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Cultivo de Spirulina maxima para suplementacin proteica

Livestock Research for Rural Development

Volume 1, Number 1, November 1989

Cultivo de Spirulina maxima para suplementacin proteica

Gloria Ximena Pedraza
Fundacin CIPAV, AA 20591, Cali, Colombia

Summary
Experiments were carried out in the Instituto Mayor Campesino (IMCA), Buga, Valle (Mean temperature 21C; 1000 m above sea level), to evaluate local sources of media for the culture of Spirulina maxima. Biodigester and distillery effluents were compared at dilutions (volumes effluent:water) of 0.25:0.75, 0.5:0.5, 0.75:0.25 y 1.0:0.0. An inoculum of spirulina (aproximately 192 cells/ml) was added at the rate of 200 ml per 1,000 ml of media. The treatments for the distillery effluent were: 0.5:0.5, 0.6:0.4 and 0.7:0.3 (effluent:water). Sodium bicarbonate was added in concentrations of 17 and 34 g/litre of media for the biodigester and distillery effluent treatments, respectively. The media were cultured in rectangular glass containers and agitated by bubbling air with a micro-compressor. Fastest growth of the culture was with dilutions of 0.5:0.5 volumes of effluent:water for both substrates. Concentrations of spirulina cells were 530, 1380 and 9500/ml after 2, 15 and 30 days of incubation with biodigester effluent. Corresponding values for distillery effluent were 1170, 2190 and 10,460. Major contaminants in the biodigester effluent media were Chlorella, Amoeba and Paramecium spp. The temperature of the media ranged from 23 to 29C, but appeared to have no marked effect on the growth rate of the spirulina. Key words: Spirulina, biodigester, distillery, effluent, protein, animal, bicarbonate, culture.

Resumen
En el Instituto Mayor Campesino en Buga con una temperatura de 21C y una altura de 1000 msnm, se llevaron a cabo ensayos para evaluar medios de cultivo apropiados para la cianobacteria Spirulina maxima usando efluente de biodigestores y vinaza, desecho proveniente de la fermentacin alcohlica de las mieles despus de la adicin de cido sulfrico, suplementando con bicarbonato de sodio para cumplir los requerimientos en carbono y estabilizar el pH. En primera instancia se reprodujo la semilla en medio qumico con un tiempo de doblaje de biomasa de 20 a 30 das. Luego se realizaron ensayos usando proporciones (volmenes) de efluente: agua de 0.25:0.75, 0.5:0.5, 0.75:0.25 y 1.0:0.0. A estas mezclas se agreg un inculo de spirulina en proporciones de 200 ml de inculo por cada litro de la mezcla. El inculo contena 192 clulas/ml, dando as una concentracin inicial de clulas en los distintos medios de aproximadamente 32 clulas por ml. Para la vinaza, las proporciones (vinaza:agua) fueron: 0.5:0.5, 0.6:0.4 y 0.7:0.3, agregndose las mismas cantidades de inculo de spirulina. Para el efluente de biodigestor se agreg 17 g de bicarbonato de sodio por litro del medio; y en el caso de la vinaza 34 g de bicarbonato. Los medios se colocaron en estanques rectangulares de vidrio, y fueron agitados con aire de un microcompresor. Se obtuvo la mayor tasa de reproduccin del cultivo con el tratamiento de 0.5:0.5 (efluente:agua) tanto para el
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del biodigestor como el de la destilera. Las lecturas fueron 530, 1380 y 9500 clulas/ml a los 2, 15 y 30 das despus. Los valores correspondientes para la vinaza fueron 1170, 2190 y 10,460 respectivamente. La mayor contaminacin que present el cultivo fue debida a Chlorella sp. y protozoarios como Amoeba sp. y Paramecium sp. Los cambios de temperatura registrados entre el dia y la noche fueron considerables (desde 23 a 29C), pero al parecer no afectaron significativamente el desarrollo del cultivo. Palabras claves: Spirulina maxima, cultivo, efluente, vinaza, bicarbonato de sodio.

