PRACTICA N 03 TITULO: PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO EJECUTORES: RESUMEN En la tercera prctica se realizo en el laboratorio de microbiologa q se encuentra ubicado el segundo

piso de la facultad de medicina cuyos objetivos fueron: a) Determinar cual es la forma adecuada de llevar a cabo el proceso de esterilizacin. b) Conocer la elaboracin de un medio de cultivo y llevarla a cabo, el mtodo aplicado fue el explicativo y demostrativo, mediante el cual se da a conocer cual es la correcta forma de preparacin de un medio de cultivo iniciando con la esterilizacin y finalizando con la prueba de calidad. Palabra clave.- Medio de cultivo, Esterilizacin ABSTRACT In the third practice accomplish him q finds herself located in the microbiology laboratory the medical faculty's second floor whose objectives attended: a) Determining to as is the adequate form carry-out to end the sterilization process . b ) Knowing the elaboration of a cultivation midway and to take her to end, the method once was applied was the explicative and demonstrative, intervening which makes itself known as the correct form is of preparation of a cultivation midway initiating with the sterilization and finalizing with the quality test.
Key word: I mediate of cultivation, SterilizationTo

I.

INTRODUCCIN: Medio de cultivo.- consiste en un gel o una solucin que cuenta con los nutrientes necesarios para permitir (bajo condiciones favorables de pH y temperatura) el crecimiento de virus, microorganismos, clulas o incluso pequeas plantas. Segn qu se quiera hacer crecer, el medio requerir unas u otras condiciones. Generalmente se presentan desecados en forma de polvo fino o granular antes de ser preparados, al prepararse podemos encontrarlos en estado slido, semislido y lquido.

II.

OBJETIVOS

Determinar cual es la forma adecuada de llevar a cabo el proceso de esterilizacin. Conocer la elaboracin de un medio de cultivo y llevarla a cabo

III.

MTODOS Los mtodos aplicados en la siguiente prctica fueron el explicativo y demostrativo

La practica se inicio dando a conocer cuales son los instrumentos y materiales que se utilizaran los cuales primero fueros sometidos al proceso de esterilizacin Paso I esterilizado Los materiales entre los cuales encontramos a las CAJA PETRI tubos de ensayo fueron preparados de la siguiente forma: 1. Matraz y tubos de ensayo tapados con un tampn a base de gasa y algodn.

Imagen 1 Matraz con tapn a base de gasa y algodn

2. Para despus ser cubiertos por papel par llevar a la bandeja del autoclave.

Imgenes 2 Bandeja del auto clave con materiales q sern sometidos a esterilizacin

3. En tanto se realizaba estos paso tambin se estaban preparando los medios de cultivo.

Siguiendo los siguientes pasos: Preparacin del medio de cultivo 15-20 ml medio de cultivo Agar dexhosa saboreaud hongos

65 Ag -----------------------------1l (1000ml) X-----------------------------60 ml X = 3.9g Ag ------------------------- 60ml Agar nutritivo 31g An------------------------------------1l (1000ml) X--------------------------------------60ml

X ---------------1.86g Los compuestos unas ves pesadas se pusieron en su respectivo Matraz para ser combinado y ser sometido a ebullicin en la cocina elctrica la cual estaba a cada instante siendo movida.

Imgenes 3 matraz con los medios de cultivo, probeta con agua medida a 60 ml, muestras en la cocina, preparacin de medio de cultivo

4. Cavado ambos pasos primero se cada uno de los Matraces se cubrieron con papel y fueron llevados al auto clave 5. El proceso de auto clavado se realizaron de la siguiente manera

Conteniendo en su interior agua destilada para poder esterilizar a. A 15 libras b. A una temperatura de 121C c. Por un tiempo de 15 minutos

Imgenes 4 autoclave

Imgenes 4 tabla de control del autoclave

6. Transcurrido en tiempo establecido se prosigui con el plaqueo y control de clida de la muestra, la cual se dio de la siguiente forma a. Primero se quita los papeles de las placas Petri al igual q de los matraces b. En presencia del fuego q genera un mechero se realiza el plaqueo respectivamente para evitar cualquier tipo de contaminacin.

Imgenes 5 placas Petri envueltas en papel, estudiante desenvolviendo placas Petri, mechero encendido para proceso de preparacin de medio de cultivo.

7. El plaqueo consiste en llevar en contenido de agar a las respectivas placas Petri finalizado este proceso se gira suavemente las placas para q el liquido se desplace uniformemente, este movimiento debe ser lento.

Imgenes 6 medio de cultivo en el matraz siendo esterilizado por en mechero, agregacin del medio de cultivo a la placa Petri, movimiento lento para acomodacin de medo de cultivo

8. Acabado este proceso se procede a marcar cada placa

Imgenes 7 placas Petri marcadas con plumn indeleble

IV.

