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B1446421 B1445862

B1446562 B1445221

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Gram Britania
Uso Reactivos utilizados para realizar la coloracin de Gram a los microorganismos a partir de muestras clnicas y/o a partir de cultivos microbianos. Fundamento La coloracin de Gram ha constituido desde los albores de la microbiologa un elemento fundamental para la taxonoma e identificacin de los microorganismos. Es uno de los ensayos bsicos en bacteriologa y constituye una ayuda invalorable en la identificacin microbiana. La observacin microscpica no basta para hacer diagnstico bacteriolgico pero es de fundamental importancia como orientacin del camino a seguir para una correcta identificacin bacteriana as como para dar una presuncin rpida de los agentes patgenos observados en el material en estudio. El comportamiento de los microorganismos como patgenos y la sensibilidad antibacteriana difieren sustancialmente; de ah que la realizacin rpida de una coloracin de Gram reviste enorme importancia en Bacteriologa Clnica. El investigador dans Christian Gram en 1884 demostr que ciertos microorganismos coloreados con violeta de genciana (cristal violeta) y mordentados con solucin de lugol, cuando eran sometidos a la accin de una mezcla alcohol-acetona se decoloraban mientras que otros retenan el color violeta. Esto ha constituido uno de los grandes pilares de la bacteriologa ya que permiti la divisin de los grmenes en Gram negativos y Gram positivos respectivamente, grupos que presentan caractersticas bien definidas que orientan no solo el diagnstico etiolgico sino tambin a la actitud teraputica. Luego del descubrimiento casual realizado por Christian Gram, pasaron muchos aos durante los cuales se efectuaron las ms variadas especulaciones sobre el mecanismo de esta coloracin. Resultaba indudable, sin embargo, su practicidad a los fines de la identificacin. El conocimiento de las estructuras de las membranas bacterianas, tanto en el aspecto fsico como en su composicin molecular que fueron logrados a partir de la dcada del sesenta, demostr que la coloracin de Gram distingue dos grupos de bacterias totalmente diferentes. La diferencia de la reaccin entre bacterias Gram positivas y Gram negativas es atribuida a diferencias qumicas y fsicas de su pared celular. Las bacterias Gram positivas presentan una gruesa capa de peptidoglicano como estructura fundamental por sobre la membrana citoplasmtica mientras que las bacterias Gram negativas presentan por sobre la membrana citoplasmtica una delgada capa de peptidoglicano a la que se superpone una capa de lipopolisacridos-lipoprotena denominada membrana externa. La presencia de esta membrana externa diferencia actualmente dos divisiones en sistemtica bacteriana: las que no lo poseen, Firmicutes (Gram positivas) y las que s la poseen, Gracilicutes (Gram negativas). En la coloracin de Gram, el violeta de genciana (cristal violeta) es captado en la pared celular de bacterias Gram positivas y Gram negativas y luego se forma un complejo con el lugol. El decolorante acta extrayendo los lpidos de la membrana externa de la pared celular de las bacterias Gram negativas lo que produce un aumento en la permeabilidad y se pierde el complejo formado entre el violeta de genciana y el lugol. Al agregar la safranina, las bacterias Gram negativas toman el color de este contracolorante y se observan de color rosado. A diferencia de estas, en las bacterias Gram positivas el agregado del decolorante produce disminucin de la permeabilidad e incrementa la retencin del complejo del violeta de genciana-iodo. El resultado es que se observan de color violeta por la retencin del mismo. Laboratorios Britania ha logrado un equipo colorante estable para Gram que permite obtener excelentes tinciones en 2 minutos gracias a la purificacin de los colorantes y a la eleccin de las modificaciones que en nuestra experiencia dan los mejores resultados. Contenido y composicin Gram Britania Equipo Cdigo B1446082: - Violeta para Gram: solucin de violeta de genciana (cristal violeta) 0.2%. Envase x 100 ml. - Lugol concentrado: solucin concentrada 10X. Ampolla x 10 ml. Permite preparar 100 ml de solucin. - Decolorante para Gram: solucin constituida por mezcla de

