Manual Procedimentos FIOCRUZ

MINISTRIO DA SADE FUNDAO OSWALDO CRUZ - FIOCRUZ VICE - PRESIDNCIA DE DESENVOLVIMENTO CIENTFICO E TECNOLGICO COMISSO DE TICA NO USO DE ANIMAIS
DE EXPERIMENTAO - CEUA
MANUAL DE UTILIZAO DE ANIMAIS/FIOCRUZ
ELABORADO PELA CEUA - FIOCRUZ RIO DE JANEIRO 2008
PRIMEIRA EDIO
RIO DE JANEIRO 2008

Edio de texto: Ftima Conceio-Silva Octavio Augusto Frana Presgrave
Ministrio da Sade
Ministro: Jos Gomes Temporo
FUNDAO OSWALDO CRUZ FIOCRUZ Presidente Paulo Marchiori Buss Vice- Presidente de Pesquisa e Desenvolvimento Tecnolgico Jos da Rocha Carvalheiro Vice - Presidente de Desenvolvimento Institucional e Gesto do Trabalho Paulo Gadelha Vice - Presidente de Ensino, Informao e Comunicao. Maria do Carmo Leal Vice - Presidente de Servios de Referncia e Ambiente Ary Carvalho de Miranda Vice - Presidente de Produo e Inovao em Sade Carlos Augusto Grabois Gadelha
Comisso de tica no Uso de Animais CEUA Coordenador: Octavio Augusto Frana Presgrave Vice - coordenador: Norma Labarthe Ftima Conceio-Silva Membros atuais: Belmira Ferreira dos Santos Bruno L. Diaz Carmen Penido Etlcia Moraes Molinaro Joseli de Oliveira Ferreira Maria Ignez Elsas Marcos Vincius Mota Pires Tnia Maria Pacheco Schubach Valber S. Frutuoso Leonardo Jos Carvalho Wildeberg Cal Moreira Giuliana Schirato Assistente administrativa: Lara Assuno Membros anteriores da CEUA que participaram da preparao deste manual Hugo Caire de Castro Faria Neto Celina Bessa Elizabeth Malagueo de Santana
5 SUMRIO CAPTULO TTULO Apresentao Prefcio 1 2 Breve histrico AUTOR Octavio Augusto Frana Presgrave Octavio Augusto Frana Presgrave Octavio Augusto Frana Presgrave a Octavio Augusto Frana Presgrave Ftima Conceio-Silva PGINA 6 7 9 10
6 7
Procedimentos para apresentao de protocolo CEUA - Fiocruz Notas importantes sobre o preenchimento do formulrio CEUA Principais vias e formas de administrao / inoculao em animais convencionais Principais frmacos usados em animais de laboratrio convencionais - anestsicos e analgsicos Recomendaes para a preparao de anticorpos poli e monoclonais Sangria
12
Joseli de Oliveira Ferreira
16
Hugo Caire de Castro Faria 20 Neto e Belmira Ferreira dos Santos Elizabeth Malagueo de Santana Octavio Augusto Frana Presgrave e Belmira Ferreira dos Santos Ftima Conceio-Silva e Celina Bessa Norma Labarthe e Etelcia Moraes Molinaro 28 33
8 9 10 ANEXO
Eutansia Pesquisa com animais silvestres Endereos importantes
37 46 52 53
Princpios ticos para o uso de animais de laboratrio (COBEA)
6 APRESENTAO
A idia principal que este Manual seja impresso e distribudo s Bibliotecas da FIOCRUZ, bem como aos Laboratrios das Unidades da FIOCRUZ, para que seja usado como ponto de partida para o uso de animais e sempre que houver dvida quanto a forma de executar um determinado procedimento. Esse Manual j deveria ter sido publicado desde julho de 2007, entretanto, diversos fatores alheios vontade da CEUA e de seus membros fizeram com que isso no tivesse sido possvel. Preocupados com o respeito que temos para com todos os funcionrios que utilizam animais de laboratrio em seus trabalhos e cientes da importncia deste em um tempo onde as presses contrrias ao uso de animais se faz presente no dia-a-dia dos pesquisadores, decidimos, antes de imprimi-lo em papel, disponibiliz-lo em nossa pgina. As crticas construtivas sero muito bem recebidas. A base do Manual est agora lanada, e sua construo ser continuada a partir das idias e necessidades dos usurios de animais. Em breve, estaremos lanando a verso impressa, mas, a digital na pgina ser sempre mantida, em funo do dinamismo com que evoluem a cincia de animais de laboratrio e a biotica.
Rio de Janeiro, 02 de maio de 2008. Octavio Augusto Frana Presgrave Coordenador da CEUA Fiocruz - MS
PREFCIO
A idia de escrever este Manual partiu no s da nossa observao quanto aos maiores problemas encontrados durante a avaliao dos protocolos, como tambm pelos questionamentos por parte dos proponentes que, nos perguntavam onde conseguir uma tabela com os anestsicos ou qual a forma de eutansia que a CEUA/FIOCRUZ indicava. Estamos vivendo em uma poca em que alternativas ao uso de animais na experimentao cientfica so estudadas e onde a participao de ONGs e da sociedade cada mais intensa na defesa dos direitos dos animais. Entretanto, temos pleno conhecimento que no possvel, ainda, substituir o uso de animais em todas as reas. nosso dever orientar que mtodos alternativos sejam usados onde estes j se encontram validados, impedindo que animais sejam usados de forma equivocada. Entretanto, se faz mister que, nas reas onde no existam alternativas de substituio, os preceitos de reduo e refinamento sejam implementados. Assim, sendo, sempre que for imprescindvel o uso de animais, entendemos que estes devem ser tratados dentro da tica, de forma que sejam respeitados como seres vivos que esto contribuindo para o progresso da cincia. Da mesma forma que seres humanos tambm o fazem quando participam de um estudo clnico. A escassez de material em portugus e a diversidade de informaes disponveis em fontes internacionais ou na internet fizeram com que procurssemos reunir neste Manual os pontos mais crticos que norteassem no s o preenchimento do formulrio da CEUA, mas, tambm, os trabalhos na FIOCRUZ. Temos conscincia de que esses dados representam a mdia e no um valor absoluto, pois muitos dos parmetros dependem da idade, estado nutricional, interao de medicamentos e situaes experimentais da cada animal, entre outros fatores. Dessa forma, importante que condies diferentes sejam claramente justificadas. Da mesma forma, estamos cientes de que esse processo dinmico e, sempre que houver atualizaes, estas estaro disponveis na pgina da CEUA at que uma nova reviso do Manual seja publicada. Portanto, quando for necessrio, deve-se verificar as possveis atualizaes on line deste manual. Agradeo a todos os profissionais que j foram membros da CEUA/FIOCRUZ ao longo de sua existncia e que ajudaram a construir a forma com que trabalhamos hoje e que, sem dvida, ainda est sendo estruturada, talvez muito longe ainda da perfeio. No posso deixar de agradecer, tambm, o esforo de todos os membros atuais que, direta ou indiretamente, participaram deste Manual atravs da redao dos captulos, reviso dos mesmos, ou da participao em reunies onde discutamos quais os assuntos a serem abordados ou a melhor forma de faz-lo. Quero agradecer, em especial, a Dra. Ftima Conceio-Silva que trouxe para si o trabalho de reunir estes textos e dar a forma final deste Manual.
Cabe ressaltar que uma Comisso de tica no deve ser encarada como uma instncia punitiva ou que deseja atrapalhar o andamento das pesquisas de uma Instituio e este trabalho ratifica uma de suas misses: a de orientar os pesquisadores, acima de tudo.
Maio de 2008.
Octavio Augusto Frana Presgrave, M. Sc. Coordenador da CEUA/FIOCRUZ
9 CAPTULO 1 Octavio Augusto Frana Presgrave
BREVE HISTRICO A Comisso de tica no Uso de Animais da Fundao Oswaldo Cruz (CEUA/FIOCRUZ) foi criada em 1999, atravs da Portaria da Presidncia n 099/99-PR, de 06/04/1999 com o objetivo de que toda e qualquer atividade que envolva o uso de animais de laboratrio no mbito da FIOCRUZ deve ser previamente submetida anlise e aprovao por esta Comisso. A CEUA/FIOCRUZ foi criada a partir da iniciativa do Dr. Renato Srgio Balo Cordeiro, na poca Vice-Presidente de Pesquisa, que convidou o Dr. Marco Aurlio Martins, do Departamento de Fisiologia e Farmacodinmica (DFF) do Instituto Oswaldo Cruz (IOC), para ser o primeiro Coordenador, tendo como Vice-Coordenadora a Dra. Clia Cardoso, do Centro de Criao de Animais de Laboratrio (CECAL). Nos primeiros 6 meses de existncia, a CEUA trabalhou de forma a elaborar o seu Regulamento, que foi aprovado atravs da Portaria da Presidncia n 242/99-PR, de 19/11/1999, ocorrendo em seguida, a publicao do Regimento Interno. Alm disso, tambm trabalhou em uma forma de apresentao dos projetos, primeiramente em um formulrio escrito em MS-Word e logo em seguida, foi desenvolvido um programa atravs do qual se faz o download do formulrio diretamente da home page. A criao da CEUA/FIOCRUZ foi ao encontro da tendncia mundial de se regulamentar o uso de animais de laboratrio e se antecipou obrigatoriedade de que toda instituio de pesquisa brasileira tenha uma Comisso de tica, conforme preconizado no Projeto de Lei n 1153/95, ainda em tramitao no Congresso Nacional. importante ressaltar que a funo da Comisso de tica no punitiva, mas sim, educativa. A CEUA/FIOCRUZ teve como seu segundo Coordenador o Dr. Hugo Caire de Castro Faria Neto, tambm do DFF/IOC. Em seguida, assumiu a coordenao de Octavio Augusto Frana Presgrave MSc, do Departamento de Farmacologia e Toxicologia (DFT) do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade (INCQS). Atualmente, a CEUA/FIOCRUZ composta por 15 membros, de diferentes formaes profissionais e de vrias reas de atuao.
10 CAPTULO 2 Octavio Augusto Frana Presgrave
PROCEDIMENTOS PARA APRESENTAO DE PROTOCOLO CEUA/FIOCRUZ Os primeiros protocolos apresentados necessitaram de uma aprendizagem, tanto por parte dos proponentes para o preenchimento, quanto dos membros da CEUA para avaliar o projeto. medida que se foi tendo prtica e, com o advento do segundo formulrio, os trabalhos foram ficando mais facilitados. Cabe ressaltar que o protocolo apresentado CEUA/FIOCRUZ constitui um documento que, embora sigiloso, poder ser solicitado pelo Ministrio Pblico a qualquer momento, em funo de denncias de maus tratos aos animais, como j ocorreu. Dessa forma, h de se entender que o preenchimento completo e detalhado do mesmo representa um instrumento de defesa da Instituio e do prprio pesquisador, este ltimo, responsvel integral pelo que consta no protocolo e pela sua fiel execuo. Diante do exposto, a CEUA/FIOCRUZ tem procurado seguir regras internacionais, de modo a garantir que os aspectos ticos que envolvem cada experimento estejam preservados. Esse fato, na realidade, proporcionou uma demora na liberao de licenas, diante da necessidade de diversas anlises das exigncias feitas aos proponentes, at que o protocolo estivesse preenchido a contento. Essa demora acabou sendo alvo de crticas ao trabalho da CEUA/FIOCRUZ. Assim sendo, a partir de janeiro de 2007 a Comisso resolveu alterar sua maneira de trabalhar, visando agilizar o processo e evitar que as licenas demorem a ser expedidas. Seguem os procedimentos, trmites e comentrios das fases de apresentao de um protocolo: 1 - preencher o formulrio de apresentao e encaminhar Secretaria da CEUA/FIOCRUZ, uma cpia impressa e o arquivo gerado pelo software, em disquete ao entregar o material, a Secretaria da CEUA/FIOCRUZ emitir, imediatamente, o recibo de entrega ao proponente. Mais adiante, sero feitos comentrios sobre os pontos crticos no preenchimento do formulrio; 2 recebido o projeto, a Coordenao ir encaminh-lo para um membro, que atuar como relator. Em alguns casos, poder haver 2 (dois) relatores. No caso do relator ou da prpria CEUA/FIOCRUZ quando da discusso do projeto, sentir a necessidade da avaliao de um especialista na rea, o projeto ser encaminhado para um consultor ad hoc, que emitir um parecer para subsidiar a relatoria e/ou a deciso pelo Colegiado. Esse consultor poder ser da prpria FIOCRUZ ou externo; Observao: tanto os membros da CEUA/FIOCRUZ, quanto os consultores ad hoc assinam um Termo de Compromisso e um Termo de Conflito de Interesses, de forma que, ao no cumprirem o teor destes mesmos, estaro sujeitos s sanes previstas em Lei.
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3 Na reunio o relator expe suas observaes e as do consultor ad hoc, se for o caso. Todos os membros tm acesso ao protocolo e contribuem para o parecer do relator. 4 O protocolo pode ser enquadrado em uma das categorias abaixo: a) inadequado para anlise quando faltam dados que permitam o perfeito entendimento do projeto. Um exemplo pode ser a falta de detalhamento do Plano de Trabalho, que no permite a compreenso das etapas do projeto; b) com pendncia quando faltam dados que interferem no contedo tico, mas que no impedem o entendimento do projeto como um todo. Exemplo: no consta o calibre da agulha, no informada qual a via de sangria, no citada a condio de anestesia etc; c) aprovado quando o contedo cumpre com os preceitos ticos internacionais; d) reprovado quando no cumpre com os preceitos ticos, quer seja por relevncia cientfica que caracterize a necessidade do uso de animais, ou por no cumprimento de pendncias. 5 No caso de existncia de pendncias, o protocolo retorna ao proponente que dever responder PONTO-A-PONTO, alm de fazer as alteraes no corpo do protocolo. Cabe ressaltar que no caso de discordncia, o proponente dever apontar os motivos e subsidiar a CEUA com referncias, que sero anexadas ao processo e que serviro como justificativa para sustentao do carter tico do projeto. O proponente dever enviar as respostas das pendncias em at 30 dias, caso contrrio o projeto ser automaticamente arquivado, sendo recebido novo nmero quando da sua apresentao e seguindo todos os trmites normais. 6- Caso um protocolo seja reprovado, este poder ser reapresentado, com as modificaes sugeridas, passando por todo o trmite de um protocolo novo.
12 CAPTULO 3 Ftima Conceio-Silva
