MICROBIOLOGA Y PARASITOLOGA GENETICA BACTERIANA

DOCENTE

Dra. Celinda Usquiano Mrquez Lic. Blga. Sonia Fiestas Purizaca Dr. Edinson Morales Chvez

ESTUDIANTE :

Alvarado Contreras, Lenny. Anacleto Galvez, Daniel. Bellido Macedo, Sandra. Benel Rivera, Christian. Bravo Espiche, Victoria. Cabrera Hurtado, Geraldine.
Campos Bautista, Carolyn.

Chiclayo, 16 de julio de 2012

I.

INTRODUCCION

La informacion gentica en las bacterias, como en toda clula, se encuentra contenida en la secuencia de nucletidos del ADN cromosmico. El conjunto de los caracteres genticos que la bacteria posee es el llamado genotipo, capaz de transmitirse a la descendencia; sin embargo, no todos estos caracteres se manifiestan, sino que el medio ambiente condiciona la aparicion o no de ellos. De ah que se denomina fenotipo al conjunto de caracteres manifestados por interaccin del genotipo y el medio ambiente. Las modificaciones que pueden aparecer en los caracteres de las poblaciones bacterianas pueden afectar su fenotipo o genotipo. En el primer caso se trata de variaciones fenotpicas y adaptaciones que aparecen ligadas a las condiciones ambientales que inducen o reprimen la expresin gentica. En el segundo caso, se trata de variaciones genotpicas, que pueden ser mutaciones o fenmenos de transferencia de material gentico. La capacidad infecciosa de las bacterias patgenas radica en que poseen la informacin gnica necesaria para colonizar los tejidos del husped, invadirlos y/o producir sustancias txicas que causarn la enfermedad. Por otro lado, el conocimiento del funcionamiento gentico de las bacterias, sumado al hecho de que son de fcil manejo en el laboratorio y que tienen crecimiento rpido, ha permitido usarlas para sintetizar productos tiles a la medicina, tanto para el diagnstico como para la prevencin y tratamiento de algunas enfermedades. Estas posibilidades se han visto incrementadas con el desarrollo de la ingeniera gentica y la disponibilidad de tcnicas de biologa molecular.

II.

OBJETIVOS

III.

MARCO TEORICO

El genoma bacteriano es el conjunto total de genes que porta una bacteria tanto en su cromosoma como en sus elementos genticos extracromosmicos, en caso de poseer alguno. El cromosoma bacteriano presenta algunas diferencias respecto al cromosoma humano. El cromosoma de una bacteria tpica (p. ej., Escherichia coli) consta de una sola molcula circular bcatenaria de cido desoxirribonucleico (ADN) que contiene aproximadamente 5.000.000 de pares de bases (o 5000 pares de kilobases [kb]) de una longitud aproximada de 1,3 mm (es decir, ms o menos 1000 veces el dimetro de la clula). Los cromosomas bacterianos ms pequeos (los de micoplasmas) miden aproximadamente la cuarta parte de dicha longitud. En cambio, el ser humano posee dos copias de 23 cromosomas, lo que representa 2,9 x 109 parejas de bases y 990 mm de longitud. Cada genoma contiene numerosos operones, que estn formados por genes. Habitualmente, los eucariotas poseen dos copias diferentes de cada cromosoma (por lo que son diploides). En cambio, por regla general las bacterias tan slo presentan una copia de sus cromosomas (consiguientemente, son haploides). Puesto que las bacterias poseen tan slo un cromosoma, la alteracin de un gen (mutacin) tendr un efecto mucho ms evidente en la clula. Asimismo, la estructura del cromosoma bacteriano se mantiene por medio de poliaminas (p. ej., espermina y espermidina) en lugar de por tristonas. Las bacterias pueden tambin contener elementos genticos extracromosmicos, como los plsmidos y los bacterifagos (virus bacterianos). Estos elementos son independientes del cromosoma bacteriano y, en la mayor parte de los casos, se pueden transmitir de una clula a otra. Los genes son secuencias de nucletidos que poseen una funcin biolgica; como ejemplos pueden citarse los genes estructurales de tipo proteico (los ostrones, que son genes codificadores), los genes del cido ribonucleico (ARN) rbosmco y los sitios de reconocimiento y de unin de otras molculas (promotores y operadores). Los promotores y los operadores son secuencias de nucletidos que controlan la expresin de un gen al determinar las secuencias que se transcribirn en ARN mensajero (ARNm). Los operones son grupos de uno o ms genes estructurales que se expresan a partir de un promotor especfico y finalizan en el denominado terminador de la transcripcin. Por tanto, todos los genes que codifican las enzimas de una ruta especfica pueden regularse de una forma coordinada. Los operones que poseen numerosos genes estructurales son policistrnicos. El opern lac de E. coli incluye todos los genes necesarios para el metabolismo de la lactosa, as como los mecanismos de control para mantenerlo apagado (en presencia de glucosa) o encendido (en presencia de galactosa u otra molcula inductora) tan slo cuando sea preciso. El opern lac incluye una secuencia represora, una secuencia promotora y genes estructurales para la enzima f3-galactosidasa, una permeasa, y una acetilasa.

