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Fermentations industrielles TABLE DES MATIERES

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INTRODUCTION .................................................................................................................................................. 3 1. LAMONT (up stream) ................................................................................................................................... 6 1.1. La biomasse.................................................................................................................................................. 6 1.1.1. Dfinition .............................................................................................................................................. 6 1.1.2. Facteurs d'efficacit............................................................................................................................... 6 1.1.3. Obtention et preparation de la biomasse ............................................................................................... 7 1.1.4. Conservation des souches...................................................................................................................... 8 1.2. Le substrat .................................................................................................................................................. 10 1.2.1. Fonction .............................................................................................................................................. 10 1.2.2. Critres de choix ................................................................................................................................. 10 1.2.2.1. Composition chimique ................................................................................................................. 11 1.2.2.1.1. Aspect qualitatif .................................................................................................................... 11 1.2.2.1.2. Aspect quantitatif .................................................................................................................. 11 1.2.2.2. Structure physique........................................................................................................................ 13 1.2.2.3. Cot.............................................................................................................................................. 13 1.2.3. Strilisation ......................................................................................................................................... 13 1.3. Lair............................................................................................................................................................ 14 1.3.1. Fonctions............................................................................................................................................. 14 1.3.2. Bilan.................................................................................................................................................... 15 1.3.2.1. Demande en oxygne (OUR) ....................................................................................................... 15 1.3.2.2. Offre d'oxygne (OTR) ................................................................................................................ 16 2. Le BIOREACTEUR...................................................................................................................................... 20 2.1. Dfinition ................................................................................................................................................... 20 2.2. Fonction : homognisation ....................................................................................................................... 20 2.2.1. Homognisation spatiale : agitation................................................................................................... 22 2.2.1.1. Agitation mcanique..................................................................................................................... 22 2.2.1.1.1. Agitation radiale.................................................................................................................... 23 2.2.1.1.2. Agitation axiale ..................................................................................................................... 24 2.2.1.2. Agitation pneumatique (air lift).................................................................................................... 24 2.2.1.3. Agitation hydraulique (ou "par pompage et recirculation" ou " jet") ......................................... 25 2.2.2. Homognisation dans le temps : rgulation ....................................................................................... 26 2.2.2.1. Principes lmentaires de rgulation ............................................................................................ 27 2.2.2.2. Principales rgulations ................................................................................................................. 27 2.2.2.2.1. Rgulation de la temprature................................................................................................. 28 2.2.2.2.2. Rgulation du pH .................................................................................................................. 28 2.2.2.2.3. Rgulation de l'oxygne ........................................................................................................ 29 2.2.2.2.4. Rgulation de la mousse........................................................................................................ 30 2.3. Types de bioracteurs................................................................................................................................. 30 2.3.1. Bioracteurs biomasse en suspension (racteurs homognes) .......................................................... 31 2.3.2. Bioracteurs biomasse immobilise (racteurs htrognes)............................................................ 31 2.3.2.1. Principe ........................................................................................................................................ 31 2.3.2.2. Modes d'immobilisation ............................................................................................................... 32 2.3.2.2.1. Inclusion................................................................................................................................ 32 2.3.2.2.2. Confinement .......................................................................................................................... 32 2.3.2.2.3. Support inerte ........................................................................................................................ 33 2.4. Modes de fonctionnement .......................................................................................................................... 34 2.4.1. Modlisation : R. I. M. et R. G. C. ...................................................................................................... 34 2.4.2. Fonctionnement discontinu ................................................................................................................. 34 2.4.3. Fonctionnement continu ...................................................................................................................... 35 3. LAVAL (downstream) ................................................................................................................................. 37 3.1. Techniques de sparation ........................................................................................................................... 38 3.1.1. Sparation particulaire (solide / liquide) ............................................................................................. 38 3.1.1.1. Sdimentation............................................................................................................................... 38 3.1.1.1.1. Principe ................................................................................................................................. 38 3.1.1.1.2. Technologie........................................................................................................................... 39
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3.1.1.2. Centrifugation............................................................................................................................... 39 3.1.1.2.1. Principes................................................................................................................................ 39 3.1.1.2.2. Technologie........................................................................................................................... 40 3.1.1.3. Filtration....................................................................................................................................... 41 3.1.1.3.1. Principes................................................................................................................................ 41 3.1.1.3.2. Technologies ......................................................................................................................... 41 3.1.2. Sparation molculaire........................................................................................................................ 43 3.2. Permation ................................................................................................................................................. 43 3.3. Concentration ............................................................................................................................................. 44

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INTRODUCTION
Bire, vin, vinaigre, yogourt, pnicilline, acide lactique, biogaz, thanol, glycrine, quelle relation peut-il bien exister entre tous ces produits ? De mme, quel point commun pourrait-on trouver entre l'activit principale du boulanger - fabriquer du pain - et le fonctionnement d'une station d'puration ? En fait toutes ces productions, et bien d'autres, utilisent un outil vivant. Le processus de transformation mis en uvre exploite des microorganismes - la biomasse - dont le dveloppement modifie les caractristiques de la matire - le substrat - sur ou dans laquelle ils se sont dvelopps.
N. B. : Selon les domaines industriels, divers termes sont utiliss pour dsigner la biomasse : "levain" en boulangerie, "ferment" ou "starter" en charcuterie et transformation du lait, "boues biologiques" en puration des eaux,

Biomasse Saccharomyces cerevisiae Malt cuit dans l'eau (levure de brasserie) Jus de raisin Lait Effluents agricoles ou ordures mnagres Eau d'gout Pte pain Saccharomyces spp Streptococcus thermophilus & Lactobacillus bulgaricus (bactries) Nombreux microorganismes

Substrat

Produit Bire Vin Yogourt Biogaz + compost

Raction biochimique Fermentation alcoolique Fermentation alcoolique Fermentation lactique

Fermentation mthanique & humification Eau pouvant tre Respiration arobie et Nombreux microorganismes rejete en rivire anarobie Saccharomyces cerevisiae Fermentation Pain (levure de brasserie) alcoolique + cuisson

Tableau 1: Quelques exemples (liste non exhaustive) d'application du gnie microbiologique

Le "gnie" microbiologique, dans la mme acception que le "gnie" militaire, correspond l'ensemble des technologies d'exploiter industriellement des microorganismes vivants. enzymatique et le "gnie" gntique, le "gnie" microbiologique lments du domaine industriel des biotechnologies.

"gnie" civil ou le qui permettent Avec le "gnie" constitue un des

N. B. : L'agriculture n'est pas considre comme "biotechnologie" mme si elle aussi exploite des tres vivants vgtaux et/ou animaux. Cela est d au fait que les techniques agricoles prsentent une spcificit qui les diffrencie nettement des logiques industrielles classiques. En particulier la dpendance aux conditions climatiques et la liaison au sol en sont des caractristiques tout fait exclusives.

Le gnie enzymatique correspond aux techniques utilisant des enzymes. Ces dernires sont des molcules organiques de nature protique dont la fonction biologique est de catalyser les ractions du mtabolisme. Leur activit est extrmement spcifique et permet, dans des conditions trs douces (temprature faible et pression atmosphrique) de raliser des ractions impossibles sans leur intervention.
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Le gnie gntique - qualifi galement de "biologie molculaire" - regroupe tous les moyens qui facilitent les actions sur le gnome cellulaire. En particulier, c'est en partie grce aux procds du gnie gntique que l'on est en mesure de modifier l'information gntique d'une cellule. Cela peut s'avrer fort utile pour amliorer les performances d'une biomasse, en gnie microbiologique. Le prsent cours est toutefois consacr exclusivement l'tude des tenants et aboutissants relatifs au gnie microbiologique. Dans ce contexte prcis, l'ensemble des lments constituant une installation de fermentation a pour objectif gnral soit de favoriser au maximum la production de cellules ou de mtabolites cellulaires directement utilisables (bioproductions), soit simplement de modifier un substrat par action biologique (bioconversion). Dans le premier cas, l'tape de fermentation proprement dite devra tre suivie par des oprations de sparation (down stream process) en vue d'isoler, de purifier et de stabiliser les cellules ou les mtabolites (ex : filtration d'une bire de type pils, en vue d'en retirer les levures ; distillation de jus de raisins ferment en vue de produire du cognac, ). Par contre on parlera de bioconversion quand aucune sparation n'intervient en aval de la fermentation (ex : fabrication de yogourt ou de fromage blanc, dans lesquels la flore active demeure dans le produit fini). Quel que soit le type de produit recherch, pour en optimiser la production, il est impratif de fournir la biomasse un substrat parfaitement adapt, tant dans sa composition que du point de vue des concentrations de ses diffrents lments. En outre ce milieu de culture doit, le plus souvent, tre strilis afin d'viter tout dveloppement anarchique d'une biomasse non dsire. Il doit en outre tre le plus accessible possible et ds lors prsenter une interface maximale avec les microorganismes utiliss. La biomasse elle-mme doit, en gnral, tre slectionne en vue d'obtenir des souches hautement performantes garantissant une productivit leve. Ces souches, prcieusement conserves, seront prpares en temps utile afin de disposer d'un maximum d'efficacit ds leur mise en production. Parmi les nombreux produits du gnie microbiologique, certains font appel des microorganismes arobies exigeant une aration plus ou moins intense du substrat. Les modalits de distribution optimale d'un air, strile ou non, font aussi l'objet d'tudes prendre en considration dans la conception d'un racteur biologique. Tenant compte de ces impratifs relatifs au substrat et la biomasse, le bioracteur (ou digesteur ou fermenteur), partie matresse de l'installation, consiste en une enceinte plus ou moins vaste (de quelques litres en installation de laboratoire, quelques dizaines de litres en installation pilote ou de prculture, plusieurs mtres-cubes en production industrielle.) conue pour optimaliser les contacts biomasse-substrat-oxygne en vue de maximiser le rendement de la (des) raction(s) biochimique(s) recherche(s). Ces contacts doivent permettre un transfert idal, dune part, des substances nutritives en solution dans le substrat vers le cytoplasme cellulaire, et d'autre part, des produits de l'activit microbienne vers le milieu extra-cellulaire. Cependant, connaissant le fonctionnement microbien (courbe de croissance, mtabolisme primaire et secondaire,...), on s'aperoit que si l'on n'y prend pas garde,
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l'environnement de cette biomasse va voluer au cours de la raction, entranant ventuellement une modification du mode de fonctionnement des cellules. D'o l'imprieuse ncessit de disposer de systmes de rgulation destins maintenir constantes les conditions de travail. Ceci implique deux contraintes : pouvoir mesurer, si possible en temps rel, la valeur des principales variables (T , pH, concentrations, dbit d'O 2, ...) susceptibles d'interfrer avec le fonctionnement de la biomasse ; disposer d'un moyen de corriger le plus rapidement possible les caractristiques de la raction en cours.

Par ailleurs, lorsque la bioraction s'achve, les produits recherchs (cellules ou molcules) se retrouvent en mlange avec des rsidus du substrat. Il s'agit donc de concevoir des moyens de sparer le produit intressant du reste sans l'endommager et en lui assurant une puret compatible avec son utilisation. Enfin, il ne faut pas perdre de vue que certains procds du gnie microbiologique exigent l'utilisation d'une biomasse extrmement spcialise (souche microbienne fortement slectionne et ventuellement protge commercialement par un brevet) susceptible d'tre concurrence, dilue voire dtruite par des infections (souches sauvages, autres espces, virus,...). La lutte contre les sources d'infection et la protection hyginique du digesteur sont donc des oprations incontournables dans la gestion d'une installation de fermentation.

Figure 1 : L'installation de bioproduction [3]

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1. LAMONT (UP STREAM)


1.1. LA BIOMASSE
1.1.1. DEFINITION
Le terme biomasse1 dsigne la partie biologique du processus de bioproduction. Il s'agit donc des cellules cultives dans le racteur. Plus particulirement, on qualifie d'inoculum la biomasse injecte dans le racteur au dbut de la production. De mme on parle souvent de souche pour dsigner le type de biomasse utilis. Cette biomasse peut provenir de diffrents groupes biologiques. Il s'agit dans l'immense majorit des cas d'organismes unicellulaires procaryotes (bactries et arches) ou eucaryotes (levures [myctes]), ou de pluricellulaires eucaryotes indiffrencis (moisissures [myctes]). Certaines productions font parfois appel me d'autres biomasses telles que des algues (production de biocarburants de 3 gnration, production de diffrentes substances telles que l'agar-agar, les alginates, ), voire certains protozoaires.
N. B. : Dans le domaine thrapeutique, les recherches et mises au point de cultures de tissus en vue de la reconstitution de peau, de foie et d'autres organes partir de cellules diffrencies ou non (cellules souches ayant conserv leur proprit de totipotence) sont en plein essor, ouvrant la voie des possibilits de greffe ou de reconstitution d'organes ou de tissus exempts de risques de rejets. De mme, les cultures in vitro partir de mristmes vgtaux sont actuellement trs bien matrises et occupent un march conomique non ngligeable. Ces techniques de cultures de cellules eucaryotes ne relvent toutefois pas directement de la microbiologie industrielle. N. B. : Pour de plus amples informations sur les caractristiques gnrales des diverses biomasses exploites en microbiologie industrielles, cfr. "Microbiologie applique".

1.1.2. FACTEURS D'EFFICACITE


Pour maximiser le rendement de production d'un racteur biologique, il s'agit de faire en sorte que la biomasse se trouve dans les meilleures conditions possibles. En effet, celle-ci prsente des preferendums et un optimum de croissance pour chaque caractristique de l'environnement dans lequel on la cultive.
N. B. : Pour rappel, par preferendum on entend les valeurs limites entre lesquelles l'organisme est capable de se dvelopper. Tandis que l'optimum dsigne la valeur du paramtre tudi pour laquelle le dveloppement est le plus intense.