Introduccin
La falta de fuentes proteicas que puedan reemplazar los concentrados con altos costos de adquisicin en el mercado para los pequeos productores, llev a considerar la Spirulina maxima como una fuente alternativa con alto contenido proteico (65%) y con un balance de aminocidos excelente, aunque con un contenido bajo en metionina para usarlo en la alimentacin animal, especialmente en monogstricos. En pases desarrollados como Mxico, EEUU y Japn la Spirulina maxima es usada en la alimentacin humana para suplir la deficiencia de protena, pero con sistemas de produccin, cosecha y secado muy tecnificados y costosos (Shelef y Soeber 1980). Se han logrado producciones mximas de hasta 120 toneladas/ha/ao con un promedio en contenido de protena del 50% y en sistemas de produccin para nutricin en cerdos se han obtenido entre 14 y 34 gr/m/da (Lincoln 1985). Se ha empleado en la alimentacin de animales, humanos, en acuacultura para la cra de microcrustceos, para tratamiento de aguas residuales y como fuente energtica, adems de contribuir a la eliminacin de desechos.

Revisin literaria
Caractersticas de la Spirulina maxima La Spirulina maxima, una cianobacteria comnmente considerada como una microalga por su estructura filamentosa, pertenece al grupo de las cianobacterias no heterocsticas del gnero de las Oscillatoriaceae (Hargaravez y Viquez 1982). Se considera como un tricoma helicoidal de forma cilndrica e inmvil, cuya reproduccin se realiza por ruptura intracelular. Su talla oscila entre 13 y 25 micras. La asimilacin de dixido de carbono se hace a travs del ciclo de Calvin, con formacin de glucgeno como material de reserva. La espirulina es capaz de realizar la fotosntesis oxignica y de fijar el nitrgeno del medio. Puede crecer en medios minerales que tengan CO2 como fuente de carbono y N2 como fuente de nitrgeno a partir de desechos, nitrgeno atmosfrico o de la respiracin bacteriana (Lincoln 1985). Esta cianobacteria presenta un alto contenido de protena (50% a 65%) con todos los aminocidos esenciales que se requieren nutricionalmente segn la FAO, pero con contenido bajo en metionina (Kosaric et al 1974), como puede observarse en el Cuadro 1.
Cuadro 1: Contenido de aminocidos de la Spirulina maxima Amino cidos * Datos FAO * Medio Sinttico Isoleucina 4.2 5.8 Leucina 4.8 9.3 Lisina 4.2 5.0 Fenilalanina 2.8 4.0 Metionina 2.2 2.2
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* Efluente 6.7 9.2 4.6 4.4 2.1

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Treonina Triptfano Valina

2.8 1.4 4.2

4.9 nr 6.9

5.3 nr 6.6

* g/100 g de protena (Kosaric et al 1974) nr: dato no registrado

Comparativamente con otros microorganismos como algas y levaduras el contenido de aminocidos es mucho ms alto (Kosaric et al 1974, ver Cuadro 2). Ensayos llevados a cabo en ratas y pollos demostraron el alto valor nutritivo que posee y su alta digestibilidad gracias a que posee aminocidos de cadena simple y una pared celular formada por mucopolisacridos no txicos (Shubert et al 1985).
Cuadro 2 : Contenido de aminocidos de otros microorganismos. Amino cidos * Scenedesmus sp * Sacharomyces cereviciae (microalga) (levadura) Cistena Isoleucina Leucina Lisina Metionina Fenilalanina Treonina Triptfano Valina * g/16 g N ( Kosaric et al 1974) 0.6 3.8 8.4 5.7 1.7 5.1 5.1 1.5 5.7 0.74 4.60 7.00 7.70 1.70 4.10 4.80 1.00 5.30

