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Modelo matemtico para la viabilidad de diferentes bacterias lcticas en la produccin de cido lctico

Daz Rodrguez C. J.I, Narvez Romero S. B.I, Montoya Ramrez J.I, Alonso Npoles M. E.I, Esparza Rivera J. R.I, Candelas-Cadillo, M. G., Cedillo Gmez, M. J. I, Ramrez Baca P.I, Rodrguez Martnez R.II, II Nevrez Moorilln G. V.
I Facultad de Ciencias Qumicas, Universidad Jurez del Estado de Durango, Gmez Palacio, Dgo . II Universidad Autnoma Agraria Antonio Narro Campus Laguna . Universidad Autnoma de III Chihuahua

Resumen: La fermentacin es un proceso de descomposicin qumica importante en la Industria Lctea en donde se utilizan bacterias lctica para la produccin principalmente de cido lctico que tiene reacciones secundarias importantes en el sabor y textura de los productos fermentados. El principal problema asociado con los cultivos en leches fermentadas es la falta de tolerancia a la acidez por parte de algunas cepas. Cuando el cido lctico se incrementa, los niveles de pH disminuyen durante la fermentacin. Por tanto, el objetivo de este estudio fue definir un modelo matemtico partiendo de un anlisis estadstico hasta llegar a ecuacionbes diferenciales para la viabilidad de diferentes combinaciones de bacterias lcticas durante la produccin de cido lctico a diferentes temperaturas y tiempos de incubacin. La mayor produccin de cido lctico se encuentra en aquellas leches fermentadas en donde se ve involucrada la triple interaccin de S. thermophilus, L. bulgaricus y L. acidophilus y en las que se encuentran el S. thermophilus y L. bulgaricus como cultivo simple. Los tratamientos en los cuales est presente el horas, sin L. acidophilus tienen una baja produccin de cido hasta las 9

embargo, sera necesario elevar los tiempos de incubacin para

observar el comportamiento en la produccin de cido lctico durante el almacenamiento y el modelo que ms ajusta son crecimientos exponenciales y cuadrticos, resultado de sus ecuaciones diferenciales respectivas. Sin embargo, queda para un posterior ejercicio variar las condiciones iniciales para mejorar los parmetros

Introduccin:

La fermentacin es el proceso de la descomposicin qumica de

una sustancia debido a la accin de enzimas producidas por bacterias, levaduras u hongos. Generalmente las bacterias lcticas se emplean en la produccin de alimentos fermentados (Hansen, 2002), cuya actividad primaria es convertir los carbohidratos a metabolitos deseables tales como alcohol, cido actico, cido lctico o CO2, aunque los cultivos utilizados para fermentaciones alimentarias tambin contribuyen con reacciones secundarias que producen sabor y textura, que es la responsable de la diferencia entre productos de distintas marcas, y por lo tanto contribuye significativamente al valor del producto (Hansen, 2002). Por

tanto, las bacterias lcticas son tiles en la Industria de los alimentos, no slo por su habilidad para acidificar y por tanto conservar los productos alimenticios de deterioro, sino por su contribucin a las propiedades organolpticas de los productos fermentados. Adems del beneficio tecnolgico, las bacterias pueden tener propiedades teraputicas por lo que actualmente tambin se han incorporado bacterias de las denominadas probiticas tales como la L. acidophillus, L. casei y la Ouwehand y col., 2002). Bifidobacterium bifidum ticas (Chick y col., 2001; Los probiticos se definen como microorganismos

viables que cuando se ingieren tienen efectos benficos en la prevencin y tratamiento de condiciones patognicas especficas al mejorar el balance microbiano intestinal (Vinderola y col., 2000). Existen productos que contienen una sola cepa, sin embargo tambin pueden haber mezclas con varias cepas (Marteau y col., 2002). Las bacterias probiticas tienen que tener caractersticas especiales para resistir el cido y la bilis en el tracto digestivo, adems de tener la capacidad de adherirse a las clulas epiteliales de forma que puedan permanecer tiempo suficiente en el tracto digestivo para producir compuestos antimicrobianos y para modular la respuesta inmune y resistir procesos tecnolgicos (Heyman y Menard, 2002). . Por tanto, es comn que durante la elaboracin del yogurt se incorporen adems del Streptococcus thermophilus y el Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus este tipo de microorganismos ya que las bacterias del yogurt no sobreviven el paso por el tracto digestivo ni colonizan el intestino y no pueden proveer ningn beneficio teraputico. An as, las bacterias del yogurt crecen

rpidamente y por lo tanto se adicionan para agilizar el proceso de fermentacin. Se ha sugerido que la concentracin de bacterias probiticas sea de 108 UFCg-1 de producto (Tharmaraj y Shah, 2003). Aunque el S. salivarius subsp.