En microbiologie industrielle, il est parfois ncessaire de distinguer les preferendums et optimums relatifs la croissance microbienne de ceux qui concernent la production de mtabolites. En effet les conditions ncessaires la
Le terme biomasse est aussi employ pour dsigner les combustibles considrs comme renouvelables dans la mesure o ils font partie du cycle court du carbone (dchets agricoles, bois et toutes ses variantes [pellets, plaquettes, bois torrfi, ], dchets organiques divers), par opposition aux combustibles fossiles (houille, ptrole, gaz naturel).
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multiplication cellulaire peuvent tre diffrentes de celles qui conditionnent tel ou tel mtabolisme. Ds lors, en fonction du produit envisag (mtabolite ou cellules), pour une mme biomasse, les conditions de pilotage du racteur peuvent diffrer. En particulier, en cas de production de mtabolites secondaires, dans un premier temps le racteur sera rgul pour favoriser la multiplication cellulaire, et ce afin de disposer d'une quantit de biomasse importante. Ensuite, les consignes de rgulation pourront tre modifies afin de stimuler le mtabolisme secondaire.

1.1.3. OBTENTION ET PREPARATION DE LA BIOMASSE


En gnral, il existe une trs forte diffrence entre les microorganismes rencontrs dans la nature et ceux qui sont exploits en microbiologie industrielle. En effet les souches naturelles - souvent qualifies aussi de "souches sauvages" sont adaptes un environnement relativement hostile et pas du tout aux conditions de fonctionnement d'une installation industrielle. En outre cette adaptation rsulte d'un processus de slection naturelle long qui leur confre une certaine stabilit gntique.
N. B. : Ceci n'est pas toujours vrai. Certaines fermentations sont le fait de populations microbiennes naturelles, souvent prsentes sur le substrat ou dans son environnement. C'est le cas par exemple pour les agents de la mthanisation de dchets organiques (prsence de la biomasse sur le substrat) ; pour la fermentation alcoolique de certains vins, en particuliers les vins "bio" (prsence de levures sur la peau des raisins [impossible ou du moins difficile en viticulture intensive vu l'emploi de fongicides pour protger les rcoltes]) ; pour l'ensemencement du mot par des levures particulires (Bretanomyces bruxellensis et Bretanomyces lambicus) provenant de l'air et spcifiques de la Gueuze ; pour l'puration des eaux rsiduaires (prsence de la biomasse dans le substrat) ;

Afin de rendre les souches sauvages plus performantes dans un contexte industriel, diffrents processus d'amlioration et de slection doivent tre mis en uvre. Schmatiquement, ceux-ci consistent provoquer des modifications dans le gnome microbien, puis tester les proprits des mutants obtenus en comparaison avec les souches initiales. Ainsi, de mutations en slections successives, on obtient des souches qui rpondent de mieux en mieux aux objectifs de production tels que la productivit, la rsistance aux conditions industrielles, l'adaptation des substrats particuliers, Ces souches idales reprsentent le capital biologique de l'entreprise de bioproduction. On les qualifie de "souches mres" dont il s'agit d'assurer la conservation de faon optimale. En effet, contrairement aux souches sauvages, les souches mres n'ont pas t confrontes une slection naturelle de longue dure. Il en rsulte que les allles2 mutants acquis au cours des processus d'amlioration manquent de stabilit et peuvent disparatre au fil des multiplications cellulaires. On parle dans ce cas de mutations rverses qui font progressivement revenir la souche mre sa forme naturelle initiale, relativement peu productive : c'est le phnomne de dgnrescence de la souche. D'autres causes peuvent expliquer cette dgnrescence, comme

Les diffrents allles d'un gne sont les formes que le phnotype d'un individu peut exprimer partir d'un mme gne. Ex : Soit une plante qui peut produire des fleurs rouges ou blanches. Si on considre que la couleur des fleurs dpend d'un gne donn, les diffrents allles correspondent aux couleurs que peuvent prendre les fleurs, en l'occurrence rouge ou blanc.
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l'altration de la membrane et de la paroi chez les levures force de bourgeonner ou 3 la drpression d'un virus tempr chez des bactries lysognes .
N. B. : En application de cette dgnrescence, en brasserie, on vite de multiplier les cycles d'ensemencement d'une production partir des levures du brassin prcdent. Cela impose de prvoir des oprations de "propagation", paralllement au processus de production proprement dit. Ces propagations consistent fabriquer du levain frais directement partir de la souche mre.

Afin de se prmunir du risque de dgnrescence, il est impratif de conserver la souche mre en limitant le nombre de multiplications. A cette fin diverses technologies (conglation, dshydratation, ) peuvent tre utilises (cfr 1.1.4). Quelles qu'elles soient elles induisent un certain stress au niveau des cellules, qui pourrait rendre dlicate leur reprise en conditions industrielles. C'est pourquoi l'ensemencement d'un racteur ne sera jamais ralis avec la souche mre proprement dite mais bien avec une souche drive, adapte grce des prcultures (propagation) dans un environnement strictement contrl. On cre ainsi des "souches de travail" susceptibles de fonctionner efficacement dans le contexte industriel. Habituellement on prvoit au moins deux tages de prculture : le premier vise rcuprer la souche mre en la cultivant en conditions parfaitement optimales tous points de vue (substrat idal et petits volumes afin de bien matriser les facteurs de multiplication) ; le second a pour but la fois de multiplier la souche mre "dstresse" par la premire prculture et de l'acclimater l'environnement industriel, notamment du point de vue du substrat. Plusieurs prcultures de multiplication peuvent se succder afin d'obtenir un inoculum suffisamment important pour assurer un dmarrage efficace du racteur de production. La succession de ces prcultures, depuis la souche mre jusqu' la souche de travail, est qualifie de "scaling up", en ce sens que les volumes de culture croissent d'tape en tape. Malheureusement, au fur et mesure de ces augmentations d'chelle, les systmes de matrise des conditions de fonctionnement tendent diminuer d'efficacit.

1.1.4. CONSERVATION DES SOUCHES


Les souches mres constituent un des trois lments - avec le substrat et les rgulations - ncessaires pour raliser une bio-production spcifique et efficace. Elles rsultent souvent d'un processus de slection relativement long et ventuellement couteux. Elles font ds lors partie du capital de l'entreprise qui les exploite et possdent une valeur concurrentielle parfois significative.
N. B. : Le fait qu'une souche-mre fasse partie du capital de l'entreprise se matrialise par le fait qu'il est possible de faire breveter ces organismes vivants (voire leurs drivs) au mme titre qu'une technique de production ou des appareils. L'obtention d'un brevet protge l'entreprise qui le dtient contre une concurrence qui tenterait d'employer le mme procd (en l'occurrence, la mme souche).

Par ailleurs, comme il s'agit de matriel vivant, elles prsentent une certaine fragilit vis--vis de leur environnement et une tendance naturelle l'volution. Pour maintenir les performances de l'activit industrielle qui les utilise, il convient ds lors
Pour rappel - Cf "Microbiologie applique" - une bactrie est dite "lysogne" lorsqu'elle hberge un virus - un bactriophage en l'occurrence - en phase lysognique. Dans cette configuration le virus est intgr au gnome bactrien mais sa propre information gntique n'est pas traduite car elle est masque par des rpresseurs. La disparition de ceux-ci induit le "rveil" du virus qui entre alors en phase lytique (ou virulente), se multiplie au dtriment de la cellule hte et colonise d'autres cellules.
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d'assurer la fois leur conservation (viter les agressions lies l'environnement) et leur stabilit (viter toute modification de leurs caractristiques mtaboliques et donc gntiques) sur le long terme. A cette fin diverses technologies peuvent tre mise en uvre : Repiquages : Les techniques de repiquage des souches consistent en fait renouveler le substrat de croissance en prlevant une partie de la population utile et en la mettant en prsence de substrat frais. Cette opration doit tre programme assez souvent - tous les 15 jours 3 semaines - afin d'viter un puisement du substrat qui pourrait stresser la biomasse. Cette mthode prsente une certaine souplesse dans la mesure o elle ne demande pas de matriel trs spcifique. Elle ne permet toutefois pas une conservation long terme. En effet, chaque repiquage relance des multiplications, ce qui augmente le risque d'apparition de mutants reverses susceptibles d'induire une dgnrescence progressive de la souche. En outre ces repiquages doivent tre raliss en conditions aseptiques, ce qui n'est jamais garanti 100 %. Le risque de contamination n'est donc pas nul et augmente avec le nombre de repiquages. En dfinitive, la conservation de souches par repiquages successifs ne prsente gure d'intrt, si ce n'est dans une optique de court terme. Rfrigration et conglation : Ces deux procds ont en commun l'utilisation du froid. Par contre, ils se distinguent par l'tat physique de l'eau, en ce sens qu'en rfrigration celle-ci reste liquide, et donc disponible pour les ractions biochimiques ; tandis qu'en conglation, la temprature est abaisse un niveau tel que l'eau est cristallise, le plus compltement possible. Cette diffrence fondamentale explique les variations dans l'efficacit de la conservation. En effet, en rfrigration les mtabolismes ne sont pas arrts, mais seulement ralentis vu que les enzymes peuvent rester en solution. L'effet de conservation se limite au fait que la cintique des ractions biochimiques est inversement dpendante de la temprature. Dans ces conditions l'activit mtabolique est seulement ralentie et des divisions peuvent encore intervenir, mme si elles sont relativement rares. Par contre, en conglation, la cristallisation de l'eau rend celle-ci indisponible, figeant de ce fait l'activit enzymatique. Les cellules entrent donc dans une sorte de dormance au cours de laquelle le mtabolisme est l'arrt vu la neutralisation des enzymes. Le processus de cristallisation de l'eau peut toutefois induire des pertes au niveau de l'effectif microbien congel. En effet, d'une part les cristaux en cours de formation risquent d'endommager certaines structures cellulaires, notamment la membrane ; et d'autre part, comme la cristallisation est progressive et ne concerne que de l'eau pure, les soluts initialement prsents se concentrent dans la fraction d'eau non encore congele au point d'en devenir toxiques. Afin de limiter ces effets nfastes, il est prfrable de procder une surglation, qui se distingue de la conglation par la vitesse de la descente de temprature. Quel que soit le mode de conglation adopt, les problmes de traumatismes occasionns la biomasse demeurent nanmoins secondaires car 9 12 vu les quantits de cellules congeles (10 10 par ml), une perte, mme de 99 % de la population, n'induit gure de difficults de reprise. Celles-ci seraient plutt lies au stress subi (altration des structures) durant la solidification de l'eau, d'o l'importance de la prculture de rcupration mentionne plus haut. Enfin, quelle que soit la faon dont on l'utilise, le froid ncessite de disposer en permanence d'un systme permettant de le produire puis de le maintenir. Cela
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consomme de l'nergie et dans une certaine mesure de l'espace (bouteilles thermos, conglateurs, ). Dshydratation : Une autre faon de bloquer les mtabolismes consiste liminer l'eau du substrat et des cellules. Toutefois, vu la sensibilit des protines - donc des enzymes - aux fortes tempratures, il n'est pas possible d'utiliser un schage haute temprature. Par ailleurs, compter sur l'vaporation naturelle temprature ambiante prendrait beaucoup trop de temps, augmentant significativement le risque de contamination. Pour pallier ces deux difficults, on recourt souvent la lyophilisation qui consiste congeler la suspension microbienne puis placer le matriel gel en dpression afin d'liminer l'eau par sublimation. On obtient ainsi une poudre qui peut se conserver temprature ambiante sans difficult. Ce qui reprsente un net avantage par rapport aux processus bass sur le froid.
N. B. : Plus de dtails sur les techniques de conservation par le froid et par dshydratation seront donnes dans la deuxime partie du cours.

1.2. LE SUBSTRAT
1.2.1. FONCTION
En microbiologie industrielle, le substrat dsigne la matire sur ou dans laquelle se dveloppe la biomasse. C'est du substrat que celle-ci tire tous les lments ncessaires sa croissance et/ou ses productions. Ds lors, il s'agit de bien concevoir celui-ci afin que pendant toute la dure de la fermentation la biomasse dispose de tout ce dont elle a besoin. Tout en tenant compte de l'aspect conomique vu que le substrat peut reprsenter de 25% 70% du cot total d'un processus de fermentation [1].

1.2.2. CRITERES DE CHOIX


Le choix d'un substrat en vue d'une bioproduction dpend avant tout de l'objectif de celle-ci. Ainsi, il est clair que dans le cadre d'une prculture de "recupration" d'une souche mre stabilise, on choisira un substrat parfait tous points de vue, sans trop se soucier de son prix ; rciproquement, en production industrielle, c'est le cot qui sera pris en compte prioritairement, vu les quantits ncessaires. Par ailleurs, dans le cas de bioconversions, le substrat est impos et la biomasse n'intervient que pour le modifier. Ainsi en est-il du compostage et/ou de la mthanisation de dchets organiques, de l'ensilage (substrat = vgtaux divers), de l'puration biologique des eaux (substrat = eaux d'gout), de la production de yogourt (substrat = lait),

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1.2.2.1. Composition chimique


1.2.2.1.1. Aspect qualitatif De par sa fonction - fournir les lments ncessaires la croissance et aux productions de la biomasse - c'est avant tout la composition chimique qui dtermine les performances d'un substrat ou l'autre.
N. B. : Rappel (cfr : Microbiologie applique [AA1]) : le substrat doit apporter les lments majeurs (vitaux) que sont C, H, O, N, P et S ; des lments mineurs (ncessaires pour un mtabolisme dynamique, mais non vitaux) tels que Ca, Mg, K, ; des oligolments (ncessaires mais en quantit trs faible vu leur rapide toxicit en cas d'excs) tels que Fe, Cu, Zn, ; des substances de croissance (molcules organiques que la biomasse est incapable de synthtiser elle-mme) telles que vitamines, enzymes,

Parmi les lments majeurs, H et O interviennent de faon spcifique. Ainsi une certaine quantit d'H2O doit imprativement tre mise disposition des microorganismes, d'une part ; et le pH, qui exprime la concentration en H+, doit lui aussi se situer au niveau de l'optimum de la biomasse. La rgulation de ces deux paramtres est ds lors indispensable en vue d'une productivit maximale. Toutefois, le problme de l'accs l'eau ne se pose que dans le cas de substrats solides (cfr. 1.2.2.2). La forme chimique sous laquelle tel ou tel lment est fourni revt galement une importance capitale. Ainsi, titre d'exemple, la source de carbone organique la plus accessible est le glucose, alors que d'autres sucres ne peuvent tre mtaboliss que par certains organismes et pas par d'autres (ex : diffrence entre coliformes [capable de fermenter le lactose] et non coliformes chez les entrobactries). Plus fondamental encore, un tre vivant htrotrophe doit disposer de C sous forme organique alors qu'un autotrophe peut synthtiser ses molcules carbones partir de C minral (CO2). Le mme genre de considration peut tre dvelopp propos des formes des autres lments chimiques (ex : accs N partir de NH4+ ou de NO3-, ). 1.2.2.1.2. Aspect quantitatif Outre la nature des substances fournies la biomasse, la concentration de chaque composant du substrat influence galement le taux de croissance de la population. La relation entre cette concentration et le taux de croissance est exprime par l'quation de Monod :
= max S Ks + S

= taux de croissance spcifique un moment donn max = taux de croissance maximum (atteint en phase exponentielle de croissance)

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S = concentration en substrat Ks = concentration en substrat au moment ou vaut la moiti de max

Cette quation se reprsente par la courbe ci-contre. On voit qu'il existe une concentration critique en substrat en dessous de laquelle le taux de croissance maximum ne peut tre atteint et au del de laquelle un apport supplmentaire n'induit aucune augmentation de la vitesse de croissance.

max/2

N. B. : L'quation de Monod et la courbe S critique Ks qui la reprsente ne sont pas applicables de faon universelle. En source : http://userpages.umbc.edu/~sahuja1/4.html effet, l'excs de certaines substances peut avoir un effet inhibiteur et donc Figure 2 : Courbe de Monod faire diminuer le taux de croissance. C'est en particulier le cas des sucres qui, forte concentration, rendent le milieu hypertonique (pression osmotique suprieure celle du cytoplasme) d'o perturbation de l'activit cellulaire.

