Mtodo de nmero mais provvel para avaliao de grupos fisiolgicos de microrganismos em digesto anaerbia de gua residuria de mandioca

Most probable number method for microorganism physiologic groups evaluation in anaerobic digestion of cassava wastewater
Maria Magdalena Ferreira Ribas Maria Eneida Cunha Marney Pascoli Cereda

Resumo
A avaliao da microbiologia anaerbia um mtodo caro e muito difcil. Tcnicas simples so disponveis para avaliao de microrganismos de diversos usos como mdico, alimentar, ambiental e sistemas anaerbios para tratamento de efluentes. Uma metodologia desenvolvida foi usada para avaliar a atividade de grupos de microrganismos em digesto anaerbia com possvel aplicao a substratos especficos. A tcnica usa gases isentos de oxignio em frascos tipo penicilina e fechados com tampa de borracha e selo de alumnio, onde foi adicionado um indicador de reduo, complementos nutricionais e agentes redutores aps a esterilizao. O metabolismo dos microrganismos foi observado nesses frascos fechados depois de um perodo de incubao de quatorze dias pela variao da turbidez, de pH medido em indicador de Arrhenius e de gs capturado em tubos Duran. A tcnica do Nmero Mais Provvel (NMP) foi usada para contagem de microrganismos em meio de cultivo adaptado para grupos especficos de microrganismos que eram esperados para se desenvolver em gua residuria de mandioca com amido e seus hidrolisados (dextrina, maltose e glicose) como fonte de energia. Para aferir o mtodo, amostras foram coletadas de um reator acidognico de mistura completa ligado a um reator metanognico de leito fixo, ambos alimentados com gua residuria de mandioca. O gs capturado nos
 Dra.; Engenheira Agrnoma; Professora adjunta do Departamento de Engenharia Agrcola da Universidade Estadual de Maring UEM; E-mail: m2fribas@yahoo.com.br  M.Sc.; Biloga; E-mail: e12cunha@ig.com.br  PhD.; Engenheira Agrnoma; Professora da Universidade Catlica Dom Bosco; Bolsista de Produtividade em Pesquisa do CNPq; E-mail: cereda@ucdb.br
Recebido para publicao em 11/09/2007 e aceito em 03/06/2009

Ambincia

Guarapuava, PR

v.5 n.3

p.401 - 417

Set/Dez. 2009

ISSN 1808 - 0251

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tubos Duran dos frascos de penicilina foi analisado por cromatografia quanto ao contedo de metano. O uso dos meios permitiu separar os microrganismos em trs grupos usando meio de cultivo seletivo: Meio Mnimo (MM) sem substratos orgnicos, Meio Completo (MC) com uma mistura de amido de mandioca e seus hidrolisados e Meio Diferencial (MD) usando cada derivado de amido isoladamente. O sistema de tratamento anaerbio no perodo analisado operou com um bom desempenho e a microbiologia confirmou estes resultados. No efluente do reator acidognico foi encontrado 103 microrganismos/mL no MC e 1015 microrganismos/mL no MM e uma contagem mxima de 1010 em MC. No efluente do reator metanognico, foi encontrado 109 em MM microrganismos/mL e 1010 em MC. Para o MD, os valores foram intermedirios para MC e MM em todas as amostras. Para testar a tcnica de avaliao da atividade microbiana, uma dose nica de choque de 750 mg/L de cianeto (CN-) foi adicionada ao afluente do reator acidognico. Depois de 48 horas, foi detectada reduo na produo de gs e queda equivalente (104) no nmero de todos os grupos de microrganismos pela entrada do cianeto. A alimentao do reator foi retornada concentrao inicial de gua residuria de processamento de mandioca e, depois de quinze dias o reator voltou a apresentar estabilidade. Em decorrncia, observou-se aumento de todos os grupos de microrganismos. Portanto, as contagens microbianas obtidas foram condizentes com as condies de funcionamento dos reatores anaerbios no perodo avaliado, validando a metodologia proposta. Palavras-chave: microbiologia anaerbia; cianeto; digesto anaerbia; NMP.

