MANUTENO DE MICRORGANISMOS: CONSERVAO E VIABILIDADE Marlia Cristina Sola1*; Aline Pedrosa de Oliveira1; Janaina Costa Feistel2; Cntia Silva

Minafra e Rezende3
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Doutoranda, Programa de Ps-graduao em Cincia Animal, Escola de Veterinria e Zootecnia, Universidade Federal de Gois - UFG, Goinia, Gois, Brasil 2 Mestranda, Programa de Ps-graduao em Cincia Animal, Escola de Veterinria e Zootecnia, Universidade Federal de Gois - UFG, Goinia, Gois, Brasil 3 Docente, Doutora, UFG, Escola de Veterinria e Zootecnia, Departamento de Medicina Veterinria, Universidade Federal de Gois - UFG, Goinia, Gois, Brasil *Endereo para correspondncia: mcslilla@yahoo.com.br
Recebido em: 04/05/2012 Aprovado em: 15/06/2012 Publicado em: 30/06/2012

RESUMO Diante da necessidade de desenvolvimento biotecnolgico e cientfico, a preservao e a manuteno de materiais biolgicos vm ganhando destaque no cenrio mundial. A garantia de sobrevivncia de culturas bem como a conservao de suas caractersticas morfolgicas, fisiolgicas e genticas so primordiais na adequao de mtodos de preservao de clulas humanas, animais e vegetais, bactrias, vrus, fungos e material gentico (DNA/RNA), porm no existe uma frmula ideal ou universal para essa conservao. Desta forma a escolha de um mtodo de manuteno deve ser baseada nas caractersticas do material biolgico em estudo, assim como nas vantagens e desvantagens de cada tcnica disponvel. Neste contexto, a preservao ex situ em colees de culturas vem garantindo a sobrevivncia, a estabilidade e pureza de linhagens durante longos perodos, empregando diversos mtodos de manuteno e principalmente disponibilizando as culturas para a comunidade cientfica e tecnolgica de diversos pases. PALAVRAS-CHAVE: Colees de culturas; Conservao ex situ; Mtodos de preservao. MAINTENANCE OF MICROORGANISMS: STORAGE AND VIABILITY ABSTRACT The necessity of scientific and biotechnological development, preservation and maintenance of biological materials have been gaining prominence on the world stage. Ensuring the survival of cultures and the preservation of their morphological, physiological and genetic characteristics are paramount in the adequacy of methods of preservation of human cells, animals and plants, bacteria, viruses, fungi and genetic material (DNA/RNA), but there is not a formula for that ideal or universal preservation. Thus, the choice of a maintenance method should be based on characteristics of the biological material under study, as well as the advantages and disadvantages of each available technique. In this context, the ex situ preservation of collections of cultures has ensured the survival, stability and purity of lines for long

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periods, employing different methods of maintenance and cultures primarily available for scientific and technological communities of several countries. KEYWORDS: Collections of cultures; Ex situ conservation; Methods of preservation. 1 INTRODUO A natureza impe em seu curso normal que materiais biolgicos sigam o ciclo de degenerao e morte, desta forma, algumas caractersticas podem se alterar e se perder, com o passar do tempo. A inteno de interromper ou pelo menos retardar o relgio biolgico de organismos tem sido alvo desde os tempos mais remotos, tendo alcanado hoje, um potencial significativo de estocagem de amostras biolgicas a curto, mdio e longo-prazo. Nesse sentido, o incremento de protocolos mais eficientes de conservao de microrganismos poder assegurar, de certa forma, a continuidade e expanso de pesquisas nesta rea. Tal ao permite o desenvolvimento de estudos capazes de superar barreiras cronolgicas e geogrficas e, por conseguinte, elucidar as particularidades dos diferentes organismos. A compreenso do papel de microrganismos no meio ambiente fornece subsdios para o desenvolvimento de aplicaes biotecnolgicas, alm de ser fundamental no estabelecimento de polticas de biossegurana, visto o carter patognico de muitos agentes. A importncia da manuteno e principalmente preservao de microrganismos caracteriza-se como reflexo da necessidade de utilizao de organismos ou espcimes a qualquer momento, quer para fins experimentais, didticos, industriais ou estudos comparativos. Desta forma, conhecer a melhor maneira de preservar culturas bacterianas e dispor de tcnicas simples e eficientes, reveste-se de grande valia aos laboratrios de microbiologia. Para tanto, a sobrevivncia do agente no se constitui o nico objetivo. Tornase necessrio considerar a viabilidade e principalmente a escolha de mtodos que no promovam em maior ou menor grau a ocorrncia de mutaes ou variabilidades. Isto posto, com reflexo na patogenicidade, virulncia ou em caractersticas bsicas da cultura original, atentando-se para a conservao de microrganismos. No que tange estocagem, conservao e manuteno de amostras independentes da origem o que inclui clulas humanas, animais e vegetais, bactrias, vrus, fungos e material gentico (DNA/RNA), h o propsito de diagnstico e pesquisa, ampliando a aplicao laboratorial. Por consequncia, no se aplica para a conservao de amostras biolgicas uma frmula singular, ideal ou universal que determine a eficincia de sua estocagem e preservao por longos perodos (COSTA et al., 2009). A escolha do mtodo de manuteno mais adequado deve ser baseada pelas caractersticas do agente em estudo, assim como pelas vantagens e desvantagens de cada tcnica disponvel. Para o estudo com clulas, tecidos e microrganismos, h o anseio pelo desenvolvimento de metodologias mais adequadas sua conservao, porm, observa-se uma lacuna entre as publicaes cientficas pertinentes, verificando-se um nmero reduzido de estudos abordando a problemtica da seleo e validao de protocolos principalmente na manuteno de bactrias, bem como na avaliao dos desafios e perspectivas da colheita, processamento, estocagem e manuteno de amostras microbiolgicas. Diante disso, prope-se com esta reviso, a exposio dos princpios que norteiam o processo de estocagem e manuteno de material microbiolgico, tomando como base estudos disponveis na literatura cientfica.
