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DIVULGAO ESTUDO DA FERMENTAO ALCOLICA DE SOLUES DILUDAS DE DIFERENTES AUCARES UTILIZANDO MICROCALORIMETRIA DE FLUXO Pedro L. O.

Volpe Instituto de Qumica - UNICAMP - 13083-970 - Campinas - SP Recebido em 8/4/96; aceito em 18/12/96

STUDY OF THE ALCOHOLIC FERMENTATION OF SUGARS DILUTED SOLUTIONS THROUGH FLOW MICROCALORIMETRY. The present study shows that with liquid nitrogen stored inocula of Saccharomyces cerevisiae , and standardized experimental procedure, flow microcalorimetry can be a valuable tool for monitoring in real time the alcoholic fermentation processes on line. The avaliation of cultural conditions contained different carbon sources for alcohol fermentation (sucrose, glucose, fructose, manose, maltose, galactose, molasses, honey and sugar cane) and their effects on the heat output recording is discussed. Some examples of diauxic growth is given, where the microcalorimeters serves to detect the temporal order of succession of alternating metabolic pathways. Keywords: flow microcalorimetry; heat output; fermentation; Saccharomyces cerevisiae.

INTRODUO A liberao de calor uma propriedade geral do crescimento de microrganismos independentemente da natureza da fonte de carbono, ou se o processo aerbico ou anaerbico. surpreendente que o primeiro experimento calorimtrico com microrganismos relacionado com fermentao que se tem notcia, foi desenvolvido numa dorna de cervejaria por Dubrunfaut1 em 1856 e talvez Lavoisier somente tenha malogrado em medir o calor liberado para o meio durante o crescimento de leveduras, em seus intensivos estudos do calor e da fermentao, porque ele estava limitado a 0oC pelo seu calormetro de gelo2. O experimento de Dubrunfaut poderia ser chamado hoje de calorimetria dinmica e incentivou Rubner3-6, no incio do sculo, a comear as primeiras medidas calorimtricas verdadeiras, quantificando a produo de calor durante a fermentao e o crescimento das leveduras. Muitas medidas calorimtricas da energia do metabolismo subsequentes ao trabalho de Rubner no foram calorimtricas no sensu strictu porque no mediam diretamente o calor produzido durante o crescimento. A fermentao alcolica (catabolismo anaerbico) fornece energia na forma de ATP ou outros compostos de transferncia de energia para a biossntese do material celular e produo do etanol. Estas reaes catablicas acontecem com uma grande diminuio na energia livre, a qual junto com a subsequente hidrlise do ATP durante as reaes de biossntese, transporte e manuteno, resulta na produo de calor. Um balano energtico simplificado para a equao do catabolismo anaerbico da glicose pela S. cerevisiae, pode ser descrito da seguinte forma: GLICOSE 2 CO2 + 2 ETANOL; DG = -175 kJ/mol de glicose O detalhamento desta reao est representada na figura 1, com os respectivos valores de energia livre para cada etapa. Durante os anos 60, Calvet Prat e Skinner7 deram importante impulso microcalorimetria estudando a termogenese de sistemas vivos. A importncia do calor como uma maneira de monitorar e possivelmente controlar processos fermentativos, refletida pelo aumento crescente de trabalho publicados nesta rea8-20. Nos anos 80, devido utilizao das termopilhas21 (Peltier ou componente termoeletrnico desenvolvido durante a corrida espacial) na construo de calormetros, tornou-se possvel experimentos de acompanhamento de processos de natureza biolgica.
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Beezer 22 e Wads 23 contriburam fundamentalmente no estabelecimento da rea conhecida hoje como microcalorimetria biolgica. Os dados da literatura tm mostrado que a velocidade de produo de calor em fermentaes pode ser til de diversas maneiras tanto na pesquisa acadmica como em aplicaes industriais. As correlaes gerais entre produo de calor e vrios outros parmetros sugerem que a velocidade de produo de calor pode ser usada como uma medida para monitorar em tempo real fermentaes, consumo de oxignio ou a velocidade de produo de CO2. Apesar dos esforos para se introduzir mtodos instrumentais modernos, at o momento existem pouqussimos mtodos on line para o monitoramento de processo fermentativos em tempo real. Os mtodos de controle dos processos analticos de laboratrio off line ainda exercem um papel importante na monitorao da fermentao para finalidades industriais e de pesquisa. Entre as desvantagens destes mtodos, a maior a demora entre a retirada das amostras e obteno dos resultados analticos, que deve ser feita durante o processo fermentativo. Entretanto, quando mtodos analticos off line so usados, geralmente no possvel utilizar as vantagens dos micro-computadores no processo de controle. O controle analtico on line de processos de fermentao geralmente abrange medidas de quantidades fsicas e qumicas. Por vrias razes, os indicadores da populao de microrganismos e outros parmetros ligados ao crescimento de clulas (ex. produo de calor) so indispensveis para o controle dos processos de fermentao. Como j descrito previamente24-25 a microcalorimetria de fluxo constitui uma tcnica analtica no especfica para caracterizar processos de crescimento e morte de microrganismos. Por meio desta tcnica, o calor produzido por todos os eventos metablicos que acontecem no meio de cultura , podem ser registrados em tempo real sem perturbar o processo. Se necessrio for, amostras podem tambm ser retiradas periodicamente para a anlise do consumo do substrato ou aparecimento dos produtos sem prejudicar o experimento. Desta maneira, a curva potncia-tempo dq/dt (Watts) x tempo(horas) ou termograma26, monitora in situ e em tempo real o processo fermentativo, no requerendo meio transparente. A figura 2 mostra um esquema de um termograma para um processo fermentativo em condies anaerbicas em meio definido e com baixa concentrao de fonte de carbono. Neste
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Figura 1. Valores da variao de energia livre para cada etapa do catabolismo anaerbico da glicose pela S. cerevisiae.