Abstract
Anaerobic microbiology evaluation is an expensive and very difficult method. Simple techniques are available for the assessment of microorganism in several uses, such as medical, food, environment and anaerobic systems for wastewater treatment. A methodology was developed to assess the activity of microorganisms groups in anaerobic digestion with possible application to specific substrata. The technique applies oxygen-free gases in serum bottles closed with a rubber cover and an aluminum seal with the addition of a reducing indicator, nutrient complements and reducing agents after sterilization. The metabolism of the microorganisms was observed in these closed serum bottles after an incubation period of fourteen days, and regarding turbidness variation, pH variation measured by Arrheniuss indicator and gas 402

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captured in Duran tubes. The Most Probable Number (MPN) technique was used for microorganism counting in cultivation media adapted to specific microorganisms groups that were expected to grow in cassava wastewater with starch and its hydrolyzed substances (dextrin, maltose and glucose) as an energy source. In order to checking the method, samples were collected from a complete mix acidogenic reactor linked to an upflow packed bed methanogenesis reactor both feed with cassava wastewater. Gas captured in the Duran tubes from the serum bottles was analyzed by means of chromatography for methane content. The use of media allowed us to separate the microorganisms in three groups using selective cultivation media: Minimum Media (MM) without organic substrates, Complete Media (CM) with a mixture of cassava starch and its hydrolyzed substances and Differential Media (DM) using each isolated starch derivative. The anaerobic treatment system operated with a good performance and the microbiology confirmed these results during the analyzed period. Findings in the acidogenic reactor effluent were 103 microorganisms/mL in CM and 1015 microorganisms/mL in MM, and maximum counts of 1010 in CM. In the methanogenic reactor effluent 109 in MM microorganisms/mL and 1010 in MC were found. For DM the values were intermediate for CM and MM in all samplings. In order to test the technique for microbiological activity assessment, a unique shock concentration of 750 mg/L of cyanide (CN-) was added to the acidogenic reactor affluent. After 48 hours, a reduction in gas production and a similar drop (104) in number of all the microorganisms groups were observed. The reactor feeding was returned to the initial concentration of cassava processing wastewater and after 15 days the reactor showed stability. As a consequence, we verified the increase of all microorganisms groups. Therefore, the microbiological counts obtained were consistent with the functioning conditions of te anaerobic reactors during the assessed period, validating the proposed methodology. Key words: anaerobic microbiology; cyanide; anaerobic digestion; MPN.

Introduo
O termo anaerobiose foi introduzido por Pasteur em 1840 para caracterizar microrganismos que vivem na ausncia de oxignio. Apesar de sua importncia, as tcnicas de manipulao e contagem de anaerbios continuam a ser complicadas e caras.

Uma das reas de aplicao da anaerobiose o tratamento de resduos, pelas vantagens que oferece em relao ao tratamento aerbio. Cereda et al. (1990) citam que vrias tentativas foram feitas para compreender melhor a microbiologia da metanognese, dada a importncia que essa tem assumido quando da necessidade de avaliar um

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inculo, otimizar o desempenho de um reator, explicar os sucessos e os insucessos de um sistema ou esclarecer a paralisao sbita de um reator. Hungate desenvolveu em 1950 tcnicas de manipulao de microrganismos anaerbios usando tubos de ensaio fechados com meios de cultura gelificados com gar espalhados nas paredes e atmosfera de gs carbnico. O controle da condio redutora era feito pela colorao do indicador resazurina. A tcnica clssica do autor para obter gases em condies reduzidas, empregava uma coluna de vidro recheada de aparas de cobre, com a desvantagem de ser frgil e alto custo, apesar de permitir boa visualizao das aparas para definir a necessidade de regenerao do cobre pela perda da cor brilhante. Para contornar essas dificuldades, algumas modificaes foram propostas por Cunha (1990), em que foi avaliada uma coluna de tubo de cobre com um segmento em espiral recheado com aparas de cobre com sistema de manuteno de temperatura a 350o C. Por uma das extremidades da coluna entrava gases (CO2, H2, N2 e 80% de CO2/20% de H2) e a outra, era ligada tubulao de borracha, de onde partiam ramificaes que terminavam em seringas com agulhas longas para sada de gases reduzidos que eram introduzidos nos frascos com meios de cultura. Um manmetro permitia registro e controle da presso dos gases no interior dos frascos a uma atmosfera. Antes do uso da coluna, o autor sugeriu que fosse corrido nitrognio gasoso (N 2) por cinco minutos para eliminar traos de oxignio e em seguida

H2. Concomitantemente, a coluna de cobre deveria ser aquecida at 350oC/20 minutos, para que o oxignio fosse fixado ao passar pelas aparas de cobre. As dificuldades deste mtodo estavam na manuteno da anaerobiose. Quando os tubos j preparados eram autoclavados, as rolhas se deslocavam ou saltavam e mesmo usando uma prensa para segurlas o rendimento do preparo era muito baixo, pois muitos tubos acusavam presena de oxignio (O2) depois de prontos. Tcnicas e equipamentos mais sofisticados melhorariam a eficincia desta metodologia, mas exigiriam materiais e laboratrio especializados. Atualmente, devido crescente aplicao de microrganismos no saneamento ambiental, a biotecnologia de microrganismos vem se desenvolvendo com o uso de tcnicas moleculares como a reao de polimerizao em cadeia (PCR), eletroforese em gel com gradiente desnaturante (DGGE) e hibridizao in situ com sondas fluorescentes (FISH), o que torna possvel a deteco, identificao especfica, quantificao, caracterizao da estrutura e da distribuio espacial da comunidade microbiana presente em lodos e biofilmes de microrganismos (HIRASAWA, 2003). Contagens de microrganismos pelo Nmero Mais Provvel (NMP) so tcnicas antigas, rpidas e de baixo custo, que permitem avaliar estatisticamente o nmero dos microrganismos presentes numa amostra e estimar a proporo vivel metabolicamente ativa (Jones apud GiajLevra, 1991). O NMP permite estimar a densidade da populao empregando-se diferentes meios de cultivo, analisandose o crescimento celular microbiano