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partes iguales de alcohol acetona. Envase x 100 ml. - Safranina para Gram: solucin de safranina 0.25%. Envase por 100 ml. Instrucciones: Los colorantes violeta de genciana y safranina y el decolorante para Gram se encuentran listos para usar. El lugol est concentrado 10X y debe ser diludo 1/10 previo al uso. Se pueden preparar 100 ml de solucin y se recomienda envasarlo en frasco gotero de vidrio. Gram Britania Repuesto (solucin concetrada 10X) Cdigo: B1446281: - Violeta de genciana (cristal violeta): solucin concentrada 10X (2 %). Ampolla x 10 ml. - Lugol: solucin concentrada 10X. Ampolla x 10 ml. - Safranina: solucin concentrada 10X (2.5%). Ampolla x 10 ml. Instrucciones: Las soluciones estn concentradas 10X y deben ser diludas 1/10 previo al uso. Se pueden preparar 100 ml de cada solucin. Violeta de Genciana en solucin (solucin concentrada 10X) Cdigo: B1446421: 3 ampollas x 10 ml. Cdigo: B1446562: envase x 500 ml. Instrucciones: Las soluciones estn concentradas 10X y deben ser diludas 1/10 previo al uso. Se pueden preparar 100 ml y 5 litros respectivamente de la solucin. Lugol Ampollas (solucin concentrada 10X) Cdigo: B1446321: 3 ampollas x 10 ml Cdigo: B1446362: envase x 500 ml. Instrucciones: El lugol est concentrado 10X y debe ser diludo 1/10 previo al uso. Se pueden preparar 100 ml y 5 litros respectivamente de la solucin y se recomienda envasarlo en frasco gotero de vidrio. Decolorante para Gram Cdigo: B1445862: envase x 500 ml Instrucciones: Decolorante listo para usar. Safranina en solucin (solucin concentrada 10X) Cdigo: B1445221: 3 ampollas x 10 ml. Cdigo: B1445262: envase x 500 ml. Instrucciones: Las soluciones estn concentradas 10X y deben ser diludas 1/10 previo al uso. Se pueden preparar 100 ml y 5 litros respectivamente de la solucin. Caractersticas del producto - Violeta de genciana (cristal violeta): solucin color violeta. - Lugol: solucin color marrn. - Decolorante: solucin incolora. - Safranina: solucin rojiza. Almacenamiento A 10-35 C, protegidos de la luz. Procedimiento Para obtener una excelente coloracin de Gram no basta el equipo para Gram Britania. Es menester como en toda otra determinacin de laboratorio seguir estrictamente las indicaciones para lograr el mximo de rendimiento del producto. Es necesario que los portaobjetos sean de buena calidad, estn perfectamente limpios y desengrasados. Los pasos son los siguientes: - Preparacin de extendidos: - A partir del crecimiento microbiano en medios slidos o lquidos: cuando la coloracin de Gram se efecta para caracterizar colonias, es prctico dividir un portaobjeto con lpiz dermogrfico o con una punta de diamante en secciones para ahorrar tiempo y colorante, colocando en cada una de las divisiones una pequea gota de solucin fisiolgica en la que se emulsionar una pequea cantidad de cada colonia tomada con un ansa. Cada divisin se identificar correctamente y permitir as obtener la coloracin de un nmero de colonias en un solo preparado. En caso de que se trate de medios lquidos, colocar una alcuota de

