UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA Curso: Engenharia de Alimentos Componente Curricular: EXA-411 Qumica Orgnica II Docente: Carla C.

. Mendes EXPERIMENTO Extrao e separao cromatogrfica de pigmentos de folhas verdes

Objetivos: 1. Introduzir os fundamentos dos mtodos cromatogrficos em laboratrio de Qumica Orgnica 2. Introduzir os mtodos cromatogrficos de separao e isolamento de produtos naturais 3. Avaliar o poder de eluio e de resoluo de diferentes fases mveis para separao cromatogrfica de pigmentos de folhas verdes 4. Separar pigmentos de folhas verdes por cromatografia em camada delgada 5. Separar e isolar pigmentos de folhas verdes por cromatografia em coluna aberta Introduo O termo cromatografia foi utilizado pela primeira vez pelo botnico russo Tswett, em 1906. Para separar as substncias contidas nos extratos de folhas, o extrato foi colocado em um tubo de vidro contendo carbonato de clcio (fase estacionria). A passagem de ter de petrleo (fase mvel) resultou na separao dos componentes, os quais foram observados em bandas coloridas ou zonas mveis. O conjunto das bandas foi denominado cromatograma. Chrom = cor e graphie = escrita A cromatografia um mtodo fsico-qumico de separao dos componentes de uma mistura que se baseia na distribuio dos componentes entre duas fases em contato. Uma das fases permanece fixa (fase estacionria) e a outra se desloca atravs dela (fase mvel). Durante a passagem da fase mvel sobre a fase estacionria, os compostos da mistura so distribudos entre as duas fases. Esta distribuio governada pelos mecanismos de interao fsica entre amostra, fase estacionria e fase mvel. A fase estacionria retm seletivamente cada componente, resultando na migrao diferencial das molculas no sistema cromatogrfico e, consequentemente, na sua separao. Existem vrios mecanismos responsveis pela separao dos componentes da amostra no sistema cromatogrfico, como partio, excluso por tamanho molecular, troca inica, adsoro e bioafinidade. O grau de adsoro das molculas dos diferentes componentes da amostra na fase estacionria depende das intensidades das foras de interao, como on-dipolo, coordenao, ligaes de hidrognio, dipolo-dipolo e van der Waals. A fase mvel deve ser livre de impurezas; no deve reagir com a amostra nem com a fase estacionria e ser facilmente separada dos componentes da amostra. A fase estacionria deve ser seletiva. A cromatografia utilizada para analisar, identificar ou separar os componentes de uma mistura. Assim, mtodos cromatogrficos so eficientes e muito utilizados para a separao de misturas quimicamente complexas. Atualmente, a cromatografia amplamente utilizada em diversas reas. Por exemplo, por mtodos cromatogrficos pode-se analisar a urina ou o sangue de um atleta para a investigao do uso de dopping durante uma competio, analisar amostras em qumica forense, controlar a qualidade qumica de medicamentos, de alimentos e do ar, purificar compostos, monitorar o progresso de reaes qumicas, separar e isolar compostos de interesse farmacolgico de fontes vegetais e animais, entre outras aplicaes. Existem vrios tipos de classificao da cromatografia: de acordo com a natureza da fase estacionria e da fase mvel (por exemplo, cromatografia slido-lquido, lquido-lquido, slido-gs); de acordo com o mecanismo de separao (por exemplo, cromatografia por adsoro, por troca inica, por excluso), entre outros. De acordo com o sistema fsico que suporta a fase estacionria, a cromatografia pode ser classificada como cromatografia planar ou cromatografia em coluna. A cromatografia em camada delgada (CCD) consiste em um mtodo de separao dos componentes de uma mistura atravs da sua migrao diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente (fase estacionria) retida sobre uma superfcie plana. Esta tcnica surgiu em 1938, mas s foi largamente utilizada a partir da dcada de 60. Atualmente, ainda praticamente indispensvel em qualquer laboratrio que envolva anlise de substncias orgnicas. A CCD uma tcnica simples, barata e muito importante para a separao rpida e para anlise quantitativa de pequenas quantidades de material. A CCD usada para determinar a pureza do composto, identificar componentes em uma mistura por comparao com padres; monitorar o curso de uma reao pelo aparecimento dos produtos e desaparecimento dos reagentes e ainda para isolar componentes puros de uma mistura (cromatografia delgada preparativa - CCDP). Na cromatografia em camada delgada a fase mvel ascende por uma camada fina do adsorvente depositada sobre um suporte, normalmente uma placa de vidro. A utilizao de aglutinantes, como o gesso, permite que o adsorvente permanea aderido ao suporte. Para o preparo das placas, uma suspenso da fase estacionria com um aglutinante depositada uniformemente sobre toda a placa, formando uma camada fina. As placas so expostas ao ar para secar temperatura ambiente e mantidas protegidas da contaminao por poeira.