thermophilus es altamente estable bajo condiciones de almacenamiento por un perodo hasta de 6 semanas, el L. delbrueckii subsp. bulgaricus se incrementa al inicio, para decrecer posteriormente. El principal problema asociado con los cultivos en leches fermentadas es la falta de tolerancia a la acidez por parte de algunas cepas. Cuando el cido lctico se incrementa, los niveles de pH disminuyen durante la fermentacin. La

sobreacidificacin o acidificacin postproduccin se debe a la disminucin de pH durante el almacenamiento a temperaturas de refrigeracin. La acidificacin

excesiva se debe al crecimiento incontrolable de cepas de L. bulgaricus a pH bajos y temperaturas de acidificacin. Se puede prevenir al aplicar buenas

prcticas de manufactura utilizando cultivos con comportamiento reducido de sobreacidificacin. La sobrevivencia de microorganismos se ve afectada por este ambiente cido. El L. acidophilus muestra una disminucin rpida en pH de 2.0 pero no tanto a pH de 4.0. Se reporta que el L. acidophilus sobrevive mejor que los cultivos bsicos del yogurt bajo condiciones cidas (Lourens-Hattingh y Viljoen, 2001). En un yogurt el pH puede descender hasta 3.6 inhibiendo a bacterias del tipo bifidobacteria ya que su crecimiento se retarda por debajo de pH 5.0, por lo tanto se recomienda que los productos en donde se utilice esta bacteria se conserven a pH por arriba de 4.6 (Lourens-Hattingh y Viljoen, 2001). Diferentes combinaciones de inculos lcticos y probiticos permiten la produccin de alimentos fermentados lcteos con caractersticas tecnolgicas definidas as como beneficios nutricionales. Sin embargo, las interacciones, ya sean benficas

(protocooperacin) o desfavorables (antagonismo) entre estos cultivos puede generar cambios indeseables en la composicin de la flora bacteriana durante la manufactura y el almacenamiento fro de los productos fermentados (Vinderola y col., 2002). El objetivo de este trabajo fue definir un modelo matemtico para la viabilidad de diferentes combinaciones de bacterias lcticas durante la produccin de cido lctico a diferentes temperaturas y tiempos de incubacin

MATERIALES Y MTODOS Este trabajo se desarroll en las Instalaciones de la Universidad Autnoma Agraria Antonio Narro Unidad Laguna y los Laboratorios y Talleres de la Facultad de Ciencias Qumicas de la Universidad Jurez del Estado de Durango Unidad Gmez Palacio. Se trabaj con leche entera en polvo (Nido elaborada por Nestl de Mxico, S. A. de C. V del lote 51440206L3-03 31-05-06 03:11), reconstituida al 12% m/v, y esterilizada a 121oC durante 15 minutos. El estudio in vitro

comprendi el anlisis del comportamiento de cada uno de los microorganismos involucrados en la investigacin con respecto al tiempo y produccin de cido lctico en forma individual y en la interaccin entre ellos, determinndose la predominancia de cada uno de ellos. Las variables para este estudio fueron el

tipo de microorganismo y tiempo de incubacin (Cuadro 1).


Cuadro 1. Tratamientos para el estudio in vitro de leches fermentadas con diferentes tipos de bacterias y diferentes tiempos de incubacin (0. 3, 6, 9) Identificacin Tratamiento
1 2 3 4 5 6 7 S. salivarius spp thermophillus L. delbrueckii spp bulgaricus L. acidophilus S. salivarius spp thermophillus y L. delbrueckii spp bulgaricus S.salivarius spp thermpphillus y L. acidophilus L. delbrueckii spp bulgaricus y L. acidophilus S. salivarius spp thermophillus, L. delbrueckii spp bulgaricus y L. acidophilus

Microorganismo

Se utilizaron bacterias lcticas liofilizadas comerciales S salivarius spp thermophillus, L. delbrueckii spp bulgaricus y L. acidophilus (Rhodia Inc, Dairy Business, Madison, WI 53701, USA). Todos los cultivos fueron pre-cultivados

agregando el 1.0% del cultivo liofilizado a 15 mL la leche en polvo reconstituida y previamente esterilizada en un tubo de ensaye con rosca. Posteriormente se

prepararon 50 mL de leche en tubos de ensaye con rosca, esterilizaron e inocularon para cada uno de los tratamientos al 0.8% (v/v) a partir del cultivo madre en condiciones aerbicas y sin agitacin posterior hasta su evaluacin.