Replicadora del ADN El cromosoma bacteriano es un almacn de informacin que define las caractersticas de las clulas y llevan a trmino los distintos procesos celulares. Por tanto, es fundamental que esta molcula se replique sin errores. La replicacn del cromosoma bacteriano se desencadena por una cascada de sucesos relacionados con la velocidad de crecimiento de la clula. La replicacin del ADN bacteriano se inicia en una secuencia especfica del cromosoma denominada OrC. Aparte de otras enzimas, el proceso de replicacin exige la participacin de una enzima (helicasa) capaz de desenrollar el ADN y exponerlo, otra enzima (primasa) capaz de sintetizar los cebadores (primers) que inician el proceso y una enzima o enzimas (polnerasas de ADN dependientes de ADN) que nicamente sintetizan una copia del ADN en presencia de una secuencia cebadora a la que aadir nucletidos y tan slo trabajan en direccin 5' a 3'. El ADN nuevo se sintetiza de forma semiconservadora y utilizando como plantillas ambas cadenas del ADN de la clula progenitura. La sntesis del nuevo ADN tiene lugar en una horquilla de crecimiento y sigue un curso bidireccional. Mientras una de las cadenas (cadena adelantada o leading strand) se copia de manera continua en la direccin 5'-3\ la otra cadena (cadena rezagada o lagging strand) ha de sintetizarse en forma de numerosas piezas de ADN a partir de cebadores de ARN (fragmentos de Okazaki). A medida que se expone su estructura, el ADN de la cadena rezagada ha de extenderse en la direccin 5'-3'. A continuacin, la enzima ligasa de ADN se encarga de unir las piezas. Para mantener el alto grado de precisin que exige el proceso de replicacin, las polimerasas de ADNs poseen unas funciones de correccin (proofreading functions) que permiten a la enzima confirmar que se ha insertado el nucletido correcto y corregir as los posibles errores que pudieran cometerse. Durante la fase logartmica decrecimiento en un medio rico, pueden tener lugar numerosos inicios del proceso de replicacin cromosmica antes de que tenga lugar la divisin celular. Este proceso genera una serie de nidos de burbujas en los cromosomas hijos, cada uno de los cuales contiene su propio par de horquillas de crecimiento para efectuar la sntesis de una nueva molcula de ADN. La polimerasa se desplaza a lo largo de la cadena de ADN e incorpora en cada posicin el nucletido (complementario) adecuado. La replicacin finaliza cuando las dos horquillas de replicacin se encuentran a 180 desde el origen. El proceso de replicacin del ADN impone una enorme fuerza de torsin sobre la molcula circular de ADN cromosmico, la cual se contrarresta por la accin de las topoisomerasas (p. ej., girasa) que superenrollan el ADN. Las topoisomerasas son enzimas clave para las bacterias y constituyen el objetivo de los antibiticos del grupo de las quinolonas.

Mltiples horquillas de crecimiento

Cadena conductora

Cadena rezagada

Replicacin del ADN bacteriano, la sintesis de ADN de novo se produce en horquillas de crecimiento y avanza en ambas direcciones. La sintesis de ADN tiene lugar de manera continua en sentido 5 a 3 (cadena adelantada) o en fragmentos. Suponiendo que cada ciclo de replicacin requiera 40 minutos, asi como un nuevo inicio cada 20 minutos, el inicio de la sintesis de ADN se produce con anterioridad a la division celular. En unas clulas pueden iniciarse mltiples horquillas de crecimientos antes de que haya ocurrido la formacin completa del tabique y la divisin celular.

Control de la transcripcin REGULACIN DE LA EXPRESIN GENTICA Las bacterias han desarrollado diversos mecanismos para adaptarse de forma rpida y eficiente a los cambios de concentracin de los nutrientes ambientales. Las bacterias ponen en marcha un conjunto completo de enzimas en caso necesario, mientras que en ausencia de sustrato evitan la produccin de la enzima o enzimas especficas de una ruta metablica. En primer lugar, y en respuesta a un estmulo nutricional, la organizacin de los genes de una ruta bioqumica en un opern dotado de unos mecanismos de control gentico adecuados permite la produccin coordinada de las enzimas necesarias. En segundo lugar, la transcripcin delgen es regulada directamente por unas protenas represoras (que se unen a los operadores) como respuesta a seales nutricionales en el interior de la clula. En tercer lugar, la velocidad de sntesis de las protenas por el ribosoma puede regular el proceso de transcripcin en los procariotas. La ausencia de una membrana nuclear permite al ribosoma procaritico unirse al ARNm conforme se transcribe a partir del ADN. REGULACIN DE LA TRANSCRIPCIN El inicio de la transcripcin puede estar sometido a unos mecanismos de control positivo o negativo. Los genes sometidos a un control negativo se expresan a menos que una protena represora los desconecte. Esta protena impide la expresin del gen al unirse a una secuencia