NOTAS IMPORTANTES SOBRE O PREENCHIMENTO DO FORMULRIO CEUA. Com base nas dvidas mais freqentes ao preencher o protocolo, seguem algumas indicaes de pontos que devem ser observados durante o preenchimento. preciso sempre ter em mente que o protocolo um documento legal, e como tal, deve conter todas as informaes relevantes para a compreenso dos detalhes de sua execuo. Como no Brasil ainda no dispomos de licenciamento individual para os pesquisadores, o protocolo CEUA-Fiocruz, alm de licenciar o projeto, habilita os membros da equipe a executarem as atividades a eles atribudas e definidas no protocolo. DVIDAS MAIS FREQUENTES: 1- Os animais para uso em experimentao so classificados em: a- Animais convencionais- camundongos, ratos, coelhos, cobaias e hamsters b- Animais no convencionais - qualquer animal que no pertena ao item (a) como ces, gatos, aves, peixes, primatas no humanos, animais silvestres de qualquer espcie etc. 2- Os animais no convencionais seguem regras especficas restritivas quanto ao procedimento e quantidades permitidas para a experimentao; 3- Se o projeto solicitar o uso de animais no convencionais torna-se obrigatrio o preenchimento do anexo utilizao de animais no convencionais existente no final do formulrio CEUA, assim como a apresentao de qualquer licena, documento etc., na dependncia do animal indicado; 4- Animais no convencionais silvestres requerem a licena do IBAMA, alm da licena da CEUA para que sejam utilizados em experimentao; uma licena no exclui a outra; 5- Para a utilizao de animais geneticamente modificados, mesmo que convencionais, o pesquisador responsvel deve possuir a licena do tipo CQB. A CEUA no poder licenciar projetos utilizando OGM sem a apresentao do CQB. A existncia de uma das licenas no exclui a necessidade da outra; 6- Animais aprovados para um protocolo no podero ser usados em outro protocolo. Tambm preciso lembrar que vedada a reutilizao de animais convencionais no protocolo original ou em novo protocolo; casos particulares devem ser apresentados CEUA para verificao das condies ticas da solicitao que sero verificadas caso- a- caso; Animais no convencionais a principio tambm no podem ser
13 reutilizados. No entanto, isto poder ocorrer em condies especialssimas. As solicitaes sero estudadas caso a caso; 7- Em todos os protocolos devem estar claros e indicados: a- O tipo (espcie, sexo, idade etc.) e o nmero de animais solicitados no total, especificando a necessidade de seu emprego; b- No caso de animais convencionais esta solicitao ser dividida pelo tempo de experimentao, cabendo ao solicitante especificar quantos, de que tipo e o cronograma de utilizao temporal; c- Solicitao de animais no convencionais s ser aceita com "nmero totais de animais", no importando o tempo de experimentao, mantendo-se a necessidade de especificao e indicao da necessidade; 8- No item membros da equipe devem ser fornecidos todos os detalhes que permitam a verificao da capacitao pessoal para a manipulao dos animais, e no apenas ttulos e diplomas; 9- No item base terica deve ser indicado todo o conhecimento prvio existente no assunto a ser abordado que indiquem: o estado atual do conhecimento (teoria), a propriedade da solicitao (justificativa) e os objetivos a serem alcanados; no item plano de trabalho deve estar especificado de forma clara todas as etapas do protocolo e da manipulao animal assim como o tempo de utilizao, e se for o caso as formas de manuteno (condies de biotrio), captura, soltura e eutansia. Devem tambm constar o nmero total de animais e a necessidade de repeties, quando bem embasadas. Solicita-se ainda organizar um desenho esquemtico do protocolo indicando quando e como os animais sero utilizados de forma a facilitar a verificao da manipulao completa do animal durante a fase experimental. 10- A justificativa e o objetivo devem estar bem claros. Cabe ressaltar que a relevncia cientfica do projeto est diretamente ligada aos aspectos ticos (uso desnecessrio de animais), sendo, portanto avaliada durante o trmite do projeto. Por exemplo, a repetio de experimento que seja consagrado na literatura sem justificativa plausvel, fere a tica, uma vez que no acrescenta nenhuma contribuio ao conhecimento cientfico; 11- O plano de trabalho deve retratar as etapas do experimento, quantos e quais grupos recebem imunizaes tratamentos, desafios etc. (por exemplo: os animais so divididos em 4 grupos de 10 animais sendo que o grupo 1 recebe soluo salina, grupo 2 tratamento na concentrao de 1mg/Kg, grupo 3 tratamento na concentrao de 2mg/Kg e grupo 4 recebe o veculo de diluio do frmaco. Os grupos sero tratados por VO por 5 dias. No quinto dia ser coletado sangue de 5 animais de cada grupo etc.). O plano pode ser apresentado como texto, tabela, organograma etc., desde que permita uma visualizao do protocolo como um todo e do real nmero de animais usados;
14 12- Na descrio dos procedimentos, detalhar todos os pontos (mesmo que j tenham sido mencionados no plano de trabalho). Informe dose, concentrao, via de inculos, calibre de agulhas, volume de sangue a ser coletado, intervalo entre as coletas, via, forma de imobilizao, tempo de imobilizao etc.; 13- A CEUA lembra que o importante o fluxo de manipulao (exemplo animal anestesiado, inoculado, sangrado semanalmente, submetidos eutansia aps 2 meses de experimentao). Assim, mesmo que todos os procedimentos sejam simples, a manipulao continuada e longa precisa ser avaliada, da a necessidade do esquema de manipulao. 14- Os protocolos experimentais a serem realizados com o material biolgico precisam ser indicados para a verificao da capacidade de obteno dos resultados esperados. No entanto, no h necessidade de detalhamento (exemplo: informar a realizao de resposta proliferativa e dosagem de citocinas por ELISA, mas sem dar detalhes dos protocolos a serem utilizados); 15- A CEUA solicita que, sempre que possvel, as manipulaes dos animais sejam organizadas em relao manipulao animal e no ao protocolo em si e que isto se reflita no ndice e detalhamento dos procedimentos solicitado no formulrio CEUA. Por exemplo, se determinado grupo de camundongos vai ser imunizado, depois desafiado e observado por quatro semanas para verificao de resposta imune (coleta de sangue e bao em grupos semanais), seguida de eutansia ao final, este pode ser considerado um nico procedimento, j que o mesmo animal estar sendo manipulado em todas estas fases. Evitar transformar este exemplo em 4 procedimentos (imunizao, desafio, coleta, eutansia). Se por questes prticas no for possvel, indicar no local apropriado que os animais de um procedimento esto sendo utilizados em outros procedimentos. Isto evita problemas na verificao do nmero de animais necessrios para o protocolo; 16- No caso de haver qualquer possibilidade de efeito adverso (exemplo: hematomas, toxicidade, dor, alteraes de comportamento) eles devem ser indicados de forma explicita, mesmo que raros ou improvveis. Deve-se ter em mente os efeitos causados pelo procedimento ou pelo experimento em si; 17- Todo procedimento que envolver cirurgia ou quando forem utilizados animais no convencionais deve ter um veterinrio responsvel inscrito no CRMV do local onde os experimentos sero realizados (Rio de Janeiro; Minas Gerais; Bahia etc.); 18- Nenhuma das partes do protocolo deve ser deixada em branco. Quando no couber resposta mencionar no se aplica; 19- Sempre mencionar, quando aplicvel, o desfecho (end-point) a ser utilizado para evitar o sofrimento animal. Neste caso, descrever quais parmetros sero indicativos de desfecho (exemplo: perda de peso superior a 20%, hiporresponsividade).
15 20- A CEUA-Fiocruz estimula os pesquisadores a manter um programa de enriquecimento ambiental, tanto na criao quanto na experimentao animal.
21- preciso lembrar que as normas para o uso de animais em experimentao so dinmicas e, sempre que houver atualizaes, estas estaro disponveis na pgina da CEUA at que uma nova reviso do Manual seja publicada. Portanto, quando for necessrio, deve-se verificar as possveis atualizaes on line deste manual.
16 CAPTULO 4 Joseli de Oliveira Ferreira
PRINCIPAIS VIAS E FORMAS DE ADMINISTRAO/INOCULAO EM ANIMAIS CONVENCIONAIS Neste captulo esto apresentadas de forma resumida em tabelas as principais vias de administrao / inoculao usadas na administrao de frmacos, imungenos e tambm na infeco de animais convencionais (ratos, camundongos, cobaias, hamster e coelhos). Tambm poder ser encontrado o volume mximo a agulha apropriada para cada manipulao. Cada tabela est dividida de acordo com a via, a saber: subcutnea (SC), intramuscular (IM), intraperitoneal (IP) e endovenosa (IV). As drogas administradas por via oral (VO) devem ser adicionadas junto rao ou na gua. J a administrao orogstrica (gavagem) exige a introduo da droga por tubo metlico ou cnula plstica (com protetor nas bordas para evitar ferimentos no animal) ligado seringa. O tamanho da cnula, as condies de pH, viscosidade e volume especficos de cada droga devem ser adequadas para cada animal. Os procedimentos de gavagem sero analisados caso- a- caso. Para tal, todos os detalhes da administrao (tipo, volume, freqncia, forma de conteno etc.), devem ser informados no detalhamento do procedimento solicitado no formulrio CEUA. Casos no contemplados neste manual devem ser verificados nos guidelines internacionais cujos endereos se encontram no final deste manual. Lembre-se que os volumes indicados so os mximos permitidos para o animal adulto. A utilizao de animais jovens ou recm - natos requerer a adaptao de via / dose em cada situao.
VIAS, VOLUMES E LOCAIS DE ADMINISTRAO DE DROGAS INJETVEIS EM RATOS. Subcutnea (SC) Regio nucal e dorsal 4mL/Kg 13x4.5 ou 25x5 Intramuscular (IM) Quadrceps face posterior da coxa 1.25mL/Kg 20x5.5 ou 25x6 Intraperitoneal (IP) Quadrante lateral inferior direito 5-10mL/Kg 25x6 ou 20x5.5 Intravenosa (IV) Dorsal do pnis, lateral da cauda e safena 1mL/Kg 25x5
Local
Volume mximo Agulha
Fonte: adaptado de Fantoni e Cortopassi, 1996; Waynforth e Flecknell, 1998; Harkness e Wagner 1993; Rasmussen e Ritskes-Hoitinga, 1999.
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VIAS, VOLUMES E LOCAIS DE ADMINISTRAO DE DROGAS INJETVEIS EM CAMUNDONGOS. Subcutnea (SC) Regio nucal, Dorsal e base da calda 0.5mL/animal Intramuscular (IM) Quadrceps; face posterior da coxa Intraperitoneal (IP) Quadrante lateral inferior direito Intravenosa (IV) lateral da calda, femural e retrorbital* 0.2mL/animal
Local
Volume mximo Agulha
0.2mL/animal
1mL/animal
13x4.5 ou 25x5
13x4.5 ou 25x5
13x4.5 ou 25x5
20x5,5 ou 13X4,5
Fonte: adaptado de Fantoni e Cortopassi, 1996; Waynforth e Flecknell, 1998; Harkness e Wagner 1993; Rasmussen e Ritskes-Hoitinga, 1999. * Em casos especiais utilizando drogas anestsicas
VIAS, VOLUMES E LOCAIS DE ADMINISTRAO DE DROGAS INJETVEIS EM COBAIAS Subcutnea (SC) Regio nucal, Dorsal e coxim plantar* 4mL/Kg Intramuscular (IM) Quadrceps; face posterior da coxa Intraperitoneal (IP) Quadrante lateral inferior direito Intravenosa (IV) Safena e Ceflica
Local
Volume mximo Agulha
1.25mL/Kg
5-10mL/Kg
0.5mL
25x5 ou 25x7
20x5.5 ou 25x 6
20x5.5 ou 25x 6
13x4 ou 25x 5
Fonte: adaptado de Fantoni e Cortopassi, 1996; Waynforth e Flecknell, 1998; Harkness e Wagner 1993; Rasmussen e Ritskes-Hoitinga, 1999. *Volume mximo de 0.1mL
18 VIAS, VOLUMES E LOCAIS DE ADMINISTRAO DE DROGAS INJETVEIS EM HAMSTERS. Subcutnea (SC) Regio nucal e dorsal 1mL/animal Intramuscular (IM) Quadrceps; face posterior da coxa 0.2mL/animal Intraperitoneal (IP) Quadrante lateral inferior direito 4mL/animal
Local
Volume mximo
Agulha 25x5 25x5 25x5 ou 25x7 Fonte: adaptado de Fantoni e Cortopassi, 1996; Waynforth e Flecknell, 1998; Harkness e Wagner 1993; Rasmussen e Ritskes-Hoitinga, 1999.
VIAS, VOLUMES E LOCAIS DE ADMINISTRAO DE DROGAS INJETVEIS EM COELHOS.
Local
Subcutnea (SC) Regio nucal e flanco/dorso 5mL/animal
Intramuscular (IM) Quadrceps; face posterior da coxa 2mL/animal
Intraperitoneal (IP) Quadrante lateral inferior direito 50mL/animal
Intravenosa (IV) Marginal da orelha* 10mL/Kg
Volume mximo Agulha
25x6 ou 25x7
25x6 ou 25x7
25x6 ou 25x7
25x7, 27x8 ou dispositivo intravenoso 24G
Fonte: adaptado de Fantoni e Cortopassi, 1996; Waynforth e Flecknell, 1998; Harkness e Wagner 1993; Rasmussen e Ritskes-Hoitinga, 1999. * esta via deve ser usada para pequenos volumes. Se volumes maiores forem necessrios pode-se usar a veia femoral. No entanto, tanto uma quanto outra requerem pessoal treinado, pois os acidentes so fceis de acontecer.
19 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS FANTONI, D. T; CORTOPASSI, S. R. G. Tcnicas anestsicas em animais de laboratrio. in: Manual para tcnicos em bioterismo. 2. ed. So Paulo: EPM 1996. HARKNESS, J. E.; WAGNER, J. E. Biologia e Clnica de coelhos e roedores. 3. ed. So Paulo: ROCA, 1993. RASMUSSEN, C; RITSKES-HOTINGA, M. 1999. An alternative method for rat fixation when giving subcutaneous, intramuscular and intraperitoneal infection (Camillas method). Scandinavian Journal of Laboratory Animal Science, 26 (3):156-159. WAYNFORTH, H. B; FLECKNELL, P. A. Experimental and surgical technique in the rat. 2. ed. London: Academic Press, 1998.
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CAPTULO 5
Hugo Caire de Castro Faria Neto & Belmira Ferreira dos Santos
FRMACOS USADOS EM AMINAIS DE LABORATRIO ANESTSICOS E ANALGSICOS