Figura 2. Termograma esquemtico para um processo fermentativo em condies anaerbicas.

termograma esto indicadas a calibrao eltrica, o ponto de inoculao e as vrias fases do processo fermentativo em termos de produo de calor. Durante a fase lag ou de adaptao, no ocorre produo de calor significativa. Durante este tempo nenhum crescimento ocorre, desde que as clulas nesta fase esto ocupadas em estabelecer o estado enzimtico necessrio para o catabolismo11. A produo de calor inicia na fase de acelerao decorrente do crescimento dos microrganismos sem obedecer uma lei exponencial. Durante a fase log a produo de calor e consequentemente a produo de etanol, exponencialmente dependente do tempo. No tempo de exausto, a baixa concentrao de fonte de carbono ou a alta concentrao de etanol limita a velocidade de crescimento. Aps o tempo de exausto inicia-se a fase de declnio com um tempo de durao de aproximadamente 1

hora onde o nmero de clulas que morrem torna-se progressivamente superior ao das que surgem. Finalmente, a fase de metabolismo endgeno ou fase diuxica, de interpretao bastante polmica entre os microbiologistas, reflete basicamente o metabolismo endgeno das clulas remanescentes. Os trabalhos na rea de microcalorimetria biolgica, principalmente na fermentao, determinam principalmente a velocidade de produo de calor que proporcional ao incremento do crescimento celular e produo do etanol. Somente a fase exponencial de crescimento corresponde a um estado termodinmico com valores especficos constantes, como velocidade de produo de calor, velocidade especfica de crescimento, aumento na concentrao de metablitos, aumento do nmero de clulas ou velocidade de catabolismo. As outras fases do termograma so perodos de transio de um estado para outro com parmetros mudando rapidamente. Desta maneira, questes interessantes de transio de fase na termodinmica de processos irreversveis podem ser estudados em culturas de microrganismos27. Experimentos de crescimento de microrganismos em calormetros podem ser usados como uma ferramenta analtica quantitativa. Sem quantificar o valor da produo de calor, a anlise do termograma pode fornecer informaes importantes, como a indicao do crescimento em diferentes vias metablicas, diferentes situaes metablicas na cultura e na convenincia ou no de se usar um composto qumico como substrato. A combinao destas condies pode ser usada como uma impresso digital para microrganismos a

