VII Congreso Nacional de Ciencia de los Alimentos y III Foro de Ciencia y Tecnologia de Alimentos

Guanajuato, Gto.
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Comparacin de dos Mtodos de Extraccin de Antocianinas en Ficus carica Variedad
Misin

Aguilera Ortz Miguel
1
, Alanis Guzmn Mara Guadalupe
2
y Reza Vargas Mara del Carmen
1

1
Facultad de Ciencias Qumicas-UJED.
2
Facultad de Ciencias Biolgicas-UANL. Av. Artculo
123 s/n, Fracc. Filadelfia. Gmez Palacio, Dgo. Tel. 01 (871) 715 88 10. Fax 01 (871) 715 29
64 e-mail: maotsetung@mixmail.com.

Resumen
Soluciones de metanol acidificado y acetona fueron usadas para extraer antocianinas de piel
de higo congelada, en un proceso no continuo. El tipo de mtodo y tamao de muestra
fueron factores significativos en el proceso de extraccin, donde el metanol acidificado fue
ms eficiente que la acetona en la extraccin producida. Un escaneo espectrofotomtrico a
diferentes longitudes de onda (regin visible) fue determinado en los extractos. Los valores
de absorbancia observados fueron ms altos a 520 nm. Una solucin de metanol:agua:cido
frmico (70:28:2) es recomendada para la extraccin de antocianinas a tamaos de muestra
menores a 1 g; sin embargo, a tamaos de muestra mayores a 2 g una solucin de acetona
es recomendada. Tambin fueron obtenidos extractos metanlicos de pi el es l i ofi l i zadas
observando val ores ms al tos de absorbanci a en muestras l i ofi l i zadas no
resuspendi das en agua que en muestras l i ofi l i zadas y resuspendi das en agua.
Adems un escano de pH fue realizado, encontrando que las antocianinas son
dependientes del pH, encontrndose rojas a pH = 2 y azules a pH = 8.
Palabras clave: antocianinas, extraccin, solvente, absorbancia.
Abstract
Solutions of acidificated methanol and acetone were used to extrac anthocyanins from frozen
fig skin, in a no continuos process. The kind of method and size of sample were significative
factors in process of extraction, where acidificated methanol was more efficient than acetone
in yield extraction. A spectrophotometric screening to different wavelengths (visible range)
was determined in the extracts. Values of absorbance were taller at 520 nm. A solution of
methanol: water: formic acid (70:28:2) is recommended for extraction of anthocyanins to size
of samples less than 1 g; however, a size of samples majorities than 2 g a solution of acetone
is recommended. Also, extracts methanolics were obtained from frozen fig skin liofilized
showing values higher of absorbance in liofilized samples no dissolved in water than liofilized
samples and dissolved in water. In addition, a screening of pH was realized, finding that
anthocyanins are dependents of pH; they are red to pH = 2 and blue to pH = 8.
Key words: anthocyanins, extraction, solvent, absorbance.


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Introduccin
Hay una fuente importante de colorantes naturales presentes en frutas rojas tales como
cerezas, ciruelas, fresas, frambuesas, zarzamoras, uvas, pasas rojas y negras (Jackson et
al, 1978; Frankel et al, 1995; Lepidot et al, 1999). Restricciones en el uso de colorantes
sintticos en alimentos ha conducido al inters en el uso potencial de antocianinas como un
colorante alimenticio en bebidas, jarabes, jugos de frutas, gelatinas, mermeladas, helados,
dulces de pasta y yogures, tan bien como en pasta dental, farmacuticos, cosmticos y
productos similares (Clydesdale y Francis, 1976; Durante, 1995). Pigmentos presentes en
pieles de higo negro pueden ser industrialmente extrados usando dos procesos de
extraccin junto con cido frmico. La produccin de ste pigmento bajo estos mtodos de
extraccin no es solamente para recuperar la mayor cantidad posible pero tambin para
obtener un ingrediente valuado comercialmente alto. Wilkinson et al comenz a extraer
antocianinas en 1977 usando metanol con pequeas cantidades de HCl (Nollet, 1996). La
acidificacin con cidos fuertes como el HCl sirve para mantener un pH bajo. Este puede, sin
embargo, alterar la forma nativa del complejo de pigmentos rompiendo asociaciones con
metales, copigmentos y protenas (Moore et al, 1982). Para obtener antocianinas lo ms
naturalmente posible el uso de solventes neutros (por ejemplo, 60% metanol, etilenglicol, n-
butanol, acetona) y cidos orgnicos dbiles (cido frmico, cido actico) han sido
recomendados (Hendry, 1992). Kalt y MacDonald (2002), describieron un proceso para la
recuperacin de antocianinas de arndano con un sistema solvente de MeOH:H
2
O:cido
frmico (70:28:2) (Agilent Technologies, 2002). Garca-Viguera et al (1998a), usaron un
mtodo para la extraccin de antocianinas con acetona y al final del proceso acidificaban el
extracto con agua acidificada (cido frmico al 3%). El presente trabajo fue conducido para
desarrollar un mtodo para extraer antocianinas de pieles de higo congelado usando
soluciones de metanol y acetona como solventes, para evaluar cul de los dos pudiera ser
elegido como mtodo de extraccin. Los valores de absorbancia observadas fueron tomadas
como parmetros de referencia en cada proceso para decidir su eleccin.