Cuando el tratamiento involucr asociaciones, los microorganismos se sembraron en forma proporcional de manera que el contenido total fuera de 0.8%. Para la determinacin de la acidez se tomaron 9.0 mL de leche con una pipeta graduada y se le adicionaron cuatro gotas de fenolftalena y se titularon con NaOH al 0.1 N. La acidez presente se reporta como el porcentaje de las tres repeticiones con base al cido lctico calculado de acuerdo a la siguiente frmula: % acidez = mL gastados x 0.090 x 0.1 x 100/9. La preparacin y dilucin de las muestras para su anlisis microbiolgico se llev a cabo basados en la NOM-110-SSA1-1994. Para el conteo de L. acidophilus y L. delbrueckii spp bulgaricus se utiliz como medio de cultivo el Agar Mann-Rogosa y Sharpe (MRS) (DIFCO de Becton Dickinson and Co. Sparks, MD 21152 USA) adicionado con sorbitol al 0.5% incubados a 37oC por 72 horas en una atmsfera de CO2 (International IDF Standard 117, 1983; International IDF Standard 117A, 1988; Dave y Shah, 1996). El conteo del S. salivarius spp thermophilus se realiz con el Agar M17 (DIFCO de Becton Dickinson and Co. Sparks, MD 21152 USA) (International IDF Standard 117, 1983; Birollo y col., 2000) en forma aerobia. Las asociaciones se cuantificaron al sembrarse las leches tanto en medio M17 como en MRS con sorbitol. Los datos fueron expresados como UFC/mL. El diseo experimental fue un bifactorial y los datos fueron analizados por un ANOVA para evaluar el efecto de los tratamientos con los diferentes microorganismos y tiempos de incubacin sobre el crecimiento bacteriano y la produccin de cido lctico. La comparacin de medias entre tratamientos se determin por la prueba de Duncan. Para la obtencin del modelo matemtico se realizaron regresiones: exponencial, cuadrtica y lineal y anlisis con errores residuales absolutos usando los asistentes estadsticos Minitab y Matlab y Excel.

RESULTADOS Y DISCUSIN Los resultados mostraron una diferencia significativa con respecto a la produccin de cido lctico en las diferentes asociaciones, con mayores valores en la asociacin del S. thermophilus-L. bulgaricus-L. acidophilus y la asociacin de las

bacterias de yogur.

Con respecto a la produccin de CLA, los tratamientos

asociados con L. acidophilus fueron los que tuvieron mayor contenido de CLA, y la viabilidad de las bacterias es mayor en el S. thermophilus y menor en el L. acidophilus (Cuadro 1y 2).
Cuadro 1. Contenido de cido lctico (oD) en leches fermentadas con diferentes tipos de bacterias y diferentes tiempos de incubacin
TRATAMIENTO S. thermophilus L. bulgaricus L. acidophilus S. thermophilus- L. bulgaricus S. thermophilus- L. acidophilus L. bulgaricus- L. acidophilus S. thermophilus - L.bulgaricus L. acidophilus 0
a

3
a

6
b

9
b

Acidez (Promedio)
a

0.16
a

0.18
a

0.42
a

0.58
cd

0.34
b

0.15
a

0.16
a

0.19
a

0.23
d

0.18
b

0.15
a

0.16
a

0.16
b

0.19
ab

0.17
a

0.16
a

0.17
a

0.38
b

0.64
b

0.34
a

0.15
a

0.18
a

0.36
b

0.59
c

0.32
b

0.16
a

0.16
a

0.21
b

0.30
a

0.20
a

0.16

0.19

0.45

0.70

0.37

Cuadro 2. Viabilidad de bacterias (UFC/mL) en leches fermentadas con diferentes tipos de bacterias y diferentes tiempos de incubacin (h). UFC/mL TRATAMIENTO 0 3 6 9 (Promedio) Mezcla de cultivos S. thermophilus L. bulgaricus L. acidophilus S. thermophilus- L. bulgaricus th bu S. thermophilus- L. acidophilus th ac L. bulgaricus- L. acidophilus bu ac S. thermophilus - L.bulgaricus L. acidophilus th bu Mo. 9.63 9.01 9.00 9.63 9.07 9.63 9.04 9.01 9.04 9.63 9.03 10.34 9.56 11.09 10.00 9.69 10.68 9.77 9.82 9.67 10.41 9.01 10.78 10.00 10.10 11.35 10.06 11.48 8.33 9.93 8.21 11.43 8.89 9.93 10.76 8.77 11.28 11.60 11.92 9.10 11.93 8.96 12.07 9.51 10.17 9.83 9.74 10.56 10.10 10.92 9.06 10.17 8.97 10.88 9.11