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2 REVISO DE LITERATURA Os processos de isolamento, identificao, conservao e a utilizao de microrganismos vem sendo considerados como rotina para o desenvolvimento de pesquisas e obteno de produtos de interesse econmico (ABREU & TUTUNJI, 2004). No mbito da cincia, a implantao e manuteno de colees de culturas permitem a formao de estoques de cepas que podem ser utilizadas experimentalmente em diferentes momentos (GIRO et al., 2004). De acordo com OPLUSTIL (2004), estudos com finalidade clnica, epidemiolgica ou cientfica necessitam a qualquer tempo de cepas de microrganismos para exames complementares e essa demanda faz com que exista a necessidade de se manter a viabilidade dos mesmos por perodos variveis. O alvo de qualquer mtodo de manuteno preservar a viabilidade e principalmente proporcionar estabilidade gentica do microrganismo ao isolamento, pelo maior tempo possvel, evitando assim a formao excessiva de mutaes que alterem suas caractersticas. Alm disso, procura-se adequar a escolha de uma tcnica de conservao baseando-se nas particularidades do agente, nas caractersticas do prprio mtodo a ser aplicado, nos custos de manuteno da tcnica, da importncia do acervo e principalmente na capacidade laboratorial e disponibilidade de equipamentos (ABREU & TUTUNJI, 2004; GIRO et al., 2004). Considerando as exigncias dos microrganismos e o manuseio em laboratrios, a manuteno de estirpes podem ocorrer em curtos perodos (dias ou meses), onde as culturas bacterianas podem ser mantidas a temperaturas relativamente baixas (4-10 C). Contudo, se a conser vao prolongada apresenta-se como opo mais vivel, deve-se optar pelo armazenamento em temperaturas ultra baixas como a criopreservao em freezers a -80 C, em nitrognio lquido a -196 C ou o processo de liofilizao que consiste no congelamento e desidratao das clulas bacterianas, em atmosfera de vcuo (COSTA & FERREIRA, 1991; CEFAR, 2006; COSTA et al., 2009). Diante da necessidade de preservao de microrganismos, muitas vezes, busca-se conservar um agente que foi selecionado e melhorado com intuito de manter sua nova identidade. Ainda assim, o objetivo da manuteno de um microrganismo no somente conservar seu estado inicial evitando mutaes indesejveis, mas tambm garantir ao mximo a vitalidade das clulas e a quantidade de clulas viveis (PAOLI, 2005; OKAFOR, 2007). Segundo COSTA & FERREIRA (1991), os mtodos de manuteno de microrganismos podem ser classificados de acordo com tempo mximo de preservao: Mtodos de curto prazo: repique contnuo; Mtodos de mdio prazo: preservao em leo mineral, preservao em gua esterilizada, congelamento a -20C; Mtodos de longo prazo: liofilizao, criopreservao. Todos estes mtodos permitem a elaborao de estudos retrospectivos e prospectivos, elucidando o estado biolgico, etiologia e aspectos epidemiolgicos. Entretanto, a escolha adequada de procedimentos de preservao, incluindo a aplicao de um ou a combinao de mais mtodos, permite uma anlise fenotpica e genotpica mais satisfatria, quando se pensa na conservao de microrganismos a longo prazo (GIRO et al., 2004).

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Diversos protocolos de estocagem tm sido desenvolvidos e aplicados, porm, a maioria no tem se mostrado plenamente eficaz, visto as peculiaridades de cada agente a ser conservado e at mesmo pelas caractersticas das tcnicas, por isso, vem se justificando a conjuno de dois ou mais protocolos a fim de se garantir a melhor recuperao dos microrganismos (GREEN, 2008; COSTA et al., 2009). As descries de BOZIARIS & ADAMS (2001) e VIEIRA et al. (2007), revelaram que as bactrias, em especfico, na tentativa de sobrevivncia mediante a utilizao de mtodos de conservao nos alimentos, so capazes de produzir mecanismos de respostas, como protenas especializadas para resistncia trmica (heat-proteins), mudanas estruturais da membrana com alterao na saturao de cidos graxos visando proteo contra baixas temperaturas e reparo de material gentico, demonstrando a capacidade de recuperao de clulas injuriadas, quando em ambiente favorvel, aps um curto perodo de tempo. Considerando o emprego de mtodos de conservao sobre alimentos, os microrganismos podem estar presentes em uma amostra sob trs estados: inviabilizados (apresentando injria letal e impossibilidade de multiplicao), com injria subletal (apesar de ter sofrido danos em suas estruturas celulares, encontrase hbil para multiplicao sob condies favorveis) e viveis (COSTA & FERREIRA, 1991; BAATI et al., 2000; VIEIRA et al., 2007). Desta forma, a capacidade de recuperao de microrganismos viveis norteia a eleio do mtodo de manuteno. 2.1 MTODO DE MANUTENO A CURTO PRAZO 2.1.1 Repicagem contnua ou peridica A tcnica de repique contnuo, tambm chamado de subcultivo ou repicagem peridica, um mtodo simples e tradicional de manuteno de culturas em laboratrio. Por ser uma das mais antigas tcnicas de conservao, tem sido bastante utilizada para se obter a viabilidade de microrganismos, principalmente de bactrias (COSTA & FERREIRA, 1991; ROMEIRO, 2006). O mtodo consiste na inoculao do microrganismo em meio adequado, incubao em ambiente favorvel multiplicao e estocagem em baixas temperaturas, aps sua multiplicao. Nesta situao, aconselhvel o armazenamento de culturas sob refrigerao (5 a 8 C ), em busca da reduo do metabolismo dos microrganismos e o aumento entre os intervalos de repiques das culturas, proporcionando a conservao de leveduras em mdia de um a trs meses e de bactrias em torno de cinco a doze meses (COSTA & FERREIRA, 1991; GREEN, 2008). Apesar de alguns autores preconizarem o armazenamento das culturas sob refrigerao, COSTA & FERREIRA (1991) relataram a possibilidade de incubao em temperatura ambiente, alertando a necessidade de monitorao, a fim de evitar a desidratao do meio de cultura e a consequente privao de elementos essenciais aos microrganismos. BARKER (2002) e ROMEIRO (2006) mencionaram que a repetio do processo para novos meios deve ser realizada em intervalos de tempo condizentes com as necessidades e particularidades de cada microrganismo, avaliando-se as condies timas e perodo mximo de sobrevivncia entre as diferentes cepas. Entretanto, aconselhvel que a transferncia de culturas seja realizada antes que o substrato do meio seja totalmente utilizado pelos microrganismos, ou ento se desidrate. PASSADOR et al. (2010) sugerem que os mtodos de repicagens
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peridicas para fungos devem ser realizados em intervalos de trs ou quatro meses, a fim de evitar o consumo total do substrato do meio de cultura e se evite o acmulo excessivo de metablitos fngicos, j que estes se comportam como agentes mutagnicos. MURRAY (2003) sugeriu que para minimizar o efeito da desidratao, os isolados devem ser conservados em tubos de ensaio com tampa rosquevel ou selados com parafina, em ambientes protegidos da luz e de variaes de temperatura, mantendo preferencialmente uma faixa entre 5 e 8 C. COSTA & FERREIRA (1991) descreveram que este mtodo clssico, apresenta como vantagens a facilidade e o baixo custo, por no provocar estresse ou injria celular e no necessitar de reativao dos microrganismos. Entretanto, apresenta maior risco de contaminao em decorrncia da constante manipulao das culturas devido aos repiques contnuos e peridicos; perdas de caractersticas genticas decorrentes de mutaes; necessidade de maior espao fsico para armazenamento das culturas; logstica inconveniente quanto postagem; variabilidade entre as cepas e consequentemente entre os intervalos de repiques para cada microrganismo armazenado (ROMEIRO, 2006). A idade das culturas e, principalmente, a frequncia de repicagens devem ser avaliadas para o emprego deste mtodo de manuteno, pois, as culturas mais velhas acabam por gerar culturas-filhas modificadas, levando-se em considerao a ocorrncia de alteraes tanto de carter morfolgico quanto fisiolgico. Ainda assim, apesar do risco de comprometimento da estabilidade gentica, a manuteno por repicagens peridicas traz consigo outro problema considervel, como a perda da patogenicidade ou virulncia de algumas bactrias, da a necessidade de verificao peridica das caractersticas de cada isolado (COSTA & FERREIRA, 1991; ROMEIRO, 2006). COSTA et al. (2009) descreveram que a composio do meio de cultura pode interferir na resistncia das clulas, no entanto, existem dois conceitos que se opem sobre qual a composio ideal de meio de cultivo na manuteno de microrganismos: meios com boa composio de nutrientes ou meios menos elaborados, do ponto de vista nutricional. Considerando a manuteno de bolores e leveduras, os meios devem conter baixa concentrao de acares fermentadores para evitar o crescimento micelial exagerado e prevenir alteraes. Neste caso, procura-se utilizar meios que propiciem o mnimo de crescimento micelial acompanhado do mximo desenvolvimento das frutificaes ou estruturas de propagao e resistncia. Quanto manuteno de fungos esporulantes, preconiza-se a utilizao de esporos e no de miclios durante a repicagem, visto que os esporos tendem a manter as caractersticas genticas originais durante o processo de estocagem (PIMENTEL & FIGUEIREDO, 1989; PEREIRA et al., 2008; PASSADOR et al., 2010). 2.2 MTODOS DE MANUTENO A MDIO PRAZO 2.2.1 Manuteno em leo mineral Este mtodo de conservao uma alternativa simples que consiste na aplicao de uma camada de leo mineral esterilizado sobre uma cultura, a fim de limitar a quantidade de oxignio disponvel, causando assim uma reduo no metabolismo e consequemente na taxa de multiplicao do agente (RHODES, 1957; COSTA & FERREIRA, 1991; ROMEIRO, 2006).