especfica del ADN, el denominado operador, lo que impide que la polimerasa de ARN inicie la transcripcin en el promotor. Por el contrario, los genes cuya expresin se encuentra sometida a un control positivo tan slo se transcriben en presencia de una protena reguladora activa denominada apoinductor. El apoinductor se une a una secuencia especfica del ADN y colabora con la polimerasa de ARN en los pasos iniciales mediante un mecanismo desconocido. Los operones pueden ser inducibles o represibles. La introduccin de un sustrato (inductor) en el medio de crecimiento puede inducir un aumento de la expresin por parte del opern de las enzimas necesarias para el metabolismo de dicho compuesto. La acumulacin de los productos finales (correpresores) de una ruta puede sealar la necesidad de desconectarla o reprimirla mediante una disminucin de la sntesis de sus enzimas. El opern de la lactosa (lac), encargado de la degradacin de este hidrato de carbono, es un opern inducible que se encuentra sometido a una regulacin tanto positiva como negativa. Normalmente, la bacteria utiliza glucosa y no lactosa. En ausencia de lactosa, la protena represora se fija a la secuencia del operador y el opern queda reprimido, con lo que se impide la funcin normal de la polimerasa de ARN. Sin embargo, la adicin de lactosa invierte esta represin en ausencia de glucosa. La expresin completa del opern lac tambin exige la presencia de un mecanismo de control positivo mediado por protenas. En E. coli, una protena denominada protena activadora de genes por catabolito (PAC) forma un complejo con el monofosfato cclico de adenosina (AMPc) y adquiere as la capacidad de fijarse a una secuencia especfica del ADN presente en el promotor. El complejo PACAMPc favorece la unin de la polimerasa de ARN al promotor, con lo que se traduce en un incremento de la frecuencia de inicio de la transcripcin. El complejo PAC-AMPc puede potenciar la transcripcin del opern mediante una interaccin protena-protena con la polimerasa de ARN o bien mediante una interaccin protena-ADN. El opern del triptfano (opern trp) contiene los genes estructurales necesarios para la biosntesis de este aminocido y se halla sometido a unos mecanismos de control dobles de la transcripcin. Aunque el triptfano es esencial para la sntesis de protenas, su presencia en concentraciones excesivas puede resultar txica para la clula, por lo que su sntesis debe estar regulada. A nivel gnico, el aumento de la concentracin intracelular de triptfano activa la protena represora para inhibir el proceso de transcripcin. Respecto a la sntesis de protenas, la traduccin rpida de un pptido de prueba al comienzo del ARNm en presencia de triptfano favorece la formacin de un asa bicatenaria en el ARN, lo cual pone fin al proceso de transcripcin. Este asa se forma tambin cuando no tiene lugar la sntesis de protenas, una situacin que tampoco requerira la sntesis de triptfano. Ambos mecanismos regulan la sntesis de triptfano a nivel del ARNm en un proceso denominado atenuacin y en el que se registra una interrupcin prematura de la sntesis del ARNm. REGULACIN POSTRANSCRIPCIN 0 REGULACIN DE LA TRADUCCIN La velocidad y la eficiencia de la sntesis de protenas pueden estar controladas por otros factores, como la estructura del ARNm o las concentraciones celulares del ARN de transferencia (ARNt) y de ciertos aminocidos. En los ARNm policistrnicos, el control de la traduccin puede ocasionar la

aparicin de diferencias en la cantidad de protena expresada a partir de cada gen. Por ejemplo, la |3-galactosidasa, la galactsido- permeasa y la acetilasa se producen en una relacin de 10:5:2 en el caso del opern lac. Mutacin, reparacin y recombinacin El ADN transporta informacin gentica, por lo que las clulas deben ser capaces de replicarlo con precisin. Adems han de minimizar la aparicin de cualquier dao accidental ocasionado al ADN mediante sistemas eficientes de reparacin de esta molcula. Estos sistemas de contencin del dao revisten tal importancia para la subsistencia cel llar que la bacteria dedica un alto porcentaje de su genoma a la especificacin y el control de las enzimas que forman parte de ellos. MUTACIONES Y SUS CONSECUENCIAS Una mutacin se define como cualquier modificacin de la secuencia de bases del ADN. Un cambio de una sola base puede ocasionar una transicin, en la que una purina es sustituida por otra purina o una pirimidina es reemplazada por otra pirimidina. Tambin puede aparecer una transversin, en la que una purina es sustituida por una pirimidina o viceversa. Una mutacin silenciosa es una modificacin del ADN que no provoca cambios en la secuencia aminoacdica de la protena codificada. Este tipo de mutacin se debe a que un aminocido puede estar codificado en ms de un codn. Aunque una mutacin de sentido errneo (missense) es aquella que comporta la insercin de un aminocido diferente en la protena; sin embargo, cuando el nuevo aminocido posee unas propiedades semejantes (p. ej., una valina que sustituye a una alanina) puede tratarse de una mutacin conservadora. Una mutacin sin sentido (nonsense) es aquella en la que se sustituye un codn que codifica a un aminocido por un codn de interrupcin (p. ej., TAG [timidina-adeninaguanina]), lo que provoca que el ribosoma pierda el ARNm y finalice prematuramente la produccin de la protena. Se pueden observar modificaciones ms notables cuando la mutacin afecta a un gran nmero de bases. Una pequea delecin o insercin que no ocurra en mltiplos de tres produce una mutacin de desfase de lectura (frameshift mutation) que altera el sistema de lectura y habitualmente ocasiona la aparicin de un pptido absurdo y la interrupcin prematura de la protena. Las mutaciones nulas, que destruyen completamente la funcin del gen, aparecen cuando se registra una extensa insercin o delecin o una acusada reorganizacin de la estructura cromosmica. La insercin de largas secuencias de ADN (muchos miles de pares de bases) por recombinacin, transposicin o tcnicas de ingeniera gentica puede producir mutaciones nulas por separacin de las partes de un gen e inactivacin del mismo. En la naturaleza se produce un gran nmero de mutaciones de forma espontnea (p. ej., debido a errores de la polimerasa); sin embargo, las mutaciones pueden tambin ser consecuencia de agentes fsicos o qumicos. Entre los agentes fsicos utilizados para inducir la aparicin de mutaciones en las bacterias figuran los siguientes: el calor, que provoca una desaminacin de los nucletidos; la luz ultravioleta, que origina la formacin de dmeros de pirimidina y la radiacin