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partir de seus termogramas, ou avaliar a aplicabilidade de diferentes linhagens de clulas na fermentao alcolica. Embora os microcalormetros de fluxo atuais operem com uma sensibilidade mxima de 1W24,25 isto , um fluxo de calor dq/dt de 1J.s-1, eles esto limitados pela concentrao de microrganismos. Considerando uma taxa mxima de produo de calor de 10-11W clula-1 mL-1, pelo menos concentraes de 105 clulas mL-1 so necessrias para se ter um sinal significativo. Desta maneira, culturas com concentraes celulares superiores a 105 clulas mL-1 podem ser investigadas. A tabela 1 mostra a comparao da microcalorimetria de fluxo com outras tcnicas e suas vantagens e desvantagens22. A resposta de uma cultura de clulas na mudana de parmetros tais como composio, natureza da fonte de carbono, tampo, adio de sais, pH, nvel de oxignio dissolvido, quantidade de microrganismos, amino cidos, vitaminas, contaminao com metais pesados, etc. causam variaes mensurveis na curva dq/dt em funo do tempo22. Este trabalho descreve alguns resultados com respeito ao uso da microcalorimetria no monitoramento em tempo real da fermentao alcolica e a avaliao de diferentes fontes de carbono (sacarose, glicose, frutose, manose, maltose, galactose, melao, mel e cana de acar) no processo fermentativo, utilizando um meio definido e cultura de levedura armazenada em nitrognio lquido, combinando no laboratrio um microfermentador de 50 mL on line com um microcalormetro de fluxo. MATERIAIS E MTODOS O processo fermentativo foi estudado para cada carboidrato, utilizando S. cerevisiae (NCYC-239). Todos os carboidratos utilizados so p.a. da marca BDH (British Drug House). O mel e o melao utilizados so de marca Super Bom e o mosto de cana de acar foi preparado a partir do liofilizado do caldo de cana. Saccharomyces cerevisiae NCYC-239 foi crescida em frascos de 250 mL contendo 40 mL do meio de composio (g.L-1): (NH 4 ) 2SO 4 , 2,5; (NH 4 ) 2 HPO 4, 2,5; MgSO 4 .7H 2 O, 2,0; CaCl2.2H2O, 2,0; soluo de traos de elementos, 0,5 mL.L-1; extrato de levedura, 4,0; fonte de carbono, 2,5. A soluo de traos de elementos foi de composio (g.L-1): EDTA, 50; ZnSO 4 .H 2 O, 22,0; CaCl 2.6H 2 O, 5,5; MnCl 2.4H 2 O, 5,0; FeSO4.6H2O, 5,0; (NH4)6 Mo7O24.4H2O, 1,1; CuSO4.5H2O, 1,6; CoCl2.6H2O, 1,6. Todas as solues e os materiais utilizados

para o preparo da cultura de microrganismos foram esterilizados em autoclave a 121oC e 2atm por 30 minutos. Quarenta frascos foram inoculados com 0,8 mL da cultura e incubados 37oC num agitador rotatrio Gallenkamp 220 rpm. O crescimento foi acompanhado por medidas de densidade tica num colormetro EEL e aps 6 horas de incubao a suspenso de clulas atingiu a densidade tica equivalente a 1,2g de peso seco de clulas L-1. As clulas foram reunidas, centrifugadas, lavadas duas vezes com soluo de Ringer contendo 10% v/v de dimetilsulfxido (DMSO) e centrifugadas. Aps a ltima centrifugao, as clulas foram resuspensas em soluo de Ringer contendo 10% de DMSO e acondicionadas em ampolas de 2 mL de polipropileno. As ampolas foram encaixadas numa placa fina de isopor perfurada a qual foi utilizada como tampa de um tanque de alumnio contendo nitrognio lquido e mantida a uma altura de 8 cm acima da superfcie do nitrognio. Quando a temperatura na ampola controle (munida de um termmetro de lquido) atingiu -80oC, as ampolas foram liberadas para imerso em nitrognio lquido e guardadas em cilindro criognico28. A contagem vivel foi feita periodicamente fornecendo 1,3x1010 clulas mL-1. Clulas armazenadas por 6 meses foram recuperadas em 95%. Os experimentos de monitoramento da fermentao alcolica foram feitos utilizando um microcalormetro de fluxo LKB10.700-1. O esquema de funcionamento do microcalormetro est mostrado na figura 3. Todos os experimentos de fermentao foram feitos utilizando a mesma concentrao de acar (2,5gL-1) e o pH do meio foi mantido no valor 5,0 , utilizando tampo cido ctrico/citrato de sdio (7,35/19,12 gL-1). As solues foram previamente autoclavadas e cuidados especiais foram tomados para que os experimentos sempre ocorressem em condies anaerbicas. A mistura fermentativa proveniente do microreator (mantida sob agitao magntica constante e dentro de uma jaqueta com circulao de gua termostaticamente controlada na temperatura de 33 1oC) foi bombeada para dentro da cela de fluxo a uma velocidade de 35 mLh-1 com o auxlio de uma bomba peristltica LKB-2132. O fluxo de calor dq/dt (Watts) proveniente do processo fermentativo foi detectado pelo par de termopilhas localizadas ao redor da cela de fluxo21. Antes da inoculao e aps a estabilizao da linha base, uma resistncia eltrica contida no interior da cela de fluxo foi utilizada para a calibrao eltrica do termograma, tornando