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CANHOS et al. (2004) e COSTA et al. (2009) afirmaram que esta tcnica proporciona uma maior longevidade s estirpes, quando comparada repicagem peridica, bem como reduo da velocidade de desidratao do meio de cultura, em consequncia da diminuio de oxignio. Diversas bactrias e fungos podem ser conservados por esta tcnica, sendo armazenados com sucesso por dois a trs anos, visto a reduo na atividade metablica e nas transferncias para outros meios de cultura. Entretanto, comparando com outros mtodos, apresenta desvantagens equivalentes tcnica de subcultivo, como a possibilidade de contaminaes, instabilidade gentica e dificuldades com a utilizao do leo (esterilizao e manuseio). A manuteno de microrganismos submersos em leo mineral promove a reduo do consumo de oxignio em torno de 10% em poucas horas. COSTA & FERREIRA (1991) e ROMEIRO (2006) afirmaram que camadas de leo superiores a 1 cm no devem ser utilizadas, mediante a reduo da viabilidade dos microrganismos em condies de total exausto de oxignio. Caso a conservao de culturas seja feita em tubo inclinado, o leo deve ser adicionado at que todo o meio esteja recoberto, pois o contato dos microrganismos com o ar promove desidratao total da cultura pela evaporao da gua. Considerando o sucesso na manuteno de microrganismos, verifica-se que os leos utilizados nesta tcnica devem ser de boa qualidade e pureza, apresentar alta viscosidade, densidade relativa entre 0,8 e 0,9 temperatura de 20 C e, alm disso, no devem conter produtos txicos, sendo a parafina e a vaselina, os mais recomendados para a manuteno de microrganismos em curto prazo (BARKER, 2002; ROMEIRO, 2006). Outra preocupao quanto qualidade dos leos utilizados neste mtodo se recorre ao processo de esterilizao. CEFAR (2006) sugere que para a esterilizao destes produtos, a autoclavao no a tcnica ideal, preconizando-se o aquecimento por meio de um forno a 170 C por uma a duas horas. Pesquisas afirmam que neste procedimento, deve-se evitar a formao de umidade a fim de se eliminar riscos de contaminao e se ter um controle de temperatura, pois sua elevao pode resultar na formao de produtos txicos aos microrganismos em estoque. GUERNA (1981) relatou a existncia de dois procedimentos possveis para a esterilizao do leo mineral: autoclavagem a 1 atm por 30 minutos seguida de secagem a 150C, ou aquecimento 170C por uma hora. Alternativamente LELLIOT & STEAD (1987) recomendaram autoclavagem a 121 C e 15lb de presso por 15 minutos, seguida de permanncia em estufa a 100 C por uma noite para remoo de gua. ROMEIRO (2006) observou que inicialmente, o cultivo dos microrganismos deve ser em meio inclinado, respeitando-se o tempo de incubao de 18 a 24 horas, sob temperatura de 25 a 28 C. Aps a observao de multiplicao bacteriana no meio de cultivo, deve-se realizar a adio do leo de forma assptica, limitando uma altura de um a dois cm acima do ponto mais alto do meio inclinado. Relata tambm que a temperatura de conservao do meio aps adio do leo pode variar entre 4C e 20C, sofrendo ajustes mediante as necessidades individuais de cada agente. No tocante, ROMEIRO (2006) afirma ainda que a recuperao dos microrganismos mantidos sob conservao em leo mineral baseia-se apenas na transferncia das culturas para outro meio slido ou lquido. Entretanto, PEREIRA et al. (2008) e PASSADOR et al. (2010) preconizam que na transferncia de culturas preservadas por este mtodo, seja utilizado o mesmo meio de cultivo utilizado

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durante a manuteno e sugerem que a retirada dos microrganismos deve ser precedida pela drenagem total da camada de leo. Neste contexto, observa-se que a alternativa de preservao de microrganismos em leo mineral possui as mesmas vantagens que o repique contnuo, diferindo somente na longevidade da cultura, que se apresenta por maiores intervalos. Pesquisadores relatam que as bactrias podem ser conservadas por perodos de um a sete anos dependendo da espcie, enquanto fungos sobrevivem por um a cinco anos, e leveduras at sete anos (COSTA & FERREIRA, 1991; ABREU & TUTUNJI, 2004; COSTA et al., 2009). 2.2.2 Manuteno em gua esterilizada A preservao em gua destilada esterilizada ou tambm conhecida pelo mtodo de Castellani consiste no armazenamento de microrganismos em gua esterilizada ou soluo salina, sendo indicada na preservao de microrganismos sensveis a baixas presses osmticas de solues hipotnicas (PIMENTEL & FIGUEIREDO, 1989; COSTA & FERREIRA, 1991; NEUFELD & OLIVEIRA, 2008). Esta tcnica deve ser utilizada preferencialmente com culturas jovens, com cerca de 10 a 15 dias, e busca reduo do metabolismo, com consequente latncia das clulas diante da restrio de fontes nutritivas (COSTA & FERREIRA, 1991; ABREU & TUTUNJI, 2004). O mtodo se baseia na transferncia de culturas para frascos contendo uma soluo de gua esterilizada, com posterior armazenamento sob temperatura ambiente. PIMENTEL & FIGUEIREDO (1989), COSTA & FERREIRA (1991) e ROMEIRO (2006) sugerem a utilizao de suspenses bem concentradas de clulas, a partir de um crescimento em meio slido ou a incluso de blocos de gar contendo os microrganismos. Apesar do baixo custo e reprodutibilidade, nota-se os riscos de contaminao das culturas e um possvel comprometimento na estabilidade gentica de alguns microrganismos. Quanto utilizao dos blocos de gar em gua, sua aplicao restrita a microrganismos que tenham grande aderncia ao gar como bolores e algumas leveduras (COSTA & FERREIRA, 1991; ROMEIRO, 2006). De uma forma geral, a utilizao de gua destilada esterilizada como meio de manuteno tem sido proposto com sucesso para bactrias fitopatgenas, esporos do gnero Bacillus e vrus da hepatite (APARECIDO et al., 2001; NEUFELD & OLIVEIRA, 2008; PASSADOR et al. 2010). Considerando bolores e leveduras, resultados satisfatrios tm sido obtidos no que se refere viabilidade, estabilidade, pureza e patogenicidade. APARECIDO et al. (2001) afirmaram que este mtodo alm de garantir a preservao das caractersticas originais da cultura por longos perodos, promove a ausncia de contaminao por caros, apresenta baixo custo por utilizar somente gua destilada e revela a necessidade de pequeno espao fsico para acondicionar os frascos, alm de ser empregado para um grande nmero de gneros e espcies de fungos. NEUFELD & OLIVEIRA (2008) tambm observaram eficincia na aplicao desta tcnica, ao avaliarem a manuteno de 15 cepas de dermatfitos por um longo perodo. Aps 11 anos de conservao destes espcimes, observaram que 93,3% (14 cepas) foram avaliadas como viveis e sem alteraes morfolgicas, demonstrando assim, a efetividade deste mtodo de conservao sob gua destilada esterilizada na manuteno de cepas de dermatfitos por longos perodos de tempo.