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atravs da leitura da turvao do meio e determinao de produtos metablicos no meio, como gases, cidos e alcois (VAZZOLLER, 1995). A tcnica do NMP pode ser utilizada para estimar a populao total ou um grupo especfico de microrganismos em uma amostra, e o conjunto de respostas positivas ou negativas considerado para o clculo estimativo do nmero de microrganismos desta amostra. Quando o mtodo considera algum aspecto do metabolismo celular, torna-se possvel avaliar a quantidade de algum grupo especfico de microrganismo (ATLAS e BARTHA, 1981). Giaj-Levra (1991) cita que o NMP um mtodo muito simples para quantificar microrganismos anaerbios, apesar de ser necessrio um tempo de incubao e a leitura dos resultados pode exigir exames microscpios e anlises cromatogrficas de gases para complementao dos mesmos. Chen (1983) objetivando determinar a concentrao de termfilos anaerbios em um reator mesoflico alimentado com lodo primrio municipal e examinar as capacidades de adaptao de vrias subpopulaes de microrganismos anaerbios a temperaturas termoflicas retirados de reatores mesoflicos que tratava lodo primrio municipal em temperaturas termoflicas, aplicou a tcnica do NMP para quantificar os diferentes grupos fisiolgicos de microrganismos anaerbios. O autor observou que apenas 10% da populao microbiana mesfila total, contando em nmero de colnias por mililitro utilizado, era capaz de sobreviver em ambiente termoflico, sendo que 9%

eram termfilos (50 C) e 1% termfilos obrigatrios (60 C). A prpria gua residuria, contendo materiais poluentes que se pretende degradar biologicamente, pode ser usada como meio de cultivo de microrganismos. Esta prtica seleciona aqueles microrganismos que so capazes de se desenvolver a partir dos compostos presentes no despejo, como o caso da biorremediao, processo em que os microrganismos so utilizados para eliminao ou detoxificao do ambiente contaminado por xenobiticos (VAZOLLER, 2002). No Brasil, o cultivo da mandioca feito para produo de farinha e amido, processos esses que geram gua residuria que carreia matria orgnica biodegradvel como acares solveis (40g/L) e linamarina, principal composto cianognico solvel em gua (CEREDA, 2001). Segundo Conn (1994) quando o tecido vegetal dilacerado como ocorre na moagem da raiz, ocorre uma reao enzimtica sob as condies timas de 25o C, pH entre 5,5 e 6,0 (Cereda e Mattos, 1996) liberando o cido ciandrico que voltil e txico a muitas formas vida. O processo de digesto anaerbia da gua residuria de processamento de mandioca em duas fases, acidognica e da metanognica, constitui-se alternativa de tratamento que alm de ser mais estvel e eficiente na reduo de cianeto total e de carga orgnica, o que foi comprovado por diversas pesquisas realizadas (CEREDA et al., 1986; LACERDA, 1991; BARANA, 2000; RIBAS e CEREDA, 2003). O sistema composto por um reator na fase acidognica do tipo mistura completa

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e como reator metanognico um fluxo ascendente com leito fixo. O sistema permite reduo da carga orgnica de 40 a 60%, rendimento de biogs de 0,5 a 0,7 L gs por g de carbono orgnico total (COT) destrudo com carga orgnica de 8,2 e 4,4 g COT/L.dia e reduo de cianeto superior a 77% (RIBAS e CEREDA, 2003). Barana (2000) avaliou o desempenho do mesmo sistema de reatores e observou remoo da carga orgnica de 51 a 87%, rendimento de biogs de 0,6 a 5,5 L gs por g de demanda qumica de oxignio (DQO) destruda com carga orgnica de entrada de 18,4 a 53,5 g DQO/L.dia. A reduo de cianeto total foi superior a 67%. A separao de fases promove condies adequadas para os grupos de microrganismos envolvidos em cada fase. Segundo Ribas e Cereda (2001), a estabilidade obtida pela neutralizao dos cidos orgnicos gerados durante a acidognese, mantendo-se o pH da flora natural que de aproximadamente 4,5, entre 5,5 e 6,0 para favorecer microrganismos acidognicos. Com o estabelecimento de sistema adequado de tratamento, importante conhecer como respondem os microrganismos envolvidos em cada fase para maior controle do sistema. Cereda et al. (1986 e 1990) avaliaram a microbiologia de sistemas anaerbios em duas fases usando mtodo de NMP em meios especficos para tratamento de suspenses amilceas de batata. Neste trabalho, testou-se o aparato experimental proposto inicialmente por Hungate para avaliar metodologia de separao de diferentes grupos