Tabela 1. Comparao da microcalorimetria de fluxo com outras tcnicas no estudo da fermentao alcolica. DESVANTAGENS DE OUTRAS TCNICAS EM COMPARAO COM A MICROCALORIMETRIA: Turbidimetria Massa celular Produo de cido Medida do potencial de oxidao e reduo Teor de oxignio dissolvido (amperometria) Consumo de oxignio (paramagntico) Formao de CO2 (infravermelho) Baixa sensibilidade, responde lentamente s variaes bruscas de energia no metabolismo O mesmo para turbidimetria Diretamente relacionado ao crescimento e metabolismo somente em casos especiais - culturas aerbicas. Varivel e dependente da disponibilidade de oxignio Mesmo para a produo de cido Rpido mas limitado culturas aerbicas com oxignio em excesso Razoavelmente rpido, mas limitado culturas aerbicas Varivel sobre diferentes condies metbolicas DESVANTAGENS DA MICROCALORIMETRIA Presena de bolhas de gs ou aglomerao das clulas na linha de fluxo. Os microcalormetros no so suficientemente sensveis produo de calor a partir de concentrao de clulas da ordem de 104 clulas/mL. O limite de deteco >105 clulas/mL.

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Figura 3. Diagrama do microcalormetro de fluxo para o monitoramento da fermentao.

Figura 4. Termograma da fermentao alcolica utilizando glicose, frutose, manose e sacarose.

assim possvel a quantificao do eixo dq/dt do termograma em unidades de Watts. Calormetros so normalmente calibrados eletricamente. O microcalormetro de fluxo utilizado neste trabalho possui uma unidade de calibrao eltrica de preciso, entretanto, nem sempre fcil simular o efeito trmico biolgico com uma resistncia eltrica de preciso, de modo que o sensor termopilha reagir identicamente. De forma a padronizar os valores das calibraes eltricas para celas calorimtricas, reaes qumicas so tambm necessrias. O microcalormetro foi tambm calibrado utilizando a reao de protonao do tris(hidroximetilaminometano) ou THAM, recomendada para medidas calorimtricas23,29. A inoculao do microrganismo (100 L da suspenso de clulas de S. cerevisiae) foi sempre feita imediatamente aps o descongelamento da ampola num banho a 36oC por 3 minutos seguida de agitao de 20 segundos. RESULTADOS E DISCUSSO O monitoramento em tempo real do processo fermentativo de vrios carboidratos (sacarose, glicose, frutose, manose, maltose, galactose, melao, mel e cana de acar) foi feito utilizando a combinao de um microcalormetro de fluxo e um microfermentador on line, conforme o esquema mostrado na figura 3. Os termogramas obtidos mostram na sua maioria trs fases distintas de produo de calor. Aps a inoculao a velocidade de evoluo de calor aumenta at um mximo em aproximadamente 8h:50-9h:00 (tempo de exausto tE), caindo rapidamente em seguida. A figura 4 mostra os termogramas para o processo fermentativo dos carboidratos glicose, frutose, manose e sacarose, mostrando semelhana nos termogramas da glicose e da fructose. Os termogramas destes carboidratos no apresentam uma fase lag longa o que indica que, nas condies do experimento, as clulas do microrganismo j tem as enzimas e protenas de transporte prontas para o metabolismo o que corresponde a um tempo de induo muito pequeno. A tabela 2 contm os dados comparativos do processo fermentativo para os aucares glicose, frutose, manose e sacarose obtidos dos termogramas da figura 4. O grfico da figura 5, contm os dados da tabela 2. Podemos observar do grfico da figura 5, que a velocidade do processo fermentativo (coeficiente angular k, obtido pela equao ln(dq/dt)=ln a + k.t) a mesma para os acares sacarose, frutose e glicose (0,29 h-1), sendo ligeiramente menor para a manose (0,25 h-1). O tempo de exausto para a glicose e frutose igual a 8h:30 sendo de 9h:15 para a manose e de 9h:40 para a sacarose. Observa-se, na figura 4, que a velocidade do processo fermentativo para a manose igual da glicose e frutose nas 4 primeiras horas do processo. Na fase exponencial esta taxa diminui e consequentemente o tempo de exausto aumenta. Os termogramas da glicose e frutose so coincidentes.
Figura 5. Taxa do processo fermentativo para os aucares glicose, frutose, manose e sacarose.