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2.2.3 Congelamento comum O congelamento comum se baseia na conservao de agentes em temperaturas relativamente baixas entre -4 e -20 C. Apresenta-se como um dos mtodos de manuteno mais simples e baratos, alm de oferecer boa segurana para o armazenamento de diversos microrganismos por perodos de trs meses a dois anos, devido a uma reduo significativa no metabolismo celular (COSTA & FERREIRA, 1991; CEFAR, 2006; TORTORA et al., 2012). Trata-se de um mtodo simples, menos oneroso, no requer equipamentos sofisticados, nem mesmo no preparo do material. Como desvantagem, verifica-se possvel reduo da viabilidade de alguns microrganismos, em funo dos danos causados s clulas em decorrncia da formao de cristais de gelo e da variao eletroltica na faixa de temperatura utilizada (ROMEIRO, 2006; VIEIRA et al., 2007; MEDEIROS, 2008). SILVA et al. (2008) buscando avaliar a viabilidade dos microrganismos presentes em uma coleo de cultura, semearam um total de 328 leveduras dos gneros Candida, Cryptococcuss, Trichosporon, Rodothorulla em caldo crebrocorao contendo glicerol, mantendo-as sob refrigerao por sete dias e posterior congelamento a -20 C, sob trs diferentes perodos de tempo. Aps trs anos de congelamento, observaram recuperao de 99,0% das leveduras (72 viveis/73 microrganismos congelados). No segundo perodo (trs anos e seis meses) observaram a viabilidade de 100% das cepas congeladas (96 leveduras congeladas e viveis aps o descongelamento). No ltimo grupo, aps o congelamento de 159 leveduras por quatro anos, notaram uma reduo da viabilidade das culturas com 90,6% de recuperao (144 leveduras). Diante dos resultados, observaram que o emprego de baixas temperaturas foi vantajoso por seu baixo custo, fcil execuo, alm de ter favorecido a conservao de quase totalidade das leveduras por 48 meses. 2.3 MTODOS DE MANUTENO A LONGO PRAZO 2.3.1 Liofilizao A tcnica de liofilizao caracteriza-se na conservao de microrganismos por meio da dessecao rpida de culturas que se encontravam em estado de congelamento. A remoo do vapor de gua presente em amostras biolgicas viveis em estado de congelamento apresenta-se como alternativa capaz de retardar o relgio biolgico estabelecido pela natureza. Desta forma, a liofilizao e a criopreservao so as tcnicas mais empregadas na conservao da biodiversidade microbiana, sendo uma das chaves para a realizao dos servios de coleo de culturas microbiolgicas (DAY & MCLELLAN, 1995; MYAMOTOSHINOHARA et al., 2000; PAOLI, 2005; COSTA et al., 2009). A liofilizao considerada uma das tcnicas mais eficientes para a manuteno de microrganismos, justamente por garantir a viabilidade dos agentes por 17 a 20 anos e ser aplicvel para a maioria deles, com exceo de algas e protozorios (COSTA & FERREIRA, 1991; CANHOS et al., 2004; PASSADOR et al., 2010). Uma grande variedade de colees de culturas depende deste processo para garantir e preservar a diversidade de seus espcimes, por isso, tem sido utilizada como mtodo de referncia para a preservao a longo prazo (ABREU & TUNTUNJI, 2004; COSTA et al., 2009).
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A tcnica se baseia na remoo da gua intracelular de materiais biolgicos congelados, por sublimao, evitando a formao de cristais de gelo, capazes de provocar danos s estruturas celulares, alm da degradao de enzimas presentes no citosol, levando a morte dos agentes (COSTA & FERREIRA, 1991; MORGAN et al., 2006). Basicamente, a liofilizao pode ser definida como um processo de desidratao sob condies de vcuo, constitudo por trs etapas: congelamento, desidratao primria e desidratao secundria. O congelamento promove a inrcia do material a ser liofilizado, gerando uma interrupo das reaes qumicas e atividades biolgicas, sendo por isso uma das fases mais crticas. Posteriormente, a amostra biolgica sofre desidratao por meio de sublimao, seguindo-se com o emprego de temperaturas de secagem, sob presses reduzidas (PAOLI, 2005; COSTA et al., 2009). Apesar da liofilizao ser amplamente empregada na manuteno de diferentes microrganismos e ser considerada uma tcnica de conservao a longo prazo, as etapas que compem o processo so capazes de causar injrias ou danos celulares como alteraes na permeabilidade da membrana celular, o que leva ao aumento da sensibilidade a alguns agentes seletivos, aumento da fase lag de multiplicao celular e a necessidade de incremento nutricional (CUNHA et al., 1998; CANHOS et al., 2004; MORGAN et al., 2006). Na tentativa de contornar os danos celulares, substncias protetoras podem ser adicionadas durante o desenvolvimento de microrganismos, antes do congelamento ou da secagem. Vale destacar que a escolha destas substncias varia com o microrganismo alvo da liofilizao, porm compostos como o soro bovino, leite desnatado, glicerol, betana, adonitol, sacarose, glicose, lactose, trealose e alguns polmeros como dextran e polietilenoglicol podem oferecer proteo para muitas espcies (HUBLEK, 2003; PAOLI, 2005; COSTA et al., 2009). Os procedimentos de estocagem e acondicionamento influenciam significativamente na vida de prateleira dos materiais liofilizados. Desta forma, os produtos liofilizados, armazenados em ampolas ou frascos de vidro, devem ser acondicionados em ambientes com baixa umidade, baixas temperaturas, abrigo de oxignio, luz e contaminantes (DAY & MCLELLAN., 1995; MORGAN et al., 2006). Considerando a manuteno de bactrias, verifica-se que a viabilidade relativa aps a liofilizao decresce entre as bactrias formadoras de esporos, Gram positivas e Gram negativas, algas e alguns protozorios, fato facilmente explicado pelas diferenas na morfologia. MIYAMTO-SHINOHARA (2008) ao avaliarem a taxa de sobrevivncia das bactrias Gram positivas imediatamente aps a execuo da liofilizao, verificaram maiores ndices, quando comparado s Gram negativas, sob as mesmas condies, sugerindo desta forma maior resistncia desidratao pelas Gram positivas, provavelmente pela sua estrutura celular diferenciada. Quanto avaliao durante o perodo de estocagem, observaram tambm que a taxa de sobrevivncia de algumas espcies se mantm fixa com o passar do tempo, enquanto a de outras espcies apresentam um declnio durante os primeiros cinco anos, tendendo a estabilizar por volta dos 15 anos. Com relao aos vrus, UHLENHAUT et al. (2005) detectaram uma considervel infectividade em modelos experimentais de liofilizados tanto entre vrus envelopados quanto no envelopados. Quanto aos fungos, grande parte das colees de culturas utilizam a liofilizao como mtodo de conservao de microrganismos, justamente por atingirem uma manuteno de viabilidade de