CONSIDERAES GERAIS: Nestas ltimas dcadas, a anestesia veterinria evoluiu bastante, e com o aumento da preocupao com o bem - estar dos animais, a necessidade do controle da dor tambm aumentou. Um dos ltimos conceitos utilizados na anestesia veterinria denominado anestesia balanceada, que se refere utilizao de diferentes frmacos associados, com intuito de conseguirmos as propriedades da anestesia (inconscincia, imobilizao, analgesia, abolio dos reflexos autonmicos e relaxamento muscular) com mnimos efeitos colaterais, principalmente nos sistemas respiratrio e cardiovascular (Ex: associar tiopental + opiide + relaxante muscular). Com relao analgesia, o que temos de mais moderno a aplicao da tcnica de analgesia multimodal, que a utilizao de diferentes frmacos analgsicos (Ex: AINEs + opiides) e diferentes tcnicas (bloqueios regionais + anestesia geral) com a finalidade de melhorarmos a analgesia do animal com mnimos efeitos colaterais e melhor conforto no ps-operatrio. Para utilizarmos as tcnicas de anestesia balanceada e analgesia multimodal essencial conhecermos a farmacologia das drogas necessrias. Em seguida esto expostas algumas propriedades dos principais frmacos utilizados em ambas as tcnicas.
Diazepam e midazolam (benzodiazepnicos) so sedativos e associados a anestsicos gerais (Ex: tiopental, propofol, etomidato e quetamina) aumentam o tempo de anestesia. Vantagem: Possuem mnimos efeitos cardiovasculares e respiratrios nas doses indicadas
21 Tiopental, propofol e etomidato (anestsicos gerais injetveis) so utilizados para induzir e manter a anestesia geral. No possuem ao analgsica logo devem ser utilizados associados com um analgsico (Ex: opiide, 2 agonista, etc). O propofol indicado em animais com problema de metabolizao (Ex: hepatopatia) e o etomidato indicado em animais com cardiopatias. Halotano e isoflurano (anestsicos gerais inalatrios) so utilizados para induzir e manter a anestesia geral. Estes frmacos podem ser administrados via mscara facial ou via traqueotubo apropriados para a espcie. A grande vantagem destes anestsicos gerais que permitem a adequao do plano cirrgico com rapidez, porm a grande desvantagem nestas espcies que necessita de um profissional atento para que no ocorra o aprofundamento drstico da anestesia. Em animais idosos mais indicada a utilizao do isoflurano. Quetamina e tiletamina (anestsicos dissociativos) so anestsicos gerais, porm possuem ao analgsica somtica (pele e msculo). Possuem como grande vantagem versatilidade de utilizarmos em diferentes vias de administrao. Aspirina, piroxicam, flunixin, ibuprofeno, fenilbutazona (AINEs) e cetoprofeno so antiinflamatrios no esterides que possuem como principal efeito a ao analgsica. Importante no controle da dor ps-operatria e para evitar o fenmeno conhecido como hipersensibilizao perifrica, que devido leso tecidual e liberao de vrias substncias inclusive as prostaglandinas. Este fenmeno promove a maior dificuldade no controle da dor. Morfina, meperidina, metadona (opiides) e cloridrato de tramadol so potentes analgsicos, sendo indicados em procedimentos mais dolorosos (Ex: Leso em uma grande rea do corpo do animal, cirurgias ortopdicas, mastectomia radical etc.). So bastante teis em evitar alteraes no sistema nervoso central (corno dorsal da medula) que promovem a hiperalgesia, alodinia e hiperpatia. Xilazina e medetomidina (2 agonistas) so potentes analgsicos que devem ser usados em cirurgias mais dolorosas. Associados aos opiides conferem uma tima analgesia para o animal.
22 Obs.: O tempo de ao destes frmacos vai depender grande parte da dose utilizada, logo para elaborar um protocolo adequado para determinado experimento, essencial sabermos o tempo de durao e o grau de dor do procedimento realizado em determinada espcie. As doses fornecidas nas tabelas servem como referncia, mas no devem ser simplesmente aumentadas visando um tempo maior de anestesia. Nestes casos imprescindvel a presena de um veterinrio. Com estas informaes possvel montar um protocolo anestsico e analgsico para determinado experimento, porm sendo de suma importncia a execuo do estudo piloto para adequarmos estas doses, se necessrio. Para avaliarmos o protocolo analgsico necessrio conhecermos a espcie que estamos trabalhando e como podemos avaliar a dor nesta espcie, pois nestes ltimos anos houve grande evoluo nos mtodos de avaliao de dor nos animais.
ANESTSICOS E TRANQUILIZANTES UTILIZADOS EM CAMUNDONGOS
Frmaco Tiopental Quetamina
Dose 25-50 mg.kg-1 50 mg.kg-1 80-100 mg.kg-1 100 mg.kg-1 50 mg.kg-1 200 mg.kg-1 5 mg.kg-1 100-200 mg.kg-1 5-16 mg.kg-1 80-100 mg.kg-1 (conteno) 23.7-33.0 mg.kg-1 11.2 mg.kg-1 12-26 mg.kg-1 Sob consulta Sob consulta
Quetamina + Diazepam Quetamina + Xilazina Tiletamina + Zolazepam (Zoletil) Etomidato Propofol Halotano Isoflurano
Via de administrao IV IP IM IP IV IM IP IM IP IP IP IV IV Sob consulta Sob consulta
Durao de anestesia 10 min
60 100 min
20 min 20 min 5.6-6.9 min Sob consulta Sob consulta
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ANALGSICOS UTILIZADOS EM CAMUNDONGOS Analgsico Aspirina (AINEs) Ibuprofeno (AINEs) Piroxicam (AINEs) Fenilbutazona (AINEs) Buprenorfina (opiide) Butorfanol (opiide) Meperidina (opiide) Dose, via e durao 20 mg.kg-1, SC, 7.5 mg.kg-1, Oral, 3.4-20 mg.kg-1, Oral 31-250 mg.kg-1, IP 2.5 mg.kg-1, IP, SC, 6-12 horas 0.05-5.4 mg.kg-1, SC, 2-4 horas 3-12 mg.kg-1, IP, SC, 2-3 horas
ANESTSICOS E TRANQILIZANTES UTILIZADOS EM RATOS Frmaco Diazepam Tiopental Quetamina Quetamina + Diazepam Quetamina + Medetomidina Quetamina + Xilazina Tiletamina + Zolazepam (Zoletil) Propofol Halotano Isoflurano Dose 5.0-15 mg.kg-1 (sedao) 20-40 mg.kg-1 40 mg.kg-1 50-100 mg.kg-1 45-60 mg.kg-1 5-10 mg.kg-1 ou 2,5 mg.kg-1 60-75 mg.kg-1 0.25-0.5 mg.kg-1 40-87 mg.kg-1 5-13 mg.kg-1 20 mg.kg-1 7.5-10.0 mg.kg-1 44-45 mg.kg.hora-1 Sob consulta Sob consulta Via de administrao SC IV IP IM IP IP IM IP SC IP, IM IP, IM IM IV bolus IV Infuso contnua Sob consulta Sob consulta 8-11 min Sob consulta Sob consulta Durao de anestesia Sedao 5-10 min
24 ANALGSICOS UTILIZADOS EM RATOS
Analgsico Aspirina (AINEs) Buprenorfina (opiide) Butorfanol (opiide) Meperidina (opiide) Xilazina (2 agonista)
Dose, via e durao 20 mg.kg-1, SC, 0.25-1.6 mg.kg-1, IP, 6-12 horas 0.04-23.3 mg.kg-1, SC, 2-4 horas 3-12 mg.kg-1, IP, SC, 2-3 horas 5-12 mg.kg-1, SC, 2 horas
ANESTSICOS E TRANQUILIZANTES UTILIZADOS EM COBAIAS Frmaco Diazepam Xilazina Quetamina Quetamina + Diazepam Quetamina + Medetomidina Quetamina + Xilazina Tiletamina + Zolazepam (Zoletil) Halotano Isoflurano Dose 2.5-5.0 mg.kg-1 5-40 mg.kg-1 40-200 mg.kg-1 60-100 mg.kg-1 5-8 mg.kg-1 40 mg.kg-1 0.5 mg.kg-1 30-44 mg.kg-1 0.1-5.0 mg.kg-1 10-80 mg.kg-1 Sob consulta Sob consulta Via de administrao IP IP IM IM IM IM ou IP SC IM IM IM ou IP Sob consulta Sob consulta Durao de anestesia Sedao Sedao mdia varivel varivel varivel
77 min
varivel Sob consulta Sob consulta
25 ANALGSICOS UTILIZADOS EM COBAIAS Analgsico Aspirina (AINEs) Buprenorfina (opiide) Morfina (opiide) Meperidina (opiide) Metadona (opiide) Dose, via e durao 20 mg.kg-1, SC, 0.5-0,8 mg.kg-1, SC, 6-12 horas 5-12 mg.kg-1, SC, IM, 2-4 horas 20 mg.kg-1, IM, SC, 2-3 horas 3.6 mg.kg-1, SC
ANESTSICOS E TRANQILIZANTES UTILIZADOS EM COELHOS
Frmaco Diazepam Midazolam Xilazina Medetomidina Tiopental Quetamina Quetamina + Diazepam Quetamina + Medetomidina Quetamina + Xilazina Quetamina + Xilazina Tiletamina + Zolazepam (Zoletil) Propofol Halotano Isoflurano
Dose 5.0-10.0 mg.kg-1 1-2 mg.kg-1 2 mg.kg-1 3-9 mg.kg-1 0.25 mg.kg-1 15-30 mg.kg-1 20-60 mg.kg-1 60-80 mg.kg-1 5-10 mg.kg-1 25 mg.kg-1 0.5 mg.kg-1 10 mg.kg-1 3 mg.kg-1 22-50 mg.kg-1 2.5-10 mg.kg-1 32-64 mg.kg-1 7.5-15 mg.kg-1 Sob consulta Sob consulta
Via de administrao IM IM, IV IP, IV IM, IV IM IV IM IM IM (administrado 30 min antes da quetamina) IM SC IV IV IM IM IM IV Sob consulta Sob consulta
Durao de anestesia Sedao Sedao Sedao Sedao varivel varivel varivel
varivel 77 min varivel varivel varivel Sob consulta Sob consulta
26 ANALGSICOS UTILIZADOS EM COELHOS Analgsico Morfina (opiide) Meperidina (opiide) Butorfanol (opiide) Buprenorfina (opiide) Flunixin meglumine (AINEs) Piroxicam (AINEs) Dose, via e durao 2.5 mg.kg-1, SC, 2-4 horas 5-10 mg.kg-1, SC, 2-3 horas 0.1-0.5 mg.kg-1 IV, 4 horas 0.01-0.05 mg.kg-1, SC, 6-12 horas 1.1 mg.kg-1, IM, 12 horas 0.2 mg.kg-1, Oral, 8 horas
ANESTESIA COMPOSTA PARA: 1- COELHOS Acepromazina 1% - 0,1mL / Kg / IM Xilazina 0,2mL / Kg / IM Cloridrato de Ketamina 50% - 0,5mL / Kg / IM Peso Animal (Kg) 1 2 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 4,5 Acepran 1% (mL) 0,1 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5 Xilazina (mL) 0,2 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 Ketamina (mL) 0,5 1,0 1,25 1,5 1,75 2,0 2,25 2,5
2- COBAIA Usar dobro da dose de coelho. 3- RATO E CAMUNDONGO Tiopental 1g diluir 5% (20mL em 1g) 0,6mL / 100g para sangria (Para manter o animal vivo usar 0,18mL / 100g) CMDG 30g 0,2 mL intraperitoneal Rato 400g 2,4 mL intraperitoneal Ketamina 50% - Xilazina 2% (mistura em partes iguais) 0,1 a 0,2 mL / 100g, caso precise prolongar, administrar metade da dose. CMDG 30g 0,03 mL intramuscular (dose mnima) Rato 400g 0,4 mL intramuscular (dose mnima)
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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS FLECKNELL, P. A. The relief of pain in laboratory animals. Laboratory Animal, 18: 147, 1984. FLECKNELL, P. A.; LILES,J. H. Assessment of analgesic action of opioid agonistantagonists in the rabbit. J. Assoc Veterinary Anaesthesia, 17: 24, 1990.
THURMON, J. C.; TRANQUILLI, W. J.; BENSON, J. G. Veterinary Anesthesia: Anesthesia of wild, exotic, and laboratory animals, Baltimore, Williams & Wilkins, 1996.686-735 p.
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CAPTULO 6
Elizabeth Malagueo de Santana
RECOMENDAES PARA A PREPARAO DE ANTICORPOS POLICLONAIS