Dans l'quation de Monod apparat une constante - Ks - dfinie comme tant la quantit de substrat qui permet d'atteindre un taux de croissance gal la moiti du taux de croissance maximal. Cette constante est spcifique d'une population microbienne donne mtabolisant un substrat donn. Par ailleurs, la loi de Liebig (ou loi du facteur limitant) est d'application ici aussi. Pour rappel cette loi stipule que c'est le facteur qui est le premier en quantit insuffisante (en l'occurrence, dont la concentration est infrieure la concentration critique) qui limite les performances d'un systme. Il n'y a donc pas de compensation d'une carence en un lment par l'abondance d'un autre. Il suffit qu'un lment soit carenc pour que le substrat ne permette pas un fonctionnement optimal de la biomasse. En outre, il est vident que le substrat ne doit pas apporter d'lments inhibiteurs susceptibles d'empcher une activit normale de la biomasse. C'est pourquoi il est parfois ncessaire de le corriger afin d'en extraire telle ou telle substance. Ex : prcipitation des mtaux lourds d'un effluent industriel liquide avant de l'introduire dans les bassins biologiques d'une station d'puration. Enfin, il faut garder l'esprit que la solubilit des lments chimiques dans l'eau est limite et dpend bien sr de leur nature mais aussi de la temprature et de la pression. Cette limite peut induire des difficults pour assurer une alimentation suffisante lorsque la biomasse est trs avide d'une substance dont la solubilit dans la phase aqueuse est faible. C'est en particulier le cas pour l'O2 dans les cultures d'organismes arobies. On rencontre le mme genre de problme lorsqu'on veut induire la bioconversion d'une molcule peu soluble dans l'eau.

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1.2.2.2. Structure physique


Fondamentalement, le substrat peut se prsenter soit sous forme solide, soit sous forme liquide. Mais mme dans le premier cas, ce n'est qu'en solution aqueuse que les nutriments sont accessibles aux microorganismes car ceux-ci ne s'alimentent que par absorption au travers de leur membrane. Dans le cas d'un substrat liquide, la phase aqueuse tant prpondrante, et les microorganismes tant en suspension dans celle-ci, la structure physique du substrat n'induit aucune difficult. Par contre, s'il est solide, il faudra rester attentif deux limites potentielles : la disponibilit de l'eau (Aw) d'une part et l'accessibilit de la biomasse au substrat d'autre part.
N. B. : Dans le cas des substrats solides, la rgulation de l'activit de l'eau (Aw) se limite prvoir un systme d'arrosage en cas de risque de dshydratation et, rciproquement, il est conseill de protger le substrat vis--vis d'inondations, pluviales ou autres. Une inondation n'agit pas tellement sur l'Aw, mais risque de refroidir l'environnement local et/ou de favoriser une compaction du matriau entranant un danger d'anarobiose, voire de lessiver certains lments utiles.

Enfin, le transfert - et plus particulirement la vitesse de transfert - des lments nutritifs de la phase solide vers la phase aqueuse sera d'autant meilleur que l'interface entre celles-ci sera plus important. C'est pourquoi le substrat doit tre broy afin d'augmenter sa surface volumique.

1.2.2.3. Cot
Vu l'importance du cot du substrat dans le prix de revient des bioproductions (25 70%), au niveau industriel, on cherche exploiter des produits bon march, tels que des dchets agricoles (fumiers et lisiers pour la production de biogaz) ou des sous-produits de l'industrie alimentaire (mlasses, lactosrum, amidon, ). L'essentiel demeure l'apport d'une source d'nergie - sucre le plus souvent - et d'une source suffisante d'azote et de phosphore, partant de l'ide que les autres lments seront vraisemblablement amens vu l'origine agricole et donc biologique du matriau. Il reste cependant parfois ncessaire de corriger la matire de base afin de la rendre compatible avec une activit microbienne : rectification du pH, apport d'un complment azot, de substances de croissance, Par contre, lorsqu'il s'agit de rcuprer une souche-mre ou de multiplier des souches fragiles, la priorit est accorde l'adquation entre les exigences de la biomasse et les proprits du substrat. L'aspect conomique devient secondaire ce niveau.

1.2.3. STERILISATION
Si on utilise une biomasse spcifique, il est absolument ncessaire de striliser l'installation de fermentation et le milieu de culture. En effet, des contaminants diffrents de la souche normalement exploite risquent de concurrencer celle-ci dans l'utilisation du substrat, voire de produire des mtabolites non dsirs.
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Or vu son origine, le substrat brut doit tre considr comme potentiellement charg d'une population microbienne diverse qu'il convient donc de dtruire avant l'ensemencement. Il en est de mme d'un substrat synthtique puisque ses composants, et en particulier l'eau ncessaire pour sa reconstitution, ne sont pas striles. Les techniques de strilisation seront dcrites plus loin (cfr. deuxime partie du cours). Habituellement ce sont les traitements thermiques qui sont employs ici. Ceux-ci peuvent cependant altrer certains constituants du substrat (sucres, acides amins, protines, vitamines, ). Dans ce cas, on strilisera, en vrac et par la chaleur, le substrat de base, et on lui ajoutera - aseptiquement - une solution des lments thermosensibles striliss par filtration.
N. B. : Lorsque le substrat amne lui-mme la flore microbienne ncessaire, il va de soi que la strilisation ne se justifie pas, au contraire. C'est le cas, par exemple, de l'puration des eaux uses, du compostage, de l'ensilage, de la vinification naturelle,

1.3. LAIR
1.3.1. FONCTIONS
Dans certaines bioproductions, de l'air doit tre apport afin de rpondre aux exigences mtaboliques de la biomasse. En fait, l'air amne l'oxygne que les microorganismes utilisent comme accepteur final d'lectrons dans leur mtabolisme nergtique. Ceci concerne donc des cellules arobies ou arobies - anarobies facultatives. Certaines de ces dernires pouvant adopter un comportement diffrent selon qu'elles disposent ou non d'O2. Par contre dans le cas o la biomasse est anarobie stricte, il s'agit au contraire de veiller empcher tout apport d'oxygne. Dans certains cas, l'oxygne apport est utilis comme lment constitutif des molcules. Il intervient alors comme lment nutritif dans l'anabolisme et non plus dans le catabolisme li la production d'nergie. L'injection d'air dans un bioracteur peut aussi avoir un rle non biologique : entranement du CO2 produit par les respirations et/ou fermentations voire simplement homognisation douce du contenu.
N. B. : Le fait que le gaz introduit ou produit dans le racteur puisse entraner vers l'extrieur certains lments de son contenu impose de le striliser galement la sortie. C'est en particulier le cas lors de culture d'organismes pathognes.

Quelle que soit sa fonction, il va de soi que cet apport gazeux ne peut en aucun cas perturber l'activit de la biomasse. En particulier, si ncessaire, il doit tre strilis afin d'viter toute introduction de microorganismes parasites. Cette strilisation s'effectue soit par traitement thermique (coteux en nergie), soit, plus couramment, par filtration.
N. B. : Si le substrat n'est pas lui-mme strile et/ou si on n'exploite pas une biomasse particulire, il est vident que la strilit de l'air ne doit pas tre assure. C'est par exemple le cas en puration des eaux.

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1.3.2. BILAN
Satisfaire les besoins en oxygne d'une population microbienne n'est pas chose aise. En effet, si on compare la demande en O2 la quantit disponible, on s'aperoit qu'il existe un foss entre ces deux donnes. O2 peut donc constituer un facteur limitant grer prioritairement pour optimiser la production.

1.3.2.1. Demande en oxygne (OUR)


La demande en oxygne dpend principalement des caractristiques de la biomasse et de l'effectif de celle-ci. L'intervention de la biomasse est exprime par le QO2 (taux d'assimilation spcifique d'O2) qui correspond la quantit d'O2 consomme au cours d'une fermentation par unit de biomasse et par unit de -1 -1 temps (mmole x gr x h ). Sa valeur est bien entendu fonction de la nature du microorganisme (espce) mais galement de son tat physiologique. Dans l'hypothse d'une fermentation en batch4, ce dernier dpend de la phase de la courbe de croissance dans laquelle la population se trouve. La demande biologique totale en oxygne (OUR en anglais pour Oxygen Uptake Rate) peut donc s'crire QO 2 X , avec X exprimant l'effectif microbien.
N. B. : Indpendamment de toute activit biologique, le substrat peut lui-mme tre consommateur d'oxygne s'il est fortement rduit et aisment oxydable. La demande en oxygne pour des oxydations non biologiques est considre comme ngligeable dans la plupart des fermentations faisant appel un substrat standardis. Ce n'est pas toujours le cas (cfr. : diffrence entre DBO5 et DCO en puration des eaux).

Le graphique suivant reprsente l'volution des principaux paramtres lis la demande et l'offre d'oxygne dans le cas d'une fermentation en batch dans un racteur ar.
[O2] [Cellules] KlaC* X CL

QO2X

QO2

temps

Figure 3 : Evolution des paramtres d'aration durant une culture en batch

On dit qu'une fermentation s'opre en batch, lorsque tout le substrat ( l'exception de O2) est apport en une fois. Il n'y a donc ni renouvellement du substrat ni extraction des produits en cours de raction.
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A titre indicatif, le tableau suivant donne quelques valeurs de QO2.


QO2 Concentration mmole/g cellules x g cellules / L heure Aspergillus niger 3,0 10 Penicillium chrysogenum 3,9 10 Saccharomyces cerevisiae 7,7 10 Escherichia coli 10,8 10 Tableau 2 : QO2 de quelques espces microbiennes [1] Microorganisme QO2 X mg / L * minute 16,0 20,8 41,1 57,6

1.3.2.2. Offre d'oxygne (OTR)


L'offre d'O2 est assure par l'injection d'air, voire d'oxygne pur, dans le racteur. Toutefois, deux difficults majeures interviennent : d'une part la faible solubilit de l'oxygne dans l'eau qui limite la quantit disponible un moment donn, et d'autre part l'existence de plusieurs facteurs qui ralentissent le transfert des molcules d'O2 vers les cellules. On peut illustrer l'cart entre demande et offre d'oxygne par un exemple chiffr. Tenant compte d'une solubilit d'O2 dans l'eau de l'ordre de +/-8 ppm (8 mg/L) aux tempratures habituelles d'incubation (20 - 30 C) et en se rfrant au tableau 2, ci-dessus on constate que les besoins en O2 pour une minute de fermentation dpassent largement la quantit disponible. Cela signifie que sans aration, il faut moins d'une minute une culture concentre 10 g de biomasse par litre pour consommer tout l'oxygne du racteur. Ajoutons que le fonctionnement de la biomasse sera perturb bien avant que l'anoxie ne s'installe puisque l'oxygne intervient comme facteur limitant ds que sa concentration est infrieure la concentration critique (cfr. : quation de Monod, avec O2, comme substrat). Le premier problme concerne donc la solubilit de l'O2 dans la phase aqueuse du substrat. En effet celle-ci est assez limite et d'autant plus faible que la temprature du substrat est leve. Or la plupart des fermentations industrielles utilisent des biomasses msophiles voire thermophiles, et on privilgie toujours la rgulation thermique en vue de maintenir la flore son optimum de temprature. Le tableau suivant donne quelques valeurs de la solubilit de l'oxygne dans l'eau pure. Il est tir de http://www.protec-traitement.com/22_Solubilite_de_l'oxygene.htm. T ( C) 10 15 20 25 30 35 37 40 45 50 Solubilit O 2 (mg/L) 11,25 10,06 9,09 8,26 7,49 6,91 6,70 6,41 5,94 5,50