Materiales y Mtodos
Los higos Ficus carica var. Misin fueron adquiridos directamente de la planta procesadora
de higo, ubicada en lvaro Obregn, Mpio. de Lerdo, Dgo. Los higos fueron cosechados en
un estado de maduracin industrial. Los lotes de higos frescos fueron almacenados en un


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cuarto fro de 0-5C conforme llegaban de la planta procesadora. Posteriormente, se separ
la piel y la pulpa del tejido manualmente con un cuchillo. Una vez separadas las pieles, se
almacenaron en un congelador a -20C aproximadamente en bolsas de plstico hasta el
momento de ser analizadas. Una vez congel adas l as pi el es de hi go, se l i ofi l i zaron
usando un l i ofi l i zador Labconco Freezone.
Extraccin de antocianinas. Un proceso no-continuo de extraccin fue empleado durante
todo el experimento. Previamente se determin el % de humedad y el % de slidos de la piel
de higo congelada, por el mtodo tradicional de la estufa de desecacin. Esto con el objetivo
de establecer un tamao de muestra determinado en base a los slidos de la piel. Se llev a
cabo la extraccin de las antocianinas, probando soluciones de metanol acidificado y
soluciones de acetona. Para poder correr la extraccin con metanol acidificado, se
manejaron cinco tamaos de muestra (en base al % slidos= 20% ) que fueron 40, 80, 120,
160 y 200 mg, respectivamente. El mtodo se bas en obtener un extracto metanlico
(metanol:agua:cido frmico) a partir de la piel de higo congelada, donde posteriormente se
hizo un escaneo a diferentes longitudes de onda en un espectrofotmetro en la regin visible
(510, 515, 520, 535, 546 y 550 nm, respectivamente). Cada tamao de muestra fue
previamente molida (molino para especies) para homogenizar la muestra. Enseguida, la piel
de higo congelada y homogenizada se coloc en un frasco de vidrio conteniendo ste 10 mL
de una solucin fra de metanol acidificado (MeOH:H
2
O:cido frmico; 70:28:2). La mezcla
se coloc en una licuadora (Osterizer) y se moli por espacio de 10 min a una velocidad de
4. Despus de la molienda, la mezcla obtenida se filtr a vaco. Finalmente, el filtrado se dej
reposar por 1 hora en la oscuridad. Pasado este tiempo, se hizo un escano a diferentes
longitudes de onda en un espectrofotmetro y por ltimo se tomaron las lecturas de
absorbancia para cada longitud de onda. Adicionalmente, se usaron otros tamaos de
muestra, aumentando el porcentaje de slidos en base a un gramo de muestra congelada,
de 2 a 20%, respectivamente. Por lo tanto, los tamaos de muestras empleados fueron 400,
800, 1200, 1600 y 2000 mg, respectivamente. Para la extraccin con acetona, se manejaron
tres tamaos de muestra: 2, 4, y 6 g, respectivamente. El mtodo se bas en obtener un
extracto acetnico (concentrndolo a vaco y resuspendindolo en agua acidificada) a partir
de la piel de higo congelada. Cada tamao de muestra (previamente homogenizada) se
coloc en un vaso de precipitado conteniendo 15 mL de una solucin de acetona.
Enseguida, se dej reposar esta mezcla por 5 min a temperatura ambiente, una vez obtenido
el extracto acetnico, se flitr a vaco. Estos filtrados se concentraron en una estufa a vaco a