As etapas crticas na produo de anticorpos so: 1-preparo de antgeno 2-seleo da espcie animal (idade inclusive) 3-seleo e preparo de adjuvante 4-protocolo de imunizao 5- seguimento ps-injeo 6- coleta dos anticorpos
ANTGENOS -Deve ser o mais purificado possvel contendo apenas os eptopos desejados, para produzir anticorpos de maior especificidade. -Deve ser livre de toxicidade para o animal (lipopolissacrides e resduos qumicos) -Possuir pH fisiolgico, estar estril. -Estar nas concentraes adequadas para no induzir tolerncia ou outro tipo de modulao no desejada. Segundo alguns autores, a dose usual para uma protena solvel administrada com adjuvante de Freund completo, depende da espcie animal:assim no caso de coelhos: 50-1000 g; camundongos: 10- 200 g; cabras e ovelhas 250 a 5000 g
ESPCIE ANIMAL Convm considerar o volume de anticorpo que se pretende produzir; a distncia filogentica entre o animal imunizado e o antgeno, assim como a idade do animal (devem ser adultos jovens) Vide tabela 1. Tabela 1 - Idades mais adequadas dos animais para imunizao Espcie animal Camundongo Ratos Coelhos Cobaias Galinhas Cabras Ovelhas idade 6 semanas 6 semanas 3 meses 3 meses 18-20 semanas 6-7 meses 7-9 meses
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ADJUVANTES No inicio da imunizao, escolher o adjuvante adequado pode ser difcil. O adjuvante completo de Freund (ACF), composto de uma emulso de gua em leo adicionada de Mycobacterium sp, deve ser evitado. O imungeno deve ser preparado como emulso que consiste de volumes iguais de adjuvante e antgeno (uma parte de ACF ou menos, e uma parte de Antgeno). Caso seja necessrio, deve ser utilizado apenas na primeira imunizao e o adjuvante incompleto de Freund (AIF)nas imunizaes subseqentes. Pode ser utilizado somente quando pequenas quantidades de imungeno solvel esto disponveis. Se houver disponibilidade de grande quantidade de imungeno particulado ou altamente imunognico, outros adjuvantes como TiterMax, Ribi, Lipovant, adjuvax, alhydrogel devem ser considerados. Um aspecto importante nos procedimentos de imunizao a utilizao de uma equipe tcnica competente, treinada e experiente na conteno das espcies animais sendo usadas assim como na realizao das imunizaes. Devem conhecer e reconhecer sinais de sofrimento nos animais injetados e estar capacitados para agir quando necessrio. O Adjuvante de Freund completo pode ser utilizado para inoculaes por via intramuscular, subcutnea ou intradrmica. Jamais deve ser inoculado endovenosamente ou em doses repetidas. No pode ser utilizado em cavalos. Este adjuvante produz reaes inflamatrias agudas e crnicas, abscessos estreis e /ou necrose ulcerativa no ponto de inoculao. Para limitar a severidade da inflamao aconselhvel: a) limitar a concentrao de Mycobacterium para 0,05 a 0,1 mg`/ mL. b) adicionar antgeno concentrado ao adjuvante e deste modo reduzir o volume da emulso a ser inoculado. c) Utilizar vrios pontos de inoculao afastados entre eles, com limite de volume por ponto e o nmero de pontos no deve exceder a 10. d) manter a esterilidade da soluo antignica. O adjuvante de Freund incompleto, por no conter micobactrias, produz reao inflamatria, porm de intensidade menor e de durao mais curta. Considera-se menos potente, embora seja adequado para reinoculaes, estimulando a resposta humoral. Vrios adjuvantes tm sido desenvolvidos visando provocar menos leses no animal inoculado. Entre estes, os que so uma suspenso de leo em gua e utilizam leos metabolizveis na sua composio alm de algum surfactante no inico que ativa o sistema complemento, se ligando a seus componentes facilitando assim o contato do antgeno com as clulas dendrticas foliculares (TiterMax) Outros, so misturas de leo metabolizvel, detergente e imunoestimuladores Como imunoestimuladores, utilizam-se produtos bacterianos modificados que minimizam a reao inflamatria (Adjuvante de Ribi). Os sais hidrxido e fosfato de alumnio so misturados ao antgeno formando uma mistura aquosa. Os gis de hidrxido de alumnio alm de serem livres de pirgenos e estveis, possuem alta capacidade de ligao com protenas a pH neutro. Alguns autores os consideram como o adjuvante para antgenos fracos, mais eficientes que o ACF; porm requer de reinoculaes mais freqentes. Nas vacinas humanas o adjuvante de escolha.
30 Tabela 1- IMUNIZAO: VIAS MAIS UTILIZADAS PARA INJEO PRIMRIA E REINOCULAES (BOOST) Leenars 1999,Leenars et al,2005 Vias Subcutnea. Recomendado para usar com adjuvantes oleosos para aproveitar o efeito depsito. Processos inflamatrios podem ser visualizados.Usar com e sem adjuvante.Usar em primo inoculao e "boosters" Distribua em mximo 4 pontos Intramuscular Absoro rpida, especialmente na atividade muscular. Pode ser administrado em volumes grandes segundo o animal. No pode usar com adjuvantes viscosos (ACF) em roedores. Pode usar na primo e reinoculaes Observaes desvantagens
Absorve lentamente
Volumes grandes em espaos restritos provocam dor. Antgeno e adjuvante podem infiltrar nos planos interfasciais e danificar o nervo citico
Intraperitoneal
Via eficiente para exposio de antgenos. No usar adjuvantes oleosos. No recomendada em coelhos e animais maiores H rpida distribuio do Antgeno e pode ser metabolizado rapidamente O antgeno enviado primeiramente para o bao e depois para os linfonodos
A inoculao de adjuvantes oleosos provoca peritonite. Risco de choque anafiltico no "boost"
Endovenosa
Risco de choque anafiltico no "boost". Antgenos insolveis, adjuvantes viscosos ou oleosos no podem ser usados sob risco de embolia.
Intradrmica
H processamento eficiente do antgeno devido abundncia de clulas de Langerhans Pequenas quantidades de antgeno so suficientes. Recomendada s para animais maiores (coelhos, cabras, cavalos).
Injeo em espao limitado da pele provoca dor. Adjuvantes oleosos provocam processos ulcerativos.
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REINOCULAES. Estmulos antignicos repetidos permitem a estimulao dos linfcitos de memria que produzem anticorpos de maior afinidade. Porm algumas precaues devem ser observadas: 1. As reinoculaes devem ser feitas quando o teor de anticorpos circulantes tenha atingido o declnio (2-3 semanas para antgenos solveis). Estmulos antignicos em prazos curtos podem induzir tolerncia. 2. Quando utilizar adjuvantes que formam depsito, administrar os boost pelo menos 4 semanas aps o primeiro inculo. Use o mximo de 2 ou 3 reinoculaes. 3. No utilizar adjuvante completo de Freund, pois podem provocar leses teciduais severas. 4. Injeo endovenosa em animal j imune pode provocar morte do animal por choque (imunocomplexos circulantes). ANTICORPOS MONOCLONAIS EM CAMUNDONGOS Na produo de anticorpos monoclonais, devem ser observadas as seguintes recomendaes: Imunizao in vivo: seguir os procedimentos indicados para anticorpos policlonais. Dependendo do antgeno, possvel fazer uso de imunizaes repetidas com intervalos curtos, eliminando a necessidade de adjuvantes, porm deve ser considerado que pode induzir a produo de anticorpos de baixa afinidade. Produo de ascites: "Priming": Utilizar mximo de 0,3 mL de adjuvante de Freund incompleto em uma s injeo. Pristane no recomendado Implantao de hibridomas: Injetar at 3x106 em 1 mL na cavidade intraperitoneal. A partir daqui o animal deve ser monitorado para evidenciar sofrimento: dificuldade respiratria, diminuio de atividade, pelo eriado, tamanho do abdmen. O acmulo de lquido asctico alm de produzir aumento no peso total, no deve produzir dor ou desconforto aos animais. De nenhum modo podem exceder mais que 20% do peso de um animal normal. Coleta de lquido asctico: Para realizar a paracentese, o animal deve estar anestesiado. Podem ser realizadas no mximo duas coletas em condies asspticas com agulha 25x8 ou 25x7. O volume que pode ser retirado na primeira paracentese de 4-5 mL e deve ser realizado em condies asspticas.
32 Tabela 2 VOLUME MXIMO (mL) A SER INOCULADO EM ANIMAIS SEGUNDO O TIPO DE ADJUVANTE UTILIZADO (adaptado de Leenaars, 2005). Mistura antgeno+adjuvante oleoso Mistura antgeno+adjuvante aquoso ou viscoso animal s.c i.d s.c i.d i.m i.p i.v Camundongo Volume (mL) Agulha Ratos Volume (mL) Agulha Cobaias Volume (mL) Agulha Coelhos Volume (mL) Agulha Ovelhas, cabras Volume (mL) Agulha Bezerros Volume (mL) Agulha Aves Volume (mL) Agulha XX no recomendado
0.1 25x5 - 0,2 - 25x5 0.2 25x5
XX
0.5 13x4,5 0.5-1.0 13x4,5 1.0 13x4,5 1.5 13x4,5
XX
XX
1.0 13x4,5 5.0 25x5 5.0-10 25x5 10-20 25x7
0.2 13x4,5 0.5 13x4,5 0.5-1.0 13x4,5 1.5 13x4,5
XX
XX
XX
XX
XX
XX
0,10.0250,25 0.05 13x4,5 25x5 0.5 0.05 13x4,5 0,25 25x5 0.5 0.05 13x4,5 25x5 0.25 0.05 13x4,5 13x4,5
0.05 13x4,5
0.20.5 25x7 0.2.0 25x8
2.0 13x4,5
0.05 13x4,5
XX
30 40x12
2.0 13x4,5 0.5 13x4,5
0.05 13x4,5 0.05 13x4,5
2.0 25x8 1.0 25x8
XX
No testado 0.5 25x7
XX
Bibliografia principal Canadian Council on Animal Care- Guidelines on: Antibody production http://www.ccac.ca.(consultado em Maio de 2006) Leenaars M. ;Henrdriksen CFM 2005- Critical steps in the production of polyclonal and Monoclonal Antibodies: Evaluation and recommendations .ILAR Journal 46(3):269-279.
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CAPTULO 7
Octavio Augusto Frana Presgrave & Belmira Ferreira dos Santos