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algumas espcies por perodos de 17 a 21 anos. Contudo, fungos no esporulados ou que possuem esporos excessivamente delicados no suportam o processo de liofilizao, sendo necessrio o emprego de tcnicas menos impactantes (COSTA et al., 2009). MIYAMOTO-SHINOHARA et al. (2000) avaliaram por 10 anos as taxas de sobrevivncia de 10 espcies de microrganismos aps liofilizao e preservao sob vcuo a 5 C. Observaram que imediatamente aps a li ofilizao, os ndices de sobrevivncia variaram entre as leveduras, bactrias Gram positivas e Gram negativas. A taxa de sobrevivncia da levedura Saccharomyces cerevisiae, foi cerca de 10% imediatamente aps a liofilizao, alm disso, os ndices de sobrevivncia no diminuiram muito durante o perodo de armazenamento de 10 anos. As bactrias Gram positivas apresentaram maiores ndices de sobrevivncia que as Gram negativas, onde as espcies Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium gultamicum e Streptococcus mutans, revelaram em torno de 80% de sobrevivncia, aps o processo de desidratao. As espcies Brevibacterium e Corynebacterium no reduziram a taxa de sobrevivncia durante o perodo de armazenamento, enquanto S. mutans diminuiu para cerca de 20% aps 10 anos. Quanto s bactrias Gram negativas, a sobrevida de Escherichia coli, Pseudomonas putida, Serratia marcescens e Alcaligenes faecalis, foi cerca de 50%, onde a reduo ocorreu nos primeiros cinco anos e posteriormente se estabilizou em cerca de 10% (MIYAMOTO-SHINOHARA et al., 2000). Posteriormente, MIYAMOTO-SHINOHARA et al. (2006) avaliaram a sobrevivncia de uma variedade de espcies de microrganismos liofilizados, submetidos estocagem por perodos superiores a 20 anos. Os diferentes agentes foram submetidos liofilizao, selagem a vcuo em ampolas e estocagem em ambiente escuro a 5 C. Dentre as espcies avaliadas, pelos autores supra mencionados, a levedura Saccharomyces cerevisiae, aps recuperao da desidratao, apresentou apenas 8% de sobrevivncia. Quando avaliada posteriormente, apresentou os melhores ndices dentre todos os microrganismos testados, alcanando uma taxa de sobrevivncia de 97,7% por ano. Quanto s bactrias Gram negativas, na avaliao feita aps a liofilizao, as espcies Escherichia coli, Pseudomonas putida e Enterobacter cloacae, apresentaram sobrevida de 42,6%, 33,5% e 50,8%, respectivamente, revelando ndices maiores que o observado para a S. cerevisiae, contudo a perda subsequente a estocagem foi superior a encontrada na S. cerevisiae, com taxas de sobrevivncia anual correspondendo a 91%, 87,5% e 84,5%. Os mesmos autores observaram que entre as bactrias Gram positivas avaliadas, as espcies Lactobacillus acidophilus e Enteroccoccus faecium, apresentaram sobrevida ps-liofilizao de respectivamente 62,5% e 85,2%. A avaliao subsequente constatou para ambas as espcies, um ndice anual de 96% de sobrevivncia durante a estocagem, valores estes superiores aos encontrados entre bactrias Gram negativas. Ainda, como concluso do estudo, destacaram que a sobrevida das espcies pode ser atribuda ao alto nvel de dessecao e da vedao das ampolas, sob condies de vcuo. Considerando a ampla utilizao da tcnica na manuteno de microrganismos, verifica-se que o mtodo oferece alta estabilidade do material a ser conservado, baixa taxa de mutao e contaminao; no requer monitoramento nem
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manuteno frequente, alm de ocupar pouco espao no armazenamento. Quanto ao transporte de culturas de referncia ou at mesmo materiais de rotina, o liofilizado pode ser transportado a longas distncias em temperatura ambiente, no havendo necessidade de refrigerao. Como desvantagem verifica-se a necessidade de equipamentos onerosos para a desidratao do material, alm dos custos com o preparo das culturas (MORGAN et al., 2006, ZAMORA et al., 2006; MIYAMOTO-SHINOHARA et al., 2008). 2.3.2 Criopreservao A criopreservao consiste na manuteno de uma variedade de tipos celulares sob baixas temperaturas, tendo como principal objetivo a reduo de injrias aos materiais biolgicos, incluindo clulas animais e vegetais, bactrias, fungos, vrus e tecidos, durante o processo de congelamento e estocagem a frio (WOLFE & BRYANT, 2001; COSTA et al., 2009). Este mtodo compreende a manuteno de materiais a baixas temperaturas (-20 C a -80 C em freezers) e ultra baixas temperat uras (-150 C a -196 C em containeres de nitrognio lquido). No que tange a conservao dos microrganismos, a estocagem a baixas temperaturas, apesar de eficiente, pode comprometer a qualidade das amostras armazenadas, visto a possibilidade de variaes de temperatura em freezers. J os sistemas de nitrognio lquido garantem o armazenamento a temperaturas constantes e por longos perodos (SU et al., 1996; WOLFE & BRYANT, 2001; PAOLI, 2005). Embora a eficincia da conservao em temperaturas ultra baixas seja garantida, VYSEKANTSEV et al., (2005) sugeriram que, alteraes cclicas da temperatura de -196 C at -130 C ou -100 C resultam na morte dos microrganismos armazenados, ressaltando desta forma, o cuidado ante a movimentao e transporte de exemplares criopreservados. DUMONT et al., (2004) e COSTA et al., (2009) relataram que apesar da existncia de diversas tcnicas de manuteno de microrganismos, o princpio do congelamento-descongelamento se manteve entre os mais importantes e viveis para a preservao celular. Considerando as altas taxa de sobrevivncia de microrganismos que a criopreservao proporciona, pesquisadores buscam aprimorar a tcnica quanto a sua utilizao, principalmente pelo aspecto prtico, visto a recuperao e obteno de clulas viveis, mas tambm na reduo de possveis mutaes genticas. Entretanto, faz-se necessrio frisar que os protocolos de criopreservao necessitam de adequao metodolgica acessvel e aplicvel para a diversidade de microrganismos existentes (PAOLI, 2005; COSTA et al., 2009). Diante da importncia do mtodo e sua aplicao na conservao de materiais biolgicos, necessrio destacar que a criopreservao de microrganismos dependente de uma srie de fatores como a espcie a qual se pretende preservar, suas particularidades como tamanho e estrutura celular, a fase e taxa de desenvolvimento, exigncias como temperatura de incubao, composio dos meios de cultivo, pH, osmolaridade, tolerncia ao oxignio, teor de gua das clulas, teor lipdico, composio do meio para congelamento, temperatura e tempo de estocagem, e condies para recuperao das culturas (DAY & MCLELLAN, 1995; COSTA et al., 2009). Outro parmetro interferente e de grande relevncia na criopreservao a taxa de resfriamento. Quando os materiais biolgicos a serem conservados so submetidos ao resfriamento lento, ocorre uma reduo gradativa da temperatura,