RESULTADOS Fuente terica DISEO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO A la hora de disear un medio de cultivo no slo hay que tener en cuenta los nutrientes sino tambin las condiciones fsicas que permitan el crecimiento de los microorganismos. 1.- Aporte de nutrientes La cantidad y naturaleza de los nutrientes en un medio de cultivo viene determinada por el rendimiento de un producto en especial adems de los requerimientos nutricionales de los microorganismos. 2.- pH Un microorganismo puede alterar el pH del medio de cultivo como resultado de las sustancias producidas por el propio microorganismos; por ejemplo: Utilizacin de carbohidratos ----> Produccin de cidos orgnicos ----> Acidificacin Catabolismo de protenas ----> Produccin de materiales nitrogenados ----> Alcalinizacin

Estos cambios pueden llegar a ser tan grandes que inhiban el crecimiento de los microorganismos. Estos cambios se pueden prevenir controlando el pH mediante sistemas tampn. Uno de los ms utilizados en microbiologa es la combinacin de KH2PO4 y K2HPO4 tamponando el medio a un pH de aproximadamente 6,8. 3.- Necesidades de gases Los gases principales que afectan al desarrollo microbiano son el oxgeno y el dixido de carbono. Las bacterias presentan una respuesta amplia y variable al oxgeno libre clasificndose en cuatro grupos: 1. Aerobias: bacterias que se desarrollan en presencia de oxgeno libre. 2. Anaerobias: bacterias que se desarrollan en ausencia de oxgeno libre. 3. Anaerobias facultativas: bacterias que se desarrollan tanto en presencia como en ausencia de oxgeno libre. 4. Microaerfilas: bacterias que crecen en presencia de pequeas cantidades de oxgeno libre.

Para desarrollar bacterias aerobias se incuban los medios de cultivo en agitacin constante o introduciendo aire estril en el medio.

Los anaerobios estrictos son muy sensibles al O2 por lo que se debe evitar la exposicin de estos microrganismos al O2. Se puede obtener un ambiente de anaerobiosis por los siguientes mtodos:

A.- Agregando al medio de cultivo un compuesto reductor, como es el tioglicolato sdico, para disminuir el contenido de O2. B.- Quitando el O2 por procedimientos mecnicos y remplazndolo por N2 o CO2. C.- Mediante reacciones qumicas dentro del recipiente que contiene el medio de cultivo inoculado para combinar el oxgeno libre con otro compuesto. Por ejemplo: al encender una vela se transforma el oxgeno en dixido de carbono. 4.- Suministro de luz Los organismos fotosintticos debern ser expuestos a una fuente de iluminacin ya que la luz es su fuente de energa. Esta fuente de iluminacin no debe plantear problemas de variacin de temperatura, por lo que suelen usarse lmparas fluorescentes con un desprendimiento mnimo de calor. 5.- Control de la temperatura

El desarrollo de las bacterias depende de reacciones qumicas, y la velocidad con que se efectan estas reacciones est influida por la temperatura, por lo que la temperatura puede en parte determinar la velocidad de crecimiento de los microrganismos. Cada especie microbiana posee una temperatura ptima de crecimiento clasificndose segn esto en los siguientes grupos: a) Psicrfilas: capaces de desarrollarse a 0 C o menos. Su temperatura ptima es alrededor de los 15 C. b) Mesfilas: crecen mejor entre 25 y 40 C. c) Termfilas: crecen mejor entre 45 y 60 C.

6.- Otros requerimientos Halfilas: bacterias que para su crecimiento requieren altas concentraciones de sal (10 15%). Son aquellas bacterias aisladas del mar y ciertos alimentos. Otras bacterias, como las aisladas en las fosas marinas, requieren presiones superiores a las normales. TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO 1.- Estado: A.- Medios lquidos B.- Medios slidos: llevan un agente solidificante (Agar) que es un polisacrido acdico producido por ciertas algas rojas que gelifica por debajo de 45 C. Se usa a una concentracin del 1,5%. C.- Medios semislidos: agar a una concentracin del 0,7%. 2.- Composicin:

A.- Medios sintticos o qumicamente definidos. Llevan fuente de carbono, fuente de nitrgeno, sales que suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca...), otros elementos como son estimuladores del crecimiento (eritritol para Brucella abortus) pero siempre a concentraciones conocidas. B.- Medios complejos o de composicin indefinida. Estos medios llevan ingredientes como extracto de levadura, peptona, infusin de cerebro, extracto de carne, etc. que contienen nutrientes en abundancia pero sin saber con exactitud la composicin cualitativa ni cuantitativa de estos nutrientes. C.- Medios de enriquecimiento. Son medios complejos (normalmente) con aditivos adicionales para favorecer el crecimiento de determinados microorganismos