Esta cianobacteria crece en condiciones alcalinas con un pH que oscila entre 8.5 y 10.5 y a temperatura promedio de 25 a 35C. La Spirulina platensis puede tolerar temperaturas bajas nocturnas hasta de 18C. Los medios de cultivo pueden ser: qumicos, sustratos convencionales y no convencionales. El medio qumico debe ser rico en carbonatos, nitratos y sales, pero los elementos que lo componen son muy costosos y usados slo en grandes producciones de biomasa de protena, con tecnologas poco aplicables a nivel del pequeo productor (Ver Cuadro 3).
Cuadro 3 : Composicin del medio qumico (g/litro de solucin) Macroelementos Oligoelemento NaHCO3 *Solucin A: K2 HPO4 H3 BO3 NaNO3 MnCl2 K2 SO4 ZnSO4 NaCl CuSO4 MgSO4 MoO3 CaCl2 *Solucin B: FeSO4 NiSO4 EDTA (Agente quelante) TiSO4 Co(NO3 )2

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*Se agrega 1ml de solucin A y 1ml de solucin B, por litro del medio

La espirulina cultivada en este medio se utiliza especialmente para consumo humano, libre de parsitos y sometida a secado para usar en forma de polvo y venderlo en forma de cpsulas hasta por seiscientos pesos la unidad (Shubert et al 1985). Los desechos industriales o aguas residuales de las alcantarillas son ampliamente utilizadas para los sustratos de cultivo en la obtencin de biomasa microalgal y para purificacin de aguas. Se pueden usar: materiales con contenido de almidn, azcares (mieles de remolacha, caa de azcar) o sueros. Entre algunos medios no convencionales que evitan altos costos de produccin puede usarse eficientemente el efluente de biodigestores anaerbicos, evitando la contaminacin de las fuentes de agua con el lavado del estircol de los animales, ceniza de la quema de material vegetal con alto contenido de minerales o los lodos de la fermentacin alcohlica de las mieles, usados especialmente en Brasil (Ferraz y Aquarone 1985).

Usos de la espirulina
Suplementacin proteica en humanos El polvo que se obtiene de la Spirulina sp. es una fuente proteica de alto valor biolgico sin efectos txicos. Posee un 80% de la protena del huevo, es decir 124 g de Spirulina maxima reemplazan 100 g de la protena del huevo. No se realizan sustituciones totales de protena, sino parciales para suplir las deficiencias por falta de fuentes proteicas a causa de los altos costos en el mercado. En dietas humanas se ha considerado como una fuente importante de cido gamma linolico, como sustituyente en la alimentacin de hipertensos y pacientes con tensiones premenstruales, resultando mas econmico que otro tipo de aceites con un costo de trece centavos de dlar por kilogramo (Roughan 1989). En la Florida existen plantas productoras de Spirulina maxima que abastecen sistemas de cra de hasta 1000 cerdos en base a cultivos con efluente de biodigestores, con sistemas de biofloculacin y con producciones de hasta 34 g MS/m/da con 60% de protena. Igualmente se ha usado en la alimentacin de pollos, proporcionando la suficiente protena y favoreciendo la coloracin del huevo (Lincoln 1985). Acuacultura La cra de microcrustceos, moluscos y peces, como consumidores de plancton, requiere procesos de reproduccin y cra artificial a gran escala y por lo tanto es de gran inters tener plantas pilotos de produccin de la cianobacteria para la alimentacin de los primeros estados larvales. Se mantiene en el medio una alta productividad y estos tapetes biolgicos constituiran una ptima calidad para el agua, acumulando el oxgeno transfiriendo sustancias metablicas producidas por los organismos en cultivo. Favorece la cra de peces ornamentales especialmente ya que la espirulina tiene buen contenido de carotenos y permite mejorar el colorido y vistosidad de estas especies. La cra de microcrutceos tambin se ha implementado para el cultivo de peces, pero se ha comprobado que la eficiencia es mayor con las microalgas y cianobacterias. Los moluscos producidos en base a este tipo de alimentacin no convencional reduciran los costos de produccin y proporcionaran al mercado alimento de alta calidad con mayores ganancias para el productor.
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Tratamiento de aguas negras Se han tratado aguas de desecho en base a Spirulina maxima, utilizada como purificadora de aguas residuales que remueve los nitratos, fosfatos, y otros elementos presentes en gran cantidad. En piscinas de oxidacin o estanques se pueden obtener dos productos esenciales: protena vegetal contnua y aguas tratadas y recuperadas, evitando la contaminacin y eutroficacin activada por la ozonizacin del agua lo cual permite utilizar el agua para consumo humano. En Israel se aprovechan las aguas de las costas para produccin de microalgas como Spirulina sp. o Scenedesmus sp., tratando de implementar mtodos menos costosos y eficientes para el tratamiento de aguas de desecho industriales y domsticas. En Londres se utilizan las aguas de tratamiento terciario de desechos para producir biomasa y purificarlas (Kosaric et al 1978). Fuente energtica Existen numerosos estudios sobre el posible uso de la energa solar, con gran prioridad en numerosos pases que poseen tecnologa de alto riesgo y mucho costo. Las cianobacterias, como responsables de la fijacin del nitrgeno y produccin de hidrgeno con altas tazas de reproduccin a travs de la utilizacin de energa solar y agua, mantienen el sistema con tcnicas de produccin simples adicionando la obtencin de biomasa usada en medicina, cosmetologa y nutricin. Objetivos del programa de CIPAV El objetivo del actual programa de investigacin es desarrollar un sistema sencillo para la reproduccin de la espirulina, con base en sustratos localmente disponibles. En primer lugar se estudi el uso de los efluentes de los biodigestores y de las destileras de alcohol (la vinaza).