f i s i o l g i c o s d e m i c r o rg a n i s m o s envolvidos na digesto anaerbia com separao de fases no tratamento da gua residuria de processamento de mandioca e avaliar diferentes meios de cultivo seletivos para cada grupo de microrganismos.

Materiais e Mtodos
O trabalho foi desenvolvido na Universidade Estadual Paulista em Botucatu (SP). A gua residuria do processamento de mandioca que foi usada como substrato dos reatores foi coletada em uma farinheira localizada no municpio Santa Maria da Serra (SP), Brasil.

Reator acidognico de mistura completa e reator metanognico de fluxo ascendente com leito fixo
Amostras dos efluentes dos reatores acidognicos e metanognicos foram usadas para avaliar a microbiologia. O reator acidognico no recebeu nenhum tipo de inculo e somente se desenvolveram microrganismos naturais do resduo. O pH da gua residuria foi corrigido diariamente para valores prximos de 6,5 com NaOH (hidrxido de sdio) por sete dias (RIBAS e CEREDA, 2003). Aps este perodo, a gua residuria praticamente estabilizada foi chamada de substrato e foi diluda em gua na proporo de 20 mL/L (0,15 g de slidos volteis/L reator/dia) e usado como afluente do reator metanognico. J, o reator metanognico foi inoculado com lodo proveniente de um reator anaerbio de mistura completa que tratava gua residuria de processamento de mandioca

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diluda com gua na proporo de 70%. O reator era constitudo de uma coluna de PVC (cloreto de polivinila) com fluxo ascendente e leito fixo com volume til de 9,33 L. O leito fixo era composto por anis de PVC rgido de 5,0 cm de comprimento e 2,5 cm de dimetro. A alimentao contnua do substrato era feita na base do reator por bomba peristltica. A carga orgnica foi estabelecida em 0,15 g de slidos volteis/L.dia e o tempo de reteno hidrulica de 4 dias. O reator ficava imerso em sistema termostatizado que manteve a temperatura em 35oC. O gs era coletado na parte superior do reator em gasmetro telescpico com selo de soluo salina acidulada e o teor de metano determinado por anlise cromatogrfica conforme Lacerda (1991).

Mtodo Nmero Mais Provvel

O mtodo foi descrito detalhadamente por Cereda et al. (1986 e 1990) utilizando frascos novos tipo penicilina com capacidade de vinte mL. Antes de serem usados foram lavados e esterilizados a seco. Aps o preparo, os frascos receberam meio de cultura em condies reduzidas, fechados com a tampa de borracha e recravadas com selos de alumnio de vinte mm de dimetro. A seguir, foram processados em similaridade com o mtodo clssico de Hungate (1950), passando os gases em coluna de cobre aquecida por vinte minutos para obter meio suficientemente reduzido Cereda et al. (1986 e 1990).

Meios de cultivo
Foram empregados os meios, citados por Leedle e Hespell (1980)

com algumas modificaes, adaptados quanto composio dos carboidratos e tcnica do nmero mais provvel (Jones e Paynter, 1980). O Meio Completo (MC) foi composto por 0,2 g/100mL carboidratos (compostos de 0,1 g/100mL de amido de mandioca, 0,05 g/100mL de dextrina, 0,025 g/100mL de maltose e 0,025 g/100mL de glicose), 0,2 g/100mL extrato de levedura, 4,0 mL/100mL soluo mineral I, 4,0 mL /100mL soluo mineral II, 1,0 mL /100mL soluo de cidos graxos volteis, 0,1mL/ 100mL soluo de resazurina a 0,1%, 40 mL/100mL soluo clarificada do efluente, 1,0 g/100mL soluo de Na2S/ cistena (2,5g/100mL /2,5 g/100mL), 5,0 g/100mL soluo de Na 2 CO 3 8 g/100mL. O Meio Mnimo (MM) foi preparado do mesmo modo que o completo, eliminando-se, porm, os carboidratos. No Meio Diferencial (MD), foi utilizado como fonte de energia cada um dos carboidratos isoladamente (amido ou seus hidrolisados) na concentrao de 0,2 g/100mL. Preparo das solues: As solues adicionadas aos meios foram preparadas da seguinte forma: - Soluo mineral I: 0,6 g K2HPO4/100 mL de gua destilada. - Soluo mineral II: 0,6 g KH2PO4, 0,6 g (NH4)2SO4, 1,2 g NaCl, 0,255 g MgSO4.7H2O, 0,169 g CaCl2.2H2O, em 100 mL de gua destilada. - Soluo de cidos graxos volteis: 17 mL de cido actico, 6 mL de cido propinico, 5 mL de cido butrico, 1 mL de cido iso-butrico, 1 mL de cido n-valrico, 1 mL de cido iso-valrico, com pH ajustado a 7,5 com NaOH concentrado e com o volume completado a 100 mL com gua destilada.