Alternativamente, podem ser utilizadas placas comerciais. Uma pequena quantidade da soluo da amostra que se deseja separar os componentes aplicada na placa cromatogrfica (cromatoplaca) com o auxlio de um capilar de vidro. Em seguida, a placa colocada verticalmente na cuba cromatogrfica contendo uma pequena quantidade de fase mvel. A cuba deve ser previamente saturada com vapores da fase mvel. A fase mvel (eluente) se desloca pela camada do adsorvente por ao capilar e os componentes da amostra se distribuiro entre a fase mvel e a fase estacionria. Durante este processo, os diversos componentes da mistura so separados a depender do grau de interao com a fase estacionria e a fase mvel (Fig. 1).

Figura 1. Separao dos componentes de uma amostra por cromatografia em camada delgada

Um parmetro frequentemente usado em cromatografia o " fator de reteno" de um composto (Rf), definido como a razo entre a distncia percorrida pela banda do componente e a distncia percorrida pela fase mvel, tomando como referncia o ponto de aplicao da amostra na placa. Na CCD, o Rf funo da natureza e da espessura da camada da fase estacionria, bem como da natureza da fase mvel. Assim, o fator de reteno pode ser calculado (Fig. 2) pela expresso Rf = dc / ds Onde: dc = distncia percorrida pelo componente da mistura. ds = distncia percorrida pela fase mvel.

Figura 2. Medidas para o clculo do fator de reteno (Rf) em CCD.

Quando os componentes das amostras apresentam colorao, o cromatograma facilmente visualizado olho n e o clculo dos Rf pode ser feito diretamente por inspeo das bandas cromatogrficas na placa. No caso de no visualizao de bandas coloridas, uma inspeo adicional pode ser realizada atravs da revelao das placas por mtodos fsicos ou qumicos. Dentre os mtodos utilizados, podem ser citados a revelao das placas com vapores de iodo, por nebulizao de reagentes qumicos especficos e por irradiao com luz ultravioleta,

neste ltimo caso, para a deteco da presena de compostos fluorescentes. Em geral, qualquer placa cromatogrfica aps o desenvolvimento revelada por um destes mtodos ou pela sua combinao, visando a deteco de determinadas classes de compostos e a avaliao do grau de complexidade qumica da amostra. Mtodos cromatogrficos podem ser realizados em uma coluna recheada com a fase estacionria, genericamente chamados de cromatografia em coluna. A separao dos compostos se d pela passagem contnua da fase mvel atravs da coluna. Na cromatografia em coluna clssica, o fluxo da fase mvel se d pela ao da fora da gravidade. Os diferentes componentes da mistura deslocam-se na coluna cromatogrfica com velocidades distintas dependendo de sua afinidade pelo adsorvente (por exemplo, molculas polares interagem melhor com um adsorvente polar do que molculas de menor polaridade) e tambm pela fase mvel. A capacidade de um determinado eluente dessorver (arrastar) um composto adsorvido na fase estacionria depende da polaridade do solvente com relao ao composto e fase estacionria. A dessoro de molculas de componentes da amostra ocorre quando molculas da fase mvel substituem as primeiras nos stios de adsoro da fase estacionria. medida que os compostos da mistura so separados, bandas ou zonas mveis comeam a ser formadas (Fig. 3).

Figura 3. Separao de componentes de uma amostra por cromatografia em coluna clssica.

A eluio dos componentes da amostra na coluna pode ocorrer pelo mtodo isocrtico, no qual a mesma fase mvel mantida durante todo o experimento, ou por gradiente de polaridade (ou gradiente de concentrao), no qual a polaridade da fase mvel modificada gradativamente, permitindo a dessoro e consequente eluio de

compostos fortemente adsorvidos na fase estacionria. As clorofilas so os pigmentos naturais mais abundantes presentes nas plantas e ocorrem nos cloroplastos das folhas e em outros tecidos vegetais, sendo responsveis pela colorao verde nas plantas. Elas atuam como molculas foto-receptoras absorvendo luz visvel, a qual convertida em energia qumica potencialmente usada no processo de fotossntese. Em geral, as clorofilas so relativamente instveis e sensveis luz, aquecimento, oxignio e pH. Cerca de 10 tipos de clorofilas tm sido isoladas de partes verdes de plantas. A composio qumica varia em funo do tipo de organismo: apenas uma clorofila pode ser detectada ou a clorofila majoritria acompanhada por outros pigmentos verdes auxiliares. A clorofila a (verde azulada) a mais abundante no reino vegetal, sendo encontrada junto com a clorofila b (verde amarelada) em uma proporo de 3:1, respectivamente. A substituio do tomo de magnsio por dois tomos de hidrognio na clorofila a, forma a estrutura da feofitina a, de colorao verde oliva e com tons marrons cinza. Carotenoides amarelos geralmente so encontrados em vegetais junto com as clorofilas. O mais conhecido dos carotenos o -caroteno, que encontrado normalmente nas plantas. As clorofilas e os carotenos so exemplos de produtos naturais elaborados no metabolismo de plantas.

