciendo este metodo como si fuera una inseminacion artificial y es cada vez mas atractivo para 10s tecnicos y 10s productores pecuarios. El factor determinante sobre la actividad de este metodo, es la destreza y experiencia del profesional para determinar el sitio de la colocacion del embrion dentro del cuerno uterino, como tambien el grado de lesion implicado durante la transferencia de embriones.
4.1.4.- Biparticion de embriones.
La habilidad de producir muchas copias a partir de un solo individuo es algo que interesa a 10s productores pecuarios, porque constituye una poderosa herramienta de seleccion y propagacion. Si se logran producir grandes cantidades de individuos geneticamente identicos, se podrian usar como base en la produccion de carne, leche y en la seleccion fenotipica que puede permitir un rapido cambio en caracteristicas especificas y muy seleccionadas. Esta tecnologia combinada con la fertilizacion in vitro podria utilizarse para producir grandes cantidades de embriones de alta calidad que despues serian congelados o transplantados.
4.15.-Micromanipulador.
La biseccion de embriones es un procedimiento que da como resultado la produccion de gemelos identicos al dividir el embrion usando tecnicas de microcirugia. El metodo mas sencillo y eficiente para producir gemelos identicos es obtener embriones de 6 a 7 dias de edad, cortarlos por la mitad y transplantar las dos mitades a igual nljmero de receptoras.
4.1.6.- Division artificial de 10s embriones.
En trabajos realizados por Leibo (1986) y Takeda (1986) las tasas de pretiez obtenidas con la transferencia de hemiembriones son muy variables con una media que varia de un 45 a 50 %. Asu vez la ausencia de la zona pelljcida en 10s miembros no afecta a 10s porcentajes de pretiez para embriones transferidos frescos.
DlVlSl6N DE LOS EMBRIONES
En referencia a 10s embriones divididos, cuando son transferidos, 10s porcentajes de preAez dependen de la calidad de 10s embriones con 10s resultados que van desde un 76,2% de fetos para mitades de calidad muy buena, hasta un 24,7% para aquellas de calidad regular, lo cual sugiere la necesidad de destinar a la micromanipulacion solo aquellos embriones de excelente y buena calidad. La selecci6n de 10s embriones provoca una perdida celular embrionaria de aproximadamente lo%, que posiblemente compromete la viabilidad de 10s embriones de calidad inferior. La tasa de preiiez obtenida con la transferencia de hemiembriones son muy variables con una media que varia entre 50 y 60%. A su vez, la ausencia de la zona pelucida en 10s hemiembriones no afecta 10s porcentajes de preiiez para embriones transferidos frescos.
M~CROMANIPULACI~N DE LOS EMBRIONES.
La division de embriones ha sido utilizada en diversos proyectos con la finalidad de incrementar la eficiencia de programas de transferencia de embriones. La tecnica permite incrementar el numero de crias obtenido por donadoras y generar pares de gemelos identicos. El impact0 potencial de la tecnica en programas de mejoramiento genetic0 en diversas especies de interes zootecnico ha sido ampliamente demostrado en diversos paises del mundo. Asi mismo, diversos investigadores han reconocido 10s beneficios de generar pares e gemelos identicos en la realizacion de investigaciones en ciencia animal.
4.1.7.-Ventajas de la bipartition de embriones
Actualmente 10s embriones bovinos son micromanipulados con el fin de obtener algunas celulas y proceder a la identificacion del sex0 previo a su transferencia o para ser divididos en dos partes iguales (hemiembriones) y producir mellizos identicos, lo que permite la disponibilidad de animales identicos en 10s programas de transferencia embrionaria.
Con referencia a aquellos embriones que son destinados a la identificacion del sexo, 10s blastomeros son abordados penetrando la zona pelucida y aspirando de 4 a 6 celulas o cortando la zona y 10s blastomeros con una navaja. En trabajos realizados con embriones sexados y transferidos frescos, la tasa de prefiez fue de alrededor de 45%, observandose ademas que de 10s resultados dependieron de la calidad del embrion.
4.1.8.- Mellizos
El tener mellizos es el resultado inevitable de produccion en ganado lechero y algo indeseable en la ganaderia lechera puesto que reduce la rentabilidad total y la eficiencia reproductiva. Los mellizos reducen el resultado reproductivo al aumentar 10s dias abiertos y servicios por concepcion durante la subsiguiente lactancia.
Las vacas que tienen mellizos presentan altos riesgos de nacer muertos, tendencia a retencion placentaria, metritis y desplazamiento de abomaso. Las incidencias de aborto van desde un 1 2 % vs. 29 %, la mortalidad neonatal de terneros 3.0 % vs. 15 %, teniendo un bajo peso al nacer de 31 vs. 41 kg.; retencion placentaria que varia de 7 % vs. 34 %.