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cada uno de ellos en cada divisin del portaobjetos. - Directamente a partir de la muestra en estudio: es comn que se preparen los extendidos directamente tomando la muestra (pus, esputo, exudados) con ansa, hisopo o pipeta estril y diseminndola sobre la superficie del portaobjeto. Es mucho ms conveniente preparar una suspensin en 1 ml aproximadamente de solucin fisiolgica estril dentro de un pequeo tubo y colocar en distintos sectores de un mismo portaobjeto 3 gotas de esa suspensin. No es imprescindible que la solucin fisiolgica y el tubo que estn estriles si no se utilizan para la siembra posterior, pero s el tubo tiene que estar limpio. Procediendo de esta manera se obtendrn preparaciones mas uniformes y los elementos no se presentarn deformados. El mismo procedimiento es conveniente cuando se trata de centrifugados de orina, lquido cefalorraqudeo, lquido asctico. - Secado del extendido: Colocar el portaobjetos en posicin horizontal dentro de la estufa de cultivos o sobre la corriente de aire caliente de un mechero. - Fijado del extendido: - A la llama: se efecta pasando 3 veces el lado del portaobjeto que no tiene la preparacin sobre la llama del mechero para que la misma adquiera una temperatura de aproximadamente 80 C. - Con alcohol metlico: cubrir el extendido durante 1 minuto. Este mtodo permite obtener fijaciones mas uniformes sin destruccin de elementos por excesivo calentamiento y ahorro de tiempo. Nota: en el caso de orinas es conveniente una vez fijada la preparacin y antes de colorear lavar con chorro fino de agua durante 10 segundos para arrastrar las sales que pudiera contener, dado que estas perjudican la correcta coloracin. - Coloracin: tiempo total: 2 minutos. - Cubrir el extendido con Violeta para Gram. Dejar actuar 20 segundos. - Lavar con agua corriente durante 10 segundos. - Cubrir con Lugol. Dejar 30 segundos. - Lavar con agua corriente durante 10 segundos. - Cubrir con Decolorante para Gram. Decolorar durante 10 segundos. - Lavar con agua corriente 10 segundos. - Cubrir con Safranina para Gram. Dejar 20 segundos. - Lavar con agua corriente durante 10 segundos. - Secar el extendido. Interpretacin de los resultados Cubrir el extendido con una gota de aceite de inmersin y observar al microscopio ptico, con aumento 1000X. Bacterias Gram Positivas: se observan de color violceo Bacterias Gram Negativas: se observan de color rosado-rojizo.

Control de Calidad
Microorganismos Staphylococcus aureus ATCC 25923 Enterococcus faecalis ATCC 29212 Escherichia coli ATCC 25922 Negativo Positivo GRAM Positivo

CONTROL DE ESTERILIDAD

RESULTADO Sin cambios

Medio sin inocular

Limitaciones - Casi todos los microorganismos pueden ser detectados por este mtodo excepto las clamidias (parsitos intracelulares obligados), los micoplasmas y ureaplasmas (carecen de pared celular) y las espiroquetas (debido a su pequeo tamao). - Es evidente que la investigacin precisa de un microorganismo solo se realiza por pruebas bioqumicas y /o confirmacin serolgica, pero si la coloracin de Gram no ha sido correctamente efectuada conducir a seleccionar y realizar pruebas bioqumicas indebidas. Por eso, al realizar una coloracin de Gram pueden cometerse errores por utilizar colorantes no certificados para bacteriologa; concentracin inadecuada de colorantes certificados; empleo de tcnicas engorrosas; preparacin de extendidos demasiado gruesos y no uniformes. -Si se realiza la fijacin por calor, no sobrecalentar el extendido porque podra llevar a una coloracin posterior atpica. Materiales necesarios no provistos Equipos y material de laboratorio, microorganismos para control de calidad, reactivos y medios de cultivo adicionales segn requeri-

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miento. Precauciones - Solamente para uso diagnstico in vitro. Uso profesional exclusivo. - No utilizar el producto si al recibirlo su envase est abierto o daado. - No utilizar el producto si existen signos de contaminacin o deterioro, as como tampoco si ha expirado su fecha de vencimiento. - Utilizar guantes y ropa protectora cuando se manipula el producto. - El decolorante para Gram es inflamable, mantenerlo lejos del fuego. - Considerar las muestras como potencialmente infecciosas y manipularlas apropiadamente siguiendo las normas de bioseguridad establecidas por el laboratorio. - Las caractersticas del producto pueden alterarse si no se conserva apropiadamente. - Descartar el producto que no ha sido utilizado y los desechos del mismo segn reglamentaciones vigentes. Referencias - 1957. Manual of Microbiological Methods, Society of American Bacteriologists. - Isenberg (ed.). 1992. Clinical microbiology procedures handbook, vol. 1. American Society for Microbiology, Washington, D.C. Indicaciones al consumidor Utilizar el producto hasta su fecha de vencimiento. Conservar el producto segn las indicaciones del rtulo

SMBOLOS UTILIZADOS
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LABORATORIOS BRITANIA S.A. LOS PATOS 2175 (C1283ABI) CABA - ARGENTINA TEL/FAX 54 11 4306 0041

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