A figura 6 mostra o termograma do monitoramento do processo fermentativo num meio definido, contendo como fonte de carbono mel de abelha (curva C), mel de abelha desproteinizado por autoclavagem (curva B) em comparao com o termograma de frutose (curva A). Aps a autoclavagem e resfriamento da soluo de mel, ocorre a precipitao de um material de aspecto gelatinoso devido a desnaturao das protenas presentes no mel. Observa-se claramente que o termograma da fermentao do mel de abelha desproteinizado (curva B) coincidente com o da frutose com tE = 8h:30. O termograma da fermentao do mel de abelha no autoclavado (curva C), portanto contendo protenas, apresenta o mesmo tempo de exausto dos termogramas B e A mas a taxa de crescimento ligeiramente menor que nos outros dois casos. Alm disso, aps o tempo de exausto a diminuio da produo de calor no to acentuada como no caso da frutose (curva A) e do mel desproteinizado (curva B) e o termograma apresenta um patamar mais alto, indicando provavelmente que as protenas so em seguida metabolizadas. Os picos que aparecem em todos os termogramas so devidos formao de bolhas de CO2 no interior da cela de fluxo e dos tubos de teflon. Uma vez que as investigaes calorimtricas de sistemas heterogneos, em contraste aos mtodos espectrofotomtricos, no requerem solues oticamente transparentes e permite o uso de suspenses de clulas, tecidos, solues grosseiras, ou suspenso de compostos bioqumicos, a formao das bolhas de CO2 inevitvel e os rudos esto relacionados com o efeito da viscosidade e da tenso superficial de cada meio de cultura na formao e despreendimento do CO2. Uma forma de atenuar o rudo no termograma da fermentao devido a evoluo de gs seria utilizar no microcalormetro uma

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Tabela 2. Dados de produo de calor para os acares glicose, frutose, manose e sacarose. Tempo Horas 1 2 3 4 5 6 7 8 Glicose dq dq /Watts ln dt dt 12,3 16,7 23,2 30,7 40,4 52,6 70,2 92,1 2,50 2,81 3,14 3,42 3,69 3,96 4,25 4,52 Frutose dq dq /Watts ln dt dt 11,4 16,2 22,8 29,8 40,3 53,1 70,2 89,5 2,43 2,78 3,12 3,39 3,69 3,97 4,25 4,49 Manose dq dq /Watts ln dt dt 11,8 16,7 21,8 28,1 35,5 44,7 57,5 73,7 2,46 2,81 3,08 3,33 3,56 3,79 4,05 4,30 Sacarose dq dq /Watts ln dt dt 09,3 12,3 17,5 23,7 29,8 40,4 51,8 65,8 2,23 2,50 2,86 3,16 3,39 3,69 3,94 4,18

Figura 6. Termograma da fermentao alcolica utilizando mel de abelha natural e desproteinizado em comparao com a frutose.

Figura 8. Termograma da fermentao alcolica utilizando melao.

cela do tipo batelada, o que inviabilizaria o monitoramento do processo fermentativo on line. A evoluo da formao de bolhas de CO2 claramente vista na figura 7, que o monitoramento da fermentao de meio de cultura preparado a partir do liofilizado do caldo de cana. Aps o tempo de exausto de 9h:30, a formao de CO2 cessa e o rudo decorrente da quantidade de CO2 remanescente dissolvido no meio de cultura e tambm de bolhas de CO2 que estavam na linha do sistema de fluxo antes de entrar na cela.