4.1.9.- Mecanismo de Gemelacion
El ganado es una especie monotoca, lo que significa que una preriez resulta en el nacimiento de un solo ternero. El mecanismo fisiologico responsable de regular el nllmero de foliculos que se hacen dominantes dentro de cada curva folicular usualmente resulta en la seleccion de un solo foliculo dominante capaz de ovular. Sin embargo, se seleccionan dos foliculos para que continOen con su crecimiento entre el grupo de foliculos en crecimiento en cada curva folicular lo que resulta en un fenomeno que se denomina codominancia, cuando el estimulo se presenta en la ovulation ya sea en la forma natural o inducida, 10s foliculos codominantes, liberan dos oocitos uno de cada foliculo. Si posteriormente son fertilizados por un esperma reciben el nombre de cigoto.
52
Por lo tanto 10s resultados de la ovulacion y fertilizacion de 10s dos oocitos se llaman mellizos dicigotos.
GEMELOS POR BIPARTICI~N DE EMBRIONES
La mayoria de 10s mellizos en el ganado son de tipo dicigoto. Los mellizos son dicigotos pueden ser del mismo sex0 u opuesto y no son parecidos geneticamente ni fenotipicamente que a 10s hijos nacidos de 10s mismos padres durante gestaciones diferentes. Los mellizos que resulten de la ovulacion y fertilizacion de un solo oocito reciben el nombre de mellizos monocigotos, el mecanismo por el cual ocurre la gemelacion monocigota puede ser considerado una clonacion natural del cigoto original en vivo.
4.1 .lo.- Tasas de gemelacion en ganado lechero
Los factores de riesgo para la gemelacion en ganado incluyen efectos del tipo de raza lecheras, el porcentaje de gemelos nacidos tambien varia entre las estaciones del at70 con una tendencia hacia mas nacimientos de mellizos durante 10s meses de verano, este efecto de las estaciones en la gemelacion ha sido atribuida a un increment0 en el plan de nutricion durante el otofio cuando las vacas en paricion durante el verano habrian concebido, un descenso del period0 de luz, y un descenso en la viabilidad de 10s embriones en fases tempranas concebidos durante 10s meses de verano comparados con 10s concebidos durante 10s meses mas frios del otot7o. La alta produccion acumulativa de leche y la gemelacion previa son factores adicionales que aumentan el riesgo de este.
En general la tasa de gemelacion para la mayoria de ganado de carne es menor d e l l %. El efecto de paridad en la tasa de gemelacion no se extiende con claridad per0 se puede explicar por una habilidad incrementada devacas mayores para soportar gemelos durante la gestacion, un aumento en la tasa de doble ovulacion o una interaccion de ambos factores.Ademas, la incidencia de la doble ovulacion en las vacas lecheras en lactancia es de aproximadamente el 14 %. Tambien se sugiere que el proporcionar dietas de mayor energia metabolizable a las vacas de alta produccion puede incrementar la incidencia de doble ovulacion y por lo tanto la tasa de gemelacion. Este efecto nutricional es similar a la Las tasas generales de gemelacion reportadas para vacas lecheras en estudios recientes son (3%)mayores que las reportadas en muchos reportes previos, indicando que la tasa de gemelacion puede estar aumentando en el tiempo en la poblacion de ganado lechero como un todo. Si la gemelacion se relaciona con la nutricion ylo produccion de leche, este aumento en gemelacion no seria inesperado considerando las tendencias recientes en las practicas de alimentacion y 10s incrementos anuales en la produccion de leche por vaca.
NAClMlENTO GEMELAR
4.1 .I1 Freemartinismo El freemartinismo en vaquillas resulta de la gemelacion cuando las membranas embrionicas de 10s fetos masculine y femenino se fusionan durante la gestacion lo que causa un intercambio de sangre entre 10s fetos macho y hembra, 10s factores endocrinos o las celulas del ternero macho causan un desarrollo anormal de 10s organos reproductivos de la ternera hembra que causa infertilidad. El freemartinismo se presenta en aproximadamente el 92 % de las vaquillas nacidas como resultado de preAez gemelar
.-
heterosexual. Por lo tanto, aproximadamente 8 % de las vaquillas de prefiez gemelar heterosexual sera fertil presumiblemente porque las membranas fetales no se fusionaron o porque la fusion de la membrana se present6 despues del period0 critic0 de la diferenciacion sexual (organos reproductores). El desarrollo temprano de anormalidades del tracto reproductor femenino que resulta en freemartinismo se presenta entre los dias 49 a 52 posfertilizacion.
LITERATURA CITADA.
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Transferencia de Embriones en El Ganado Bovino