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porm se estabelece uma curva de resfriamento extremamente rpida capaz de prevenir as injrias celulares, e ao mesmo tempo lenta, o suficiente para permitir um nvel de desidratao capaz de evitar a formao de gelo intracelular. A vitrificao compreende a utilizao de taxas de resfriamento extremamente altas, porm a adio de crioprotetores em altas concentraes promove a reduo de gua antes do resfriamento, impedindo assim a formao de cristais de gelo e os consequentes danos estruturais (COSTA et al., 2009; SPUTTEKA & ROWEB, 2011). Durante o processo de congelamento, o desafio das clulas no se caracteriza na resistncia sob temperatura de armazenamento de -196 C, mas sim na capacidade de suportar as possveis alteraes decorrentes pela passagem pelas faixas intermedirias de temperatura (+ 19 C a + 8 C e -15 C a - 60 C), tanto durante o congelamento quanto no descongelamento (MAZUR, 1984; COSTA & FERREIRA, 1991; OLIVEIRA, 2007). A metodologia padro para a criopreservao tem incio na refrigerao do material biolgico, mantendo-o a temperatura de 20C. Nesta etapa, no se evidencia danos s estruturas celulares, desde que a amostras estejam diludas em meios adequados (OLIVEIRA, 2007; COSTA et al., 2009). Com a reduo da temperatura, pode ser determinada uma faixa crtica, entre +19 e +8 C, na qual os microrganismos podero sofrer algum tipo de injria celular. Quando este resfriamento realizado de uma forma inadequada, o fenmeno determinado como choque trmico provoca danos irreversveis como alteraes na membrana plasmtica com consequente aumento da permeabilidade e perda de ons e molculas intracelulares, alm da reduo do metabolismo (WATSON, 2000). Quando o processo de reduo de temperatura atinge a faixa de -6 C a 15 C, verifica-se a cristalizao da gua presente no meio, o aumento da concentrao de soluto na frao descongelada e a ausncia de formao de cristais de gelo intracelular pelo controle da membrana plasmtica. Quando o material atinge a temperatura crtica de -60 C veri fica-se a inrcia celular, sendo possvel realizar a imerso do material em nitrognio lquido, para seu armazenamento e conservao (WATSON, 2000; OLIVEIRA, 2007). Diante da forte influncia que a taxa de resfriamento exerce sobre a viabilidade celular, DUMONT et al., (2004) verificaram em seu estudo a viabilidade de cinco tipos celulares (Saccharomyces cerevisiae, Candida utilis, Escherichia coli, Lactobacillus plantarum e uma clula humana da linhagem leucocitria K562) frente a diferentes taxas de resfriamento, durante a criopreservao. Classificaram a viabilidade celular em trs escalas: alta viabilidade para baixas taxas de resfriamento (5 a 180 C/min), permitindo o efluxo do contedo de gua celular, prevenindo a cristalizao intracelular; baixa viabilidade para taxas intermedirias de resfriamento (180 a 5.000 C/min), levando a prevalncia do fluxo de calor sobre o efluxo de gua e a consequente cristalizao (onde o fluxo de gua est em direo ao meio externo); e alta viabilidade para taxas de resfriamento muito altas, onde h induo de um rpido fluxo de calor com consequente vitrificao intracelular, antes mesmo do efluxo de gua. Os referidos autores verificaram que para todos os tipos celulares investigados, a viabilidade mostrou-se maior nas taxas de resfriamento baixas e muito altas, fato este que pode ser explicado pela competio entre o fluxo de calor e o efluxo de gua na clula, durante o processo de congelamentodescongelamento. Nos casos de taxas mais baixas de resfriamento, o calor latente de congelamento da gua celular permitiu a sada de gua e preveniu desta forma, a formao de cristais de gelo no espao intracelular. As taxas intermedirias de
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resfriamento conferiram um retardo na vitrificao intracelular, e se caracterizaram fator negativo para a viabilidade do espcime, levando a morte celular decorrente aos danos pela cristalizao durante o efluxo de gua pela membrana plasmtica. J nas altas taxas de resfriamento, as clulas foram capazes de se congelar, sem qualquer alterao no volume celular e apresentaram viabilidade considervel aps descongelamento. Apesar do comportamento geral dos espcimes envolvidos, os resultados podem ser alterados por influncia do tamanho da clula, presena de parede celular e permeabilidade gua (DUMONT et al., 2004). 2.3.2.1 Danos decorrentes do processo de criopreservao A criopreservao requer alguns cuidados para que seja realmente eficiente. Diversos fatores podem afetar a viabilidade e estabilidade celular, no entanto os danos celulares so decorrentes principalmente do comportamento da gua sob condies de baixas temperaturas. A crioinjria ou leso celular causada durante os processos de congelamento e descongelamento um processo letal relacionado formao de extensos cristais de gelo intracelular e estes so capazes de alterar as estruturas da membrana plasmtica, modificando o fluxo de gua para o meio extracelular (desidratao) e ao aumento da concentrao intracelular de solutos (WATSON, 2000; OLIVEIRA, 2007; CASTRO et al., 2011). Durante o congelamento, as clulas esto suscetveis desidratao e instabilidade osmtica devido alterao das concentraes de sais das clulas. Em condies normais, a soluo extracelular apresenta-se em maior proporo que a intracelular, e por isso, o congelamento extracelular tende a ocorrer primeiro. Os solutos contidos no meio externo se concentram numa pequena frao de gua sob estado lquido, passando a apresentar uma maior presso osmtica, e promover o fluxo de gua para fora da clula. Altas concentraes intracelulares inibem a formao de gelo, entretanto a desidratao decorrente e a elevada concentrao de ons podem ocasionar danos s clulas (WOLFE & BRYANT, 2001; HUBLEK, 2003). Diante da complexidade do processo de congelamento, verifica-se que os mecanismos de efluxo de gua juntamente com a formao de longos e protuberantes cristais de gelo so os responsveis pelos danos irreversveis que atingem a membrana plasmtica e que muitas vezes podem ocasionar a morte celular. A extenso dos danos causados pelo gelo intracelular depende do grau de formao de gelo e do tamanho dos cristais. Desta forma, algumas alternativas so muito utilizadas para minimizar estas ocorrncias, como a utilizao de agentes crioprotetores com vistas a prevenir a cristalizao mediante a reduo da atividade de gua, adoo de uma taxa de congelamento uniforme (aproximadamente 1C por minuto) e a prtica de um processo de descongelamento rpido (banho-maria a 37C) (ABREU & TUTUNJI, 2004; COSTA et al., 2009). 2.3.3.2 Agentes conservantes para criopreservao Considerando a importncia da conservao de microrganismos por longos perodos, POLGE et al. (1949) na tentativa de preveno ou at mesmo na reduo dos efeitos adversos dos mtodos de preservao de amostras biolgicas, por uma descoberta acidental, verificaram a proteo efetiva do glicerol sobre materiais biolgicos. Posteriormente, a ao protetora de outras substncias foram descobertas e intensamente utilizadas na rotina laboratorial, como o dimetilsulfxido (DMSO), o metanol e o etilenoglicol (BAATI et al., 2000; HUBALEK et al., 2003).