Figura 9. Termogramas da fermentao alcolica utilizando galactose e maltose.

Figura 7. Termograma da fermentao alcolica utilizando cana de aucar.

importante lembrar nesta oportunidade que no processo fermentativo da produo industrial do lcool combustvel, utilizando a cana de acar, a concentrao da fonte de carbono de 18 Brix = 180 g.L-1, portanto, cerca de 70 vezes mais concentrado que nas condies utilizadas neste trabalho. Utilizamos tambm neste trabalho como fonte de carbono o melao e o termograma do processo fermentativo est mostrado na figura 8 com tE = 8h:00. O processo fermentativo utilizando a maltose como fonte de carbono, figura 9, muito lento, comparado com os outros acares sacarose, glicose, frutose e manose da figura 4. Neste

caso o tempo de exausto de 18 a 19 horas, apresentando tambm uma fase lag e de acelerao bem definida e longa. O mesmo comportamento tambm observado quando a fonte de carbono utilizada no processo fermentativo o acar galactose, para o qual o tempo de exausto de 13 a 15 horas. Em ambos os casos, o tempo necessrio para atingir a fase exponencial da ordem de 10 horas indicando que tanto a maltose quanto a galactose no so prontamente utilizadas pela S. cerevisiae como o caso dos outros acares. No processo fermentativo da maltose e galactose as clulas demoram para produzir todas as enzimas e protenas de transporte necessrias para o metabolismo destes acares, aumentando portanto o tempo de induo. Neste trabalho foi possvel tambm verificar que a microcalorimetria de fluxo serve para detectar a ordem temporal da sucesso metablica dos acares. Quando existe mais do que uma fonte de carbono no meio de cultura, o microorganismo exerce a sua capacidade de seletividade metabolizando em primeiro lugar o acar que apresenta o menor tempo de induo (favorecimento cintico e termodinmico) e o termograma apresenta um crescimento bifsico tambm conhecido como diauxismo. Um bom exemplo de diauxismo mostrado no termograma do processo fermentativo da mistura de acares glicose + maltose, (Figura 10) e glicose + galactose, (Figura 11). Em ambos os casos os meios de cultura foram preparados utilizando concentraes de aucares de 1,5 g.L-1, totalizando a concentrao de fonte de carbono 3,0 g.L-1. Observa-se na figura 10 que aps o