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- Soluo clarificada do efluente: obtida aps filtragem e fervura do sobrenadante por 1 minuto para eliminao dos colides, seguida de nova filtragem em papel de filtro. - Soluo de Na2S/cistena: 2,5 g de cistena (HCl.H2O) diludas em gua destilada, com pH ajustado a 10 com NaOH 3N. Foram acrescentados 2,5 g de Na2S.9H2O e o volume completado para 200 mL. Em seguida, esta soluo foi fervida sob fluxo de N2 e esterilizada. - Soluo de Na2CO3 (8 g/100mL): obtida pela dissoluo de 8,0 g de Na2CO3 em gua destilada. A soluo foi esterilizada e aps resfriada foi saturada com CO2 isento de oxignio por trinta minutos. - Diluente: foi preparado a partir do efluente final do reator metanognico diluindo a 10% com gua destilada, clarificado por filtrao. O pH foi ajustado a 7,0 com NaOH antes da esterilizao. O diluente assim preparado foi distribudo em volumes de 9 mL nos frascos, sob condies reduzidas. - Manipulao dos meios: uma vez preparados o pH dos meios de cultivo foi ajustado para 7,0 com NaOH. As condies reduzidas foram obtidas por ebulio por poucos minutos, seguida de borbulhamento de CO2 reduzido. Foram distribudos 10 mL de meio em cada frasco, que foi ento tampado e recravado. As solues redutoras (Na 2S/cistena e Na 2CO 3) foram introduzidas assepticamente nos frascos ps a esterilizao com seringas hipodrmicas. - Diluio em srie sob condies reduzidas: A amostragem do efluente dos reatores foi feita sob fluxo constante de N2 reduzido. Um segmento da tubulao

prximo sada do efluente de cada reator foi fechado com presilha. O gs reduzido foi injetado no segmento anterior presilha e ao mesmo tempo foi retirado sob presso um volume desejado da amostra, que foi colocado imediatamente em um frasco gaseificado. A partir do lquido deste frasco, o inculo foi submetido diluio em srie. Para isso foi usada seringa de 10 mL e o procedimento de diluio foi feito como segue: sob N2 injetado no frasco inculo foi retirado 1 mL do lquido que foi transferindo para o primeiro frasco contendo 9 mL de diluente. O frasco foi homogenizado e 1 mL da diluio foi retirada com a seringa. Com a mesma seringa foram retirados 2 mL de nitrognio, que foram injetados no segundo frasco da diluio, criando uma atmosfera positiva de modo que permitiu retirar 1 mL dessa diluio e injetar no terceiro frasco da sequncia. Procedeu-se assim, at que se completasse a diluio decimal desejada. - Inoculao nas sries de frascos para tcnica do NMP: para a tcnica de NMP foram inoculadas no mnimo trs sries em cinco repeties para cada grupo a ser avaliado, iniciando pela srie mais diluda. Para iniciar a inoculao 6 mL de nitrognio foram coletados com a seringa e injetados no frasco da diluio mais alta. Do frasco que continha o inculo foram retirados 5 mL e injetados 1 mL por frasco, nos cinco frascos que constituam a srie. Em seguida, passou-se diluio imediatamente mais baixa, com a mesma seringa e assim por diante. Aps a inoculao, os frascos foram gaseificados com a mistura 80% CO2/20% H2, mantendo-se presso de 1 atm no interior dos mesmos, lida atravs

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do manmetro inserido no sistema de distribuio dos gases. O esquema ilustrativo da unidade experimental est apresentado na figura 1.

poderiam ser capazes de se desenvolver em condies termoflicas. - Adio de cianeto: Como forma de avaliar a metodologia proposta, foi

Figura 1. Esquema ilustrativo da unidade experimental: A, A1, A2, A3 - cilindros de gases, B - coluna de cobre com 2 m de comprimento e 0,65 cm de dimetro, C- termostato, D - frasco para controle da sada de gases, E - sada para meio externo, F - tubulao de borracha especial, G - tubulao de cobre, H - manmetro, I - agulha, J - frasco com meio de cultivo para introduo de gs, L - seringa com agulha para introduo de gs, M - meio de cultivo

