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OSMOTOLERANCIA Mauricio Tomasso, 2004
OSMOTOLERANCIA
Mauricio Tomasso, 2004
La fermentación algunos gramos azúcar hasta 15 alcohólica es lenta en un medio que no
La fermentación
algunos gramos
azúcar hasta 15
alcohólica es lenta en un medio que no contenga más que
de azúcar por litro,
o 20g/L. Unos 100 o
su velocidad aumenta con el tenor de
200g/L no entorpecen a las levaduras,
pero una tasa más elevada posee un efecto inhibidor que se suma al del alcohol
y contribuye a detener prematuramente
la fermentación.
La inhibición por el azúcar se explica por un fenómeno de ósmosis: si una
célula de levadura está situada en
una disolución de azúcar de presión
osmótica más fuerte que la
menos plasmolizada.
del contenido de sus vacuolas, la célula será más o
Azúcar del mosto (g/L)
Alcohol formado en 2 meses
(% vol.)
370
8.6
420
6.3
470
5.9
550
3.4
750
0
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Cuando la concentración de azúcar inicial es elevada, la fase lag se prolonga, la viabilidad
Cuando la concentración de
azúcar inicial es elevada, la fase
lag se prolonga,
la viabilidad celular durante la fase lag disminuye y los recuentos de células
viables durante la fermentación dan valores bajos.
En síntesis, la fermentación
se retarda y quedan elevados niveles de
azúcar residual. (Nishino et al., 1985)
Osmolalidad es una medida
de la cantidad total de partículas osmóticamente
activas en una solución y es igual a la
solutos presentes en esa solución.
suma de las molalidades de todos los
Es de destacar que es la cantidad y no el tamaño de las partículas quien tiene
importancia, por esto, un simple ión, como por ejemplo el potasio, contribuye
de igual forma a
la osmolalidad de un jugo de uva que un
aminoácido, un
carbohidrato o cualquier macromolécula presente.
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Para estudiar el efecto de la presión osmótica en el comportamiento de la levadura, los
Para estudiar el efecto de la presión osmótica en el comportamiento de la levadura,
los volúmenes celulares fueron medidos
a diferentes presiones osmóticas.
La diferencia de
presión osmótica medida antes
y después
parece servir como medida del efecto de la presión osmótica
la levadura.
de la inoculación
en la actividad de
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Efecto de la presión osmótica sobre el crecimiento y la actividad fermentativa de la levadura
Efecto de la presión osmótica sobre el crecimiento y la actividad
fermentativa de la levadura
Células de levadura pasaron de un jugo con 10 y 20% (w/v) de azúcar a
uno con 26% (w/v). Las diferencias de presión osmótica medidas antes y
después de la inoculación fueron de 0,7 y 0,1Osm
respectivamente.
El volumen inicial de partida de las células fue de 82mm 3 , llegando a 42 y
56mm 3 luego de la inoculación cuando las diferencias de presión osmótica
fueron 0,7 y 0,1Osm respectivamente.
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82mmm 3 Cuando la presión osmótica sufre un cambio brusco en la inoculación, la fase
82mmm 3
Cuando la presión osmótica sufre un
cambio brusco en la inoculación, la
fase lag prácticamente se duplica y la
proporción de células muertas
también
se incrementa marcadamente
(3 a 36%).
Dentro de las 15hs
luego del inicio de
la fermentación, las células recuperan
su volumen inicial (82mm 3 )
Cuando
la diferencia de presión
1.03x10 8
osmótica inicial es mayor en la
4.7x10 7
inoculación, el nº máximo de células
por mL
fue de 4.7x10 7 , mientras que
en el otro caso fue de 1.03x10 8 .
La diferencia puede deberse a la
disminución en el nº de células
viables
en la fase temprana del
crecimiento.
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A 14% v/v de alcohol producido, el porcentaje de células viables disminuye notoriamente de 82%
A 14%
v/v
de alcohol producido, el
porcentaje de células viables disminuye
notoriamente de 82% a 28% cuando la
diferencia de presión osmótica se
incrementa de 0,1 a 0,7Osm.
La velocidad de ingreso de azúcar a la
célula no es
afectada por el choque de
presión osmótica en el momento de la
inoculación.
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Un incremento en el inóculo de 4x10 6 a 75 82 10x10 6 cél/mL resulta
Un
incremento en el inóculo de 4x10 6 a
75
82 10x10 6
cél/mL
resulta
en una menor
reducción del
volumen celular (vol inicial
82m
m 3 )
56 68
42
Se sugiere que
inicial reduce
osmótica en la
un incremento en el inóculo
el efecto de la presión
célula.
El
inicio
de
la fermentación se reduce
significativamente a medida el tamaño
celular es mayor debido a
inicial.
un mayor inóculo
Esto indica que el volumen celular luego de
la inoculación
depende de la diferencia de
presión osmótica medida antes y después
de la siembra y del tamaño del inóculo.
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En este trabajo presión osmótica se ha estudiado entonces el efecto de los cambios de
En este trabajo
presión osmótica
se ha estudiado entonces el efecto de los cambios de
sobre:
• Volumen celular
• Tiempo de inicio
de la fermentación
• Muerte celular debida al choque osmótico
• Recuento de células viables durante la fermentación
• Poder
fermentativo
Así como la influencia del
de las levaduras.
tamaño del inóculo sobre el choque osmótico
Este trabajo propone que los cambios en el
volumen
celular en la
inoculación pueden servir como indicador para el crecimiento y la
actividad fermentativa de las células de levadura.