Tableau 3 : Solubilit d'O2 dans l'eau en fonction de la temprature

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Par ailleurs, le substrat n'est pas de l'eau pure, et la prsence de soluts (lments nutritifs) diminue encore la solubilit de l'oxygne. Ds lors, Il s'agit de mettre en uvre des techniques permettant d'apporter suffisamment d'O2 la biomasse malgr la faible quantit susceptible d'tre "stocke" (solubilise) dans la phase aqueuse. Comme il n'est pas possible de jouer sur le "stock" disponible, c'est sur la vitesse de renouvellement de celui-ci qu'il va falloir travailler. Le paramtre qu'il s'agit ainsi de maximiser n'est donc plus la solubilit d'O2 dans le substrat, mais bien le taux de transfert de l'oxygne de la phase gazeuse (les bulles d'air injectes dans le substrat) vers les cellules. C'est ici qu'intervient la deuxime difficult. En effet, pour qu'un atome d'oxygne soit utilisable par une cellule, il doit se trouver l'endroit o il est ncessaire, c'est--dire dans le cytoplasme. Or, au dpart, cet atome est inclus dans un mlange de gaz (l'air, qui contient galement N2, CO2, ) formant une bulle au sein de la phase aqueuse du substrat. Entre l'intrieur de cette bulle et l'intrieur de la cellule, voire de la mitochondrie si O2 intervient dans la respiration d'un eucaryote, toute une srie de barrires ralentissent le transfert. Le schma ci-dessous, inspir de SCRIBAN ([2]), reprsente cette succession d'entraves au transfert. On y identifie 6 tapes qui sparent la molcule de dioxygne incluse dans la bulle d'air du site d'utilisation de l'atome d'oxygne (cytoplasme, mitochondrie ou membrane). Ainsi, entre la bulle d'air et l'eau existe un double film gazeux (1) et liquide (2) qui, dans une certaine mesure, s'oppose au transfert. La solubilisation d'O2 dans l'eau a t discute plus haut et la diffusion des molcules n'est pas instantane, ce qui constitue une troisime barrire (3). Au niveau de la cellule on retrouve un film liquide (4) qui constitue l'interface entre le milieu et la biomasse. Passes les enveloppes cellulaires, dont la permabilit n'est pas absolue (5), au sein de chaque cellule, le mouvement (6) d'O2 vers les sites d'utilisation demande aussi un certain temps.

film gazeux (1)

film liquide (2)

film liquide (4)

enveloppes cellulaires (5)

O2

DIFFUSION (3) cytoplasme

site d'utilisation de O (6)

bulle d'air

Figure 4 : Les entraves au transfert de l'oxygne

Tenant compte des considrations prcdentes, on admet l'quation suivante dC pour exprimer la vitesse du transfert ( L ) d'un gaz vers un liquide : dt

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dC L = K L a C * CL dt

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)
[M][L]
-3 -3

C = concentration en gaz dans la phase liquide saturation -1 (mmole x Litre ) CL = concentration en gaz dans la phase liquide au temps t (mmole x Litre ) KL = coefficient de transfert (spcifique du gaz et du liquide) (cm/h) a = superficie de l'interface gaz-liquide (cm/cm) [L] [L]
2 -3 -1

[M][L]

[L][T]

-1

Ce taux (vitesse) de transfert s'exprime en mmoles x Litre-1 x heure-1 ([M][L]3 [T]-1) et est couramment dsign par l'abrviation OTR (Oxygen Transfert Rate). On voit qu'il sera d'autant plus lev que la concentration du gaz sera loigne de la saturation. Rciproquement il sera nul saturation (C* = CL C* - CL =0), ce qui est logique. Le KL tant une constante typique de la situation tudie, il n'est pas possible d'agir dessus. Il reprsente en fait la vitesse avec laquelle les molcules de gaz peuvent traverser l'espace qui les spare du liquide. Cela fait rfrence aux barrires mentionnes plus haut. Par contre on amliore le taux de transfert en maximisant l'interface gaz-liquide (a). Pour ce faire, il s'agit d'injecter le gaz de faon ce qu'il se forme des bulles de taille rduite. En effet, dans ces conditions, pour un volume donn de gaz, la surface est leve. a exprime donc la surface volumique du gaz. Concrtement, il n'est pas possible de distinguer ni de mesurer sparment le KL et le a. Ces deux facteurs sont donc tudis de faon combine - notion de KLa et caractrisent globalement chaque systme de transfert de gaz, en incluant la nature du gaz et du liquide, le type d'injection, le type d'agitation et les caractristiques morphologique du racteur de mlange. Diffrentes mthodes permettent de dterminer le KLa d'un fermenteur (cfr. : infra et cours d'informatique industrielle pour l'valuation du KLa pour l'oxygne). Par ailleurs, dans le cadre de l'alimentation d'une biomasse consommatrice d'oxygne, O est assimil au fur et mesure de sa solubilisation. Cette assimilation est exprime par le QO2 x X (OUR). Le taux de transfert global - qui reprsente la vitesse de variation de la concentration en O2 dans le substrat - devient alors
dC L = K L a C * C L QO2 X = OTR OUR dt

Au vu de cette formule, on comprend que l'apport d'oxygne ne doit pas ncessairement tre constant tout au long d'une fermentation. En effet, comme cela a t expliqu plus haut, le terme QO2X varie au cours de celle-ci (cfr. : Figure 3 : Evolution des paramtres d'aration durant une culture en batch). En fait le premier terme du second membre de l'galit reprsente les variations (positives) de la concentration en O2 dues l'injection d'air dans le racteur ; tandis que le second terme dsigne les variations (ngatives) lies l'assimilation d'O2 par la biomasse.

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A l'aide de cette quation, on peut calculer diffrentes donnes spcifiques de la fermentation en cours. Cela suppose de disposer de sondes oxygne permettant de mesurer la concentration en O2 dissous (CL) tout moment. Ainsi, via un essai relativement simple (dynamic gassing out) on peut obtenir les valeurs de l'OUR et du KLa. Cela se droule durant une fermentation (phase exponentielle) et on opre en deux temps (cfr. : Figure 5 : Essai de mesure du KLa et du QO2X, ci-dessous) : A) arrt de l'aration (tout en gardant un minimum d'agitation afin de maintenir la biomasse en suspension). L'offre d'oxygne (OTR) est donc nulle et dC L dC L = K L a (C * C L ) QO2 X devient = QO2 X . La sonde enregistre une dt dt diminution linaire de la concentration en O2 (CL) en fonction du temps. La pente de dC L cette droite, qui par dfinition est prcisment , correspond donc l'OUR. dt B) reprise de l'aration et de l'agitation dans les conditions pour lesquelles on veut mesurer le KLa. La sonde enregistre alors une croissance +/- rapide de la concentration en O2. Celle-ci n'est pas linaire mais la pente de la tangente la dC L courbe obtenue n'est autre que , par dfinition. dt
dC L = K L a C * C L QO2 X et obtenir dt 1 dC L une nouvelle relation : C L = + QO2 X + C * . Il s'agit de l'quation d'une droite K L a dt 1 dont la pente n'est autre que et qui apparatra sur un graphique dans lequel KLa dC L on porte en abscisse les valeurs de + QO2 X et en ordonne celles de CL dt

Par ailleurs, on peut transformer

[O2] = C

CL

Reprise de l'aration

Arrt de l'aration

Figure 5 : Essai de mesure du KLa et du QO2X


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2. LE BIOREACTEUR
2.1. DEFINITION
D'une manire trs gnrale, un racteur est l'endroit o a lieu une raction. Plus concrtement il s'agit de l'enceinte physique, la cuve, dans laquelle une ou plusieurs ractions interviennent. On parle donc de racteurs tant en industrie chimique (ractions chimiques) que dans le cadre de la biochimie (ractions enzymatiques). Et lorsque la raction est initie par un organisme vivant, on utilisera plus spcifiquement le terme de "bioracteur"5. C'est donc au sein du bioracteur que se ralise la transformation du substrat en biomasse et produits (mtabolites), selon lquation : Substrat + Biomasse = (Biomasse)n + Mtabolites + Rsidus de substrat. L'utilisation des nutriments du substrat par la biomasse lui permet de se maintenir en vie et de se multiplier. Cette activit mtabolique, comme beaucoup de ractions chimiques, gnre cependant, outre les produits normalement attendus (les lments constitutifs de la cellule) des sous-produits inutiles que la cellule accumule dans son cytoplasme (endotoxine, endoenzymes,...) ou rejette (exotoxines, exoenzymes, CO2, ...). Ce sont les mtabolites (endo et exo mtabolites), que l'on qualifie de primaires ou secondaires selon qu'ils drivent d'un mtabolisme primaire (= normal = en conditions optimales) ou secondaire (= anormal = en conditions non optimales [carence en substrat, accumulation de produits, conditions cologiques insatisfaites]).
N. B. : Des molcules considres comme "inutiles" pour la cellule peuvent bien entendu tre extrmement utiles pour la production industrielle Pensons, par exemple, l'thanol issu du mtabolisme secondaire de certaines levures !

2.2. FONCTION : HOMOGENEISATION


Le bioracteur doit favoriser au maximum les bio-productions, qu'elles portent sur la biomasse (ex. : levurerie, production de bactries pour enrobage de semences [P.G.P.R., Rhizobium spp, ...], ou des fins thrapeutiques [Bacillus thermophilus, Bifidus spp, Saccharomyces spp ...]), ou sur les mtabolites (ex. : production d'alcool, d'acides actique, lactique, butyrique, d'enzymes, d'antibiotiques, ...). Pour ce faire, il s'agit d'assurer un contact parfait entre les diffrentes phases en prsence afin de maximiser les possibilits d'changes entre elles :
5

transfert gaz liquide : solubilisation de l'oxygne de l'air dans le substrat ; transfert liquide gaz : dsorption du substrat (CO2 et autres gaz dissous) ; transfert liquide solide : assimilation des nutriments et de l'O2 en solution dans le substrat (liquide) par les cellules (solides) ; transfert solide liquide : dissimilation des exomtabolites des cellules vers le substrat.

synonyme : racteur biologique, fermenteur, digesteur. N. B. : le terme "digesteur" est souvent employ pour dsigner les racteurs anarobies
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On peut considrer, en effet, que le contenu du racteur se scinde en trois, voire quatre, parties de natures physiques diffrentes. On a ainsi habituellement : une phase liquide qui correspond initialement au substrat mais dont la nature chimique, et, partant, les proprits physico-chimiques (pH, viscosit,...), voluent au cours du temps. Par exemple, on assiste un enrichissement progressif en produits conjointement un appauvrissement en lments nutritifs. Cette phase liquide consiste le plus frquemment en une solution aqueuse. Dans certains cas cependant (cas des racteurs dits "biphasiques") elle est compose de deux ou plusieurs liquides non miscibles, ce qui rend l'homognisation encore plus malaise. une phase solide en suspension dans la partie liquide et qui est constitue principalement par la biomasse (cellules). Celle-ci a spontanment tendance s'agglomrer (floculation = formation de "flocs") et sdimenter ou flotter. Ces trois comportements nuisent l'efficacit de la raction car dans ce cas l'interface biomase-substrat diminue. D'autres particules que les cellules vivantes peuvent parfois apparatre dans le substrat (rafles, ppins en vinification, particules de CaCO3 lorsqu'on tamponne le milieu la chaux, ...). une phase gazeuse qui comprend d'une part les gaz de fermentation si le processus est gazogne (CO2 en fermentation alcoolique ou en respiration arobie, biogaz de la mthanisation, ...) et d'autre part l'air ou l'oxygne pur destin apporter l'O2 ncessaire aux micro-organismes arobies, ou un autre gaz en vue de maintenir la biomasse en suspension si elle est anarobie stricte. (dans le cas des racteurs cellules immobilises, on peut ajouter un quatrime lment dans le racteur : le support sur ou dans lequel les cellules sont fixes.)
N. B. : Il existe des situations o le substrat est solide. La phase aqueuse se limite alors aux zones proches des lments solides. La prsence d'eau est nanmoins toujours ncessaire.

Malgr cette complexit du contenu du racteur, il s'agit imprativement de maintenir en permanence les conditions les plus favorables la production par les microorganismes. Or celles-ci varient tant dans l'espace que dans le temps. En effet, la consommation du substrat et la production de mtabolites et de cellules s'effectuent l o se trouvent les cellules. Et si celles-ci tendent sdimenter dans le fond du racteur ou flotter en surface, l'activit mtabolique se limitera ces zones. Sans un minimum d'agitation on risque ds lors rapidement de constater, localement, des carences en substrat et/ou des accumulations de produits, incompatibles avec une production optimale.
N. B. : Lorsque les cellules sont immobilises sur ou dans un support, l'"agitation" consiste faire en sorte que le substrat s'coule rgulirement sur le film de cellules. Il y a de ce fait la fois un renouvellement permanent des nutriments proximit des cellules et un entranement des mtabolites.

Paralllement, le mtabolisme induit une volution au cours du temps des conditions de vie au sein du racteur. Ceci est galement li la consommation progressive du substrat et la production de mtabolites et de cellules. Or ces activits sont elles-mmes directement sous la dpendance des caractristiques du substrat et de l'environnement dans lequel se passent les ractions. Il est donc
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impratif d'assurer durant toute la dure de la fermentation le maintien un niveau optimal de tous les paramtres de fonctionnement des cellules. D'o l'importance des systmes de rgulation.

2.2.1. HOMOGENEISATION SPATIALE : AGITATION


N. B. : Les notions dveloppes ci-dessous ne concernent que les racteurs dans lesquels les cellules sont maintenues en suspension dans un substrat liquide. Comme expliqu supra, aucune agitation n'est prvoir dans les cuves contenant des cellules fixes sur support.

A l'exception du cas de racteurs cellules immobilises, toute inhomognit dans la rpartition des trois phases (L, S, G) risque dentraner localement des carences en substrat ou O2 et/ou des excs de produits, voire des accumulations de chaleur, tous phnomnes incompatibles avec l'activit microbienne. C'est pourquoi il convient imprativement d'homogniser la masse en fermentation. Cette opration, en dispersant les cellules et les bulles de gaz dans l'ensemble du volume mis leur disposition, favorise galement les transferts de matire entre les diffrentes phases. Homogniser consiste en fait provoquer un mouvement entre les trois phases. Ce mouvement relatif entre les trois phases peut tre ralis de diverses manires : agitation mcanique l'aide de pales et contre-pales ou d'hlices ; agitation pneumatique par injection d'air ou de gaz de fermentation ; agitation hydraulique par pompage et recirculation.