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crescimento da biomassa, mas sua inclinao menos pronunciada e informativa. Muitos pesquisadores discutem o fenmeno do metabolismo endgeno levando em considerao a grande vantagem energtica da respirao representada pela reao: GLICOSE + 6O2 + 38ADP + 38P 6CO2 + 6H2O + 38ATP sobre a fermentao e consideram que o metabolismo endgeno deva ser aerbico a partir de um ponto de vista de gerao de energia. Foi portanto, possvel, estudar a fermentao alcolica utilizando solues diludas de diferentes aucares, demonstrando que a microcalorimetria de fluxo uma ferramenta sensvel para detectar e monitorar em tempo real, o metabolismo (Energia) da fermentao alcolica, on line. O futuro da calorimetria nesta rea auspicioso devido ao desenvolvimento de novas tcnicas e o melhoramento da instrumentao para o monitoramento trmico. Com isto ser possvel fazer um estudo ainda mais detalhado de sistemas celulares, sendo grande o potencial para medidas trmicas em cincias bsicas, medicina, farmacologia e toxicologia. AGRADECIMENTOS O autor agradece o Professor Roger Miles do Departamento de Microbiologia, Kings College, Universidade de Londres pelas proveitosas discusses sobre o metabolismo fermentativo da S. cerevisiae e a cooperao bilateral CNPq/British Council. REFERNCIAS 1. Dubrunfaut, M.; C.r. Sanc. Soc. Biol. 1856, 42 , 945. 2. Hemminger, W. e Hhne, G.; In Calorimetry, Fundamentals and Practice, Verlag Chemie, Weinheim 1984. 3. Rubner, M.; Arch. Hyg. 1903, 48, 260. 4. Rubner, M.; Arch. Hyg. 1904, 49, 355. 5. Rubner, M.; Arch. Hyg. 1906, 57, 193. 6. Rubner, M.; Arch. Hyg. 1906, 57, 244. 7. Calvet, E. Prat. H. e Skinner, H. A.; In Recent Progress in Microcalorimetry, Pergamon Press, London 1963. 8. Belaich, J. P.; Senez, J. C. e Murgier, M.; J. Bacteriol. 1968 , 95 1750. 9. Fujita, T., Nunomura, K. Kagami, I e Nishikaura, Y.; J. Gen Appl. Microbiol. 1976, 22, 43. 10. Forrest, W. W.; Methods Microbiol. 1972 , 6b, 285. 11. Beezer, A. E.; In Applications of Calorimetry in Life Sciences (Lamprecht, I. e Schaarschmidt, B., eds), de Gruyter, Berlin and New York, 1976. 12. Luong, J. H. T. e Volesky, B.; Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 1983, 28, 1. 13. Calvet, E.; In Experimental Thermochemistry (Skinner, H. A., ed.), Wiley, New York, 1962. 14. Belaich, A. e Belaich, J. P.; J. Bacteriol. 1976, 125, 14. 15. Mou, D-G. e Cooney, C. L.; Biotechnol. Bioeng. 1976, 18, 1371. 16. Wang, H.; Wang, D. I. C. e Cooney, C. L.; Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1978, 5 , 207. 17. Luong, J. H. T.; Yerushalmi, L. e Volesky, B.; Enzyme Microb. Technol. 1983, 5, 291. 18. Erickson, R. e Holme, T.; Biotechnol. Bioeng. Symp. 1973, 4, 581. 19. Monk, P. R.; J. Bacteriol. 1978, 135 , 373. 20. Ishikawa, Y.; Shoda, M. e Maruyama, H.; Biotechnol. Bioeng. 1981, 23, 2629. 21. Volpe, P. L. O.; Qum. Nova 1993, 16, 49. 22. Beezer, A. E.; In Biological Microcalorimetry, Academic Press, London 1980. 23. Wads, I.; In Thermal and Energetic Studies of Cellular Biological Systems (Ed. A. M. James) Wright, Bristol 1987 , p.34.
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Figura 10. Termograma da fermentao alcolica utilizando a mistura glicose + maltose.

consumo da glicose com tE = 7h:00 ocorre o consumo da maltose com tE = 11h:00 e o termograma tem um aspecto bifsico, apresentando dois mximos de produo de calor consecutivos na fermentao anaerbica da mistura glicose + maltose, indicando que a glicose metabolizada preferencialmente. Entre os dois processos metablicos h um decrescimento da produo de calor, podemos observar que a seletividade pode ser acompanhada pelo microcalormetro. A figura 11 mostra o termograma do processo fermentativo da combinao dos acares glicose + galactose. Neste caso, observa-se tambm que a glicose metabolizada primeiro, apresentando dois mximos de produo de calor. A aproximidade destes 2 tempos de exausto em relao ao termograma da mistura maltose + glicose, da figura 10, explicada pelo fato do tempo de exausto da galactose ser menor do que a da maltose.

Figura 11. Termograma da fermentao alcolica utilizando a mistura glicose + galactose.

Mesmo quando o meio de cultura contm apenas um nico acar, diauxismo pode tambm se tornar presente. Se o registro do termograma da fermentao de um acar deixado por mais tempo, aps a exausto, (cerca de uma hora aps a estabilizao da linha base) ocorre novamente um novo mximo de produo de calor. Este tipo de diauxismo extremamente polmico entre os microbiologistas, existindo uma respeitvel especulao respeito deste fenmeno. Alguns pesquisadores acreditam que aps o esgotamento da glicose um segundo metabolismo aparece, resultante da respirao do etanol ou devido ao metabolismo das reservas do microorganismo (metabolismo endgeno) ou reserva de energia utilizvel no ciclo da clula na ausncia de nutriente. Outros pesquisadores acreditam que esse tipo de diauxismo aparece quando as clulas tm que se adaptar a partir da fermentao anaerbica da glicose para a respirao do etanol22. A armazenagem de reservas energticas em microrganismos, foi revista por Dawes e Senior30. O glicognio e a trealose de leveduras foram discutidos por Manners31, Lillie e Pringle32, os quais estudaram o metabolismo da reserva de carboidratos em S. cerevisiae e mostraram que o glicognio e a trealose contribuem com 1% na fermentao da glicose. Este comportamento energtico refletido tambm no
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