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Manual de Transferencia de Embriones en el Ganado B

Gobierno del Estado de Chiapas

MVZ. Oscar Moguel Delarbre Jefe de Departamento de Vinculaci6n

Secretaria de Agricultura, Ganaderia, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentacion

Fundacidn Produce Chiapas A.C.

Universidad Aut6noma de Chiapas

MVZ. Adizain Alegria C6rdova Director de la FMVZ

Colaboradores en la elaboraci6n del material didactic0

I.. INTRODUCCION .................................................................................... 1

11.-ANTECEDENTES DE LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES

ESQUEMA 1.- S E L E C C I ~ N DE DONADORAS Y RECEPTORAS PARA LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN EL GANADO BOVINO.

LAVADO DE VACAS DONADORAS PARA LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES (METODO NO QUIRURGICO 0 TRANSCERVICAL).

SIGNOS Y CONDUCTA ESTRAL EN EL GANADO BOVINO

DIFERENTES ESTRUCTURAS OVARICAS (CUERPO HEMORRAGICO Y CUERPO LUTEO)

Cuerpo luteo y foliculos

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 DlAS DEL ClCLO

PCF2 alfa Olcada folicular

ESQUEMA 2.- CAMBlOS OVARICOS Y HORMONALES DURANTE EL ClCLO ESTRAL DE LA VACA

Seleccion y manejo de Receptoras

(IBR) y DiarreaViral Bovina (DVB).

2.4.- Metodos de sincronizacion de estros

PROSTAGLANDINA NATURAL (DINOPROST TROMETAMINA)

LUPROSTIOL (ANALOGO SINTETlCO DE LA PROSTAGLANDINA F,ALFA)

Progesterona natural y progestagenos

Aplicacion via oral

PROGESTERONA NATURAL - CIDR. LAB-PFIZER

NORGESTOMET MAS VALERATO DE ESTRADIOL

GANADO CON BUENA CONDIC16N CORPORAL PARA LA SUPEROVULACI~N.

HORMONA FOLICULO ESTIMULANTE (FSH). NIH-FSH-PI

Prescntacion dcl astro

Duracion dcl ostro No do c u e r p o ~ lr~teos

ESQUEMA 3. DIAGRAMA DE LA S I N C R O N I Z A C ~ ~SUPEROVULACI~N N, Y COLECCldN DE EMBRIONES EN LAS VAQUILLAS DONADORAS.

2.6.- Deteccion de estro

MANIFESTACION DE ESTRO EN EL GANADO BOVINO.

2.7.- Inserninacion de las vacas donadoras y superovuladas

INSEMINACI~N ARTIFICIAL EN EL GANADO BOVINO

Ill.-MEDlOS PARA LA COLECCION DE EMBRIONES

MEDlOS PARA LA C O L E C C I ~ N DE EMBRIONES

El mol, es la unidad de medida basica del sistema internacional de unidades, definida

M = Molaridad = moles de soluto litros de disolucion

TERM0 DE N I T R ~ G E N O LIQUID0 PARA CONGELAMIENTO YALMACENAMIENTO DE EMBRIONES.

Velociclacl cle e~rfrin~niemto

CURVAS DE SOBREVIVENCIA DE C ~ L U L A S SEGUN LA VELOCIDAD DE CONGELACI~N.

3.15.-Funcion del glicerol

GLICOLES PARA LA CRlOPRESERVACldN (GLICEROL)

3.1 -6.- Funcion del etilenglicol

GLICOLES PARA LA CRIOPRESERVACI~N (ETILENGLICOL)

3.1.7.- Congelacion de embriones con glicerol

TECNICA DE CONGELAMIENTO (PETER ELSDEN)

LLENADO DE PAJILLA FRANCESAS DE 0.25 ML CON EL SlSTEMA DE GLICEROL

CUADRO 2. EMBRIONES CONGELADOS CON EL SISTEMA DE (ADAPTACI~N DE PETER ELSDEN, 1977).

Termina el congelado gradual

Se sumerge la pajilla a nitrogen0 liquid0 en forma inmediata a -1 96C

3.1.8.- Congelacion de embriones con etilenglicol

Sol. Hartmann Etilenglicol + Embridn

LLENADO DE PAJlLLA FRANCESAS DE 0.25 ML CON EL METODO DE ETlLENGLlCOL

CUADRO 3. CONGELACION DE EMBRIONES BOVINOS CON EL METODO DE ETILENGLICOL

Cristalizacion (Seeding) durante 10 minutos

3.1.9.- Descongelacion de embriones con glicerol

Pozo 2 Sacarosa + 50% Medio de Transferencia

Pozo 3 Medio de Transferencia

Pozo 4 Se sube el embrion en la Z

EL~M~NAC DEL ~ ~GLICEROL N E H~DRATAC~ DEL ~NE M B R ~ ~ UTlLlZANDO N LA CAJA MULTIWELDISCH.

Medio de Tran sferencia