Quel qu'il soit, le module d'agitation doit permettre de rpartir uniformment dans le substrat les particules solides (cellules et matires insolubles), les bulles gazeuses (aration et/ou gaz de fermentation), les liquides (substrat ajout, correctifs [acide, base, antimousse], ...), les calories (issues du mtabolisme ou apportes par les entrants). Et ce de faon atteindre partout les conditions optimales de production.

2.2.1.1. Agitation mcanique


La technique d'agitation la plus classique consiste en un systme mont sur un axe central soumis un mouvement de rotation autour de cet axe. La forme des pices en mouvement influence l'efficacit de lagitation car deux impratifs sont respecter. D'une part, s'assurer que tout le volume est rellement agit, et d'autre 6 part, viter dabmer les cellules par effet de cisaillement au niveau des parties mobiles. Diffrents modles d'agitateur sont donc proposs. Les uns induisent un mouvement principalement radial du fluide (mouvement initialement centrifuge), tandis que les autres fournissent un effet axial (mouvement initialement parallle l'axe).

L'effet de cisaillement est la contrainte que subit un objet soumis des forces de sens opposs tangentiellement sa surface. C'est ce que subit une bulle de gaz ou une cellule au contact avec une pale en rotation.
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Agitation radiale

Agitation axiale

contre pale

pale

hlice

Figure 6 : Mouvement du fluide en fonction du type d'agitation

2.2.1.1.1. Agitation radiale Dans le cas des digesteurs ars, on a le plus souvent recours une agitation radiale qui permet une meilleure rpartition des bulles dans le volume et un meilleur transfert d'oxygne vu la faible taille des bulles obtenue grce un effet de cisaillement relativement important. Cela suppose l'utilisation de pales fixes l'extrmit de bras perpendiculaires l'axe du racteur. Diffrentes dispositions de ces pales existent, dont la Figure 7 : Diffrents types de couronne d'agitation radialeprsente quelques exemples (source : http://www.rvb-industries.fr)

Figure 7 : Diffrents types de couronne d'agitation radiale

Par ailleurs, afin d'viter la cration d'un vortex, c'est dire d'un mouvement de l'ensemble du contenu du digesteur sans homognisation relle, il est ncessaire d'installer sur les parois des contre-pales qui, en crant des turbulences, amliorent l'efficacit de l'agitation. De plus, toujours dans l'optique d'optimiser l'homognisation, certains digesteurs sont munis de systme de circulation interne (inner loop reactor). Ceux-ci consistent en structures internes dont la disposition oriente le flux du fluide de faon amliorer le contact entre les phases.
N. B. : Dans le cas d'agitation classique par pales, la hauteur du digesteur impose parfois une trs grande longueur de l'axe de rotation. Auquel cas un risque de torsion et de rupture existent. A ce danger s'ajoute la ncessit d'installer des guides pour maintenir l'axe, lesquels constituent des entraves la circulation du fluide et des sources potentielles d'infection vu les difficults de nettoyage. Ces dispositifs sont nanmoins ncessaires car, pour profiter au maximum de l'effet de l'agitation pneumatique et pour disperser idalement les bulles, l'apport d'air a lieu la base du
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digesteur. Et on a tout intrt disposer d'une srie de pales juste au dessus de la couronne d'amene d'air afin de provoquer un cisaillement maximum des bulles. Ce qui a pour consquence d'augmenter leur surface spcifique en diminuant leur taille. Afin de limiter ces risques lis la longueur de l'arbre, on placera, dans la mesure du possible, le moteur dentranement sous le digesteur. Ce qui allge en outre la partie suprieure de la cuve et libre de l'espace pour installer les sondes de contrle. Par contre la prsence du moteur la base du racteur pose le problme de l'tanchit de la zone d'entre de l'axe d'agitation dans le racteur. Des dispositifs particuliers doivent donc tre prvus cet endroit.

2.2.1.1.2. Agitation axiale L'agitation axiale repose sur la rotation d'une hlice monte sur un axe dispos longitudinalement dans le racteur. Contrairement au cas d'un bateau qui se dplace sur un fluide considr comme immobile, ici, puisque la structure portant l'axe est fixe, c'est le fluide qui est mis en mouvement paralllement celui-ci. Mais le phnomne physique est exactement le mme !

Figure 8 : Diffrents types d'hlices pour agitation axiale

2.2.1.2. Agitation pneumatique (air lift)


Dans les racteurs "pneumatiques", l'agitation rsulte exclusivement du dplacement des bulles de gaz dans le fluide (ex. : "bouillonnement" dans les cuves de fermentations de la bire d au dgagement de CO2, agitation dans un digesteur CH4 par les gaz de fermentation, ...). Dans le cas particulier des digesteurs ars, le dimensionnement des arateurs prsente certaines difficults car il rsulte d'un compromis entre d'un ct la surface volumique des bulles et de l'autre la vitesse ascensionnelle de celles-ci. Le premier paramtre - surface volumique - doit tre maximis de faon obtenir la plus grande surface d'change possible entre la phase gazeuse et la phase liquide (cfr. : 1.3.2.2). En effet, l'oxygne n'est assimilable par les microorganismes que s'il est dissous dans le substrat. Il n'est donc pas accessible sous forme gazeuse. Et plus l'interface gaz-liquide sera tendue, meilleurs seront les transferts. Le second impratif de dimensionnement des bulles - la vitesse ascensionnelle - s'explique par le besoin d'une turbulence suffisante. Or celle-ci exige des bulles de grande taille. L'norme avantage de l'agitation strictement pneumatique provient de l'absence totale de phnomne de cisaillement, gnrateur de traumatisme pour la biomasse.

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Diffrentes technologies, plus ou moins sophistiques, ont t conues : colonnes bulles : Il s'agit de cuves trs allonges et de section trs faible de faon ce que les bulles puissent se rpartir uniformment dans tout le volume. La hauteur de la cuve se justifie par la ncessit de pouvoir disposer de volumes suffisants. Cela prsente en outre l'avantage de permettre un temps de sjour relativement long des bulles dans la phase liquide, ce qui permet une bonne solubilisation de l'O2. bioracteurs boucle : Le principe de ce genre de fermenteur repose sur le mouvement ascendant du fluide provoqu par l'apport d'une grande quantit d'air. En effet, cette aration intense se traduit par une augmentation importante du volume sans pratiquement toucher la masse. Ds lors le fluide ainsi expans tend s'lever puisque sa masse volumique est infrieure celle du fluide non ar. Pour peu que le digesteur soit compartiment, en vue de sparer la zone d'expansion du reste, toute la masse Figure 9 : Bioracteurs airlift : (a) inner va se mettre en mouvement. La loop ; (b) outer loop [2] partie expanse s'levant et la partie plus dense descendant. La compartimentation du digesteur peut tre interne (inner loop airlift reactor) ou externe (outer loop airlift reactor). Dans ce dernier cas, les deux zones communiquent bien entendu par leurs parties haute et basse.

2.2.1.3. Agitation hydraulique (ou "par pompage et recirculation" ou " jet")


L'aspiration du fluide et sa projection brutale dans la cuve peuvent contribuer l'agitation. Cela sous entend une structure en boucle externe puisque la pompe va devoir aspirer le fluide dans une zone externe avant de le projeter avec un maximum de turbulence dans la cuve de fermentation proprement dite. On profitera du passage dans la boucle externe pour apporter l'O2 ncessaire et ventuellement corriger les paramtres du substrat.
Figure 10 : Racteur agitation hydraulique [3]

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2.2.2. HOMOGENEISATION DANS LE TEMPS : REGULATION


L'activit mtabolique au sein du racteur induit une modification permanente des caractristiques de son contenu. En effet, d'une part on assiste la consommation de certains composants du substrat et l'accumulation de divers mtabolites (modification des concentrations), et d'autre part, le caractre exergonique des ractions peut provoquer un chauffement ventuellement incompatible avec la poursuite d'un mtabolisme actif. De mme le maintien d'une teneur optimale en oxygne est loin d'tre acquis vu les difficults de transfert signales prcdemment (cfr. : 1.3.2). Comme, par ailleurs, les performances de multiplication et/ou de production d'un microorganisme dpendent parfois trs finement des conditions dans lesquelles il vit (cfr. : notions de preferendums et d'optimums), il est impratif de maintenir celles-ci constantes et au niveau voulu.

Figure 11 : Bioracteur et boucles de rgulations [2]

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2.2.2.1. Principes lmentaires de rgulation


Afin de satisfaire en permanence les exigences de la biomasse, des systmes de rgulation doivent ncessairement intervenir dans la conception d'un racteur efficace. De tels systmes sont toujours constitus de trois lments, formant ce qu'on appelle couramment une "boucle de rgulation". On y trouve ainsi un capteur (= sonde) qui mesure la situation au sein du systme un moment donn et est capable de la transmettre. Si elle est seule, cette information est quasi inutile puisqu'elle ne fait que constater un tat ; un comparateur : cet lment reprsente la partie "intelligente" de la boucle de rgulation. En effet, sa fonction consiste comparer la valeur mesure par le capteur la valeur souhaite. Cette dernire est qualifie de consigne. En fonction de la diffrence (positive ou ngative) entre la mesure et la consigne, le comparateur envoie un signal l'actionneur, troisime et dernier lment du systme ; un actionneur qui, sous l'impulsion du comparateur active ou dsactive un appareil de correction en vue de rapprocher la situation au sein du racteur de la valeur consigne.

Ces trois actions, qui visent donc minimiser l'cart entre une valeur mesure (ce qui est rellement) et une valeur impose (ce qui devrait tre), constituent un systme dit servo-command ou asservi. Ce dernier peut tre plus ou moins sophistiqu. La technologie de la rgulation est tudie plus en dtails dans d'autres cours. Retenons cependant que le principal problme demeure la vitesse de raction du systme. En effet, entre le moment o la sonde enregistre une valeur anormale et celui o cette donne est corrige, il peut s'couler un certain temps, d'autant plus long que le volume rguler est important. Durant cette priode de correction, qu'elle soit positive ou ngative, les microorganismes sont en situation dfavorable. La dtermination des consignes et la calibrations des sondes sont donc des oprations particulirement sensibles pour un fonctionnement correct du racteur.
N. B. : Les consignes ne correspondent pas ncessairement aux optima de croissance. Elles y correspondront s'il s'agit de produire des cellules ou un mtabolite primaire. Par contre si on vise la production d'un mtabolite secondaire, il sera ncessaire d'adopter des valeurs consignes telles que le microorganisme soit en situation de stress.

En outre, il faut rester conscient que les corrections apportes le sont localement, c'est--dire l o sont injects les correctifs. De la dispersion homogne de ceux-ci dans l'ensemble du volume dpendent aussi les performances du racteur. D'o l'importance de l'agitation dont il tait question au chapitre prcdent.

2.2.2.2. Principales rgulations


Idalement tous les facteurs de production de la biomasse devraient tre rguls. Il est vident que cela est techniquement irralisable. Ds lors, on se base sur la loi des facteurs limitants (loi de Liebig) pour slectionner les facteurs qu'il est indispensable de matriser. Par ailleurs, certaines techniques de rgulation permettent de contrler simultanment plusieurs facteurs. Ainsi, la vitesse de
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rotation de l'arbre d'agitation intervient bien sr dans la qualit de l'homognisation, mais elle peut aussi collaborer l'efficacit de l'oxygnation via le cisaillement des bulles sortant du diffuseur d'air. Quoi qu'il en soit, on ne peut imaginer un processus performant sans un minimum de contrles. En l'occurrence, on rgule la plupart du temps la temprature, le pH, la teneur en O2, et le phnomne de moussage.
N. B. : Avec certains modes de fonctionnement, il arrive que le substrat, ou du moins certains de ses composants, soit rgul. Cela concerne les fermentations de type "fed batch". On rencontre aussi cette situation en fermentation alcoolique. Ainsi, en vinification, si les conditions climatiques n'ont pas permis une accumulation suffisante de sucre dans les grains de raisin, les viticulteurs sont autoriss en ajouter dans le jus avant ou en cours de fermentation. C'est ce qu'on appelle la "chaptalisation". De mme, dans la confection de certaines bires spciales, la "refermentation" en bouteille suppose de rinjecter du sucre avant de poser le bouchon.

2.2.2.2.1. Rgulation de la temprature La temprature est le principal facteur de dveloppement d'une population microbienne. La nature des sondes thermomtriques est trs diverse. Cela va du simple thermomtre, des thermocouples plus ou moins sophistiqus selon la sensibilit de la biomasse, ... et les budgets. Quant la correction, elle s'opre selon deux techniques principalement : le serpentin ou les doubles parois. Le principe de base est toujours de faire circuler l'intrieur de ceux-ci, et donc proximit du substrat, une quantit d'eau froide ou chaude, voire de vapeur, destine respectivement prlever ou fournir des calories. Dans les digesteurs modernes c'est en gnral la deuxime solution qui est retenue car le serpentin prsente le double inconvnient d'une part d'occuper du volume dans le digesteur et de perturber ainsi l'homognisation, et d'autre part d'tre difficilement nettoyable.
N. B. : Pour de faibles volumes, on emploie parfois des techniques plus simples, telles qu'une rsistance lectrique la base du racteur ou des baffles immerges dans le substrat et l'intrieur desquelles circulent de l'eau chaude ou froide,

Enfin, comme le but de la rgulation thermique consiste maintenir la temprature au niveau de l'optimum biologique, et que par ailleurs la plupart des biomasses utilises en biotechnologie sont de type msophile ou mme thermophile, on est la plupart du temps amen chauffer le digesteur en dbut de fermentation. Toutefois, lorsque l'activit mtabolique est enclenche (phase exponentielle de croissance), vu la tendance exothermique du systme, il devient impratif de pouvoir refroidir le digesteur. La rgulation thermique doit donc pouvoir s'oprer positivement et ngativement.
N. B. En vinification, on parle du risque de "coup de chaud" lors de la chaptalisation. En effet, l'apport de sucres hautement fermentescibles peut induire un redmarrage brutal de l'activit des levures et un chauffement anormal du mot.