Fonte: Os autores

- Cultivo dos microrganismos: Aps as inoculaes os frascos foram incubados em estufa bacteriolgica a 35o C por quatorze dias. As variveis analisadas aps o perodo de incubao foram: (a) anaerobiose pela descolorao do indicador (resazurina) em meio reduzido e colorao (rsea) em meio oxidado; (b) crescimento por turvao; (c) produo de gases em tubo de Duran; (d) alterao do pH do meio de crescimento observado por indicador de Arhenius. A separao dos microrganismos em grupos acidognicos e arquias metanognicas foi feita por tratamento trmico do inculo a 80oC/15 minutos (Cereda et al., 1986 e 1990), visando inativar as arquias metanognicas, inclusive quelas que

provocando no reator um choque de cianeto na dose de 750 mg/L que segundo Yang et al. (1980) e Yang (1982) era suficiente para restringir o processo de digesto anaerbia por pelo menos dez dias. Fez-se o acompanhamento microbiolgico desta fase e da recuperao do sistema. - Determinaes analticas: metano por cromatgrafo CG modelo 370, pH (APHA, 1995) e cianeto total (CETESB, 1978).

Resultados e Discusso
Aps 48 dias de operao do reator metanognico, verificou-se que seu desempenho era estvel e, considerouse que o reator estava em estado de equilbrio dinmico aparente. Nesse perodo, constatou-se que o gs Np

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reator anaerbio apresentava rendimento constante mdio de 92% de metano. O pH apresentou-se dentro da faixa esperada para um bom desempenho de reator metanognico, entre 7,0 e 7,4. Ribas e Cereda (2004) tambm verificou estabilidade no processo anaerbio com pH acima de 7,5, remoo de slidos volteis (SV) de 42% e metano no biogs de 35%. J Barana (2000) obteve condies estveis com pH maior que 7,6, remoo de slidos volteis de no mnimo 50% e teor de metano variando de 35% a 68%. Ao longo de toda fase experimental, foram feitas avaliaes microbianas nos efluentes para acompanhar o desempenho dos reatores acidognico e metanognico. Mas, inicialmente, foi necessrio desenvolver uma metodologia simples e prtica para que uma amostra do inculo colocada nos frascos estivesse isenta de microrganismos metanognicos quando se pretendia avaliar somente os

acidognicos. Dessa forma, partiu-se para testes que comprovariam a pasteurizao como um mtodo eficiente, pois segundo Cereda et al. (1990) era possvel a separao de fases da digesto anaerbia atravs do aquecimento do inculo a 80 C por quinze minutos para eliminar microrganismos metanognicos. Para comprovar que a relao temperatura/tempo selecionada por Cereda et al. (1990) era tambm adequada para inativar as arquias metanognicas em tratamento de gua residuria de mandioca, realizou-se uma avaliao microbiana com e sem esse tratamento. Os resultados esto apresentados no quadro 1 e se observa que o tratamento trmico foi eficiente na inativao, quanto produo de metano e contagem pela tcnica NMP para este grupo de microrganismos, considerando a deteco de metano como resultado positivo a partir da diluio de 10-9. Observou-se que houve turvao em todos os frascos sem tratamento

Quadro 1. Produo de metano e NMP para arquias metanognicas em efluente de reator metanognico com e sem tratamento trmico 80oC por quinze minutos em meio de cultivo completo (MC) incubado por quatorze dias
Amostragem Diluio 10-9 10-10 10-11 10-12 10-9 10-10 10-11 10-12 Produo de metano (srie de 5 frascos) 1 2 3 4 5 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + NMP (totais)

Com tratamento trmico

< 109

Sem tratamento trmico

Fonte: Os autores

> 2400x109

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trmico e o valor da contagem foi devido provavelmente presena de bactrias acidognicas, j que no foi detectado metano no biogs e tambm pelo fato de que o meio (MC) tinha como fonte de carbono alm de cidos orgnicos, carboidratos facilmente biodegradveis. O crescimento visualizado sugere que os carboidratos foram fermentados e os cidos foram consumidos pelas metanognicas. Portanto, o tratamento trmico a 80C/15 minutos foi eficiente para inibir o crescimento de metanognicas para esse tipo de amostra. Sendo assim, os resultados obtidos nesse ensaio, comprovaram a viabilidade de separar grupos de microrganismos nas condies experimentais propostas por Cereda et al. (1990). Definido isso, partiu-se para a avaliao de grupos de microrganismos em amostras de efluentes dos reatores nos diferentes meios de cultivo. Reator acidognico: avaliao dos grupos de microrganismos em amostras de efluente A gua residuria da mandioca sofreu fermentao natural neste reator

