Universidade de So Paulo

Instituto de Qumica de So Carlos

SQM0416 Bioqumica II
Prof. Dr. Jlio Csar Borges

Douglas Morisue Sartore, n USP 7144445

So Carlos, novembro de 2012

Compreende bioqumicos;

uma

srie

de

processos

Tem por objetivo determinar a sequencia de nucleotdeos na molcula de DNA;

Na dcada de 50, James Watson e Francis Crick descobrem a estrutura do DNA; Publicam na revista Nature o artigo

Molecular Structure of Nucleic Acids: A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid;

O DNA se estrutura na forma de uma dupla hlice e as bases nitrogenadas se ligam aos pares por ligaes de H;

At a dcada de 70 era extremamente difcil obter a sequencia dos cidos nucleicos, mesmo os pequenos (5 a 10 nucleotdeos); Em 1977 surgem duas novas tcnicas para o sequenciamento do DNA; Uma pelos cientistas Alan Maxam e Walter Gilbert e outra por Frederick Sanger;

Maxam e Gilbert: degradao qumica do DNA;

Tratamento com substncias qumicas que lisam a molcula de DNA em nucleotdeos especficos;

Sanger: sequenciamento enzimtico, dideoxi ou de trmino de cadeia;

Sntese enzimtica de fita complementar, cujo comprimento interrompido pela adio de dideoxinucleotdeo;

Degradao Qumica;

Primeiramente, a fita dupla de DNA marcada com 32P, na extremidade 5 da dupla fita. A enzima polinucleotdeo quinase catalisa esse processo; dupla fita adiciona-se dimetilsulfato, seguido de aquecimento (90 C). As ligaes de H so rompidas, separando as duas fitas do DNA; A amostra separada em 4 tubos, onde em cada tubo ocorrer a clivagem da fita num determinado nucleotdeo ou par de nucleotdeos; A amostra de cada tubo submetida eletroforese e o gel usado para posterior revelao radiogrfica, revelando a sequencia encontrada dos nucleotdeos (extremidade marcada);

Degradao Qumica:

Sequenciamento Enzimtico:
A fita dupla de DNA a ser sequenciado deve ser separada em suas fitas simples (moldes); Essa amostra dividida em quatro diferentes tubos, cada um dos tubos contm os quatro desoxirribonucleotideo trifosfatado (dNTP) e apenas um didesoxirribonucleotdeo trifosfatado (ddNTP), alm do primer, marcado radioativamente; A sntese da fita complementar ao molde ocorre a partir do primer marcado, com a ao da enzima DNA polimerase;

Sequenciamento Enzimtico:
Os ddNTP diferem dos dNTP pela ausncia do grupo 3-OH, ou seja, quando incorporados fita h a interrupo de sua sntese; Pequenas quantidades de ddNTP so adicionadas e aleatoriamente a sntese ser interrompida com o ddNTP de seu respectivo tubo, formando fragmentos de tamanhos diferentes; Estes fragmentos podem ser separados e analisados atravs de eletroforese, com posterior revelao radiogrfica;

Sequenciamento Enzimtico:

Mtodos Manuais (Maxam-Gilbert e Sanger):

Utilizao de elementos danosos para marcao de amostras (istopos radioativos); Necessidade de radiografia para visualizao da sequencia de DNA;

Mtodos Automticos:

Alguns utilizam os mesmos princpios do mtodo de Sanger; Uso de marcadores fluorescentes (nos diferentes ddNTP); Ao ser excitada com laser, emite fluorescncias caractersticas de cada base; Fim da necessidade de 4 reaes paralelas (mistura de produtos fluorescentes);

Sequenciamento automtico em placa de gel de poliacrilamida:

Incorporao dos ddNTP, produzindo as diversas fitas; Anlise dos compostos marcados, atravs da eletroforese em gel; Incidncia de laser, excitando os corantes; Emisso de fluorescncia caracterstica de cada base; Fluorescncia detectada por fotomultiplicador e utilizada na construo de um eletroferograma (Intensidade x Tempo); Uma das etapas mais complicadas desse processo a preparao do gel de poliacrilamida;

Sequenciamento automtico com eletroforese capilar:

Analisam as molculas pelo processo de eletroinjeo; No h necessidade da preparao do gel de poliacrilamida; Quando os fragmentos do DNA atingem a janela de deteco, um laser excita as molculas de corante, cuja fluorescncia emitida capturada pela cmara CCD; Um software interpreta os resultados, atribuindo uma cor especfica para cada base marcada; Por conveno, A fica como verde, C como azul, G como preto e T como vermelho; Anlises mais rpidas e com melhor resoluo;

Eletroferograma:

Sequenciamento por fragmentos aleatrios (Shotgun):

Pequenos fragmentos do genoma estudado so gerados randomicamente (mtodos fsicos ou enzimticos especficos); Esses fragmentos so clonados em vetores; Esses fragmentos devem conter todo o genoma estudado; Atravs da sobreposio desses fragmentos, pode-se montar genomas inteiros; Processo mais rpido do que seguir em ordem o DNA, porm, requer grande capacidade computacional;

Pirosequenciamento:
Desenvolvido pela Roche Applied Science, empresa sua; Ocorre em nanoesferas de oligonucleotideos (PCR); O nucleotdeo adicionado fita crescente de DNA detectado diretamente pela liberao e transformao de uma molcula de pirofosfato (PPi), no se baseia na eletroforese para separao dos fragmentos; O PPi liberado convertido em ATP, pela ao da ATP sulfurilase, este ATP fornece energia para que a enzima luciferase oxide a luciferina, com emisso de luz; Essa luz imediatamente detectada, para a construo do pirograma, utilizado para anlise das sequencias; Sequenciamento em tempo real e por sntese;

Pirosequenciamento:

Outras tcnicas de sequenciamento:

Sequenciamento por hibridao Colnias da polimerase Seqenciamento por nanoporos Espectrometria de massa

Dias, C.K.S. SEQUENCIAMENTO DE DNA: MTODOS E PRINCPIOS, Instituto de Biocincias UNESP Botucatu (SP); Nelson L.D., Cox M.M. Lehninger Princpios de Bioqumica, 3 ed., So Paulo, 2002; http://pt.wikipedia.org/wiki/cido_desoxirribonucleico <acessado em 7/11/2012> http://www.biomolweb.kit.net/pages_html/sequencing.html <acessado em 9/11/2012>

http://www.infoescola.com/genetica/sequenciamento-de-dna/ <acessado em 9/11/2012>

http://www.proac.uff.br/virologia/sites/default/files/bacteriologia_mole cular_2.pdf <acessado em 10/11/2012>

Ao prof. Jlio pela oportunidade;

todos os presentes pela ateno;

Obrigado!