SANGRIA INTRODUO Diversos estudos necessitam que seja realizada a coleta de sangue para verificar alteraes hematolgicas ou outros parmetros necessrios ao entendimento, avaliao e concluso da pesquisa. Todo pesquisador deve ter a conscincia de que essa coleta representa, em diferentes graus, um estresse para o animal, seja pelo procedimento em si ou pelo uso de anestsicos. Tambm altamente recomendvel que o operador seja treinado e tenha conhecimento da anatomia do animal, de forma a localizar o vaso correto definido pelo protocolo e de forma rpida e precisa. importante que os mtodos sejam refinados de forma que necessitemos coletar apenas pequenos volumes de sangue. Entretanto, existem situaes crticas onde o pequeno tamanho dos animais influencie no volume ou freqncia da coleta. Neste caso, no se deve colocar em risco o bem estar dos animais, nem usar um nmero maior dos mesmos. A necessidade de coleta freqente de sangue deve levar em considerao a possibilidade de uso de cnulas, que substituiria as punes repetidas. No caso de se aquecer o animal, deve-se tomar cuidado para evitar hipertermia, que se manifesta com sinais, tais como, aumento da freqncia respiratria e salivao. No se recomenda o uso de dilatadores (p.ex. xilol), tendo em vista que causam irritao cutnea. Ressalta-se a necessidade da assepsia do local onde ser procedida a coleta.
SANGRIA VENOSA Volumes at 0,1 mL Deve-se puncionar uma veia superficial. Em geral, no necessita anestesia, uma vez que esta submeteria o animal a um estresse maior do que o causado pelo uso de uma agulha, por exemplo. Em geral, pequenos animais podem ser sangrados pela veia caudal (coccgea). Camundongos, ao contrrio dos ratos, podem ter a extremidade da cauda amputada para coleta de sangue, uma vez que no oferece risco de eliminao de vrtebra. Recomenda-se
34 o corte na cauda, no mximo, duas vezes. Como alternativa, pode-se retirar o tampo cicatricial para nova coleta. Pequenos animais sem cauda (cobaias e hamsters) podem ter o sangue coletado pela veia jugular ou da orelha, sendo que esta ltima necessita de grande habilidade. Em animais grandes podem-se usar veias superficiais. Os locais recomendados para sangria se encontram na tabela 1. Volumes acima de 0,1 mL Normalmente se consegue coletar essas quantidades de sangue de animais maiores sem o uso de anestesia, entretanto, em animais menores, uma anestesia de curta durao pode ser necessria, sempre levando em considerao que seu uso poder afetar parmetros hematolgicos ou bioqumicos. Deve-se ter especial ateno ao calibre da agulha, pois, um calibre pequeno pode provocar coagulao e um calibre maior pode danificar o vaso. Em alguns casos, a dilatao do vaso por obstruo suave ou aquecimento poder facilitar a coleta. Os locais recomendados para sangria se encontram na Tabela 1.
CONSIDERAES GERAIS 1) A coleta de sangue pelo plexo orbital no recomendada quando h a recuperao do animal. Coletas repetidas por esta via somente justificvel quando no for possvel o uso de outro mtodo. Este tipo de coleta dever ser realizado, sempre, com o uso de anestsico local (colrio anestsico). Ao final deve-se aplicar pomada oftlmica. 2) O volume mximo de coleta de sangue em uma s ocasio de 10% do volume total. Acima desse percentual, surgiro complicaes que podero levar o animal a alteraes significativas, choque e at morte. A coleta de 10% do volume de sangue somente poder ser repetida depois de 3 a 4 semanas. Se houver necessidade de coletas repetidas, em intervalos mais curtos, no mximo 1% do volume de sangue poder ser retirado a cada 24 horas. O volume mdio de sangue circulante para cada animal se encontra na Tabela 2.
3) A puno cardaca dever sempre ser realizada sob anestesia. Quando se aplica este procedimento com fim terminal, dever se assegurar o bito ps-exsanginao pela administrao de uma sobredose de anestsico. A puno cardaca repetida no recomendada, mas, se necessria, dever ser cuidadosamente justificada em funo de seus efeitos adversos. Neste caso, dever se dar preferncia canulao de longa durao.
TABELA 1 PRINCIPAIS VIAS DE COLETA DE SANGUE EM ANIMAIS CONVENCIONAIS E NO CONVENCIONAIS EM EXPERIMENTAO. Veia Veia Cava Ceflica Veia Marginal Veia da Orelha Femoral Puno Cardaca X X X X X Veia Jugular X Seio Orbital X X X Veia / Artria Caudal X X Veia Corte na da Cauda Asa X X
Rato Camundongos Cobaia X X Coelho X Hamster X X X PNH X X Co X X X Gato X X X Aves X X Gamb X X Bovinos X X Pq. Ruminantes X X Furo X X X X Gerbil X X X Porco X X Peixes X X R X Serpentes X Tartaruga X X Adaptado de Manual sobre al cuidado y uso de los animales de experimentacin, do Conselho Canadense de Proteo aos Animais.
TABELA 2 VOLUME DE SANGUE CIRCULANTE EM ANIMAIS CONVENCIONAIS E NO CONVENCIONAIS ADULTOS, SADIOS E ALIMENTAO ADEQUADA.
mL/kg Gato 47-66 Gado 60 Frango 60 Co 79-90 Furo 75 Gerbil 67 Cabra 70 Cobaia 67-92 Hamster 78 Cavalo 75 Camundongo 78-80 Porcos 65 PNH* 54 Coelho 44-70 Rato 50-70 Ovelha 60
*PNH - primatas no humanos
REFERNCIAS Morton DB, Abbot D, Barclay R, Close BS, Ewbank R, Gask D, Heath M, Mattic S, Poole T, Seamer J, Southee J, Thompson A, Trussel B, West C, Jennings M. (1993) Removal of blood from laboratory mammals and birds. Laboratory Animals 27:1-22. Canadian Council On Animal Care (1998). Manual sobre el cuidado y uso de los animales de experimentacin. v.1 Extrado de: http://www.ccac.ca/en/CCAC_Programs/Guidelines_Policies/GUIDES/SPANISH/toc_v1.h tm
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CAPTULO 8
Ftima Conceio-Silva & Celina Bessa EUTANSIA
PRINCPIOS GERAIS Eutansia (eu=bom; thanatos= morte) palavra de origem grega que significa morte serena, sem sofrimento. considerada a forma correta de interromper procedimentos experimentais quando detectado qualquer tipo de reao adversa, ou ao final de uma experimentao, mesmo que bem sucedida. Pelas normas ticas, a no ser em casos especficos e excepcionais, animais no devem ser reutilizados. Evitar o sofrimento, minimizar o desconforto e dor durante qualquer procedimento envolvendo o uso de animais em experimentao um compromisso do pesquisador. A determinao do momento da eutansia deve levar em considerao o protocolo experimental e o bemestar do animal. A escolha dos protocolos deve contemplar o maior benefcio, o melhor resultado, com a utilizao do menor nmero de animais possvel. A eutansia deve ser realizada por mtodo que produza inconscincia com analgesia rpida e morte subseqente, sem nenhuma evidncia de dor ou agonia do animal. Neste contexto, a escolha do mtodo deve tambm evitar a excitao do animal, ser irreversvel, produzir o mnimo de conteno, alm de ser apropriado para a idade, espcie e estado de sade do animal. Tambm no pode ser esquecida a necessidade de segurana fsica e emocional para o pesquisador. A realizao da eutansia requer pessoal treinado e experiente, bem estruturado emocionalmente, consciente da importncia do procedimento. No permitida a realizao do procedimento por menores de idade. O mtodo deve reproduzir o menor impacto na natureza e ser realizado em local apropriado, longe da rea onde outros animais so mantidos. Por fim o mtodo escolhido, dentro destes parmetros, no deve resultar em modificaes biolgicas, histolgicas ou outras incompatveis com o protocolo experimental. Mesmo levando-se em considerao as particularidades de algumas espcies como a paralisao de coelhos e galinceos frente a situaes de estresse, alguns sinais podem ser considerados gerais para a maioria dos animais usados em experimentao. Dentre eles podemos citar como indcio de sofrimento: vocalizao, tentativa de fuga, agresso defensiva, salivao, emisso de fezes e urina, midrase, taquicardia, sudorese, tremores, espasmos musculares. Por ltimo, importante reafirmar a necessidade de local especfico para a realizao do procedimento, j que a vocalizao e a liberao do contedo de glndulas de odor ou a secreo de ferormnio pode ser sentida por outros animais levando a situao de angstia desnecessria. A morte do animal deve ser confirmada por apnia seguida de parada cardaca. preciso lembrar que a apnia por si s no significa morte, pois muitos medicamentos produzem apnia com manuteno de contrao cardaca.
38 ALGUNS EXEMPLOS E ESCLARECIMENTOS SOBRE MTODOS DE EUTANSIA (para detalhamento ver tabela ao final deste captulo) Dependendo da espcie animal e do protocolo de experimentao vrios modos de eutansia podem ser indicados (detalhamento apresentado abaixo). No entanto, de um modo geral podemos classificar a eutansia em qumica e fsica. Como mtodo fsico podemos citar: a utilizao de trauma fsico cerebral, eletrocusso e decapitao. So usados em situaes particulares, principalmente em casos em que a administrao de drogas pode alterar a obteno de resultados. Estes mtodos devem ser evitados. A eutansia por meios fsicos deve ser feita por pessoal bem treinado, pois, se no houver preciso pode acarretar sobrevida temporria com sofrimento animal. Para sua aprovao o responsvel deve demonstrar de maneira inequvoca que outro mtodo no pode ser aplicado. Desta forma, sua utilizao restrita a casos muito especficos e devem ser analisados de forma individual podendo no ser aceita nas condies propostas. O deslocamento cervical usado para aves, pssaros, alguns rpteis e anfbios, alm de camundongos. rpido e eficaz e pode ser obtido por trao ou presso sobre a regio da nuca. Ocorre parada respiratria imediata seguida de hipxia e parada cardaca. Algumas vezes nestes casos, podem ser observados efeitos de contrao muscular que esto associados despolarizao das clulas nervosas e no presena de dor ou estresse. A decapitao s aceita em peixes de pequeno porte, alm de roedores recm natos, pois nestes casos os animais so resistentes s drogas tanto injetveis quanto inalantes. Neste grupo, as terminaes nervosas ainda no so completas e a sensao dolorosa diminuda ou ausente. A utilizao em outros animais / faixas etrias no permitida. A eletrocusso produz depresso cerebral direta e parada crdio respiratria imediata, se usada na dosagem correta que pode variar com a espcie do animal, idade, peso etc. No entanto, comumente vem acompanhada de contraes musculares involuntrias. Devido dificuldade de execuo e ao efeito adverso observado este mtodo no indicado em nosso meio. A eutansia por exsanguinao no permitida sem uma prvia sedao. Em adio, mesmo nestes casos s permitida quando comprovada a necessidade de coleta de amostras de sangue em quantidades que no possam ser obtidas por outros meios. Deve ser realizada por pessoal capacitado, pois requer preciso e rapidez de execuo. A aprovao s poder ocorrer se a justificativa for consistente e de acordo com as normas internacionais vigentes. A prtica de traumatismo crnio enceflico apesar de constar dos guias internacionais fortemente desaconselhada, pois sua aplicao exige preciso e a possibilidade de falha na aplicao do mtodo no compensa a rapidez. De um modo geral, a eutansia qumica deve ser o mtodo de escolha. Estes mtodos tm como base a aplicao de superdosagem de frmacos que gerem inconscincia (ausncia de reflexo pupilar, caudal e outros) e analgesia rpida seguidas de parada crdio respiratria. As substncias mais comumente empregadas so os barbitricos e os anestsicos. A via de administrao mais eficaz a endovenosa, podendo ser substituda em algumas espcies pela via intraperitoneal nos caso de dificuldade de obteno de acesso venoso. Na avaliao da escolha do mtodo mais apropriado em cada protocolo preciso levar em considerao: a espcie de animal, a rapidez, eficcia, a compatibilidade com a