De acuerdo a los resultados de las regresiones exponencial, cuadrtica y lineal y anlisis con errores residuales absolutos se concluye que el modelo que ms ajusta son crecimientos exponenciales y cuadrticos, resultado de sus ecuaciones diferenciales respectivas. Sin embargo, queda para un posterior ejercicio variar las condiciones iniciales para mejorar los parmetros (Cuadro 3) .
Cuadro 3. Modelos matemticos para el crecimiento de bacterias lcticas en la produccin de cido lctico. BACTERIAS S. thermophilus L. bulgaricus L. acidophilus S. thermophilus- L.bulgaricus S. thermophilus- L.acidophilus L. bulgaricus- L.acidophilus S. thermophilus - L.bulgaricus - L acidophilus ECUACIN

Se ha reconocido que la asociacin entre el S. thermophilus y el L. bulgaricus puede influenciar las propiedades fisicoqumicas y el nivel de componentes aromticos presentes en las leches fermentadas en comparacin con aquellas inoculadas con simples cepas que en crecimiento simbitico, S. thermophilus produce cido lctico estableciendo un pH ptimo ideal para el crecimiento de L. bulgaricus; por otro lado, produce tambin pequeas cantidades de cido frmico que estimula su crecimiento, lo cual explica el comportamiento de la produccin observado en este estudio. CONCLUSIONES La mayor produccin de cido lctico se encuentra en aquellas leches fermentadas en donde se ve involucrada la triple interaccin de S. thermophilus, L.

bulgaricus y L. acidophilus y en las que se encuentran el S. thermophilus y L. bulgaricus como cultivo simple. Los tratamientos en los cuales est presente el L. acidophilus tienen una baja produccin de cido hasta las 9 horas, sin embargo, sera necesario elevar los tiempos de incubacin a 24 horas para observar el comportamiento en la produccin de cido lctico.

REFERENCIAS
Birollo, G. A., J. A. Reinheimer y C. G. Vinderola. 2000. "Viability of lactic acid microflora in different types of yogurt." Food Res Int 33: 799-805. Chick, H., H. S. Shin y Z. Ustunol. 2001. "Growth and acid production by lactic acid bacteria and bifidobateria grown in skim milk containing honey." J Food Sci 66(3): 478-481. Dave, R. I. y N. P. Shah. 1996. "Evaluation of Media for Selective Enumeration of Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Lactobacillus acidophillus, and Bifidobacteria." J Dairy Sci 79(9): 1529-1536. Hansen, E. B. 2002. "Commercial bacterial starter cultures for fermented foods of the future." Int J Food Microbiol 78(1-2): 119-131. Heyman, M. y S. Menard. 2002. "Probiotic microorganisms: how they affect intestinal pathophysiology." Cell Mol Life Sci 59(7): 001-015. International IDF Standard 117. 1983. Yogurt. Enumeration of Characteristic Microorganisms colony count technique at 37 oC. International Dairy Federation. 117. International IDF Standard 117A. 1988. Yogurt. Enumeration of Characteristic o Microorganisms colony count technique at 37 C. International Dairy Federation. 117A. Lourens-Hattingh, A. y B. C. Viljoen. 2001. "Yogurt as probiotic carrier food." Int Dairy J 11(1-2): 1-17. Marteau, P., P. Seksik y R. Jian. 2002. "Probiotics and intestinal health effects: a clinical perspective." Br J Nutr 88 Suppl 1: S51-57. Ouwehand, A. C., S. Salminen y E. Isolauri. 2002. "Probiotics: an overview of beneficial effects." Anton Leeuw Int J C 82(1-4): 279-289. Tharmaraj, N. y N. P. Shah. 2003. "Selective enumeration of Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacteria, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, and Propionibacteria." J Dairy Sci 86(7): 2288-2296. Vinderola, C. G., N. Bailo y J. A. Reinheimer. 2000. "Survival of probiotic microflora in Argentinian yoghurts during refrigerated storage." Food Res Int 33: 97-102. Vinderola, C. G., P. Mocchiutti y J. A. Reinheimer. 2002. "Interactions among lactic acid starter and probiotic bacteria used for fermented dairy products." J Dairy Sci 85(4): 721-729.

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