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Bioquímica de la Osmotolerancia Transportadores de azúcares en S. cerevisiae (Bisson, 1999) La disminución en
Bioquímica de la Osmotolerancia
Transportadores de azúcares en S. cerevisiae
(Bisson, 1999)
La disminución en la velocidad de consumo de azúcares está correlacionada con
la disminución en la capacidad de la levadura de tomarla del medio, a pesar de
que el resto de la vía glicolítica se mantiene intacta
y activa.
La capacidad de transporte a
través de la membrana plasmática y no el nivel de
enzimas internas determinan la velocidad de producción de CO 2 .
La levadura equilibra la velocidad de ingreso de
azúcar con
catabolismo. La velocidad de flujo a través de la glicólisis es
la velocidad del
equivalente a la
velocidad de flujo
a través de
los transportadores.
Los procesos de transporte son exquisitamente regulados a fin de igualar, pero
no exceder, las necesidades metabólicas de la célula.
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Saccharomyces posee una familia multigénica de transportadores (18) llamados genes HXT. HXT1 y HXT3 codifican
Saccharomyces
posee
una
familia
multigénica
de
transportadores
(18)
llamados genes HXT.
HXT1 y HXT3 codifican transportadores de baja
afinidad (K m =50-100mM),
mientras que HXT6, HXT7 y GAL2 son transportadores de
glucosa de alta
afinidad (K m =1
-2mM). HXT2 y HXT4 poseen afinidad moderada
(K m =10mM)
Los transportadores HXT2 aparentemente pueden
existir en estados de alta y
baja afinidad, sugiriendo que las condiciones ambientales pueden modificar
la cinética de esta proteína.
La propia glucosa funciona
(inducción o represión)
como regulador de expresión de
los genes HXT
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¿Por qué hay tantos transportadores en Saccharomyces? El transporte de glucosa y fructosa ocurre por
¿Por qué hay tantos transportadores en Saccharomyces?
El transporte de glucosa y fructosa ocurre por difusión facilitada. Estos sistemas
son óptimamente operativos solo en un rango pequeño de concentraciones de
sustrato.
La fluidez de la
membrana debe permitir el cambio conformacional de las
proteínas transportadoras para lograr el
ingreso de
sustrato.
A elevadas concentraciones
de azúcar,
transportadores con sitios múltiples de
reconocimiento (estructura abierta), están sujetos a inhibición
por sustrato.
A elevadas
concentraciones
de
azúcar
transportadores
con
estructura
relativamente cerrada son requeridos.
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La estrategia de acoplar la expresión de los genes HXT a las concentraciones externas de
La estrategia de acoplar la expresión de los genes HXT a las concentraciones
externas de glucosa asegura que transportadores con afinidad apropiada y
sensibilidad a la inhibición por sustrato serán
apropiado durante la fermentación.
expresados en el momento
Una segunda razón para la existencia de
múltiples especies proteicas catalizando
el mismo paso en el catabolismo, concierne a la velocidad de adaptación a
condiciones cambiantes (hipótesis del consorcio) (Bisson et al., 1993)
En Saccharomyces el transporte es el sitio principal del control de la velocidad
de fermentación.
Cuando las condiciones ambientales se tornan adversas la
velocidad de fermentación disminuye debido a la degradación
transportadores HXT.
específica de los
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Señales de estrés osmótico y osmoadaptación en levaduras (Stefan Hohmann, 2002) Luego de un cambio
Señales de estrés osmótico y osmoadaptación en levaduras
(Stefan Hohmann, 2002)
Luego de un cambio a un
ambiente
de elevada osmolaridad la levadura
rápidamente estimula una cascada de proteinquinasa activada por mitógeno
(MAP), la vía del glicerol de
la respuesta transcripcional.
alta osmolaridad (HOG) la cual orquesta parte de
Los cambios expresados luego de un cambio a alta
osmolaridad apuntan a un
ajuste en el metabolismo
y
producción
de
protectores
celulares. La
acumulación de glicerol, el cual es también controlado alterando su transporte
transmembrana, es de central
importancia.
Luego de un cambio de alta a baja osmolaridad las células de levadura
estimulan una cascada de MAP quinasa diferente, la
vía de integridad celular.
La salida rápida
de glicerol es un evento importante en la adaptación a
condiciones de baja osmolaridad.
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Esquema de las vías involucradas en el metabolismo del glicerol en S. cerevisiae Gpd1p, 2p,
Esquema de las vías
involucradas en el metabolismo del glicerol en S. cerevisiae
Gpd1p, 2p, NAD-dependent glycerol-3-phosphate dehydrogenase; Gpp1p, 2p, glycerol-3-
phosphatase; Gut1p, glycerol kinase; Gut2p, FAD-dependent glycerol-3-phosphate dehydrogenase;
Dak1p, 2p, dihydroxyacetone kinase; Fps1p, glycerol facilitator; Gcy1p
and Ypr1p, putative
NAD(P)H dependent glycerol dehydrogenase; Gup1p, 2p, glycerol uptake protein; G3P, glycerol
3-phosphate; GAP, gliceraldehído-3-fosfato; DHAP, dihidroxiacetona fosfato.
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