39 obteno de resultados e a segurana para o operador. Desta forma, apesar de ser possvel a utilizao de um nmero variado de mtodos de eutansia, as condies gerais devem sempre ser observadas. A seguir resumiremos alguns detalhes sobre os agentes qumicos mais comumente empregados e cujas especificaes podem tambm ser encontradas no captulo sobre analgesia / anestesia. Para a eutansia de animais de pequeno porte considerados no convencionais (ver classificao dos animais usados em experimentao constante neste manual) como ces, gatos, alguns animais de sangue frio e primatas no humanos, o uso de sedao (xilazina / quetamina / diazepnicos / acepromazina) seguida por superdosagem de derivados do cido barbitrico como o pentobarbital e o tiopental so os mais indicados devido facilidade de aplicao, aliada a ao rpida e grande eficcia. Quetamina isolada no deve ser usada pela dificuldade de verificao do efeito de sobredose. A ao dos barbitricos se inicia por uma depresso profunda e rpida dos centros respiratrios levando apnia seguida de parada crdio respiratria. De forma geral a dose para a eutansia deve ser calculada com base no peso do animal e situa-se entre trs a quatro vezes a normalmente empregada para anestesia / sedao (para detalhes consulte captulo referente). A via de escolha a endovenosa e, na impossibilidade desta pode-se usar a via intraperitoneal. A exceo so animais aquticos que, dependendo do tamanho podem receber a droga diluda na gua em que esto sendo mantidos. Animais de porte maior como eqinos e candeos maiores tambm so sedados e a seguir submetidos a uma superdosagem de barbitricos (tiopental sdico). Em alguns casos, depois de obtida a anestesia pode-se acelerar o procedimento com a injeo de soluo saturada de sulfato de magnsio \ cloreto de potssio, sempre resguardado o bem estar do animal e a obteno dos resultados sem interferncia das drogas para eutansia. No se recomenda a utilizao de anestsicos inalatrios como o halotano, isofluorano devido a potencial capacidade de produzir acidentes nos profissionais responsveis pela manipulao. Um dos mtodos mais empregados a inalao de gases no anestsicos. Devido periculosidade para o operador (hepatotoxicidade, cardiotoxicidade e/ou carcinognese) e as reaes irritativas no animal o uso de ter e clorofrmio proibido. Em adio, o ter inflamvel e explosivo podendo causar acidentes graves. Carcaas embebidas em ter no podem ser incineradas ou autoclavadas sem haver eliminao prvia dos resduos. Atualmente o CO2 o gs aceito como de melhor eficcia / rapidez para a eutansia de animais de pequeno porte como camundongos e outros pequenos roedores. Animais maiores como coelhos, podem ser eutanasiados com CO2 contanto que recebam pr anestesia como xilazina / diazepan, midazolan, entre outros. A forma ideal de administrao a utilizao de cmaras apropriadas com vlvulas para controle da entrada de gs e com vedao eficiente. A administrao deve ser lenta para que o animal entre em narcose antes da parada cardio respiratria. Fluxos muito intensos podem causar estresse desnecessrio levando a agitao, eliminao de urina e fezes e outros sinais de desconforto. Concentraes em torno de 40% no interior da cmara levam a sedao seguida de anestesia e morte neste grupo. Outros animais como ces e gatos podem necessitar de doses maiores (60%). Este tipo de eutansia tambm pode ser empregado para outros animais desde que resguardas as particularidades de cada um. No esquecer que animais recm natos podem ser resistentes a esta forma de eutansia. Animais que podem viver em condies de anaerobiose relativa como peixes e anfbios so normalmente resistentes a este processo. Estudos j publicados tm demonstrado no haver nenhuma
40 repercusso de alterao de tecidos que contra indique sua utilizao na maioria dos experimentos realizados em laboratrios de pesquisa. Pssaros podem ser eutanasiados por inalao de CO (monxido de carbono) comprimido em cilindros. No so aceitas outras formas de emisso de CO. Este agente tambm no recomendado devido potencialidade de produo de acidentes. Outra droga no permitida o cianeto de potssio, pois sua utilizao leva ao aparecimento de convulses e contraturas antes da morte. Lembramos que algumas drogas podem ser extremamente eficazes num grupo de espcies e completamente contra indicadas em outras. Deve-se tomar especial ateno a animais que foram previamente tratados com agentes paralisantes como o curare, succinilcolina, sulfato de nicotina etc., pois neste caso a ausncia de reflexos ou mesmo a depresso respiratria no necessariamente significam inconscincia e por isto o animal pode estar sensvel a estmulos dolorosos sem, contudo conseguir promover reaes que exteriorizem esta condio. De forma resumida, a escolha do procedimento de eutansia deve levar em considerao a espcie animal (tipo, idade, peso etc.), as condies experimentais e a prtica do operador. De todos os mtodos aqui exemplificados os mais aceitos so a inalao de CO2 e a superdosagem de barbitricos. Ao submeter um projeto em cujo protocolo seja necessria a utilizao da eutansia, o pesquisador deve fornecer todos os detalhes para que a eficincia, propriedade e condies do procedimento possam ser avaliadas. Sempre que necessrio, os procedimentos podero ser questionados e alternativas propostas. Os critrios para a utilizao de eutansia na presena de efeitos adversos devem estar claramente explicitados (end point).
DESCARTE DOS ANIMAIS APS EUTANSIA Mesmo que no tendo sido infectado por nenhum agente patognico durante a experimentao, os animais devem ser considerados como potencialmente infectados. De forma geral, animais de pequeno porte devem ser autoclavados para posterior descarte em lixo biolgico destinado incinerao. Animais de porte mdio e grande devem ser enviados a fornos crematrios, devidamente embalados e identificados de acordo com as normas de biossegurana existentes no Campus. Alternativamente, na impossibilidade de uso de autoclave, os animais podem ser formolizados por exposio de vsceras a aplicao de formol 10%. No entanto, preciso frisar que este mtodo no recomendvel devido gerao de resduos txicos e sua utilizao em nossa Instituio deve ser abolida o mais breve possvel.
ALGUNS GRUPOS DE ANIMAIS E SEUS MTODOS DE EUTANSIA Ver tambm resoluo n. 714 de junho de 2002 Conselho Federal de Medicina Veterinria Alguns animais devem ser submetidos eutansia sob a responsabilidade de um mdico veterinrio.
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Mtodo de eutansia
CO2
Roedores e coelhos pequenos
Roedores e coelhos maiores
Ces e gatos
Mtodo de escolha (dependendo do peso), alguns grupos consideram que mesmo animais pequenos devem ser submetidos s superdosagem de barbitricos. Superdosagem de Mtodo de escolha barbitrico (EV ou IP) Superdosagem de Mtodo de escolha anestsico Exsanguinao em Outro mtodo animal anestesiado aceitvel KCl EV em animais Outro mtodo previamente aceitvel sedados Decapitao Apenas em recmnatos de roedores Deslocamento Aceito para cervical camundongos Aceito para recm Crioeutansia de (nitrognio lquido - nato camundongos e N2) ratos, alm de peixes pequenos
Mtodo de escolha No aceito (dependendo do peso). Animais maiores que 1 kg devem ser submetidos superdosagem de barbitricos Mtodo de escolha Mtodo de escolha (apenas por via EV) Mtodo de escolha
Mtodo de escolha Outro aceitvel Outro aceitvel No aceito No aceito No aceito
mtodo No aceito mtodo Outro aceitvel No aceito No aceito No aceito mtodo
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Mtodo de eutansia
CO2
aves
Mtodo aceitvel
peixes
Mtodo aceitvel
Rpteis e anfbios
Mtodo aceitvel desde que o animal no seja resistente ao CO2 Mtodo de escolha Mtodo de escolha No utilizado
Superdosagem de Mtodo de escolha Barbitrico EV Superdosagem de Mtodo de escolha anestsico Exsangunao em Mtodo aceitvel animais anestesiados Decapitao Mtodo aceitvel
Mtodo de escolha Mtodo aceitvel No utilizado
Mtodo de escolha Aceitvel em exemplares dependendo pequenos espcie
da
Mtodos de eutansia
CO2 Superdosagem barbitricos EV Aps sedao Superdosagem anestsicos Aps sedao Outros mtodos
Primatas no humanos
No aceitvel de Mtodo de escolha
de Mtodo de escolha
No aceito
43 DETALHAMENTO Usar sempre a via endovenosa ou intraperitoneal, com veculo na temperatura ambiente, agulha de calibre apropriado para cada espcie assim como volumes apropriados (ver captulo referente a inoculaes). A dosagem, se no especificada, deve ser de trs a quatro vezes a dose usada para anestesia (vide tabelas no captulo anestesia / sedao constante neste guia de procedimentos).
animal
Especificaes e pr-tratamento
adultos
Mtodo de eutansia de escolha*1