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Diante da necessidade de utilizao dos agentes crioprotetores, muitos estudos tem sido desenvolvidos na busca de otimizar a escolha de diferentes crioprotetores, diferentes concentraes, relao do tempo e da temperatura para sua adio durante o processo de congelamento e at mesmo quanto a possvel toxicidade que estes agentes podem oferecer ao material biolgico a ser conservado (DAY & MCLELLAN, 1995; COSTA et al., 2009; CASTRO et al., 2011). Atualmente, crioprotetores como a sacarose, trealose, glicerol e dimetilsulfxido (DMSO), vem sendo utilizados na criopreservao de microrganismos, nas concentraes de 10% a 15%, garantindo a viabilidade de agentes como Escherichia coli, Klebsiella sp., Serratia marcescens, Lactobacillus sp., Pasteurella multocida, Pseudomonas aeruginosa, entre outras bactrias (LUDLAM et al., 1989; BAATI et al., 2000). Estudos demonstram que a utilizao de glicerol ou DMSO em concentraes acima de 20%, apresentam efeitos deletrios aos microrganismos devido a sua toxicidade, sendo ento um obstculo na sobrevivncia das estirpes durante o congelamento (FAHY, 1986; ANDREATTI FILHO et al., 2007; FAHY, 2010; CASTRO et al., 2011). Os crioprotetores caracterizam-se por molculas de baixo peso molecular, alta solubilidade em meio aquoso e baixa toxicidade celular, sendo classificados com relao capacidade de penetrao em materiais biolgicos, como crioprotetores penetrantes (intracelulares) ou crioprotetores no penetrantes (extracelulares) (COSTA & FERREIRA, 1991; HUBLEK, 2003; OLIVEIRA, 2007). Os crioprotetores no penetrantes ou extracelulares so molculas capazes de induzir o aumento na osmolaridade do meio externo, promovendo a sada de gua do meio intracelular para o meio extracelular, prevenindo desta forma, a formao de cristais de gelo intracelular durante o congelamento (HUBLEK, 2003; FULLER, 2004). So substncias apropriadas para a preservao de microrganismos, visto a capacidade de recobrir a superfcie celular, formando uma camada viscosa capaz de estabilizar a parede celular e membrana plasmtica, minimizando e reparando os possveis danos causados pela manuteno em baixas temperaturas. Destacam-se nesse grupo: mono, oligo e polissacarideos, manitol, sorbitol, dextran, metilcelulose, albumina, gelatina, polivinilpirolidona, polietilenoglicol, xido de polietileno, entre outros (HUBLEK, 2003; OLIVEIRA, 2007). Os crioprotetores penetrantes ou intracelulares atuam nas clulas por meio de suas propriedades coligativas, levando a reduo do ponto crioscpico. Deste modo, uma maior quantidade de gua permanece no estado lquido sob baixas temperaturas, levando a reduo na concentrao intracelular de solutos e proporcionando um ambiente menos prejudicial aos microrganismos durante o congelamento (WATSON, 2000). Estes compostos so capazes de realizar ligaes com as molculas de gua, levando a uma significativa reduo na formao e no tamanho dos cristais de gelo, bem como as concentraes de soluto tanto no meio extracelular quanto no intracelular, destacando-se o etanol, o glicerol, o metanol, o etilenoglicol, o polietilenoglicol, o propilenoglicol, a acetamida, a dimetilformamida, a metilacetamida e o dimetilsulfxido (HUBLEK, 2003; OLIVEIRA, 2007; COSTA et al., 2009). Diante do emprego dos diversos agentes crioprotetores, verifica-se a ampla utilizao do glicerol, dimetilsulfxido (DMSO), soro sanguneo e a soroalbumina, leite desnatado, sacarose, extrato de levedura, glicose, metanol, sorbitol, extrato de malte, dextran e o etilenoglicol (COSTA et al., 2009; CASTRO et al., 2011). Entretanto, a escolha do agente crioprotetor deve ser baseada tambm nos efeitos
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txicos particulares de cada substncia ou mesmo pela induo de estresse osmtico, o que aumenta a possibilidade de alterao do perfil morfolgico e/ou gentico dos espcimes, alm do risco de morte celular (HUBLEK, 2003; FULLER, 2004; OLIVEIRA, 2007). Alm da classificao em crioprotetores penetrantes (intracelulares) ou no penetrantes (extracelulares), estas substncias podem ser diferenciadas pela sua viscosidade. Crioprotetores de alta viscosidade, como o propilenoglicol e os sacardeos, atuam principalmente em processos onde so aplicadas rpidas taxas de resfriamento como na conservao de espermatozides, eritrcitos e bactrias. J os crioprotetores de baixa viscosidade, como o dimetilsulfxido (DMSO) e o metanol, proporcionam uma proteo inferior, justamente por no provocarem mudanas estruturais no material biolgico durante os processos de congelamento com taxas rpidas de resfriamento (MORRIS et al., 2006; COSTA et al., 2009). Considerando as particularidades dos microrganismos, do mtodo de manuteno e dos crioprotetores, ANDREATTI FILHO et al. (2007) propuseram avaliar a capacidade de proteo da microbiota cecal cultivada em aerobiose, congelada em nitrognio lquido e associada crioprotetores como o glicerol, DMSO, sacarose e trealose sob pintos de corte desafiados experimentalmente com Salmonella enterica sorovar Enteritidis. Os pintos de corte de um dia foram tratados com microbiota cecal cultivada em aerobiose, sob tempos de congelamento diferenciados (90, 200, 290 e 360 dias) e em conjunto com os crioprotetores usuais. Posteriormente, os animais foram desafiados com as cepas de Salmonella sp e os autores puderam determinar a eficcia ou no dos tratamentos empregados, verificando a quantidade de microrganismos viveis presente na microbiota. No tempo zero (antes do congelamento), os tratamentos com crioprotetores e o grupo controle no diferiram entre si, pois todas as aves apresentaram Salmonella sp (100%). A proporo de microrganismos viveis foi maior aos 90 dias quando os microrganismos foram congelados com sacarose (10,58 Log10 UFC/ml) e menor quando tratados com glicerol (7,73 Log10 UFC/ml). ANDREATTI FILHO et al., (2007) contabilizando 200 dias de congelamento, constataram que as maiores contagens de UFC foram provenientes dos tratamentos com sacarose e no grupo controle, seguidos pelo DMSO. Aos 290 dias de congelamento, a menor quantidade de microrganismos viveis foi no tratamento com glicerol enquanto os maiores ndices foram com sacarose e no grupo controle. J nos 360 dias de congelamento, a menor contagem foi ao tratamento com sacarose e a maior utilizando o glicerol. Apesar dos resultados, foi possvel concluir no estudo que o efeito benfico esperado dos crioprotetores no foi to significativo, pois a microbiota cecal conservada com ou sem crioprotetores, manteve-se adequada, garantindo efetividade mesmo at 360 dias de congelamento. Alm da viabilidade do agente, verificou-se uma reduo no nmero de aves infectadas e consequentemente a colonizao cecal por S. enterica ser. Enteritidis. Neste contexto, cabe ressaltar que os crioprotetores em altas concentraes so txicos para as clulas, resultando em baixas taxas de sobrevivncia, e parte dessa toxicidade decorrente de alteraes na composio bioqumica das membranas e pelo estresse osmtico (HUBLEK, 2003; CASTRO, 2011).