Materiales y mtodos
El ensayo se realiz en el Instituto Mayor Campesino en Buga (Valle, Colombia) con una altitud de 1000 msnm, una temperatura media de 20C y una precipitacin de 1300 mm. Los cultivos de la espirulina se realizaron en tanques rectangulares (20 cm x 25 cm x 30 cm) de vidrio y fueron agitados con aire de un microcompresor (2,500 cm3 de aire/minuto). Tratamientos Efluente del biodigestor: Se utilizaron tres tratamientos preliminares correspondientes al medio qumico, y efluente mezclado con agua a nivel de 0.5:0.5 y 0.75:0.25 volmenes de efluente:agua, agregando bicarbonato de sodio en cantidades de 17 g por litro del medio e inculo de spirulina (192 clulas/ml) de 200 ml por litro del medio de agua. Las observaciones indicaron que la reproduccin fue ms eficiente cuando se hizo el medio con partes iguales de efluente y agua. Con base en esta informacin, se realizaron comparaciones de cuatro diluciones del efluente correspondientes a volmenes efluente:agua de: 0.25:0.75, 0.5:0.5, 0.75:0.25 y 1.0:0.0 (ver Cuadro 4). A 1,000 ml de la mezcla se agregaron 200 ml de inculo de espirulina (192 clulas/ml) y 17 g de bicarbonato de sodio. Despus de 15 das se agregaron otros 1,000 ml del medio (efluente, agua y bicarbonato en las concentraciones usadas en el
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principio). El efluente se recolect de un biodigestor plstico de flujo continuo (Solarte 1989), alimentado con excreta de cerdos, con un tiempo de retencin de 60 das. El efluente contena (% base fresca): N 0.10, P 0.03, K 0.07, slidos totales 2.0.
Cuadro 4: Niveles de efluente usados como medio de cultivo* Volumen efluent: Volumen agua 0.25:0.75 Cantidad de agua (ml) Cantidad de efluente (ml) 750 250 0.5:0.5 500 500 0.75:0.25 250 750 1000 1.0:0.0

*A cada 1000 ml del medio se agregaron 17g de bicarbonato de sodio y 200 ml de inculo de espirulina (192 clulas/ml).