-caroteno
CH2 CH Me N Mg N Me MeO2C Me O O O N Me Me Me Me N R Et
Clorofila a R= Me Clorofila b R= CHO

Este experimento ser realizado em duas partes. A primeira parte consiste no preparo do extrato orgnico de folhas verdes (espinafre, coentro, capim, agrio etc) e na utilizao da CCD para a separao de dois grupos de compostos presentes no extrato: o grupo das clorofilas e o grupo dos carotenos. A visualizao das bandas correspondentes a cada grupo de compostos no cromatograma possvel aps a eluio dos compostos em um sistema de solvente (fase mvel) adequado. Na segunda parte, a cromatografia em coluna (CC) ser empregada para a separao e o isolamento destes compostos.

Procedimento experimental PARTE I Obteno do extrato orgnico de folhas verdes e do extrato de cenoura Usando luvas, cortar as folhas (espinafre, coentro, agrio, salsa etc) em pequenos pedaos (sem nervuras) e pesar cerca de 15 a 20 g do material vegetal. Transferir para um almofariz e triturar com o auxlio de um pistilo. Adicionar diclorometano aos poucos, pressionando as folhas com cuidado at que a fase orgnica obtida apresente uma colorao verde escuro. Transferir o lquido (livre de resduos de folhas) com auxlio de pipeta tipo Pasteur contendo um pequeno chumao de algodo na ponta para um bquer (bquer 1). Caso se formem duas fases, separar a fase orgnica da fase aquosa com o auxlio de uma pipeta tipo Pasteur. Secar a fase orgnica com sulfato de sdio anidro. Transferir a fase orgnica livre de umidade para um recipiente seco, rotulado e pesado em balana analtica (bquer 2). Retirar uma pequena quantidade da fase orgnica do bquer 2 (para ser usada na parte I do experimento) e transferir para um bquer de 25 mL (bquer 3) e deixar secar ao ar. Levar o bquer 2 capela para evaporar o excesso de solvente e reservar para a parte II do experimento. Preparar um extrato hexnico de cenoura da seguinte forma: ralar um pedao de cenoura crua (cerca de de uma cenoura mdia) em um frasco de vidro. Adicionar um volume suficiente de hexano para cobrir levemente o material slido. Tampar o frasco. Deixar em repouso por cerca de 20 minutos. Retirar uma poro do lquido com auxlio de uma pipeta tipo Pasteur e transferir para um bquer de 25 mL. Deixar evaporar o solvente ao ar. O extrato de cenoura ser usado como amostra padro para carotenos.