ionizante (p. ej., rayos X), que producen radicales hidroxilo hiperreactivos capaces de abrir la estructura anular de una base o bien de generar roturas monocatenarias o bicatenarias en el ADN. Las sustancias qumicas de tipo mutagnico pueden agruparse en tres clases. Los anlogos de nucletidos producen apareamientos errneos y frecuentes errores en la replicacin del ADN. Por ejemplo, la incorporacin de 5-bromouracilo en la molcula de ADN en lugar de timidina permite su apareamiento con guanina en lugar de adenina, de forma que sustituye un par T-A por un par G-C. Los mutgenos de desfase de lectura, como algunas molculas policclicas planas (bromuro de etidio, derivados de la acridina) se insertan (o intercalan) entre las bases a medida que se enfrentan una a otra en la doble hlice del ADN. Estos agentes intercalantes aumentan el espacio existente entre los sucesivos pares de bases, de modo que destruyen el esqueleto regular de hidratos de carbono-fosfato y disminuyen el grado de inclinacin de la hlice. Estos cambios comportan la adicin o delecin de una nica base y ocasionan la aparicin de frecuentes errores durante la replicacin del ADN. Las sustancias qumicas reactivas frente al ADN actan directamente sobre este y modifican la estructura qumica de la base. Entre estas sustancias qumicas destacan el cido nitroso (HN02) y los agentes alquilantes (p. ej., nitroso-guanidina y etilmetano-sulfonato), de los que se sabe que aaden grupos metilo o etilo a los anillos de las bases del ADN. Las bases modificadas pueden aparearse de forma anormal o bien no aparearse. Esta alteracin puede provocar la eliminacin de la base del esqueleto del ADN.

MECANISMOS DE REPARACIN DELADN Con el propsito de minimizar los daos al ADN, las clulas bacterianas han desarrollado diversos mecanismos de reparacin. Estos mecanismos de reparacin se pueden dividir en cinco grupos: 1. La reparacin directa del ADN consiste en la eliminacin enzimtica del dao (p. ej., dmeros de pirimidina y bases alquiladas). 2. La reparacin por escisin se basa en la escisin del segmento de ADN que contiene las lesiones, seguida de la sntesis de una nueva hebra de ADN. Existen dos tipos de mecanismos de reparacin por escisin: generalizada y especializada. La reparacin posreplicacin o por recombinacin consiste en la recuperacin de la informacin que falta mediante procesos de recombinacin gentica (cuando estn daadas ambas dos hebras de ADN). La llamada respuesta SOS se caracteriza por la induccin de numerosos genes (aproximadamente 15) tras la aparicin de dao al ADN, o bien en la interrupcin de su replicacin.