CO2 (40% em ar atmosfrico com administrao lenta) seguido de deslocamento cervical
observaes
Camundongos
camundongos
Recm-natos, embries ou fetos. Hamster / gerbil e Se necessrio usar similares sedao prvia com xilazina ou diazepan. Ratos Se necessrio, sedao prvia com xilazina ou diazepan cobaias Sedao prvia com xilazina ou diazepan
Decapitao/ crioeutansia CO2 (40% em ar atmosfrico com administrao lenta) CO2 (40% em ar atmosfrico com administrao lenta) Superdosagem de tiopental sdico
Superdosagem de anestsicos e barbitricos podem ser usadas principalmente no caso de necessidade de sangria branca; tambm aceito o deslocamento cervical, se realizado por pessoal treinado. So resistentes ao CO2
coelhos
Sedao prvia com Superdosagem diazepan, midalzolan, tiopental sdico xilazina.
Outros roedores, usados em laboratrio. Outras espcies de roedores de origem silvestre*2
Acepromazina quetamina Acepromazina quetamina
+ Superdosagem tiopental sdico + Superdosagem tiopental sdico
Considerar superdosagem anestesia ou tiopental sdico Considerar superdosagem anestesia ou tiopental sdico Pode-se fazer sangria branca sob anestesia. Nestes casos deve-se verificar a morte do animal de Pode-se sedar o animal e fazer sangria branca. Nestes casos deve-se sempre aplicar uma superdose de barbitrico aps para ter certeza da morte do animal de CO2 (40% em ar atmosfrico com administrao lenta) de CO2 (40% em ar atmosfrico com administrao lenta)
44 Outros animais Obrigatrio o prsilvestres *2 tratamento com sedao do animal Primatas no Sedao com humanos qualquer quetamina + diazepan porte Aves Em determinadas condies CO2 pode ser aceito Superdosagem de -------------barbitricos (como o tiopental sdico) Superdosagem de Ajustar a dose ao porte tiopental sdico do animal de Pode-se sedar o animal e fazer sangria branca. Nestes casos deve-se sempre aplicar uma superdose de barbitrico aps, para ter certeza da morte do animal barbitricos CO2 barbitricos CO2 Decapitao Alternativamente peixes (pequenos) ou muito pequenos podem anestsicos como ser eutanasiados com a benzocana (maiores) diluio do anestsico na gua do aqurio Superdosagem de -----------tiopental sdico EV Superdosagem de -----------tiopental sdico EV Superdosagem tiopental sdico
anfbios rpteis peixes
----------------------Observar o tamanho do animal
Ces Gatos
Acepromazina quetamina Xilazina acepromazina quetamina
+ ou +
*1- de acordo com determinados protocolos, e por solicitao do responsvel, a CEUA poder avaliar outros mtodos. A deciso ser tomada caso a caso, levando-se em considerao o custo benefcio e o bem estar animal. *2- animais silvestres devem ter licena do IBAMA para captura, transporte, criao e eutansia. A no ser em casos excepcionais, avaliados um a um, animais silvestres no podem ser introduzidos no Campus e toda a manipulao, inclusive eutansia, deve ser feita em local apropriado prximo s reas de captura. As carcaas podem ser taxidermizadas (para depsito em coleo) ou formolizadas e encaminhadas para incinerao. Os tecidos e secrees obtidos devem ser condicionados e transportados de acordo com as normas de biossegurana do Campus.
REFERENCIAS CANADIAN COUNCIL ON ANIMAL CARE- http://ww.ccac.ca CCAC, guide volume 1 (2nd edition), 1993
45 American Society Of Ichthyologists And Herpetologists, The Herpetologists' League, And The Society For The Study Of Amphibians And Reptiles. Guidelines For The Use Of Live Amphibians And Reptiles In Field Research. J. Herpetol. 1987; 4 (Suppl.): 1-14. American Society Of Ichthyologists And Herpetologists, American Fisheries Society, American Institute Of Fisheries Research Biologists. Guidelines For The Use Of Fishes In Field Research. Copeia (Suppl.) 1987: 1-12. American Veterinary Medical Association. 1993 Report Of The AVMA Panel On Euthanasia. J. Am. Vet. Med. Assoc. 1993; 202(2): 229-249. http://www.nature.com/nature/journal/v441/n7093/full/441550a.html http://www.nature.com/nature/journal/v441/n7093/full/441570a.html Resoluo n 714, de 20 de junho de 2002 do Conselho Federal de Medicina Veterinria. Disposio sobre os mtodos de anestesia e eutansia em animais
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CAPTULO 9
Norma Labarthe & Etelcia Moraes Molinaro PESQUISAS COM ANIMAIS SILVESTRES
Animais Silvestres - todos aqueles animais pertencentes s espcies nativas, migratrias e quaisquer outras, aquticas ou terrestres, que tenham todo ou parte de seu ciclo de vida ocorrendo dentro dos limites do territrio brasileiro, ou em guas jurisdicionais brasileiras. Ampliando a abrangncia de proteo conferida fauna silvestre, inclui-se tambm a proteo dos seus ninhos, abrigos e criadouros naturais, considerados propriedade do Estado. Para os fins operacionais, excetuam-se dessa definio os peixes, crustceos e moluscos susceptveis a pesca e que so regidos por normas especficas. http://www.ibama.gov.br/fauna/conhecimentos.php A CEUA entende que os pesquisadores devero atender legislao vigente em todas as etapas de seus trabalhos, portanto, trabalha para que a tica e a legislao sejam respeitadas em todas as suas dimenses. Informamos que todas as atividades com animais silvestres devem estar em consonncia com as diretrizes da Comisso de Biossegurana/Fiocruz, bem como com a documentao exigida pelos organismos reguladores, tais como o IBAMA, Institutos Ambientais Estaduais ou Municipais, de colees biolgicas cientficas e Conselho de Gesto do Patrimnio Gentico (CGen). A aprovao da CEUA no exclui a necessidade destas aprovaes e licenas para a realizao dos procedimentos, sendo os proponentes responsveis por suas aquisies antes de iniciar seus trabalhos.
DETALHAMENTO DOS PROCEDIMENTOS DE: Captura: Devero ser sempre detalhadas armadilhas (fabricante, modelo, dimenses e material, incluindo calibre da tela ou grade e isca a ser utilizada) ou pus (material, dimetro da boca, trama da tela etc.). Quando o animal for capturado por procedimento qumico (arma ou zarabatana) deve-se observar a distncia provvel entre o operador e o animal, porte fsico, (espcie pretendida e possvel distrbio na comunidade silvestre local). Tambm dever constar o tipo, volume e concentrao do componente
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qumico a ser usado, alm do tempo mdio de conteno, formas de controle de sedao e da recuperao do animal. Alm disso, a descrio do nmero de armadilhas e do tempo que cada armadilha permanecer no local, alm do intervalo entre sua colocao e visitas subseqentes, nmero de expedies no mesmo local e avaliao do estoque gentico, devero permitir que o leitor tenha plena percepo de cada etapa a ser executada, inclusive com a informao de tempo mdio de cativeiro antes do recolhimento/ soltura do animal. Nesta descrio devero ser detalhados os procedimentos especiais em casos de injrias e traumatismos sofridos pelos animais capturados ou no caso captura de animais gestantes ou filhotes. Deve-se evitar a utilizao de fmeas de qualquer faixa etria. Manipulao: Devero ser detalhados cuidados com o transporte dos animais capturados e que incluam se o animal ser retirado da armadilha, se ser transportado sob sedao e como ser o deslocamento base de campo. Qualquer conteno qumica dever ser cuidadosamente detalhada. Todos os procedimentos realizados com os animais capturados devero ser explicitados, incluindo tempo mximo de manuteno de cada indivduo, tipo das gaiolas de manuteno, nmero de animais por gaiola, alimentao e condies de abrigo. Detalhar plano de marcaes visual (visa evitar a manipulao duplicada no mesmo animal) e permanente (recomenda-se o uso de microchips). Descrever detalhadamente o end point e procedimentos de eutansia em casos de acidente durante os trabalhos, sem omitir o destino das carcaas. Todos os procedimentos visando s condies de segurana do animal e manipuladores devem ser detalhados. A aprovao do procedimento pela CEUA no garantia de sua realizao, j que outros parmetros como normas de biossegurana (veiculao de agentes patognicos), controle de diversidade gentica e proteo ambiental tambm fazem parte dos documentos necessrios a realizao dos procedimentos de transporte e manipulao. Soltura: Descrever como ser garantido que a soltura ser realizada no mesmo local da captura, com horrio e condies climticas da soltura e condies individuais de cada animal a ser solto.
A CEUA se baseia principalmente na de Lei de Crimes Ambientais e na Instruo Normativa No. 154 de 01 de Maro de 2007 do Ibama, brevemente apresentadas abaixo:
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A Lei de Crimes Ambientais (Lei No. 9.605 de 12 de fevereiro de 1998) considera crime contra a fauna a manuteno de animais silvestres em cativeiro sem a devida permisso, licena ou autorizao da autoridade competente. No caso especfico de fauna silvestre entende-se como autoridade competente o IBAMA. A manuteno de animais silvestres em cativeiro tambm considerada crime se a origem dos animais no estiver devidamente documentada atravs de nota fiscal emitida pelo comerciante ou pelo criadouro que tem autorizao do IBAMA para reproduzi-los em cativeiro. Nessa nota fiscal deve constar o nome cientifico e popular do animal, o tipo e o nmero de identificao individual do espcime (animal), que poder ser uma anilha fechada, tatuagem permanente e/ou um microchip. Segundo a Instruo normativa No. 154 de 01 de Maro de 2007 (DOU No. 42 de 02/03/2007, Seo 1, pgina 57-59), o Ibama estabeleceu o Sistema de Autorizao e Informao em Biodiversidade (Sisbio) e fixou normas sobre a realizao de: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Coleta de material biolgico; Captura ou marcao de animais silvestres in situ; Manuteno temporria de espcimes de fauna silvestre em cativeiro; Transporte de material biolgico; Recebimento e envio de material biolgico ao exterior e, Realizao de pesquisa em unidades de conservao federal ou em cavidade natural subterrnea.
DEFINIES: Captura - deter, conter ou impedir, temporariamente, por meio qumico ou mecnico, a movimentao de um animal, seguido de soltura. Coleta obteno de organismo silvestre animal, vegetal, fngico ou microbiano, seja pela remoo do indivduo do seu habitat natural, seja pela coleta de amostras biolgicas. Transporte deslocamento de material biolgico no territrio nacional, plataforma continental, no mar territorial, ou na zona econmica exclusiva.
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Pesquisador profissional graduado ou de notrio saber, que desenvolva atividades de ensino e pesquisa vinculada instituio cientfica. Licena permanente ato administrativo vinculado pelo qual o IBAMA faculta ao pesquisador o direito de realizar a captura, a coleta, e o transporte de material biolgico de espcies da fauna silvestre, por perodo indeterminado, desde que, atendido os requisitos previstos. Material biolgico organismos ou partes desses. Instituio Cientfica Instituio brasileira de ensino e pesquisa ou de pesquisa que desenvolva atividades de pesquisa de carter cientfico ou tecnolgico. No Artigo 16 daquela Instruo fica o pesquisador obrigado a apresentar parecer do Comit de tica da instituio a qual est vinculado quando o projeto visar utilizao de espcimes vivos de vertebrados silvestres em experimentos cientficos.
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DROGAS PARA USO NO CONTROLE DA DOR DURANTE PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS COM ANIMAIS NO CONVENCIONAIS (SILVESTRES)
Primatas Tiopental Diazepam Ketamina Ketamina +Xilazina 8-10mg/kg(IV) 0,5mg/kg (IM) 10-15mg/kg(IM) 10mg/kg(IM) 2mg/kg(IM) 2-6mg/kg (IM) 0,05-1mL/kg (IM) Marsupiais* 5mg/kg(IP) Prociondeos __ Musteldeos __ Observaes Pouca analgesia, indicado para procedimentos no cirrgicos Sedao Anestesia para procedimentos rpidos. Pouca analgesia Anestesia cirrgica para procedimentos rpidos e pouco dolorosos Sedao rpida Grande analgesia. Recomendado para procedimentos cirrgicos com abertura de cavidades
0,1-0,5mg/kg(IM) 0,5- 1mg/kg(IM) 0,5-1mg/kg (IM) 15-30mg/kg (IM) 10mg/kg(IM) 1mg/kg (IM) (atropina) 5-10mg/kg(IM) 0,4mg/kg(IM) 10-15mg/kg (IM) 5-10mg/kg(IM) 0,5-1mg/kg(IM) 2-8mg/kg (IM) __ 10-15mg/kg (IM) 10mg/kg(IM) 2mg/kg(IP) 3-6mg/kg (IM) __
Tiletamina +Zolazepan Fentanil + Droperidol
IP intraperitonial
IV intravenoso
IM - intramuscular
Marsupiais Famlia Didelphidae (gamb, cuca, etc) Musteldeos Famlia Mustelidae (furo, ferret, lontra, etc). Prociondeos Famlia Procyonidae (quati, mo-pelada, etc.). *Marsupiais com menos de 250g de peso, so imobilizados mais facilmente com anestesia voltil sob mscara (halotano ou isoflurano + oxignio).
51 COLETA DE SANGUE PRIMATAS, MARSUPIAIS, MUSTELDEOS E PROCIONDEOS*.
Tamanho do animal Pequeno ou filhote Mdio
Primata Veia femoral agulha 13x4,5
Marsupial Veia jugular agulha 13x4,5
Musteldeo Veia jugular agulha 13x4,5 ou 20x5,5 Veias ceflica ou femoral ou safena lateral ou jugular agulha 25x7,0 Veias ceflica ou femoral ou safena lateral ou jugular agulha 25x7,0 ou 30x8,0
Prociondeo Veia jugular agulha 13x4,5 ou 20x5,5 Veias ceflica ou femoral ou safena lateral ou jugular agulha 25x7,0 Veias ceflica ou femoral ou safena lateral ou jugular agulha 25x7,0 ou 30x8,0
Veias ceflica Veias jugular ou femoral ou ou femoral braquial ou agulha 20x5,5 safena lateral ou 25x6,0 agulha 20x5,5 ou 25x6,0 Grande Veias ceflica Veias jugular ou femoral ou ou femoral ou braquial ou safena lateral safena lateral agulha 25x7,0 agulha 25x8 ou 30x8,0 *animais contidos quimicamente - sedados
INJEES INTRAMUSCULARES - PRIMATAS, MARSUPIAIS, MUSTELDEOS E PROCIONDEOS**.
Tamanho Primata Marsupial Musteldeo Prociondeo do animal Pequeno Msculos semi Msculos semi Msculos semi Msculos semi ou filhote membranceo ou membranceo ou membranceo ou membranceo ou semitendneo semitendneo semitendneo semitendneo agulha 13x4,5 agulha 13x4,5 agulha 13x4,5 agulha 13x4,5 Mdio Msculos semi Msculos semi Msculos semi Msculos semi membranceo ou membranceo ou membranceo ou membranceo ou semitendneo semitendneo semitendneo semitendneo agulha 20x5,5 ou agulha 20x5,5 agulha 25x6,0 agulha 25x6,0 25x6,0 Grande Msculos trceps ou Msculos semi Msculos semi Msculos semi semi membranceo membranceo ou membranceo ou membranceo ou ou semitendneo semitendneo semitendneo semitendneo agulha 25x8 ou agulha 25x6,0 agulha 25x6,0 ou agulha 25x7,0 30x8,0 25x7,0 ** animais contidos mecanicamente Obs.: o volume da droga injetado no msculo depender do porte fsico do animal
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CAPTULO 10 ENDEREOS IMPORTANTES
PRINCIPAIS ENDEREOS ELETRNICOS PARA BUSCA DE PROCEDIMENTOS ENVOLVENDO EXPERIMENTAO ANIMAL Biblioteca Virtual de Biotica http://www.ufrgs.br/bioetica/ Canadian Council on Animal Care (CCAC) http://ww.ccac.ca Colgio Brasileiro de Experimentao Animal (COBEA) http://www.cobea.org.br Comisso de tica na Experimentao Animal (CEEA) IB/UNICAMPhttp://www.ib.unicamp.br/institucional/ceea/index.htm National Institutes of Health http://bioethics.od.nih.gov/animals.html Research Animal Resource (RAR) http://www.ahc.umn.edu/rar/ Sociedade Brasileira de Biotica http://www.sbbioetica.org.br/default/default.asp Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) http://www.ufrgs.br/bioetica/
ENDEREO DA CEUA FIOCRUZ http://www.presidencia.fiocruz.br/vppdt1/com_etn_uso_anim_.php email- ceua@fiocruz.br
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ANEXO
PRINCPIOS TICOS PARA O USO DE ANIMAIS LABORATORIO (conforme preconizado pelo COBEA)
DE
ARTIGO I Todas as pessoas que pratiquem a experimentao biolgica devem tomar conscincia de que o animal dotado de sensibilidade, de memria e que sofre sem poder escapar a dor; ARTIGO II O experimentador , moralmente responsvel por suas escolhas e por seus atos na experimentao animal; ARTIGO III Procedimentos que envolvam animais devem prever e se desenvolver considerando-se sua relevncia para a sade humana o animal, a aquisio de conhecimentos ou o bem da sociedade; ARTIGO IV Os animais selecionados para um experimento devem ser de espcie e qualidade apropriadas a apresentar boas condies de sade, utilizando-se o nmero mnimo necessrio para se obter resultados vlidos. Ter em mente a utilizao de mtodos alternativos tais como modelos matemticos, simulao por computador e sistemas biolgicos In vitro; ARTIGO V imperativo que se utilizem os animais de maneira adequada, incluindo ai evitar o desconforto, angstia e dor. Os investigadores devem considerar que os processos determinantes de dor ou angstia em seres humanos causam o mesmo em outras espcies, a no ser que o contrrio tenha se demonstrado; ARTIGO VI Todos os procedimentos com animais, que possam causar dor ou angstia, precisam se desenvolver com sedao, analgesia ou anestesia adequadas. Atos cirrgicos ou outros atos dolorosos no podem se realizados em animais no anestesiados e que estejam apenas paralisados por agentes qumicos e/ou fsicos; ARTIGO VII Os animais que sofram dor ou angstia intensa ou crnica, que no possam se aliviar e os que no sero utilizados devem ser sacrificados por mtodo indolor e que no cause estresse; ARTIGO VIII O uso de animais em procedimentos didticos e experimentais pressupe a disponibilidade de alojamento que proporcione condies de vida adequada s espcies, contribuindo para sua sade e conforto. O transporte, a acomodao, a alimentao e os cuidados com os
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animais criados ou usados para fins biomdicos devem ser dispensados por tcnico qualificado; ARTIGO IX Os investigadores e funcionrios devem ter qualificao e experincia adequadas para exercer procedimentos em animais vivos. Deve-se criar condies para seu treinamento no trabalho, incluindo aspectos de trato e uso humanitrio dos animais de laboratrio.