2.2.2.2.2. Rgulation du pH Deuxime critre fondamental du dveloppement et de l'activit microbiens, le pH. Pour rappel, les bactries sont en gnral neutrophiles lgrement
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acidophiles, avec, pour certaines espces, une adaptation gntique des niveaux d'acidit relativement lev (certains Lactobacillus sont encore actifs des pH proches de 5, Thiobacillus ferrooxydans a un optimum de pH aux alentours de 2). Les moisissures et levures par contre sont en gnral plus franchement acidophiles. Concernant les sondes pH, il n'y a rien de spcial signaler si ce n'est que le choix de l'lectrode doit bien sr tenir compte de la nature du substrat, afin d'viter tout risque d'altration. Le maintien d'une acidit constante aux cours du processus peut s'obtenir soit en utilisant un substrat pralablement tamponn, soit en apportant des correctifs (acide ou base) tout au long de la fermentation. Dans le premier cas, la rgulation n'est assure que dans une plage de pH limite et pour autant que les productions d'acides ou de bases ne soient pas excessives. Dans le second cas, l'homognisation du substrat corrig doit tre particulirement efficace pour viter toute accumulation locale du correctif. Ici aussi une rgulation positive et ngative est prvoir car selon l'tat du substrat, un mme micro-organisme peut avoir tendance soit acidifier, soit alcaliniser. C'est ainsi que dans la plupart des cas, le mtabolisme des sucres fait chuter le pH, alors que la dgradation des substances azotes (acides amins et protines) induit l'effet inverse. 2.2.2.2.3. Rgulation de l'oxygne L'aration du substrat, qui conditionne la disponibilit en oxygne pour les micro-organismes arobies, exige aussi un systme rgulateur. Comme expliqu au chapitre 1.3, le transfert d'O2 jusqu'aux sites d'utilisation au sein de la cellule est loin d'tre ais. Et la consommation peut parfois tre extrmement intense, selon la nature de la biomasse utilise et son effectif. C'est pourquoi, la rgulation se limite veiller assurer la saturation en O2 dissous. Ds que celle-ci n'est plus atteinte, les systmes correcteurs sont activs. Ceux-ci peuvent agir sur trois facteurs : d'une part le dbit d'air entrant dans le digesteur, d'autre part la richesse de l'air en O2, et enfin l'intensit de l'agitation. Les deux premiers facteurs apportent un supplment d'O2 via un renouvellement plus rapide (augmentation du dbit d'air) ou via un supplment brut d'oxygne (augmentation de la concentration en O2 du gaz inject), tandis que le troisime favorise la migration de l'oxygne de la bulle de gaz vers le substrat liquide en augmentant l'interface gaz-liquide (action sur le "a" du KLa).
N. B. : Concernant la modulation de la teneur en O2 de l'air, il n'y a en ralit pas de nuance : on utilise de l'air ou de l'oxygne pur.

L'enregistrement de la concentration en oxygne dissous dans le milieu est ralis par une sonde oxygne qui mesure la concentration en O2 via une lectrode ad hoc. Quant la correction elle consistera, comme indiqu plus haut, soit adapter le dbit et/ou la concentration en O2 de l'air, soit moduler la vitesse de l'arbre d'agitation.

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Il est bien sr vident que tout ce raisonnement ne prsente aucun intrt pour les digesteurs anarobies, puisque dans ce cas l'oxygne doit absolument tre banni du processus. 2.2.2.2.4. Rgulation de la mousse Un grand nombre de fermentations gnrent des gaz dont la solubilit dans la CO2, f. mthanique phase aqueuse est limite (ex : f. alcoolique, f. htrolactique CH4 + CO2, ). La respiration arobie fournit galement du CO2. Ces gaz forment des bulles et, selon la tension superficielle de la phase liquide, celles-ci peuvent provoquer la formation d'une mousse plus ou moins abondante. Cette mousse est constitue de petites bulles de gaz entoures d'une fine pellicule de liquide. Ces bulles vont remonter la surface du substrat et s'y accumuler. Toutefois, elles peuvent aussi se fixer par adsorption aux surfaces avec lesquelles elles entrent en contact. C'est pourquoi l'accumulation de mousse au sein d'un digesteur peut provoquer divers problmes. On peut ainsi tre confront des dfauts de strilit, essentiellement lis l'imprgnation des filtres de sortie des gaz. En effet, une fois satur d'humidit un filtre n'exerce plus son action. A fortiori s'il est humidifi par du substrat. Par ailleurs, on rencontre aussi des perturbations dans les rgulations, dues au fait qu'un film de mousse emballe les sondes, ce qui induit des anomalies de lecture. Enfin, les changes gaz - liquide la surface du substrat sont galement modifis par l'cume ainsi forme. Pour pallier ce risque, on dispose une sonde destine dtecter la prsence de mousse dans le racteur. Il s'agit simplement d'un circuit lectrique ouvert plac au dessus de la surface du substrat. L'accumulation de mousse et donc le contact de celle-ci avec la sonde aura pour effet de fermer le circuit lectrique, ce qui induira la mise en route du systme de correction. Celui-ci peut consister en une action mcanique ou physico-chimique. Dans le premier cas, un bras "brise-mousse" fix perpendiculairement l'axe de l'arbre d'agitation tourne rapidement et projette la mousse contre les parois du racteur, o les bulles clatent. Par contre l'intervention physico-chimique consiste injecter un "anti-mousse" dans le racteur. Il s'agit d'une substance tensio-active qui modifie la tension superficielle du liquide et diminue la cohsion entre les molcules de substrat l'interface liquide-gaz. Ds lors, le film liquide qui "emballe" les bulles de gaz est moins solide et celles-ci clatent ds leur sortie du substrat. Toutefois les tensioactifs tendent interagir au niveau de toutes les interfaces, donc aussi entre les cellules et le substrat, ce qui peut induire des difficults d'alimentation et d'excrtion pour la biomasse. De mme la prsence de tensioactifs dans le substrat perturbe galement les transferts d'oxygne.

2.3. TYPES DE BIOREACTEURS


On rencontre essentiellement deux types de racteurs en fonction du fait que la biomasse y est en suspension ou pas.

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N. B. : On peut considrer que les racteurs substrat solide constituent un troisime type, pour lequel les impratifs d'homognit sont toujours d'application, mais dont la technologie diffre trs nettement.

Lorsque les cellules sont en suspension dans un substrat liquide, des oprations destines sparer la biomasse du substrat mtabolis doivent tre mises en uvre l'issue de la fermentation. Celles-ci induisent des cots supplmentaires. C'est pourquoi, afin d'viter ou du moins de limiter les tapes d'aval (downstream process), des technologies permettant de maintenir la biomasse dans la zone de fermentation ont t imagines. On parle alors de racteurs cellules immobiliss ou fixes. Deux modalits d'immobilisation existent : fixation sur un support solide ou confinement dans une enceinte ferme. On qualifie aussi ces racteurs d'htrognes, dans la mesure o la rpartition des phases solide, liquide et gazeuse n'est pas homogne vu la prsence des lments d'immobilisation. Quelle que soit la technologie adopte, les impratifs de contacts optimaux entre les diffrentes phases sont bien sr toujours d'actualit. Mais des diffrences majeures apparaissent. Ainsi, dans les racteurs homognes, pour maintenir la biomasse en suspension, des systmes d'agitation sont absolument indispensables (cfr. : 2.2.1), ce qui n'est pas le cas lorsque les cellules sont fixes dans le racteur. Par contre, dans ce dernier cas, il n'est videment pas possible d'assurer une quelconque homognisation au sein du racteur. Le mlange doit donc tre prvu en amont. Et il en est de mme pour les rgulations. En dfinitive on peut donc considrer deux situations : bio-particules libres et maintenues en suspension dans un substrat liquide d'une part (racteurs homognes), et prsence d'un support immobile sur ou dans lequel sont fixes les cellules, d'autre part (racteurs htrognes).

2.3.1. BIOREACTEURS A BIOMASSE EN SUSPENSION (REACTEURS HOMOGENES)


Comme le nom l'indique, dans un racteur biomasse en suspension, des "units biologiques" sont perptuellement agites de faon optimiser leur interaction avec le substrat et viter toute accumulation locale. Les "units biologiques" en question peuvent tre constitues soit de cellules indpendantes, soit de cellules agglomres entre elles en vue de former un floc, soit de cellules fixes sur un support mobile ou encore des cellules enfermes dans des capsules poreuses. La notion d'agitation (cfr. 2.2.1) revt ici une importance absolument capitale puisque sans elle les particules biologiques auraient tendance sdimenter ou flotter, induisant un dysfonctionnement majeur.

2.3.2. BIOREACTEURS A BIOMASSE IMMOBILISEE (REACTEURS HETEROGENES) 2.3.2.1. Principe


A l'exception des cas de bioconversion pour lesquels il s'agit simplement de transformer le substrat par voie biologique sans vouloir produire spcialement des
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cellules ou des mtabolites (ex : production de yogourt, compostage, ensilage, ) l'utilisation de bioracteurs particules en suspension implique un processus de sparation en aval de la fermentation pour rcuprer soit les cellules, soit les molcules intressantes. Pour viter cette opration, consommatrice de temps et d'nergie, on a imagin d'immobiliser les cellules soit en les emprisonnant dans des matrices de plus ou moins grandes tailles, soit en les fixant sur un support inerte. On parle alors de biofilm pour dsigner l'ensemble de la biomasse fixe sur le support ou la membrane de confinement. Et la quantit de cellules prsentes dans le racteur est directement fonction de la surface disponible, ce qui permet d'obtenir des concentrations cellulaires nettement plus leves que dans le cas des racteurs biomasse en suspension. Dans cette configuration, le mouvement relatif entre substrat et biomasse indispensable pour viter les carences et/ou les accumulations - est obtenu en faisant s'couler le substrat sur la biomasse qui est, quant elle, immobile dans le racteur. Vu cette organisation, on comprend qu'un fonctionnement en continu est beaucoup plus aisment grable que si la biomasse est libre et en suspension. La fixation cellulaire n'est cependant pas toujours applicable car des difficults de transfert de nutriments et particulirement d'oxygne peuvent apparatre. Elles sont causes par l'paisseur du "film" cellulaire, qui empche une bonne diffusion des lments ncessaires aux cellules, ce qui se traduit par un ralentissement du mtabolisme des couches sous-jacentes. De mme lorsque la biomasse est enferme dans une membrane ou intgre dans un gel, la translation des nutriments et des produits aux travers de ceux-ci peut tre ralentie. Enfin, on peut assister des phnomnes de "relargage" (dtachement de la biomasse [ex : autocurage d'un lit bactrien]) qui imposent malgr tout souvent des processus de sparation en aval de la fermentation.

2.3.2.2. Modes d'immobilisation


2.3.2.2.1. Inclusion La technique d'immobilisation de cellules par inclusion consiste enfermer celles-ci dans un gel de polymre permable au substrat et aux produits. Dans ce cas la biomasse est intgre dans le rseau du polymre et est par consquent totalement immobile (ex : inclusion en billes d'alginate). Une fois cette opration ralise, le gel peut tre fractionn afin de fournir des particules de taille choisie que l'on pourra grer exactement comme s'il s'agissait de cellules libres. 2.3.2.2.2. Confinement Le principe du confinement s'apparente celui de l'inclusion en ce sens qu'il s'agit galement d'enfermer les cellules dans le racteur. Toutefois, dans ce cas-ci, seule une membrane permable exclusivement aux molcules de substrat et de produit spare les cellules du substrat. A l'intrieur de la zone dlimite par ce voile, les cellules sont totalement libres, ce qui vite les problmes locaux de diffusion des nutriments et/ou des excrtions.
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La microencapsulation est une application du confinement qui consiste immobiliser dans de petites "capsules" les cellules utiles. On dispose ainsi de particules biologiquement actives dont la gestion peut correspondre celle d'un R. I. M.. L'avantage de la mthode rside, d'une part, dans le fait qu'on dispose ainsi d'entits de plus grande taille (et donc plus faciles sparer de la phase liquide), et que d'autre part, ces microcapsules protgent la biomasse des chocs et de l'effet de cisaillement d lagitation 2.3.2.2.3. Support inerte Ici la biomasse est fixe par adhsion (processus naturel de fixation d'une cellule sur un support via la production de molcules spciales, les adhsines) et adsorption (processus physico-chimique d'attraction entre surfaces) un support inerte minral (argiles, sable, graviers, ...) ou organique (plastiques, frigolite, ). Le substrat est amen par le haut ou par le bas et peut tre recycl dans le racteur en vue d'amliorer le taux de conversion ([P]/[S] = moles de produit par mole de substrat). La technique d'puration des eaux rsiduaires dite "par lits bactriens" est un exemple typique de ce procd. Le support doit bien sr rester absolument neutre par rapport aux cellules. Sa nature et sa conception doivent galement permettre de contenir une quantit de biomasse maximale. A cette fin, deux caractristiques essentielles mritent d'tre prises en considration : la surface spcifique et la rsistance mcanique. En effet, le rendement de la fermentation dpend, entre autres choses, de la surface de contact biomasse-substrat. Et puisque la biomasse est dispose en un biofilm tapissant le support, l'interface biomasse-substrat est d'autant plus grande que le support prsente lui-mme une surface volumique importante. Celle-ci est d'autant plus grande que le support est rugueux et poreux. Cependant le diamtre des pores ne peut pas tre trop rduit car on risquerait alors d'assister un colmatage du support. Celui-ci est provoqu par la croissance de la biomasse. En effet, initialement, celle-ci va se rpartir en une couche monocellulaire sur toute la surface mise sa disposition. Ensuite, tant que les conditions de croissance sont respectes, ce "biofilm" va s'paissir par accumulation de cellules. Ds lors, si deux biofilms placs vis vis se rejoignent, le pore est bouch et le substrat ne peut plus traverser le digesteur. Par ailleurs, pour assurer un rendement lev de production il est ncessaire de prvoir un temps de contact biomasse-substrat suffisant. Celui-ci correspond en fait au temps mis par le substrat pour traverser le racteur de part en part. Il est donc directement fonction de la hauteur, lorsque l'coulement se fait par gravit. Par consquent, dans le cas d'un racteur trs haut, la quantit de support sera telle que les couches basses risquent de subir une pression norme, due au poids la fois du support lui-mme et du biofilm. Le choix de la nature du support devra donc tenir compte de sa rsistance mcanique l'crasement afin d'viter un tassement la base. Ce qui aurait pour effet de bloquer le processus vu la rduction des interstices.