(particularmente hetertrofos exigentes). Ejemplo: adiccin de sangre, suero o extractos de tejidos de animales y plantas. D.- Medios selectivos. Son aquellos que favorecen por su diseo el crecimiento especfico de un microorganismos particular (o grupo de microorganismos). Es de gran utilidad para el aislamiento de microorganismos a partir de una poblacin microbiana mixta. Ejemplo: CO2 como fuente de carbono es selectivo para autotrofos; adiccionando cristal violeta se inhibe el crecimiento de los Gram (+); utilizando maltosa como nica fuente de carbono slo crecern los que usen maltosa. E.- Medios diferenciales. Son aquellos destinados a facilitar la discriminacin de microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios. Ejemplo: Agar sangre diferencia hemolticos de no hemolticos; McConkey diferencia lactosa (+) de lactosa (-). F.- Medios de mantenimiento. Suelen ser distintos a los de crecimiento ptimo ya que el crecimiento rpido y prolfico suele ocasionar la muerte rpida de las clulas. Ejemplo: al aadir glucosa y utilizarla los microorganismos producen cidos, acidificndose el medio por lo que es preferible no utilizar glucosa en los medios de mantenimiento. Agar sangre: Apto para el crecimiento de la mayora de los microorganismos de importancia clnica y para estudiar su propiedad hemoltica. Se usa una base nutriente y sangre ovina estril al 5%. El AS al 5% con base de Tripticasa-Soja es un medio de uso general que permite el crecimiento tanto de microorganismos exigentes como no exigentes, que incluyen bacterias aerobias y anaerobias, aunque no es medio de eleccin para anaerobios. Permite visualizar reacciones hemolticas que producen muchas especies bacterianas. Tiene por base una fuente proteica (digeridos trpticos, digeridos proteicos de soja) con una pequea cantidad de hidratos de carbono naturales, cloruro sdico y 5% de sangre. La aportacin de caseina y peptonas de soja al agar de Tripticasa-soja hace el medio en muy nutritivo por el suministro de nitrgeno orgnico, particularmente aminocidos y pptidos de cadena ms larga. La presencia de estas peptonas en el medio permite el cultivo de una gran varedad de grmenes aerobios y anaerobios que crecen rpidamente, as como los del gnero Candida. Tambn permite el crecimiento de algunos grmenes exigentes como estreptococos, pneumococos, Brucella, corinebacterias, Erysipelothrix y Pasteurella. El cloruro sdico proporciona electrolitos esenciales. La adicin de sangre de carnero desfibrinada enriquece la base y lo hace un medio adecuado para realizar la prueba del factor CAMP.

Permite as mismo determinar la capacidad de algunas bacterias de producir enzimas extracelulares que actan sobre los glbulos rojos, ya sea por lisis completa (hemlisis beta, produce un halo transparentealrededor de la colonia hemoltica), parcial (hemlisis alfa, coloracin verdosa alrededor de la colonia) o por ausencia de alteracin (hemlisis gamma). La produccin de hemolisinas por las bacterias depende de muchos factores ambientales como pH o atmsfera de incubacin. Las muestras que puedan contener Brucella o Neisseria deben incubarse en atmsfera enriquecida en CO2. Si se aade al medio el 0,5% de telurito potsico es muy til par el cultivo y aislamiento selectivo de Corynebacterium diphteriae, Candida albicans, Listeria y estreptococos. PROCEDIMIENTO: pesar el medio segn las indicaciones del envase, (staphylococus 110 44.7gr y agar sangre 12gr) Calentar agua Vaciar el medio a un matrz Erlem Meyer y disolverlo. Calentarlo con agitacin hasta que se haga translucido, cuidando que no ebulla demasiado y as evitar que se derrame. Se prepara para esterilizar y se pone a esterilizar a 15 lbs / 15 min. ya estril, esperar a que baje la temperatura hasta poderla soportar con las manos, ya que si se enfra demasiado se gelatiniza. Vaciar el medio a las cajas de petri, dejndola en la campana esteril, abiertas hasta que se enfre. se deja enfriar, despus se tapa y se almacena en un refrigerador previamente envueltas en papel hasta su uso. MATERIAL: agua staphylococus 110 agar sangre sangre autoclave cajas de petri

vaso de precipitado matraz parrilla balanza esptula agitador algodn gasa Resultado positivo. el proceso realizado de manera correcta pero no al 100% debido a que una de las placas con medio de cultivo no paso el proceso de control de calidad.

V.

CONCLUSIONES Se determino cual es la forma adecuada de llevar a cabo el proceso de esterilizacin de los materiales de laboratorio. Se llego a conocer la elaboracin de un medio de cultivo y cual era la forma correcta de llevarla a cabo.

VI.

SUGERENCIAS Para un mejor aprendizaje del curso de microbiologa y parasitologa, se sugiere que el estudiante venga ya con saberes previos.

VII.

BIBLIOGRAFA Wikipedia. La Enciclopedia Libre. http://perso.wanadoo.es/sergioram1/medios_de_cultivo.htm

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE BAJA CALIFORNIA FACULTAD DE ODONTOLOGA Laboratorio de Microbiologa PRCTICA #4 Elaboracin de los Medios de Cultivo http://www.fagro.edu.uy/~fisveg/docencia/cursos%20posgrado%20y%20o ptativos/curso%20de%20micropropagacion/mateoricos/Medios%20de%2 0cultivo.pdf