Manual Procedimentos FIOCRUZ

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MINISTRIO DA SADE FUNDAO OSWALDO CRUZ - FIOCRUZ VICE - PRESIDNCIA DE DESENVOLVIMENTO CIENTFICO E TECNOLGICO COMISSO DE TICA NO USO DE ANIMAIS

MANUAL DE UTILIZAO DE ANIMAIS/FIOCRUZ

ELABORADO PELA CEUA - FIOCRUZ RIO DE JANEIRO 2008

MANUAL DE UTILIZAO DE ANIMAIS/FIOCRUZ

RIO DE JANEIRO 2008

MANUAL DE UTILIZAO DE ANIMAIS/FIOCRUZ

Joseli de Oliveira Ferreira

Eutansia Pesquisa com animais silvestres Endereos importantes

Princpios ticos para o uso de animais de laboratrio (COBEA)

Octavio Augusto Frana Presgrave, M. Sc. Coordenador da CEUA/FIOCRUZ

9 CAPTULO 1 Octavio Augusto Frana Presgrave

10 CAPTULO 2 Octavio Augusto Frana Presgrave

12 CAPTULO 3 Ftima Conceio-Silva

16 CAPTULO 4 Joseli de Oliveira Ferreira

Volume mximo Agulha

Volume mximo Agulha

Volume mximo Agulha

VIAS, VOLUMES E LOCAIS DE ADMINISTRAO DE DROGAS INJETVEIS EM COELHOS.

Subcutnea (SC) Regio nucal e flanco/dorso 5mL/animal

Intramuscular (IM) Quadrceps; face posterior da coxa 2mL/animal

Intraperitoneal (IP) Quadrante lateral inferior direito 50mL/animal

Intravenosa (IV) Marginal da orelha* 10mL/Kg

Volume mximo Agulha

25x7, 27x8 ou dispositivo intravenoso 24G

FRMACOS USADOS EM AMINAIS DE LABORATRIO ANESTSICOS E ANALGSICOS

ANESTSICOS E TRANQUILIZANTES UTILIZADOS EM CAMUNDONGOS

Frmaco Tiopental Quetamina

Via de administrao IV IP IM IP IV IM IP IM IP IP IP IV IV Sob consulta Sob consulta

Durao de anestesia 10 min

20 min 20 min 5.6-6.9 min Sob consulta Sob consulta

24 ANALGSICOS UTILIZADOS EM RATOS

varivel Sob consulta Sob consulta

ANESTSICOS E TRANQILIZANTES UTILIZADOS EM COELHOS

Durao de anestesia Sedao Sedao Sedao Sedao varivel varivel varivel

varivel 77 min varivel varivel varivel Sob consulta Sob consulta

Elizabeth Malagueo de Santana

RECOMENDAES PARA A PREPARAO DE ANTICORPOS POLICLONAIS

A inoculao de adjuvantes oleosos provoca peritonite. Risco de choque anafiltico no "boost"

0.1 25x5 - 0,2 - 25x5 0.2 25x5

0.5 13x4,5 0.5-1.0 13x4,5 1.0 13x4,5 1.5 13x4,5

1.0 13x4,5 5.0 25x5 5.0-10 25x5 10-20 25x7

0.2 13x4,5 0.5 13x4,5 0.5-1.0 13x4,5 1.5 13x4,5

0.20.5 25x7 0.2.0 25x8

2.0 13x4,5 0.5 13x4,5

0.05 13x4,5 0.05 13x4,5

2.0 25x8 1.0 25x8

No testado 0.5 25x7

Octavio Augusto Frana Presgrave & Belmira Ferreira dos Santos

*PNH - primatas no humanos

Ftima Conceio-Silva & Celina Bessa EUTANSIA

Roedores e coelhos pequenos

Roedores e coelhos maiores

Mtodo de escolha Outro aceitvel Outro aceitvel No aceito No aceito No aceito

mtodo No aceito mtodo Outro aceitvel No aceito No aceito No aceito mtodo

Mtodo de escolha Mtodo aceitvel No utilizado

Mtodo de escolha Aceitvel em exemplares dependendo pequenos espcie

Mtodo de eutansia de escolha*1

Sedao prvia com Superdosagem diazepan, midalzolan, tiopental sdico xilazina.

Outros roedores, usados em laboratrio. Outras espcies de roedores de origem silvestre*2

Acepromazina quetamina Acepromazina quetamina

+ Superdosagem tiopental sdico + Superdosagem tiopental sdico

anfbios rpteis peixes

----------------------Observar o tamanho do animal

Acepromazina quetamina Xilazina acepromazina quetamina