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2.4. MODES DE FONCTIONNEMENT


2.4.1. MODELISATION : R. I. M. ET R. G. C.
Pour tudier thoriquement le fonctionnement d'un racteur biologique, on dispose de deux modles mathmatiques : le Racteur Infiniment Mlang (R. I. M.) et le Racteur Gradient de Concentration (R. G. C.) ou racteur "piston".
N. B. : Ces modles sont utiliss pour dimensionner n'importe quel type de racteur. Cela ne se limite donc pas aux fermenteurs mais peut galement tre appliqu des enceintes dans lesquels se droulent des ractions purement chimiques ou enzymatiques.

Un racteur infiniment (ou idalement) mlang (ou encore racteur mlange complet) est une cuve conue pour qu'en tout point les conditions soient identiques. Autrement dit, quelle que soit la position d'une cellule dans le racteur, ses paramtres de fonctionnement (disponibilit en substrat, pH, Aw, T , [O 2], ) seront les mmes, et si possible optimaux. On comprend aisment que cette contrainte ne peut tre satisfaite que moyennant une homognisation performante. Laquelle dpend de l'efficacit du systme d'agitation (cfr. : 2.2.1). C'est la situation que l'on rencontre lorsque le racteur fonctionne en batch, voire en fed batch (voir infra). Dans un racteur gradient de concentration, au contraire, on considre que les caractristiques voluent selon une direction au sein de la cuve et que dans tout plan perpendiculaire cet axe les valeurs des paramtres sont identiques. D'o la notion d'coulement "piston". Ce genre de situation se rencontre lorsque la biomasse est maintenue dans le racteur alors que le substrat est renouvel continuellement et ne fait donc que traverser le racteur. Il n'y a dans ce cas aucun mlange. Dans cette configuration, on comprend que, suite l'action des microorganismes, les caractristiques que prsente le substrat l'entre du racteur voluent durant sa migration vers la sortie. Ainsi, par exemple, les concentrations en nutriments diminuent tandis que la concentration en mtabolites augmente. Du fait de cette variation des conditions au sein du racteur, on peut supposer que l'tat physiologique de la biomasse dpend de sa position. De mme, si la biomasse est constitue d'un mlange de plusieurs espces, chacune s'installera l o les paramtres lui sont les plus favorables. Par contre, dans une "tranche" du racteur, perpendiculaire au mouvement du substrat, les conditions sont identiques et par consquent les microorganismes actifs ainsi que les ractions y sont identiques. Ce mode de fonctionnement est associ aux racteurs fonctionnant en continu (voir infra).

2.4.2. FONCTIONNEMENT DISCONTINU


Faire fonctionner un digesteur cellules en discontinu consiste mettre en contact la biomasse et le substrat une fois pour toutes. Et arrter le processus lorsque, par puisement du substrat et/ou accumulation de produits, la raction ralentit provoquant une diminution de la productivit7. Dans ce contexte, deux modalits de gestion existent : fermentation en "batch" ou en "fed batch".
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La productivit exprime la quantit de produits fabriqus par unit de temps. Cela correspond la vitesse de production.
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Dans la premire - fonctionnement en batch - l'entiret du substrat est apporte ds la mise en route de la fermentation. Il s'agit d'un procd employ trs couramment car il prsente les avantages de la simplicit et d'un relativement faible cot puisque les investissements se limitent la cuve de fermentation et aux rgulations. L'inconvnient majeur de cette technologie rside dans le risque de rpression catabolique. Il s'agit en fait d'une inhibition par le substrat. On constate, en effet, que l'excs de certaines molcules thoriquement nutritives, comme par exemple le glucose, peut perturber le mtabolisme microbien et induire une diminution du taux de croissance ou la production de mtabolites non attendus. L'exemple le plus document est l'"effet Crabtree" que l'on rencontre chez divers organismes et en particulier chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Chez cette dernire il se manifeste par la production d'thanol en phase arobie, ce qui a priori est anormal. En effet, normalement, en arobiose la levure adopte un mtabolisme respiratoire qui induit la dgradation complte du glucose ; tandis qu'en anarobiose elle entre en fermentation alcoolique. L'effet Crabtree est d la rpression des enzymes respiratoires provoque par l'excs de glucose. Rciproquement, cet arrt de la respiration active le mtabolisme fermentaire qui produit l'thanol. On constate le mme genre de dysfonctionnement mtabolique chez certaines bactries en prsence de trop de glucose, voire trop d'azote. Pour pallier ce problme, on peut amener le substrat progressivement au cours de la fermentation, en adaptant les quantits la biomasse dj forme. Comme la croissance de celle-ci est exponentielle les doses de nutriment doivent crotre dans les mmes proportions. Il s'agit donc de disposer d'un moyen de mesurer aisment et rapidement l'importance de la biomasse. Quoi qu'il en soit, le procd fed batch demeure discontinu puisqu'il n'y a pas de soutirage de produits avant l'arrt de la fermentation.

2.4.3. FONCTIONNEMENT CONTINU


Dans un racteur fonctionnant en continu, il y a un apport permanent ou du moins rgulier de substrat. Bien sr, en contrepartie, une partie quivalente du contenu du racteur doit tre soutire. Deux cas peuvent se prsenter : soit les cellules sont fixes dans le racteur par diffrents moyens (racteur htrognes) ; soit elles sont libres et le racteur est homognis (racteur homogne) de faon ce que la biomasse se rpartisse dans l'ensemble du volume disponible. La premire situation (racteur continu cellules immobilises) relve typiquement du modle R. G. C. dcrit plus haut. La gestion du second cas (racteur continu particules biologiques libres en mlange complet) par contre est beaucoup plus dlicate. En effet, pour obtenir une production stable quantitativement et qualitativement il est impratif de maintenir constant l'tat de la biomasse. Or la concentration en cellules au sein du racteur est influence par deux actions antagonistes : d'une part l'apport continu de substrat stimule la croissance microbienne puisqu'aucune carence ne peut se manifester ; mais d'autre part, cet apport de substrat doit tre contrebalanc par des soutirages, lesquels entranent des cellules et induisent dont une diminution de la concentration. Idalement donc, pour garder un effectif cellulaire constant, il convient de grer le
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digesteur de faon conserver en permanence l'galit entre le taux de croissance -1 ( = nombre de division par unit de temps, en [T ]) et le taux de dilution (D = rapport du dbit [LT-1] d'entre de substrat frais au volume [L] total du digesteur, en [T-1] galement). Dans le cas contraire, si < D on assistera un lessivage (= perte de biomasse) du digesteur car, vu qu'il s'agit d'un R. I. M., la dispersion des cellules est idale et par consquent une partie de celles-ci est entrane lors du soutirage. Or si la croissance microbienne ne permet pas de compenser la disparition de biomasse par soutirage, le digesteur s'appauvrit et son rendement s'en trouve affect. D'autre part, lorsque > D, ce qui signifie que le renouvellement de substrat ne suffit pas satisfaire les besoins de la biomasse, des symptmes de carence apparaissent, entranant un ralentissement du mtabolisme, c'est dire une diminution du . Il y a donc dans ce dernier cas une autorgulation du digesteur puisque la biomasse s'adapte automatiquement aux conditions de fonctionnement. Un digesteur ainsi autorgul est appel chmostat.
N. B. : Il est vident que D doit correspondre au taux de soutirage sous peine de voir la cuve se remplir ou se vider. N. B. : Il est possible de faire fonctionner un racteur particules libres en continu sans trop se soucier de l'quilibre /D. C'est ce qui se passe dans une station d'puration boues actives. Dans ce cas, la sortie du bassin biologique (racteur), un dcanteur permet de rcuprer les cellules. Une partie de celles-ci est alors rinjecte dans le bassin biologique afin de maintenir la concentration constante. N. B. : En recherche en biotechnologie, dans l'optique de modliser le fonctionnement de la biomasse, on a parfois recours au turbidostat. Il s'agit d'un type de digesteur continu particules libres dans lequel l'tat physiologique de la culture est maintenu constant. Ceci est obtenu en mesurant rgulirement la quantit de biomasse prsente de faon la situer dans sa courbe de croissance. Ainsi, en jouant sur la quantit de substrat apporte (via le taux de dilution) on peut conserver les cellules en phase exponentielle ou de ralentissement ou mme en phase stationnaire. L'apprciation de l'effectif de la population microbienne se ralise dans ce cas par turbidimtrie (mesure de la densit optique), d'o le nom de l'appareil.

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3. LAVAL (DOWNSTREAM)
A l'issue de la fermentation, il s'agit bien sr de rcuprer le produit dsir et de le conditionner en vue d'une commercialisation. Toutefois, le contenu du racteur est complexe puisqu'il comprend une phase solide, reprsente par la biomasse et ventuellement d'autres particules, ainsi qu'une (ou deux, dans le cas des racteurs biphasiques) phase(s) liquide(s) dans laquelle (lesquelles) se trouvent en solution divers mtabolites et des rsidus de substrat non mtaboliss. Dans le cas des racteurs htrognes, on peut, en premire approche, considrer que la biomasse reste enferme dans le racteur puisqu'il a t conu pour cela. Ceci se vrifie relativement bien dans le cas d'un confinement par membrane, mais est beaucoup plus alatoire lorsque les microorganismes sont simplement fixs sur un support (problme de relargage lorsque le biofilm devient trop pais). Quoi qu'il en soit, l'exception des cas de bioconversion pure o le produit correspond au substrat modifi et charg de la biomasse (ex : yogourt, choucroute, ensilage, compost, bires non filtres, ), il est quasi toujours ncessaire de procder des oprations de sparation en vue de rcuprer le produit d'intrt. Ainsi, si on cherche fabriquer des ferments, il s'agira de rcuprer des cellules exemptes de rsidus du substrat ; alors que si le produit correspond une molcule particulire (antibiotique, enzyme, ), les cellules constitueront un dchet et il faudra mettre en uvre des techniques parfois trs sophistiques pour rcuprer telle molcule au milieu d'un mlange extrmement complexe. Une difficult supplmentaire concerne les endomtabolites dont la rcupration suppose d'avoir au pralable dtruit les cellules afin d'en extraire le cytoplasme. Lequel devra ensuite tre trait en vue de capter les molcules d'intrt. La complexit des oprations de rcupration et de purification dpend donc essentiellement du type de produit recherch. Ainsi, titre d'exemple, le substrat et la technologie ncessaires pour fabriquer de la bire ou du whisky sont pratiquement les mmes : brassage d'orge malte puis fermentation alcoolique. Pour la bire le procd s'arrte l, quelques nuances prs ; tandis que pour le whisky, comme il s'agit d'augmenter le taux d'alcool, on procdera une distillation. Et si on dsirait fabriquer de l'thanol pur, il conviendrait d'ajouter d'autres oprations de dshydratation, adsorption sur charbon actif,
N. B. : Le raisonnement est identique pour le jus de raisin transformer en vin ou en cognac ; ou le jus de pomme en cidre ou en calvados...

Il est remarquer que lorsque la molcule d'intrt est destine un usage thrapeutique (ce qui n'est pas le cas des produits cits ci-dessus !) les exigences de puret sont infiniment plus draconiennes encore car il faut tout prix viter les risques d'interfrences entre molcules ou de rejet immunitaire (cfr. antibiotiques, antimitotiques, ). Il reste enfin conditionner le produit afin de le rendre commercialisable. Cela implique une stabilisation en vue d'une conservation long terme et temprature
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ambiante s'il s'agit de ferments, ou une dshydratation plus ou moins pousse avec adjonction ventuelle de matires complmentaires (masse, protecteur, ) lorsqu'on fabrique des molcules particulires.

3.1. TECHNIQUES DE SEPARATION


Dans le contexte des tapes relatives la rcupration du produit d'intrt (downsteam process) diffrentes technologies peuvent tre mises en uvre. Except la permation (cfr. : ), aucune d'entre elle n'est spcifique du domaine de la microbiologie industrielle. On les retrouve donc dans de nombreux secteurs industriels tels que le traitement des fumes, l'industrie chimique,

3.1.1. SEPARATION PARTICULAIRE (SOLIDE / LIQUIDE)


La sparation solide / liquide correspond toutes les techniques permettant d'extraire des particules d'un fluide liquide ou gazeux. Au point de dpart, les particules sont en suspension dans le milieu dont on veut les extraire. Deux mthodes principales permettent de parvenir l'objectif d'extraction : leur confrer une force perpendiculaire celle du fluide dans lequel elles se trouvent, d'une part, ou placer un matriau permable au fluide mais impermable aux particules en travers du flux, d'autre part. La premire "philosophie" inclut les techniques de sdimentation, de centrifugation, et d'lectrofiltration8 ; tandis que la seconde fait appel tout ce qui concerne la filtration. D'une faon gnrale, l'efficacit d'une technique s'exprime par le pourcentage de particules d'une taille donne qui peut tre extraite, ou, lorsqu'il s'agit de filtration, par la taille des plus petites particules retenues.

3.1.1.1. Sdimentation
3.1.1.1.1. Principe La sdimentation consiste profiter de l'attraction terrestre pour extraire les particules en suspension. Pour ce faire, afin de permettre aux particules de descendre vers le fond du bassin on introduit le fluide porteur dans une zone la plus calme possible. Il est clair, en effet, que toute turbulence risque de perturber cette chute. En fait, les particules en suspension sont soumises 3 forces, comme le reprsente la figure cicontre : la gravit qui les attire vers le bas, la pousse d'Archimde qui s'exerce vers le haut et les forces de frottement qui s'opposent tout mouvement.