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35C por 6 horas aproximadamente. Despus, se resuspendieron los extractos con 5 mL de
una solucin de agua acidificada (3% de cido frmico). Finalmente, se hizo un escano a
diferentes longitudes de onda en un espectrofotmetro y por ltimo se tomaron las lecturas
de absorbancia para cada longitud de onda. Despus de lo anterior se utilizaron los extractos
metanlicos para llevar a cabo un screening de pH y color (titulando con cido y base),
usando piel de higo congelada y liofilizada.

Resultados y Discusin
Soluciones de metanol acidificado fueron efectivas en la extraccin de antocianinas de piel
de higo congelada a tamaos de muestra menores de 1 g, como se puede observar en el
Cuadro 1., donde la tendencia observada fue que el valor de la absorbancia aument
conforme se pas de una onda de longitud pequea a una ms grande, sin embargo al llegar
a 520 nm aqu se registraron los valores ms altos y a partir de este valor nuevamente
descendi el valor de la absorbancia. De la misma manera pas con el tamao de muestra,
sin embargo, al pasar de un tamao de muestra cuatro (160 mg) a un tamao de muestra
cinco (200 mg) descendi el valor de la absorbancia.

Cuadro 1. Valores Promedios de Absorbancia de Extractos Metanlicos Acidificados a
Diferentes Longitudes de Onda (Regin Visible) y con Diferentes Tamaos de Muestra.

Longitud de Onda, Tamao
de
muestra,
mg

510

515

520

535

546

550
40 0.740 0.763 0.778 0.776 0.682 0.633
80 0.842 0.861 0.877 0.860 0.782 0.738
120 0.819 0.848 0.872 0.848 0.726 0.656
160 1.365 1.424 1.470 1.447 1.240 1.117
200 1.140 0.973 1.013 0.996 0.824 0.724

Con lo anterior, confirmamos que a mayor tamao de muestra se extraen mejor las
antocianinas y que la mejor lectura se da en 520 nm en la regin visible, usando el mtodo
del metanol acidificado. El pigmento extrado como una funcin del tamao de muestra y de


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la longitud de onda es mostrado en la Fig. 1. Cuando se us un tamao mayor en base a los
slidos (de 2 a 20%) se pudo observar un comportamiento similar que al inicio. Lgicamente,
la concentracin obtenida aument significativamente. Como vemos en Cuadro 2, el
comportamiento fue similar al del primer experimento.

Figura 1. Espectro de Absorcin de Extractos Metanlicos Acidificados de Antocianinas en la
Regin Visible a Diferentes Tamaos de Muestra.

Cuadro 2. Valores Promedios de Absorbancia de Extractos Metanlicos Acidificados a
Diferentes Longitudes de Onda (Regin Visible) y con Diferentes Tamaos de Muestra.
Longitud de Onda, Tamao
de
muestra,
mg

510

515

520

535

546

550
400 1.765 1.832 1.888 1.861 1.614 1.469
800 3.066 3.111 3.134 3.068 2.762 2.515
1200 3.683 3.735 3.740 3.714 3.443 3.185
1600 3.835 3.824 3.834 3.820 3.809 3.760
2000 3.873 3.868 3.821 3.856 3.829 3.821

Tambin podemos comentar que el valor de la absorbancia aumentaba conforme
pasbamos de una onda de longitud pequea a una ms grande, sin embargo al llegar a 520
nm aqu se registraban los valores ms altos y a partir de este valor nuevamente descenda
el valor de la absorbancia. De la misma manera pas con el tamao de muestra. Sin
0
0.5
1
1.5
A
B
S
O
R
B
A
N
C
I
A
i
510 515 520 535 546 550
Longitud de Onda, nm

40 mg
80 mg
120 mg
160 mg
200 mg


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embargo, algunos valores obtenidos no mantuvieron este comportamiento. Como
previamente comentamos, el comportamiento de los datos para los tamaos de muestras
cuatro y cinco no mostraron la misma tendencia de aumentar conforme aumentaba la
longitud de onda; en consecuencia, en este experimento el dato ms alto (absorbancia) se
observ en una longitud de onda ms baja y en un tamao de muestra ms grande, en
comparacin con el primer experimento realizado. El pigmento extrado como una funcin
del tamao de muestra y de la longitud de onda es mostrado en la Fig. 2.