La reparacin propensa a error (error-prone repetir) es el ltimo recurso con que cuenta la clula bacteriana antes de morir. Se utiliza para rellenar los espacios con una secuencia aleatoria cuando no se dispone de una plantilla de ADN que pueda orientar con precisin el proceso de reparacin. Intercambio gentico en los procariotas Muchas bacterias (especialmente numerosas especies patgenas) utilizan su ADN de forma promiscua. El intercambio de ADN entre clulas permite el intercambio de genes y caractersticas entre ellas, lo que ocasiona la aparicin de cepas bacterianas nuevas. Este intercambio puede resultar ventajoso para el receptor, especialmente cuando el ADN codifica mecanismos de resistencia a los antibiticos. El ADN transferido puede integrarse en el cromosoma del receptor o bien mantenerse de manera estable en forma de elemento extracromosmico (plsmido) o como un virus bacteriano (bacterifago) y se transmite a las bacterias hijas como una unidad dotada de capacidad autnoma de replicacin. Los plsmidos son pequeos elementos genticos cuya replicacin es independiente del cromosoma bacteriano. La mayor parte de los plsmidos son molculas circulares bicatenarias de ADN con un nmero variable de pares de bases (de 1500 a 400.000). Sin embargo, Borrelia burgdorferi (el agente etiolgico de la enfermedad de Lyme) y la bacteria afn Borrelia hermsii presentan una caracterstica peculiar en el grupo de las eubacterias: la presencia de plsmidos lineales. Al igual que el ADN cromosmico bacteriano, estos plsmidos se pueden replicar de forma autnoma, por lo que reciben el nombre de replicones. Algunos plsmidos, como el plsmido F de E. coli, son episomas, lo que indica que se pueden integrar en el cromosoma del anfitrin. Los plsmidos portan informacin gentica, la cual puede proporcionar una ventaja selectiva a las bacterias aunque no constituya una ventaja selectiva para la bacteria. Por ejemplo, los plsmidos pueden conferir un nivel alto de resistencia a antibiticos, codificar la produccin de bacteriocinas, toxinas, determinantes de virulencia y contener otros genes que otorguen una ventaja respecto a la metabolizacin de ciertos sustratos en comparacin con otros microorganismos o en el interior del organismo anfitrin. El nmero de copias de plsmido producidas por una clula es especfico de cada uno de ellos. Este nmero es la relacin existente entre las copias del plsmido y el nmero de copias del cromosoma. Su valor puede ser bajo (hasta de 1 en el caso de los plsmidos grandes) o alto (hasta de 50 en los plsmidos ms pequeos). Los plsmidos de gran tamao (20-120 kb), como el factor F de fertilidad de E. coli o el factor de transferencia de resistencia (80 kb), pueden a menudo mediar su propia transferencia de una clula a otra mediante un proceso denominado conjugacin (vase el apartado sobre Conjugacin, ms adelante en este captulo). Estos plsmidos conjugativos codifican todos los factores necesarios para su propia transferencia. En cambio, otros plsmidos pueden ser transferidos a las clulas bacterianas por medio de mecanismos distintos de la conjugacin (p. ej., por transformacin o por transduccin).

Los bacterifagos son virus bacterianos. Estos elementos genticos extracromosmicos pueden sobrevivir fuera de la clula del anfitrin ya que su genoma (que puede estar formado por ARN o ADN) est protegido por una capa de protenas.

Los bacterifagos infectan las clulas bacterianas y/o se replican hasta un nmero elevado que ocasiona la lisis de la clula (infeccin ltica) o, en algunos casos, se integran en el genoma del anfitrin sin producir su muerte (el llamado estado lisognico), como el bacterifago X de E. coli. Algunos bacterifagos lisognicos portan genes toxignicos (p. ej., el fago (3 contiene el gen de la toxina de la difteria). El bacterifago X permanece en estado lisognico mientras contine la sntesis de una protena represora, y evita que el fago abandone su estado de integracin y se replique independientemente del cromosoma del anfitrin. Esta reaccin se desencadena cuando la radiacin u otro factor daa el ADN de la clula anfitriona o bien cuando la clula es incapaz de continuar fabricando nuevas molculas de la protena represora, seal de que la clula anfitriona no est sana y no representa un lugar adecuado para el proceso de replicacin vrica. Los transposones (genes que saltan) son unos elementos genticos mviles que pueden transferir ADN de una posicin a otra del genoma o entre distintas molculas de ADN dentro de una misma clula (p. ej., de un plsmido a otro o de un plsmido a un cromosoma). Los transposones se detectan tanto en los procariotas como en los eucariotas. Los transposones ms simples se conocen como secuencias de insercin y su longitud comprende de 150 al 500 pares de bases con repeticiones invertidas de 5 a 40 pares de bases y la informacin gentica mnima necesaria para su propia transferencia. Los transposones complejos contienen otros genes, como genes que proporcionan resistencia frente a antibiticos. En ocasiones, los transposones se introducen en el interior de los genes y los inactivan. Si la insercin e inactivacin tiene lugar en un gen encargado de codificar una protena esencial, la clula muere. Algunas bacterias patgenas utilizan un mecanismo semejante para coordinar la expresin de un sistema de factores de virulencia. Los genes de actividad pueden agruparse en un islote de virulencia o patogenicidad rodeado por unos elementos mviles semejantes a los transposones que les permiten moverse tanto en el interior del cromosoma como haca otras bacterias. Cualquier unidad gentica puede reaccionar ante la presencia de un estmulo ambiental (p. ej., pH, calor o contacto con la superficie de la clula del anfitrin) como mecanismo de coordinacin de la expresin de un proceso complejo. Por ejemplo, el islote SPI-1 de Salmonella codifica 2 5 genes que permiten la entrada de esta bacteria en clulas no fagocticas. Mecanismos de transferencia gentica entre clulas El intercambio de material gentico entre las clulas bacterianas puede tener lugar a travs de uno de los tres mecanismos siguientes:

1) conjugacin, que consiste en un apareamiento o intercambio cuasisexual de informacin gentica entre una bacteria (donante) y otra bacteria (receptora). 2) transformacin, la cual provoca la adquisicin de nuevos marcadores genticos mediante la incorporacin de ADN exgeno. 3) transduccin, la cual se caracteriza por la transferencia de informacin gentica de una bacteria a otra por medio de un bacterifago. En el interior de la clula, el transposn puede saltar entre distintas molculas de ADN (p. ej., plasmido a plasmido o plasmido a cromosoma).