Efluente de destilera (vinaza): Se emplearon tres medios de cultivo suplementados con vinaza residual de la Industria Licorera en proporciones del 0.5:0.5, 0.6:0.4 y 0.7:0.3 volmenes vinaza:agua. La vinaza contena (% base hmeda): slidos totales 60, N x 0.66, K x 0.27. Se adicion 34 g de bicarbonato por litro de medio y 200 ml de inculo de espirulina. Diseo experimental Se utiliz el diseo de bloques al azar con dos y tres repeticiones (para efluentes de biodigestor y vinaza, respectivamente) y la evaluacin se hizo durante treinta das. Se determinaron a los 2, 15 y 30 das, los siguientes parmetros: conteo de clulas de cianobacterias y conteo de clulas de microorganismos por campo de cubreobjetos. A los 30 das se midi el pH, la temperatura y el porcentaje de materia seca del medio. Anlisis Se realizaron anlisis qumica del efluente, la vinaza y de la espirulina.

Resultados y discusin
Durante los primeros 15 das la tasa de reproduccin de la espirulina se relacion directamente con la concentracin del efluente en el medio, en el caso del efluente del biodigestor (Cuadro 6). Sin embargo, despus de agregar otra vez el medio, fue mucho ms marcado la respuesta en el tratamiento de mitad efluente:mitad agua, que con concentraciones mayores, siendo altamente significativas las diferencias (P<.001). La concentracin de clulas alcanzada en 30 das en el tratamiento 50:50 (9 x 103/ml) todava no representa el potencial del organismo, ya que concentraciones de hasta 1 x 106/ml han sido reportadas por Noue y Proulx (1986). La mayor contaminacin que present el cultivo con efluente del biodigestor fue debida a Chlorella sp. y protozoarios como Amoeba sp. y Paramecium sp. Los cambios de temperatura registrados entre el da y la noche fueron considerables (desde 23 a 29C), pero al parecer no afectaron significativamente el desarrollo del cultivo. El porcentaje de materia seca del producto (6.4 a 6.8%) fue ms alto que el que reportaron Nguyen (1982) y
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Lincoln (1985) (aproximadamente 5%), probablamente debido al contenido de slidos residuales del efluente en el material.
Quadro 5: Efecto de la concentracin de efluente de biodigestor en el medio de cultivo sobre la tasa de reproduccin de la espirulina Porporcin de efluente* 0.25 Lectura 2 das 15 das 30 das pH (ES) Slidos totales (%) (ES) * Reemplazando el agua 0.5 0.75 1 ES Prob Nmero de clulas de espirulina/ml : 800 1310 830 9.30 (0.07) 6.39 (1.51) 530 1380 9500 9.57 (0.08) 6.80 (2.65) 540 2220 3460 9.35 (0.07) 6.27 (2.99) 430 2700 4210 9.60 (0.18) 6.57 (2.60 110 280 510 NS 0.16 <0.001

Se realizaron anlisis de espirulina en base seca y se obtuvieron los siguientes resultados: N=7.2, P=0.24, K=0.85, Ca=1.02, La vinaza Los medios suplementados con diferentes niveles de vinaza presentaron dificultades en cuanto a pH y agitacin. El pH de la vinaza es 4.2 luego de pasar por un tratamiento final de cido sulfrico para la fermentacin alcohlica de las mieles y por lo tanto se aumentaron los niveles de bicarbonato de sodio para aumentar el pH a 7.4 y la agitacin fue muy lenta por la alta viscosidad del medio.
Cuadro 6: Efecto de la concentracin de efluente de destilera (vinaza) en el medio de cultivo sobre la tasa de reproduccin de la espirulina Proporcin de efluente* 0.5 Lectura 2 das 15 das 30 das pH (ES) *Reemplazando el agua 0.6 0.7 ESmed Prob Nmero de clulas de espirulina/ml 1170 2190 10460 9.04 (0.1) 370 1630 4510 8.81 (0.01) 460 2080 5740 8.93 (0.01) 160 370 900 .06 NS .04