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2. 4 COLEES DE MICRORGANISMOS (EX SITU) Diante da diversidade biolgica que o planeta possui e a busca pelo desenvolvimento tecnolgico e cientfico em que muitos pases se encontram, os Ncleos ou Servios de Colees de Culturas tornaram-se responsveis por um amplo trabalho em microbiologia, sendo responsveis na colheita, manuteno e distribuio de microrganismos vivos e sem variaes genticas (cepas de referncia), atendendo assim as requisies para diversos fins, incluindo atividades de ensino e pesquisa, controle de qualidade e biotecnologia (HOLLAND et al., 2003; ABREU & TUTUNJI, 2004 ). Atualmente existem vrios centros de colees de culturas, podendo citar os ncleos com relevncia mundial como a ATCC (American Type Culture Collection), de Manyland, nos EUA; a DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) na Alemanha; o IMI (International Mycological Institute), com sede na Inglaterra; o CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures), em Baar-Delft, Holanda; o IFO (Institute For Fermentation), em Osaka, Japo; o JCM (Japan Collection of Microorganisms), em Wako, Japo e a MUCL (Mycotheque De L.Universite Catholique de Luvaim), localizada em Luvain-le-Neuve, Blgica (CAVALCANTI, 2010). A World Federation for Culture Collections (WFCC) e a European Culture Collection Organization (ECCO), atuam como fruns de discusso, agrupando uma massa crtica de colees e usurios a fim de facilitar o progresso da conservao gentica ex situ. O WFCC rene em torno de 700 scios, pertencentes a 62 pases e conta com aproximadamente 470 colees registradas no World Data Center for Microorganisms (WDCM). Das colees cadastradas no WDCM estima-se a manuteno de mais de um milho de cepas, onde 44% so fungos, 43% bactrias, 2% vrus, 1% clulas vivas e 10% espcimes como plasmdeos, plantas, clulas animais e algas (ABREU & TUTUNJI, 2004; COSTA et al., 2009). No Brasil, o ltimo levantamento nacional identificou a existncia de 43 ncleos de pesquisa registrados no Centro Mundial de Dados de Microrganismos (WDCM), porm apenas 16 prestavam servio para usurios de outras instituies. Nas 80 colees que os ncleos abrigam, esto armazenados acervos de microrganismos associados a enfermidades em humanos, animais e plantas, destacando a Coleo de Culturas do Instituto Adolfo Lutz So Paulo/SP; a Coleo de Culturas Tropicais (CCT) da Fundao Tropical de Pesquisas e Tecnologia Andr Tosello Campinas/SP; Coleo de Culturas IBSBF do Instituto Biolgico- Campinas/SP; Coleo de Culturas da Fundao Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)- Rio de Janeiro/RJ; o Banco de Clulas do Rio de Janeiro (BCRJ), localizado no Hospital Universitrio Clementino Fraga Filho, da Universidade Federal do Rio de Janeiro; o Hospital de Medicina Tropical de So Paulo; a Universidade Federal de Pernambuco e o Centro Especializado em Micologia Mdica, da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Cear (CEMM) (ABREU & TUTUNJI, 2004; CANHOS et al., 2004). Diante da imensa diversidade gentica entre os microrganismos e a necessidade de conservao destes recursos, verifica-se a importncia da intercomunicao entre os ncleos de colees de culturas a fim de fortalecer o desenvolvimento de pesquisas no pas, propiciando novas aplicaes biotecnolgicas dos microrganismos e possibilitando a abertura de novas linhas de pesquisa.

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3 CONSIDERAES FINAIS A manuteno de microrganismos um recurso prtico e cientfico para a atividade laboratorial, diagnstica e de pesquisa, permitindo ampla explorao biolgica. A conservao e viabilidade de culturas, por outro lado, pode ser divergente, por vezes contraditria, entre grupos de pesquisa e seus objetos de estudo e explorao. Para tanto, muitas tcnicas tm sido avaliadas. Pensar em manter, estocar e preservar colees significa assegurar um patrimnio de culturas e bancos genticos com ateno morfologia, fisiologia, respostas celulares e teciduais, bem como sua associao patogenia e infectividade, no caso de agentes patognicos. A variabilidade das populaes microbianas determina a comparao experimental quanto ao melhor mtodo, melhor temperatura e perodo de tempo para condies especficas, ou a combinao de dois ou mais mtodos. As colees de culturas so ferramentas fundamentais para profissionais, estreitando o conhecimento e fortalecendo a interao dos grupos, suplantando fronteiras para a multidisciplinariedade dos segmentos de ensino, pesquisa, agropecuria, medicina, agronomia, indstrias, biotecnologia e meio ambiente, de forma atemporal e sem delimitao geogrfica. Diversos pases tm sugerido a ampliao de colees, com a formalizao de redes distribudas pelo mundo, incluindo normas padronizadas, harmonizao de aes, gerenciamento de informao, bem como a transparncia da comunicao. Tudo isso, para que as colees de culturas passem a ser de propriedade mundial, com aplicao destinada comunidade, para seu bem estar e segurana. REFERNCIAS ABREU, M. M. V.; TUTUNJI, V. L. Implantao e manuteno da coleo de culturas de microorganismos do UniCEUB. Universitas: Cincias da Sade, Braslia, v.02 n.2, p. 236-25, 2004 ANDREATTI FILHO, R. L.; LIMA, E. T.; OKAMOTO, A. S.; SAMPAIO, H. M. Uso de microbiota cecal congelada com crioprotetores em pintos infectados experimentalmente com Salmonella enterica sorovar Enteritidis. Arquivo Brasileiro Medicina Veterinria e Zootecnia, Belo Horizonte, v.59, n.3, p.647-653, 2007. APARECIDO, C. C.; EGYDIO, A. P. M.; FIGUEIREDO, M. B. Avaliao de trs diferentes mtodos utilizados na Micoteca do Instituto Biolgico de So Paulo para preservao de fungos fitopatognicos. Summa Phytopathologica, Jaguarina, v.27, p.421-424, 2001. BARKER, K. Na bancada. Manual de iniciao cientfica em laboratrios de pesquisas biomdicas. Porto Alegre: Artmed, 2002. 474 p. BAATI, L; FABRE-GEA, C.; AURIOL, D. Study of the cryotolerance of Lactobacillus acidophilus: effect of culture and freezing on the viability and cellular protein levels. International Journal of Food Microbiology, Amsterdam, v. 59, n. 3, p. 241-247, sep. 2000.

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