La transformacin es el proceso mediante el cual las bacterias captan fragmentos de ADN desnudo y los incorporan a sus genomas. La transformacin fue el primer mecanismo de transferencia gentica que se descubri en las bacterias. En 1928, Grifflth observ que la virulencia del neumococo se relacionaba con la presencia de una cpsula de polisacrido que le rodeaba y que los extractos de bacterias encapsuladas productoras de colonias lisas podan transmitir este rasgo

a las bacterias no encapsuladas, las cuales presentan generalmente una morfologa rugosa. Alrededor de quince aos despus, los estudios de Grifflth permitieron que Avery, McLeod y McCarty identificaran el ADN como el principio clave del mecanismo de transformacin. Las bacterias grampositivas y gramnegativas son capaces de captar y conservar de forma estable ADN exgeno. Ciertas especies presentan una capacidad natural de captacin de ADN exgena (por lo que se definen como competentes), como Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae y bacterias pertenecientes a los gneros Bacillus y Neissera. La competencia aparece al final de la fase logartmica de crecimiento, un cierto tiempo antes de que la poblacin bacteriana entre en la fase estacionaria. La mayor parte de las bacterias no muestra una capacidad natural de captacin del ADN. Asimismo, para introducir plsmidos y otras molculas de ADN en el interior de E. coli y otras bacterias se utilizan mtodos qumicos o de electroporacn (empleo de pulsos de alto voltaje). CONJUGACIN La conjugacin se produce en la mayora, si no en todas, las eubacterias. Suele darse entre bacterias pertenecientes a una misma especie o de especies relacionadas, aunque tambin tiene lugar entre procariotas y clulas vegetales, animales y micticas. La conjugacin se ha descrito en E. coli, bacteroides, enterococos, estreptococos, estreptomicetos y clostridios. Un gran nmero de plsmidos conjugativos de mayor tamao codifica colicinas o resistencia a antibiticos. La transferencia gentica en E. coli fue descrita por vez primera en 1946 por Lederberg y Tatum al observar un intercambio semejante al sexual entre dos cepas mutantes de E. coli K12. La conjugacin es el proceso por el que el ADN pasa directamente por contacto intercelular durante el acoplamiento de las bacterias. La conjugacin produce una transferencia unidireccional de ADN desde una clula donante (o macho) hasta una clula receptora (o hembra) a travs del llamado pilus sexual. Las bacterias grampositivas que llevan a cabo una conjugacins R (resistencia antibitica), como ios estreptococos, los estreptomicetos y los clostridios, se acercan por medio de una molcula de adhesina presente en la superficie de la clula donante en lugar de a travs de un pilus. El tipo de acoplamiento (sexo) de la clula depende de la presencia (clula macho) o ausencia (clula hembra) de un plsmido conjugativo, como el plsmido F de E. coli. El plsmido F se define como conjugativo porque contiene todos los genes necesarios para su propia transferencia, como la capacidad de fabricar pli sexuales e iniciar la sntesis de ADN en el llamado origen de transferencia (OrT). El plsmido F se transfiere a s mismo, convirtiendo a las clulas receptoras en clulas macho F+. Cuando un fragmento de ADN cromosmico se ha incorporado a la secuencia del plsmido, se designa como plsmido F prima (F'). Cuando este plsmido se transfiere al interior de la clula receptora, transporta el fragmento y lo convierte en un F' macho. Cuando la secuencia del plsmido se integra en el interior del cromosoma bacteriano, la clula se designa como clula Fffr (alta frecuencia de recombinacin).

Mecanismos geneticos de evolucion de Staphylococcus aureus resistente a meticina y vancomicina. Los enterococos resistentes a vancomicina (ERV) (color rojo) contienen plsmidos portadores de numerosos factores de resistencia antibiotica y virulencia. Durante la confeccin, un Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) podria haber adquirido el plasmido de resistencia enterococica (plasmido e) mediante un proceso de transformacin o, con mayor probabilidad, por conjugacin. Un transaosn del plsmido e que contiene el gen de resisitencia a vancomicina salto y se inserto en el plasmido de resistencia antibiotica mltiple del SARM. El nuevo plsmido se propaga con facilidad a otras clulas del 5. Aureus por conjugacin.

El ADN transferido por conjugacin no es una molcula bicatenaria helicoidal, sino una molcula monocatenaria. La movilizacin comienza cuando una protena codificada por un plsmido introduce una rotura monocatenaria en un punto especfico del OriT. La muesca as formada inicia un replicacin por crculo rodante y la cadena lineal desplazada se dirige hacia la clula receptora. A continuacin, el ADN monocatenario adopta nuevamente una conformacin circular y sintetiza su cadena complementaria. La integracin de un plsmido F en el cromosoma bacteriano crea una clula Hfr. La conjugacin comporta la transferencia parcial de la secuencia plasmdica y de un fragmento del ADN cromosmico bacteriano. Como consecuencia de la fragilidad de la conexin formada entre las dos clulas acopladas, la transferencia se suele interrumpir antes de finalizar el proceso, de modo que nicamente se transfieren las secuencias cromosmicas cercanas al plsmido F integrado.