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Al parecer, la dilucin de partes iguales de vinaza y agua es la mejor, ya que no hubo diferencias significativas en el nmero de clulas a los 15 das, siendo menores a los 30 das las concentracines de la espirulina con diluciones de 0.6 y 0.7 (P=0.04)(Cuadro 6). Como puede verse el contenido de nutrientes de la vinaza es mayor que en el efluente pero el contenido de potasio es muy alto, por lo tanto es muy importante la asimilacin de este elemento por parte de la cianobacteria para que no sea txico para consumo en animales y que a nivel industrial este desecho sea utilizable para otro fin. Se revisaron las muestras para evaluar el contenido de microorganismos en los medios pero no se encontr ninguno, por lo tanto esto favorece el crecimiento de las clulas de la cianobacteria por no existir ningn tipo de competencia frente a los medios suplementados con efluente de biodigestor donde la incidencia de microorganismos como Chlorella sp., Paramecium sp. y Amoeba sp. es mayor. El pH oscil entre 7.40 y 9.04, lo que muestra que la Spirulina maxima puede resistir un pH extremo como lo hace la Spirulina subsalsa Oersted de Costa Rica (Hargaravez y Viquez 1982). Las temperaturas tomadas para estos cultivos mostraron mximos de 29C y mnimos de 23C en las noches y el promedio calculado fue de 24.6C. No se presentaron diferencias significativas entre los tratamientos respecto a la temperatura (Ver Cuadro 6).

Conclusiones
Al parecer, el nivel de efluente de biodigestor ms recomendable para el cultivo de Spirulina maxima es una combinacin de partes iguales de efluente y de agua (sin cloro) con 17 g de bicarbonato de sodio por cada litro de medio, teniendo en cuenta que el efluente tendra una concentracin de slidos de aproximadamente 2%. El nivel de vinaza ms efectivo para la reproduccin de la cianobacteria fue del 50% de vinaza y 50% de agua. En este caso fue usado 34 g de bicarbonato de sodio por cada litro de medio, en vista de la acidez de la vinaza. La poblacin de clulas de espirulina posiblamente fu afectada bsicamente por la competencia de microorganismos cuando se us como sustrato el efluente, de ah la ventaja de la suplementacin con la vinaza. El pH y la temperatura para los ensayos, tanto de efluente como de vinaza, no variaron significativamente como para afectar el cultivo de espirulina.

Recomendaciones
Realizar ms ensayos para tratar de aumentar los niveles de suplementacin con efluente y vinaza. Buscar otras alternativas para uso de desechos como sustrato para la espirulina, adems de emplear elementos qumicos como el carbonato de calcio para suplir las necesidades de carbono. Hacer nfasis en la implementacin del cultivo de la cianobacteria a nivel de campo, dando ms importancia al anlisis de los sustratos para el cultivo y las tecnologas aplicadas para el pequeo productor.

Referencias
Ferraz C A M y Aquarone C 1985 Utilization of by-products from alcoholic fermentation industry to biomass production of
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Spirulina maxima . Part 2. Use of molasses alcohol distillate waste. Reviews in Microbiology 17(1). Hargaravez y Vquez 1982 Spirulina subsalsa Oersted en Costa Rica. Estructura y posible importancia comercial. Mimeograph. Kosaric N, Nguyen H T and Bergougnou M A 1974 Growth of Spirulina maxima algae effluents from secondary waste water treatment plants. Biotechnology and Bioengineering 14:881-896. Lincoln E 1985 El uso de microalgas en la produccin porcina. Universidad de Florida, Gainesville (Mimeograph) Noue J and Proulx 1986 Inters de biomasse d'alguas et d'invertebres obtenues par reciclage. Entropie 131:19-32 Roughan P G 1989 Spirulina: a source of dietary Gamma Linoleic Acid. Journal Science Food and Agriculture 47:85-93. Shelef G y Soeber C J 1980 Algal biomass. Biomedical press: Holland 600 pp. Shubert B D, Larsen B D y Johnson P D 1985 Nutritional values of Spirulina and Chorella for human consumption. En: Annual Meeting of the Phycological Society of America (Resea). Solarte A J 1987 Experiencias con los biodigestores plsticos de flujo continuo. Reporte de Investigacin. 1:89-93 (CIPAV;Cali)

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