Figura 2. Espectro de Absorcin de Extractos Metanlicos Acidificados de
Antocianinas en la Regin Visible a Diferentes Tamaos de Muestra.

A tamaos de muestras menores de 1 g, extractos acetnicos de antocianinas no fueron
obtenidos, sin embargo, a tamaos de muestra superiores a 2 g, soluciones de acetona son
recomendadas. Posteriormente, se realiz otra corrida experimental usando 2, 4 y 6 g como
tamaos de muestra. Una vez obtenido el extracto acetnico, se filtr dicho extracto.
Finalmente, se estabiliz la temperatura y se consigui concentrar los extractos. Se realiz la
resuspensin en agua acidificada (3% cido frmico. Los resultados obtenidos del escano a
diferentes longitudes de onda se dan en el Cuadro 3.

0
1
2
3
4
A
B
S
O
R
B
A
N
C
C
I
A

510 515 520 535 546 550
Longitud de Onda, nm
400 mg
800 mg
1200 mg
1600 mg
2000 mg


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Cuadro 3. Valores Promedio de Absorbancia de Extractos Acetnicos a Diferentes
Longitudes de Onda (Regin Visible) y con Diferentes Tamaos de Muestra.
Longitud de Onda, Tamao
de
muestra,
g

510

515

520

535

546

550
2 3.779 3.782 3.792 3.673 3.319 2.992
4 3.856 3.861 3.847 3.839 3.802 3.807
6 3.867 3.844 3.877 3.859 3.846 3.807

Los valores de absorbancia obtenidos de esta corrida experimental son diferentes y
ligeramente ms altos que por el mtodo de metanol acidificado. El pigmento extrado como
una funcin del tamao de muestra y de la longitud de onda es mostrado en la Fig. 3.

Figura 3. Espectro de Absorcin de Extractos Acetnicos de Antocianinas en la
Regin Visible a Diferentes Tamaos de Muestra.

Referente a las muestras liofilizadas resuspendidas en agua y no resuspendidas en agua,
podemos observar que se obtiene un valor de absorbancia ms alto en muestra liofilizada no
resuspendida con agua que en muestra liofilizada y resuspendida en agua. Por otro lado, los
extractos metanlicos, al ser titulados con el HCl 0.1 N su color rojo dbil se intensifica a un
rojo ms fuerte con forme desciende el valor del pH; de acuerdo con Nollet (1996), reporta
que en medios fuertemente cidos (a valores por debajo de 2) las antocianinas existen en su
forma coloreada roja como cationes de flavilium. Los extractos metanlicos obtenidos de piel
de higo congelada y liofilizada, al ser titulados con el NaOH 0.1 N su color rojo dbil decrece
y cambia de rojo a azul oscuro con forme aumenta el valor del pH; segn Nollet (1996),
0
1
2
3
4
A
B
S
O
R
B
A
C
I
A

510 515 520 535 546 550
Longitud de Onda, nm
2 g
4 g
6 g


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comenta que a valores de pH dbilmente cidos, neutros y bsicos, el carbinol y las formas
de la base quinonoidal dominan al cation flavilium, tanto que el color decrece y cambia de
rojo a azul.
Conclusiones
El mtodo de metanol acidificado fue mejor con respecto al de acetona, usando un tamao
de muestra menor a 1 g. El mtodo de soluciones de acetona fue mejor comparado con el de
metanol acidificado, usando un tamao mayor de 2 g. De acuerdo al tamao de muestra, el
mtodo de metanol acidificado es ms sensible, menos complicado y con menos tiempos de
espera que el de la acetona. Sin embargo, aunque ligeramente, en cuanto a cantidad de
extraccin, el de la acetona es recomendado. Las mejores absorciones de antocianinas a
partir de piel de higo congelada se observaron a 520 nm en la regin visible del espectro de
absorcin. Con respecto a las pieles liofilizadas, se observan valores ms altos de
absorbancia en muestras liofilizadas no resuspendidas en agua que en muestras liofilizadas
y resuspendidas en agua. Las antocianinas se comportan dependientes del pH,
encontrndose rojas a pH = 2 y azules a pH = 8.

Bibliografa
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