por sete dias, durante os quais foram coletadas e analisadas amostras com um e sete dias de fermentao. Os resultados encontrados atravs do NMP para o nmero total de microrganismos, acidognicos e metanognicos em meios de cultivo mnimo, diferencial e completo, esto expressos no quadro 2. Os meios de cultivo MM e MD da gua residuria da mandioca com sete dias de fermentao em relao de um dia apresentaram aumento na contagem para o nmero total e metanognicas e, em MC houve diminuio do nmero total e acidognicas. Isso, provavelmente, devido presena de cidos orgnicos consumidos e anaerobiose. O MC apresentou contagens maiores que o MM e MD como ramos de se esperar, uma vez que se constatou a presena de acidognicas e metanognicas. O crescimento em MM provavelmente representou o grupo das metanognicas que utilizam H2 e CO2 e cidos orgnicos, j que esse meio continha cidos (actico, propinico, butrico e outros), apresentando contagens menores que o MD e MC. O meio completo apresentou contagens da ordem de 10 13 , pois tinha como fonte de carbono, cidos orgnicos e carboidratos, o que deve

Quadro 2. NMP de amostras incubadas por quatorze dias para contagem do nmero total de microrganismos, acidognicos e metanognicos de gua residuria de mandioca fermentada por um e sete dias em MM, MD e MC
TRH 1 Meios de cultivo MM MD MC MM 7 MD MC Nota: * sem crescimento. Fonte: Os autores NMP (microrganismos/mL) Nmero total Acidognicos Metanognicos * * * 5,5 x 109 * * 17,0 x 1013 12,0 x 10 13 * 2,0 x 108 * 2,0 x 108 6,1 x 1010 4,5 x 1010 2,0 x 1010 4,5 x 1013 1,8 x 1013 3,6 x 1013

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ter proporcionado fonte de energia suficiente para o crescimento de bactrias acidognicas. Com tempo de reteno hidrulica (TRH) de um dia no houve formao de gs em qualquer dos meios usados. O meio mnimo tambm no apresentou crescimento. Pode-se concluir que os resultados obtidos nas avaliaes microbianas do efluente do reator acidognico, condizem com as caractersticas do processo avaliado, indicando predominncia de acidognese no primeiro dia de fermentao da gua residuria de processamento de mandioca. Com sete dias de tempo de reteno hidrulica (TRH), as contagens de grupos fisiolgicos apresentaram diferenas. Houve uma diminuio da contagem de microrganismos em MC e aumento nos MD e MM, denotando especializao. Os valores das contagens em MD, com cidos orgnicos e amido, ficaram entre os do meio mnimo e completo, o que era esperado devido presena de bactrias hidrolticas. O crescimento em meio mnimo, que tinha como fonte de carbono somente cidos orgnicos, pde ter proporcionado crescimento de diversos tipos de microrganismos anaerbios que fermentam a partir destes cidos. Segundo Mosey (1983) e Foresti (1994), a partir de substrato que contm cidos orgnicos, possvel o estabelecimento de microrganismos acetognicos, que convertem compostos orgnicos reduzidos (como lactato, cido ltico, cido propinico, cido butrico, etc) em H2, bicarbonato e cido actico. A partir destes produtos formados, outro grupo de bactrias anaerbias, as homoacetognicas,

consome o H2 e o bicarbonato produzindo cido actico. Enfim, o grupo das arquias metanognicas se instalam, como as arquias hidrogenotrficas conhecidas como Methanosarcina sp., que consomem bicarbonato e H2, e as acetoclsticas, as Methanosaeta sp., que consomem somente cido actico, convertendo estes produtos a metano. H sintrofismo entre os grupos de microrganismos, pois um produz o substrato para que o outro possa se estabelecer. D e acordo co m o expos to, constatou-se que o meio mnimo pde ter selecionado microrganismos anaerbios que fermentam a partir de compostos orgnicos reduzidos como as acetognicas, homoacetognicas e, por fim, as arquias metanognicas hidrogenotrficas e acetoclsticas.

Reator metanognico: avaliao dos grupos de microrganismos em amostras de efluente aps adio de KCN
Aos 25 dias de operao, observouse que reator metanognico apresentava estabilidade operacional com rendimento de biogs de 0,81 L gs/g SV adicionados, 58% de metano no biogs e pH entre 6,5 e 7,0, conforme pode ser visualizado na figura 2a. Nesse perodo, as avaliaes microbianas obtidas evidenciaram um nmero elevado de metanognicas em MC e MM, figura 2b. Em seguida, provocou-se a desestabilizao do sistema, adicionando-se ao reator uma carga de cianeto, a fim de verificar esse efeito nas contagens microbianas. A literatura (YANG et al., 1980; YANG, 1982) enfatiza o efeito txico do cianeto em sistemas de digesto