Pousse d'Archimde

Forces de frottement

Particule

Gravit

Figure 12 : Forces de sdimentation


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Electrofiltration : technique d'extraction de particules d'un fluide gazeux qui consiste appliquer aux particules une force lectrostatique en vue de les attirer ultrieurement vers des lectrodes de collecte non charges lectriquement ( la terre).
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Pour assurer l'extraction le temps de sjour dans le bassin doit tre suprieur ou gal au temps de chute de la plus petite particule que l'on dsire liminer. Autrement dit, il faut que la vitesse de chute de la particule soit suprieure la vitesse d'avancement du fluide porteur. On comprend que vu la trs faible masse des cellules, dont la densit est relativement proche de celle du substrat, et vu la viscosit possible de ce dernier, la rsultante des forces qu'elles subissent reste minime voire nulle. Auquel cas, soit le temps de chute est extrmement long ce qui impose des dimensions de bassins gigantesques, soit elles ne sdimentent pas du tout. 3.1.1.1.2. Technologie Vu les contraintes prcises ci-dessus, la technique de sdimentation est trs peu employe pour extraire des cellules. Une seule exception : la clarification des eaux rsiduaires, o le but est de limiter la charge en cellules rejetes sans pour autant chercher les liminer toutes. Et mme dans ce contexte particulier, on est parfois amen amliorer la sdimentabilit des boues biologiques (= les cellules qui interviennent dans le processus d'puration) en provoquant leur agglomration via l'adjonction d'agent floculants. Pratiquement, dans ce contexte on rencontre principalement deux types de dcanteur : les dcanteurs longitudinaux et les dcanteurs circulaires. Dans les premiers le fluide charg de bio-particules est introduit une extrmit du bassin et chemine doucement d'un bout l'autre. Au cours de cette translation, les particules chutent vers le fond o elles s'accumulent. Un systme de raclettes les repousse intervalles rguliers vers une "fosse boues", d'o elles sont pompes vers la suite du traitement. Si le dimensionnement de l'ouvrage a t bien fait, on considre que la concentration en particules de la lame superficielle de liquide est suffisamment rduite. Dans le cas des dcanteurs circulaires, le fluide dcanter entre par le centre de l'ouvrage et en sort en priphrie, via une goulotte de dbordement qui ne rcolte que la partie suprieure du volume. Les particules quant elles sdimentent et s'accumulent dans le fond, o des raclettes les chassent galement vers une fosse boue. Celle-ci est en position centrale vu que le fond du bassin est habituellement en forme de cne renvers.
N. B. : Pour de plus amples informations sur les dcanteurs cfr cours de Technologie de l'Environnement.

3.1.1.2. Centrifugation
3.1.1.2.1. Principes Les principes de base de la centrifugation sont exactement les mmes que pour la sdimentation. La seule diffrence - mais elle est majeure - concerne la nature des forces appliques. En effet, ici la mise en rotation du fluide et de son contenu induit l'apparition d'une force centrifuge qui s'applique aux particules les plus denses et tend les repousser vers la priphrie du systme. Bien entendu, la gravit et les forces de frottement n'ont pas disparu, mais elles deviennent quasi ngligeables par rapport l'intensit de la force centrifuge, qui dpend de la vitesse de rotation et peut atteindre plusieurs milliers de g.
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3.1.1.2.2. Technologie La centrifugation est largement employe en microbiologie industrielle car les appareils peuvent fonctionner en continu et tre striliss automatiquement assez aisment. Ici aussi on distingue classiquement deux modles : les centrifugeuses bols et les centrifugeuses vis. Dans les premires le fluide charg est introduit au centre d'une srie de bols de forme conique qui tournent trs grande vitesse. De ce fait le liquide et son contenu sont mis en rotation et les lments les plus denses, en l'occurrence les bio-particules, sont projets vers l'extrieur o elles sont rcupres, tandis que le liquide pur est repris en zone centrale.

Figure 13 : Centrifugeuses bols : principes et appareil source : http://www.btec.ncsu.edu/learn/dev/downstream

Dans les centrifugeuses vis, le fluide traiter est galement inject en zone centrale, mais la mise en rotation est assure par une vis sans fin. La fraction dense s'accumule donc galement en priphrie du systme, d'o elle est limine en continu.

Figure 14 : Centrifugeuse vis [2]

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3.1.1.3. Filtration
3.1.1.3.1. Principes Les techniques de filtration reposent sur un tout autre principe puisque ce n'est plus la densit des particules qui permet de les extraire mais bien leur taille. En effet, d'une manire gnrale, un filtre est un matriau poreux dont le diamtre des pores autorise ou non le passage des substances qui le traversent, exactement comme un tamis. C'est ainsi que suite l'apparition de nouveaux types de membranes - obtenues par bombardement de voiles totalement impermables l'aide d'lments choisis qui crent des trous (pores) de taille parfaitement dtermine et standardise -, il est possible actuellement de procder de la microfiltration voire de la nanofiltration, ce qui signifie que des particules de l'ordre respectivement du micromtre (10-6 m, taille des cellules procaryotes) voire du nanomtre (10-9 m, taille de certains virus) peuvent tre retenues. Les techniques d'osmose inverse, qui s'apparentent de la filtration puisqu'elles sont toujours bases sur la taille des pores de la membrane qui spare le liquide filtrer du liquide filtr, permettent des sparations encore plus fines, au niveau molculaire.
N. B. : On parle aussi d'ultrafiltration pour dsigner les techniques de filtration membranaires -9 -5 permettant d'extraire des particules, voire des molcules, de tailles comprises entre 10 et 10 m.

L'interposition d'un systme filtrant en travers du flux charg de particules induit cependant des pertes de charges importantes, d'autant plus fortes que la porosit9 du filtre est faible. Pour des filtrations grossires la gravit suffit en gnral pour assurer l'coulement du fluide filtrer (cfr : filtre caf). Mais lorsqu'on vise l'extraction de particules de trs petite taille, il faut ventuellement appliquer une pression en amont du filtre (ou une dpression en aval) (cfr. : microfiltration strilisante de l'eau). Dans ces conditions, la rsistance mcanique du filtre devient un paramtre significatif de ses performances car s'il se dchire sous l'action des contraintes exerces, toute filtration devient videment impossible. Enfin, en ce qui concerne la vitesse de traitement, pour une porosit et une diffrence de pression amont/aval donnes, c'est la surface de filtration qui est dterminante. En effet, si on considre que les pores sont rpartis de faon homogne par unit de surface, plus l'aire filtrante est tendue, plus il y a de pores disponibles et donc plus grande est la quantit de fluide susceptible de traverser le filtre par unit de temps.
N. B. : D'autres facteurs tels que la temprature du fluide, sa viscosit, peuvent interfrer avec l'efficacit d'une filtration. Et il faut bien videment que le matriau filtrant soit totalement inerte par rapport au liquide filtrer.

3.1.1.3.2. Technologies Indpendamment des contraintes dfinies ci-dessus, le principal problme de la filtration est son caractre discontinu. En effet, en filtration classique, dite frontale en ce sens que le flux est amen perpendiculairement au filtre, au fur et mesure que du fluide le traverse, de plus en plus de particules sont retenues sa surface. Cette accumulation progressive de matire en amont du filtre constitue ce
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La porosit d'un filtre correspond au diamtre des pores les plus troits de ce filtre. Autrement dit, cela correspond aussi la taille des plus petites particules qui peuvent tre retenues par ce filtre.
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que l'on appelle le "gteau de filtration". L'paississement de celui-ci finit par colmater compltement l'accs aux pores et par empcher tout passage de fluide. Il est alors ncessaire de "dcolmater" le filtre en inversant le sens du flux. Mais cette opration n'est jamais parfaite, ce qui impose tt ou tard de le remplacer. Il est nanmoins possible d'augmenter la dure de fonctionnement d'un filtre en utilisant la technique de filtration tangentielle. Celle-ci consiste amener le fluide charg des particules liminer, paralllement la surface filtrante. Ainsi, vu le mouvement du fluide, le gteau est dsagrg au fur et mesure de sa formation. Il en rsulte une 10 concentration croissante du rtentat mais, comme le montre la figure ci-dessous, la vitesse de filtration se stabilise sans s'annuler. La diminution de celle-ci en dbut de traitement s'explique par la formation d'une espce de gteau minimal rsultant de l'adsorption des premires particules sur la surface filtrante.

Outre la distinction "filtration frontale" vs "filtration tangentielle", on rencontre aussi deux grands types de filtres selon que l'effet filtrant se limite du tamisage ou fait appel d'autres phnomnes. On trouve ainsi d'une part des filtres "cran" (ou membranaires), et d'autre part les filtres "profondeur". Leurs modes de fonctionnement sont fondamentalement diffrents puisque les premiers se limitent une action de tamisage en surface, alors que les seconds sont volumineux et effectuent la filtration dans toute leur paisseur. Ces derniers sont en fait constitus d'un empilement alatoire de grains (sable, silex ou tout autre matriau) ou de fibres (cellullose, coton [cfr.: les bourres d'ouates utilises en microbiologie comme
Le "rtentat" correspond ce qui est retenu en amont du filtre, en l'occurrence la phase solide ; tandis que le "filtrat" est constitu de ce qui traverse le filtre, savoir la phase liquide (ou gazeuse).
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Figure 15 : Filtrations frontale et tangentielle Source : http://www.jle.com/fr/revues/agro_biotech/ocl/edocs/00/04/17/F2/texte_alt_jleocl00109_gr1.jpg

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bouchon]). Entre ces grains (ou ces fibres) se forment des espaces que la phase liquide ou gazeuse peut traverser. Toutefois vu la disposition dsordonne des lments constituant le filtre, les interstices qui traversent le volume prsentent un diamtre et un profil longitudinal irrguliers. Le diamtre minimal d'un pore donn permettra de capter les particules d'un diamtre suprieur. Tandis que le caractre non linaire du pore est susceptible de faire apparatre des zones mortes o le flux est fortement ralenti, voire nul. Des particules peuvent ds lors se retrouver piges dans ces parties stagnantes du filtre. C'est l'effet de "pigeage" qui s'ajoute celui de tamisage li au diamtre des pores. Enfin, il existe une troisime explication de la filtration en profondeur : l'adsorption. En effet, les pores sont relativement longs et prsentent donc une surface relativement importante. L'adsorption tant un phnomne d'interaction physico-chimique entre surface, il est fort possible que certaines particules du fluide filtrer s'adsorbent sur la surface interne ( l'intrieur des pores) du matriau filtrant. D'une manire gnrale, la filtration profondeur est moins performante que la filtration cran. En effet, non seulement il n'est pas possible de dterminer avec certitude le diamtre moyen des pores d'un filtre profondeur, mais, en outre, tout choc peut entraner la fois une modification des caractristiques des pores et la dsorption d'une partie des particules retenues. A l'oppos, les techniques de fabrication des membranes filtrantes permettent de garantir avec certitude leur porosit efficace. A ce propos, il faut remarquer que, quel que soit le type de filtre, ses performances optimales de filtration ne sont atteintes qu'aprs un certain temps de fonctionnement. En effet, au tout dbut de l'opration des molcules s'adsorbent sur toutes les surfaces internes et externes ce qui provoque un lger rtrcissement du diamtre moyen des pores. Ce n'est qu'aprs cette tape que le filtre acquiert vraiment son efficacit maximale.
N. B. : En filtration membranaire, on parle du "seuil de coupure" pour dsigner la masse molculaire des molcules retenues 90% par la membrane dans des conditions opratoires donnes.

3.1.2. SEPARATION MOLECULAIRE


Lorsqu'il s'agit de rcuprer, l'tat pratiquement pur, une molcule d'intrt (un mtabolite) issue du mtabolisme ou rsultant de la transformation du substrat, de nombreuses techniques parfois extrmement sophistiques peuvent tre mises en uvre. On parle alors de distillation, d'absorption dans un solvant, de chromatographie, d'lectrophorse, Toutes ces mthodes relvent plutt de la chimie que de la microbiologie et sont envisages dans d'autres cours.
N. B. : L'volution technologique fournit aujourd'hui des membranes filtrantes dont la porosit permet une sparation au niveau molculaire.

3.2. PERMEATION
Lorsque la molcule d'intrt est un endomtabolite, elle n'est pas excrte dans le substrat mais reste enferme dans la cellule. Sa rcupration suppose donc de disposer du cytoplasme cellulaire. Ds lors, une fois extraites, les bio-particules devront subir un traitement destin librer leur contenu. C'est l'opration qualifie de "permation", dans la mesure o il s'agit de rendre les enveloppes cellulaires
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permables. On utilise aussi le terme "homognisation" pour dsigner ce traitement. Deux mthodes peuvent tre mises en uvre dans cette perspective. L'une est physique et consiste simplement dchirer les enveloppes cellulaires par voie mcanique. Ceci est ralis soit en soumettant les cellules des chocs violents (homogniseurs billes o les cellules sont introduites dans un rcipient agit et contenant des billes de verre ou mtalliques), soit en forant le passage de la suspension cellulaire au travers d'un orifice plus troit que le diamtre des cellules (homogniseurs pression).

Figure 16 : Homogniseurs : A billes ; B pression [2]

L'autre mthode d'extraction du contenu cellulaire consiste soumettre les enveloppes un traitement physico-chimique (action de la pression osmotique) ou enzymatique susceptible de les dtruire. En gnral les mthodes physiques sont privilgies dans la mesure o aucune molcule supplmentaire, qui devrait tre retire ensuite, n'est ajoute. Une fois la permation effectue, le liquide obtenu (cytoplasme) subira les mmes tapes de purification que celles dcrite en 3.1 en vue de rcuprer le mtabolite d'intrt.

3.3. CONCENTRATION

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Bibliographie

[1] CRUEGER W. & CRUEGER A., Biotechnology : A textbook of industrial microbiology, 2n edition, Sunderland (USA), Science Tech Publishers, 1990 [2] LARPENT-GOURGAU M. & SANGLIER J. J., Biotechnologie : principes et mthodes, Biosciences et Techniques, Doin Editions, 1992 [3] SCRIBAN R., Biotechnologie, Techniques et Documentation, Lavoisier, Paris 1988

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