Separao por cromatografia em camada delgada a) Preparo das placas cromatogrficas Lavar, desengordurar e secar 5 placas de vidro. Em um bquer de 50 mL preparar uma suspenso uniforme e livre de bolhas com cerca de 3g de gel de slica 60G e cerca de 10 mL de gua destilada. A suspenso deve ser fluida, porm com boa consistncia. Com auxlio de um basto de vidro, espalhar a suspenso cuidadosamente de maneira uniforme sobre a placa de vidro, mantendo-a na posio horizontal. Repousar as placas em superfcie plana livre de poeira e deixar secar ao ar. b) Seleo da fase mvel Escolher 03 solventes puros e/ou misturas de solventes a serem utilizados como fase mvel tomando como base a srie eluotrpica de solventes (em anexo) e os solventes disponveis no laboratrio. Realizar os itens c e d para cada fase mvel escolhida. c) Preparo da cuba cromatogrfica Utilizar vidraria livre de umidade. Preparar 20 mL da fase mvel, homogeneizar e adicionar em um bquer de 250 mL, previamente rotulado contendo papel de filtro aderido em uma das paredes internas. Se certificar de que a altura do solvente no ultrapasse 1,0 cm de altura. Tampar imediatamente o bquer com uma placa de Petri para saturao com os vapores do solvente. d) Aplicao da amostra e do padro na placa e desenvolvimento do cromatograma Utilizar uma placa cromatogrfica (preparada no item a) previamente ativada por aquecimento em estufa a 110oC por 30 minutos. Com a placa ainda quente e com o auxlio de uma rgua, marcar cuidadosamente nas bordas laterais da placa pontos de referncia (Fig. 2) a uma distncia de 1,0 cm da borda inferior e a 0,5 cm da borda superior (ponto de aplicao da amostra e ponto de chegada da frente de solvente, respectivamente). Adicionar pequena quantidade de diclorometano no bquer 3 contendo o extrato seco de folhas e no bquer contendo o extrato seco de cenoura, suficiente para obteno, em cada caso, de uma pequena quantidade de uma soluo concentrada de colorao intensa. Com o auxlio de um capilar de vidro, aplicar uma gota da soluo concentrada de extrato de folhas (preparado na parte I) na parte inferior da placa (ponto de aplicao da amostra). Fazer o mesmo procedimento com o extrato de cenoura: com outro capilar, aplicar o extrato a 1,0 cm da base da placa, separado do ponto de aplicao do extrato de folhas. Introduzir cuidadosamente a placa dentro da cuba cromatogrfica, tampar a cuba e esperar que a fase mvel atinja a marca de chegada. Retirar a placa com auxlio de uma pina metlica e sec-la cuidadosamente na capela de exausto. Observar as bandas e as suas coloraes. Documentar o cromatograma no caderno de laboratrio. Medir as distncias (em cm) percorridas pela fase mvel e por cada banda observada para os clculos dos fatores de reteno. Aps o experimento, guardar o extrato orgnico (bquer 2) em local escuro para a parte II do experimento. e) Revelao da placa Revelar a placa em uma cmara de luz ultravioleta a 365 nm. Observar se h o aparecimento de bandas fluorescentes. Em capela, colocar a placa em um recipiente contendo cristais de iodo. Fechar o recipiente e deixar por cerca de 10 minutos. Observar o aparecimento de bandas de colorao marrom. PARTE II - Separao por cromatografia em coluna Antes de realizar o experimento, pesar o extrato orgnico (seco) e anotar a massa. Usar vidraria livre de umidade. a) Empacotamento da coluna cromatogrfica Cortar um pedao de papel de filtro na forma de crculo com dimetro compatvel ao da coluna. Com auxlio de um basto de vidro, cobrir a placa de vidro sinterizado da coluna com o papel. Fixar a coluna verticalmente em um suporte universal. Manter um bquer abaixo da coluna. Pesar cerca de 8 g de gel de slica 60 e preparar uma suspenso com hexano (pasta fluida). Agitar com basto de vidro para eliminar as bolhas. Com a torneira fechada, adicionar hexano na coluna at completar cerca de 1/3 do volume da coluna. Adicionar a suspenso de slica dentro da coluna com auxlio de um funil de vidro e abrir a torneira da coluna. Passar vrias vezes hexano na coluna para o slido assentar gradualmente. No deixar a coluna secar durante o enchimento. Fechar a torneira aps o empacotamento. b) Aplicao do extrato na coluna cromatogrfica Empregar um dos mtodos a seguir: Mtodo 1 (extrato lquido): Abrir a torneira da coluna at o nvel do solvente se aproximar da superfcie da slica (cerca de 0,5 cm acima), porm sem deixar a coluna secar. Com a torneira fechada e com auxlio de uma pipeta tipo Pasteur de ponta longa (ou conta-gotas), transferir cuidadosamente a soluo concentrada do extrato (dissolvido em pequena quantidade de diclorometano) para o topo da coluna. A soluo do extrato no deve tocar as paredes da coluna. Espalhar uniformemente a soluo do extrato sobre a slica durante a aplicao. Abrir lentamente a torneira at o extrato ser totalmente adsorvido na slica. Fechar a torneira e colocar cuidadosamente sobre o extrato uma camada de slica de cerca de 1 cm de espessura ou um pequeno chumao de algodo. Mtodo 2 (extrato slido): Abrir a torneira da coluna at o nvel do solvente se aproximar da superfcie da slica (cerca de 0,5 cm acima), porm sem deixar a coluna secar. Adicionar uma pequena quantidade de slica 60 soluo concentrada do extrato orgnico de folhas (dissolvido em diclorometano) e agitar, usando um basto de vidro, at obter uma mistura slida seca e homognea. Com a torneira da coluna fechada e com auxlio de uma esptula, aplicar cuidadosamente o extrato no topo da coluna. O extrato no deve tocar as paredes da coluna. Durante a aplicao, espalhar uniformemente o extrato sobre a slica. Aps a aplicao, colocar cuidadosamente sobre o extrato uma camada de slica de cerca de 1 cm de espessura ou um pequeno chumao de algodo. c) Eluio do extrato na coluna cromatogrfica Selecionar, rotular (em sequncia numrica) e pesar 08 frascos coletores, sendo o primeiro denominado volume