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Figura 2. Desempenho do reator anaerbio de fluxo ascendente com leito fixo: (a) pH e rendimento em gs, (b) Log de NMP de microrganismos totais, acidognicos e metanognicos em meio completo e mnimo, em relao ao tempo de operao (a seta indica o momento de do choque de cianeto

a)

b)
Fonte: Os autores

anaerbia, especificando a dosagem de 750 mg de cianeto por litro de efluente como quantidade suficiente para ocasionar uma paralisao brusca do processo. No caso do sistema estudado era de se esperar que houvesse maior resistncia uma vez que os reatores tratavam gua

residuria de mandioca, que apresenta valores de cianeto ao redor de 90,32mg/L. Observou-se que nove dias aps a introduo da dose de choque de cianeto como KCN (Figura 2a), o rendimento de gs caiu de 0,95 para 0,67 L gs/g SV adicionados, no atingindo a total

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paralisao citada devido adaptao dos microrganismos ao cianeto. Foi observado que houve oscilaes no valor de rendimento de 1,19 (terceiro dia aps a adio de cianeto) a 0,20 L gs/g SV adicionados, aps quatro dias da adio de cianeto. A figura 2, detalhes a e b, ilustra o desempenho do reator metanognico durante o perodo experimental, onde possvel observar a queda imediata de rendimento de biogs e do NMP de todos os grupos de microrganismos. A partir de dez dias da adio, o reator passou a dar indcios de recuperao, avaliados pela produo de gs e estabilizao do processo, provavelmente pela lavagem que foi sendo feita pela alimentao com substrato normal sem grande quantidade de cianeto. O pH apresentou-se prximo neutralidade dentro do esperado para um reator anaerbio com bom desempenho, com exceo do perodo seguinte adio de cianeto, quando apresentou ligeira variao para 7,6. As contagens obtidas, aps a adio de cianeto, mostraram que os valores para o nmero total de microrganismos em MM sofreram uma reduo em relao ao perodo anterior sem adio de cianeto. Os valores obtidos para microrganismo em MM acompanharam os obtidos para nmero total, mas caram para nveis mnimos de 104. Nove dias aps a adio de cianeto, as contagens voltaram aos valores anteriores e ficaram estveis. No perodo avaliado, em MM, as acidognicas no foram detectadas na diluio usada, confirmando os resultados obtidos anteriormente.

Em MC, os valores para contagens totais tambm apresentaram reduo com relao ao perodo anterior da adio de cianeto. As contagens de acidognicas e de metanognicas foram reduzidas de 109 para 104, restabelecendo-se os valores aps nove dias da adio de cianeto. Os resultados das amostragens feitas aps a adio de cianeto permitiram comprovar que no primeiro dia houve reduo do nmero de todos os grupos fisiolgicos de microrganismos avaliados, sendo a recuperao das acidognicas mais acentuada que os demais grupos. No dcimo quinto dia aps a adio, houve inverso de grupos de microrganismos, predominando o grupo das acidognicas sobre as metanognicas (MC). No MM as metanognicas estritas diminuram, assim como o nmero total de microrganismos. O pico observado na produo de gs mostra que parte da metanognicas continuou em atividade, produzindo metano a partir dos cidos existentes. O esgotamento desse substrato poderia ser evidenciado pelo aumento do pH e pela queda subsequente da produo de gs, o que no chegou a ser observado. Esta rpida recuperao do sistema aps uma carga de choque de cianeto em dose nica pode estar relacionada com o leito fixo do reator alimentado continuamente, o que leva o reator a uma maior estabilidade operacional por reter dentro do reator por maior tempo os microrganismos anaerbios.

Concluses
De acordo com os objetivos propostos nesse trabalho, em que

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se desejava testar uma metodologia prtica e de custo baixo de avaliao de diferentes grupos de microrganismos que predominam em reatores de fases separadas baseado na tcnica desenvolvida por Hungate em 1950, a pesquisa desenvolvida permitiu concluir que: - o c h o q u e t r m i c o p e l a pausterizao a 80o C pelo tempo de quinze minutos foi suficiente para eliminar as arquias metanognicas, inclusive as termfilas que se desenvolvem em altas temperaturas. Essa prtica permitiu separar e avaliar os grupos de acidognicas e metanognicas; - o MM pode ser considerado como meio de cultivo seletivo para o grupo de

metanognicas estritas, no tendo sido constatado crescimento de acidognicas nesse meio; - a metodologia refletiu as variaes no processo fermentativo acidognico e metanognico nos reatores estudados. Ressalta-se que a pesquisa focou as condies operacionais para os tipos de reatores avaliados na digesto anaerbia de gua residuria de mandioca e, que um estudo mais detalhado necessrio para validar a tcnica em outras condies experimentais. Alm disso, recomenda-se o uso de tcnicas mais modernas quando se faz necessria preciso ou identificao dos grupos de microrganismos envolvidos.

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