La interrupcin artificial de un acoplamiento entre un Hfr y una pareja F~ ha resultado til para cartografiar el ADN cromosmico de E. coli. Este tipo de mapas muestra la posicin de cada gen en minutos (en relacin con los 100 minutos que requiere la transferencia completa a 3 7 C) segn su momento de entrada a una clula receptora respecto a un origen fijo. TRANSDUCCIN La transferencia gentica por transduccin est mediada por virus bacterianos (bacterifagos) que captan fragmentos de GENTICA BACTERIANA ADN y los almacenan en el interior de partculas de bacterifago. El ADN suministrado a las clulas infectadas es luego incorporado al genoma bacteriano. La transduccin puede clasificarse como especializada si los fagos en cuestin transfieren genes especficos (habitualmente los adyacentes a sus lugares de integracin en el genoma) o generalizada si la seleccin de las secuencias es aleatoria debido al almacenamiento accidental del ADN de la clula anfitriona en el interior de la cpside del fago. Las partculas de la transduccin generalizada deben contener sobre todo ADN bacteriano y una cantidad pequea o nula de ADN del fago. Por ejemplo, el fago Pl de E. coli codifica una nucleasa que degrada el ADN cromosmico de las clulas anfitrionas de E. coli. Un pequeo porcentaje de las partculas resultantes de fago almacenan los fragmentos de ADN en el interior de sus cpsides. En lugar del ADN del fago, se inyecta ADN encapsulado en el interior de una nueva clula anfitriona, en la que puede recombinarse con el ADN homlogo de aquella. Las partculas implicadas en la transduccin generalizada son muy valiosas para realizar el cartografiado gentico de los cromosomas bacterianos. Cuanto ms prximos se dispongan dos genes en el cromosoma bacteriano, mayor ser la probabilidad de un proceso de cotransduccin en el mismo fragmento de ADN. Recombinacin La incorporacin del ADN extracromosmico en el cromosoma tiene lugar mediante un proceso de recombinacin. Existen dos tipos de recombinacin: homologa y no homologa. La recombinacin homologa (legtima) es la que tiene lugar entre secuencias de ADN estrechamente relacionadas y habitualmente sustituye una secuencia por otra. El proceso requiere la presencia de un conjunto de enzimas producidas por los llamados genes rec (en E. coli). La recombinacin no homologa (ilegtima) es la que tiene lugar entre secuencias distintas de ADN y, por regla general, produce inserciones, deleciones o ambas. Habitualmente este proceso precisa de la intervencin de enzimas de recombinacin especializadas (algunas veces, incluso especficas para un sitio determinado), como las producidas por muchos transposones y bacterifagos lisognicos. CREACIN DE CEPAS DE STAPHYLOCOCCUSAUREUS RESISTENTES A VANCOMICINA MEDIANTE DIVERSAS MANIPULACIONES GENTICAS Hasta hace poco tiempo, vancomicina ha constituido el ltimo recurso frente a las cepas de S. aureus resistentes a los betalactmicos (antibiticos relacionados con la penicilina), es decir,

S. aureus resistente a meticilina [SARM]). S. aureus adquiri el gen de resistencia a vancomicina en el transcurso de una infeccin mixta por Enterococcus faecalis. El gen de resistencia a este antibitico se hallaba en un transposn (TN1546) localizado en un plsmido conjugativo de multirresistencia. Es probable que la transferencia del plsmido tuviera lugar mediante conjugacin entre E. faecalis y S. aureus. Otra posibilidad sera que este ltimo adquiriera el ADN por transduccin tras la lisis de E. faecalis y sufriese una transformacin como consecuencia de la introduccin de este nuevo ADN. A continuacin, el transposn habra saltado desde el plsmido de E. faecalis para recombinarse e integrarse en el plsmido de multirresistencia de S. aureus, y se habra degradado el ADN del primer microorganismo. El plsmido de S. aureus as creado contiene genes de resistencia a betalactmicos, vancomicina, trimetoprim y gentamicina/kanamicina/ tobramicina y a desinfectantes de amonio cuaternario y es capaz de transferirse a otras cepas de esta especie mediante procesos de conjugacin. Ingeniera gentica La ingeniera gentica (conocida tambin como tecnologa del ADN recombinante) emplea tcnicas y mtodos desarrollados por especialistas en gentica bacteriana con el objeto de purificar, amplificar, modificar y expresar secuencias genticas especficas. La utilizacin de la ingeniera gentica y la clonacin ha revolucionado tanto la biologa como la medicina. Los componentes bsicos con que cuenta la ingeniera gentica son los siguientes: 1) Los vectores de clonacin y expresin, que pueden utilizarse para introducir secuencias de ADN en el interior de bacterias receptivas y amplificar la secuencia deseada. 2) La secuencia de ADN que se desea amplificar y expresar. 3) Diversas enzimas, como las enzimas de restriccin, que se usan para degradar de forma reproducible la molcula del ADN en unas secuencias determinadas y la ligasa de ADN, la enzima que une los fragmentos al vector de clonacin.