morto. Com a torneira da coluna fechada, adicionar cuidadosamente hexano sobre a camada de slica. Abrir a torneira e iniciar a eluio, mantendo o fluxo da fase mvel em cerca de uma gota por segundo por todo o experimento e no deixando a coluna secar. Recolher o volume morto da coluna no primeiro frasco coletor. Trocar de frasco quando a primeira banda (amarela) atingir a placa de vidro sinterizado (prxima torneira da coluna). Manter a fase mvel at coletar a primeira banda no segundo frasco. Adicionar cuidadosamente a segunda fase mvel selecionada na parte I do experimento e recolher as bandas seguintes, trocando de frasco e a fase mvel quando necessrio, at recolher as bandas verdes. Por ltimo, mudar a fase mvel para a lavagem da coluna, recolhendo o lquido de lavagem no ltimo frasco coletor. Observar as coloraes de cada frao cromatogrfica obtida. Evaporar o solvente em capela. Pesar as fraes obtidas.
Srie de eluentes de baixo ponto de ebulio, em ordem crescente de polaridade Hexano ter de petrleo Cicloexano Tetracloreto de carbono Benzeno Tolueno Diclorometano Clorofrmio ter etlico Acetato de etila Piridina Acetona Etanol Metanol cido actico

Bibliografia
1. Pavia, D. L.; Lampman, G. M.; Kriz, G. S. Introduction Laboratory Techniques A Contemporary Approach. 3. ed. Orlando: Saunders College Publishing, 1988. 2. Wilcox, C. F.; Wilcox, M. F. Experimental Organic chemistry A small scale approach. 2. ed. New Jersey: Prentice Hall, 1988. 3. Collins, C. H.; Braga, G. L.; Bonato, P. S. Introduo a mtodos cromatogrficos, 6. ed, Campinas, Editora da UNICAMP, 1995. 4. StreitI,N. M.; L. P., CanterleI; CantoII, M. W.; HecktheuerII, L. H. H. As Clorofilas. Cienc. Rural, v.35, n. 3. p. 748-755, 2005.

Questionrio 1. Por que as folhas foram modas? Por que foi adicionado diclorometano? Poderia ser utilizado hexano? 2. Qual a finalidade do uso da CCD neste experimento? 3. Qual a finalidade do papel de filtro dentro da cuba cromatogrfica? Explicar. Se no fosse utilizado, o que seria observado? 4. O que Rf? Calcular os valores de Rf para as bandas. Explicar as diferenas encontradas. 5. Explicar como a fase mvel participa do processo de separao dos componentes de uma amostra por cromatografia slido-lquido. 6. Analisar os cromatogramas obtidos por CCD e classificar as fases mveis testadas quanto ao poder de resoluo e quanto ao poder de eluio. Indicar a melhor e a pior fase mvel para a separao dos pigmentos. 7. Considerando as estruturas qumicas dos grupos de compostos separados, as polaridades da fase estacionria e da fase mvel, comparar e explicar os cromatogramas obtidos na parte I do experimento. Que grupo de compostos eluiu primeiro na coluna? Que grupo de compostos ficou mais retido? 8. Qual o mecanismo de separao dos dois grupos de compostos neste experimento? Explicar. 9. Comparar os cromatogramas da amostra com os cromatogramas revelados sob luz ultravioleta e com iodo. 10. Por que a coluna foi empacotada com hexano? Este procedimento poderia ser realizado com a fase mvel selecionada na parte I do experimento? Qual a consequncia disso? 11. Por que a coluna no deve possuir bolhas e no deve secar? 12. Comparar o comportamento observado das bandas na CC com o observado na CCD. 13. Que tipo de eluio foi realizado no experimento de CC? Por qu? 14. Foi possvel separar e isolar clorofila a, clorofila b e feofitina a? Caso afirmativo, qual a ordem de eluio destes compostos? Justificar. Quais as coloraes observadas das bandas? Caso negativo, sugerir razes. 15. Em uma tabela, indicar as fraes obtidas, o aspecto fsico, a massa, a fase mvel e o rendimento percentual da separao. Quanto foi perdido do extrato na coluna cromatogrfica? 16. Explicar como as fraes cromatogrficas obtidas na separao por CC poderiam ser analisadas por CCD quanto pureza e quanto natureza qumica. 17. Por que a vidraria utilizada nos experimentos deve ser livre de umidade?