Los vectores de clonacin y expresin deben permitir que el ADN exgeno se inserte en su interior, pero conservando su capacidad de replicacin normal en la clula anfitriona bacteriana o eucariota. En la actualidad se utilizan muchos tipos de vectores. Los vectores de tipo plasmdico, como pUC, pBR322 y pGEM se ocupan de fragmentos de ADN de hasta 20 kb. Los bacterifagos, como X, se emplean para fragmentos mayores de ADN (de hasta 25 kb). Ms recientemente, los vectores basados en csmidos han combinado algunas de las ventajas de los plsmidos y los fagos para transportar fragmentos de ADN de hasta 45 kb. La mayora de los vectores de clonacin se ha sometido a tcnicas de ingeniera gentica para: creacin de un sitio de insercin del ADN exgeno; un medio de seleccin de las bacterias que han incorporado plsmidos (p. ej., resistencia a los antibiticos) y un medio de seleccin de las que han incorporado esos plsmidos con ADN insertado. Los vectores de expresin poseen secuencias de ADN que facilitan su replicacin en las clulas bacterianas y eucariotas, as como la transcripcin del gen en ARNm. El ADN que se desea clonar se obtiene mediante la purificacin del ADN cromosmico de clulas, virus u otros plsmidos o bien por amplificacin selectiva de secuencias de ADN a travs de una tcnica conocida como reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Tanto el vector como el ADN exgeno son atacados por enzimas de restriccin. Las enzimas de restriccin reconocen una secuencia palindrmica especfica y realizan un corte significativo (que produce la aparicin de extremos adherentes) o un corte romo (que produce unas terminaciones romas). La mayora de los vectores de clonacin presentan una secuencia que reconoce numerosas enzimas de restriccin, el denominado lugar de clonacin mltiple. La unin del vector a los fragmentos de ADN genera una molcula capaz de replicar la secuencia insertada y que recibe el nombre de ADN

recombinante. El nmero total de vectores recombinantes obtenidos durante la clonacin de todos los fragmentos obtenidos en la restriccin del ADN cromosmico se conoce como biblioteca genmica, puesto que debe contener al menos un representante de cada gen. Un mtodo alternativo de clonacin del gen de una protena consiste en convertir en ADN el ARNm destinado a ella; se lleva a cabo mediante una enzima retroviral denominada transcriptasa inversa (polimerasa de ADN dependiente de ARN) y el proceso genera un ADN complementario (ADNc). Una biblioteca de ADNc engloba todos los genes expresados en una clula determinada.

A continuacin, el ADN recombinante se introduce en una clula anfltriona bacteriana, habitualmente E. coli, y se seleccionan las bacterias que contienen el plsmido por su resistencia antibitica (p. ej., resistencia a ampicilina). Despus se puede realizar un cribado de la biblioteca con el fin de identificar un clon de E. coli que posea el fragmento de ADN deseado. Para identificar las bacterias que contienen el ADN recombinante apropiado pueden utilizarse diversas tcnicas. El lugar de clonacin mltiple utilizado para insertar el ADN exgeno con frecuencia forma parte del gen lacZ del opern lac. La insercin del ADN exgeno en el gen lacZ conlleva su inactivacin (acta casi del mismo modo que un transposn) y evita que la clula receptora lleve a cabo la sntesis de |3-galactosidasa dirigida por un plsmido, lo que resulta en la formacin de colonias bacterianas blancas en lugar de las azules que aparecen cuando esta enzima degrada un cromforo adecuado. La ingeniera gentica se ha utilizado tambin para aislar y expresar distintos genes con el propsito de obtener protenas tiles en bacterias, levaduras o, incluso, en clulas de insecto (p. ej., insulina, interfern, hormonas del crecimiento e interleucina). Igualmente se pueden preparar grandes cantidades de un inmungeno puro destinado a una vacuna sin necesidad de emplear los microorganismos patgenos intactos. El desarrollo de una vacuna contra el virus de la hepatitis B constituye el primer xito de las vacunas de ADN recombinante cuyo uso en el ser humano ha autorizado la Food and Drug Administration de EE.UU. El antgeno de superficie de la hepatitis B es producido por la levadura Saccharomyces cerevisiae. En el futuro, puede que baste con inyectar un ADN plasmdico capaz de expresar el inmungeno deseado (vacuna de ADN) a un individuo para conseguir que las clulas del anfitrin expresen este inmungeno y desencadenen la respuesta inmunitaria. La tecnologa del ADN recombinante resulta tambin esencial en el diagnstico de laboratorio, las tcnicas forenses, la agricultura y muchas otras disciplinas.

IV. V.

CONCLUSIONES REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS