Validacin de la determinacin de la DQO en la unidad analtica del CEBI

I. Aguilera, S. Rodrguez, R. M. Prez, J. Buzn, M. Camacho Centro de Estudios de Biotecnologa Industrial, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad de Oriente

"

Resumen
La validacin de mtodos de ensayos constituye una premisa para la realizacin de servicios y una garanta de la calidad de los resultados para brindar. En el presente trabajo se realiz una validacin de adecuacin para la determinacin de la Demanda Qumica de Oxgeno (DQO) en el laboratorio analtico del CEBI. La misma consisti en validar el empleo de un termoreactor para el calentamiento de las muestras y dos mtodos de deteccin: espectrofotomtrico y volumtrico. Para ello se determinaron parmetros como linealidad, precisin, exactitud , lmites de deteccin y determinacin. Como resultado del trabajo, se concluye que se pueden emplear ambos mtodos de deteccin para los anlisis de DQO de las muestras que se procesan en el laboratorio, y se logr la validacin de adecuacin para el mtodo de reflujo cerrado y deteccin espectrofotomtrica para la determinacin de la DQO. Palabras clave: validacin de mtodos analiticos, demanda qumica de oxgeno (DQO).

Abstract
The validation of analytical methods assays constitutes a premise for the realization of services and a guarantee of the quality of the results. At presently work is carried out a validation for the determination of the Chemical Demand of Oxygen (COD) in the Analytical Laboratory of the Industrial Biotechnology Center (CEBI). The same one consisted on validating the employment of a termoreactor for the heating of the samples and two detection methods: spectrophotometric and volumetric. They were determined parameters like lineality, precission, accuracy, detection and determination limits. As a result of the work it was concluded that both detection methods can be used for the analyses of COD of the samples that are processed in the analytical laboratory and the validation was achieved for the closed reflux method with spectrophotometric detection for the determination of the COD. Key words: validation of analitycal methods, chemical oxygen demand (COD).

Introduccin
La validacin de procedimientos analticos es un tema de gran importancia para el anlisis qumico y una exigencia prctica para los centros donde se realizan. Actualmente, en nuestro pas, el Ministerio de Educacin Superior se ha dado a la tarea de acreditar laboratorios de ensayos en las universidades del pas. El laboratorio de Qumica del Medio Ambiente

del Departamento de Qumica, conjuntamente con el de analtica del CEBI, se encuentra dentro de los implicados en cumplir este reto en nuestra Universidad. La acreditacin de ensayos es necesaria para ofrecer servicios confiables a los clientes del territorio e incrementar la competitividad de nuestros laboratorios, teniendo en cuenta la necesidad del monitoreo de contaminantes en la regin, para lo cual ofrecemos servicios cientfico-tcnicos.

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Los mtodos ms comunes para estimar la contaminacin orgnica se basan en la determinacin global de las materias oxidables presentes en el agua y que son susceptibles de oxidarse a partir del oxgeno del medio, pues los mtodos que determinan especficamente cada una de las sustancias orgnicas presentes, son mas laboriosos. Para el anlisis global de la materia orgnica contaminante, actualmente son usados los siguientes mtodos: - La Demanda Qumica de Oxgeno (DQO), medida de las materias oxidables por el dicromato de potasio en medio cido. - La Demanda Biolgica de Oxgeno (DBO): medida de las materias orgnicas biodegradables. La DQO puede considerarse como una medida aproximada de la demanda terica de oxgeno. La DQO se define como la cantidad de oxgeno que es equivalente a la cantidad de dicromato de potasio, el cual es consumido por las materias disueltas y en suspensin, cuando la muestra es tratada por dicho oxidante en las concentraciones definidas. Existen muchas modificaciones para la determinacin de DQO por oxidacin con dicromato de potasio. Este mtodo es preferido sobre otros que utilizan distintos agentes oxidantes por poseer una mayor capacidad para oxidar (oxida entre un 95 y un 100 % de los compuestos orgnicos presentes) y por ser aplicable a una gran variedad de muestras, adems de su fcil manipulacin. Para la digestin de la materia orgnica, se reportan los mtodos por reflujo abierto y reflujo cerrado, realizndose la deteccin del mismo por mtodos volumtricos o espetrofotomtricos. La determinacin de la DQO se encuentra entre los mtodos ms habituales solicitados por nuestros clientes al Laboratorio de Qumica Analtica del CEBI, constituyendo uno de los puntales de nuestros servicios cientfico-tcnicos. Puede un laboratorio contar con los equipamientos ms modernos, que si no tiene mtodos apropiados y validados para los ensayos que satisfagan las

necesidades del cliente, no lograr la aceptacin y el reconocimiento de los mismos. Es por ello, que el presente trabajo tiene como objetivo realizar una validacin de adecuacin de la tcnica de DQO por el mtodo de reflujo cerrado, utilizando dicromato de potasio como agente oxidante en nuestras condiciones de laboratorio, para aguas y aguas residuales.

Materiales y mtodos
Equipos y materiales
Las determinaciones fueron realizadas utilizando equipos y cristalera calibrada y validada por el CEN. Los reactivos son de calidad apropiada para los ensayos realizados.

Mtodos de anlisis
Descripcin del mtodo de calentamiento con reflujo abierto y deteccin volumtrica 1. Tomar con pipeta una alcuota de muestra de 1 mL e introducirlo en un erlenmeyer de 50 mL con boca adaptable. 2. Aadir 1 mL de solucin de dicromato de potasio 0,25 N y 0,04 g de H2SO4. 3. Se adicionan 3 mL de cido sulfrico concentrado, el cual contiene Ag 2SO 4. La mezcla se refluja durante 15 min, sobre bao de arena. 4. Se diluye la mezcla hasta aproximadamente 10 mL con agua destilada y se valora el exceso de K 2Cr 2O 7 con sulfato de amonio ferroso, utilizando ferrona como indicador. 5. Se trata un blanco de la misma forma, aadiendo 1 mL de H2O (d).
(Vb- Vm) N 8 000 DQO mg/L= mL de muestra

donde: Vb = mL de Fe (NH 4)2 (SO4) consumidos en el ensayo del blanco. Vm = mL de Fe (NH4)2 (SO4) consumidos para la muestra. N= Concentracin de Fe (NH4)2 (SO4).
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Descripcin del mtodo de calentamiento con termoreactor de DQO y deteccin espectrofotomtrica

1. Homogeneizar la muestra. 2. Encender el reactor DQO y precalentar a 150 0C 3. Quitar el tapn de tubo de reactivo, y mantenindolo con un ngulo de 450, aadir 2 mL de la muestra. 4. Cerrar hermticamente y agitar cuidadosamente. 5. Preparar blanco de reactivos. 6. Calentar los tubos durante 2 h. 7. Enfriar aproximadamente 20 min y agitar varias veces. 8. Realizar lectura en espectrofotmetro a 620 nm contra blanco de reactivos.

Metodologa de validacin del mtodo analtico

Linealidad: De la solucin patrn, se tomaron alcuotas correspondientes a 200, 400, 600, 800, 1 000 mg/L de DQO, y se realiz el mismo tratamiento para n= 10. Precisin: Se realiz por determinacin de la desviacin standard y C.V de los resultados del anlisis para n= 10 de muestras sintticas para tres niveles de concentracin en condiciones de repetibilidad. Exactitud o veracidad: Se realiz mediante un ensayo de recuperacin para n= 10. Se tom la muestra a la cual se reconoci la concentracin de DQO y se le adicion una cantidad conocida del analito que deba corresponder con la cantidad del analito presente en la muestra.

Preparacin de curva de calibracin

Se tomaron alcuotas de la solucin patrn de ftalato cido de potasio, de modo que la concentracin se encuentrara en el intervalo de 0-1 000 mg/L de DQO, y se realiz el mismo tratamiento que a las muestras.

% recuperacin =

FG muestra x analito - muestra s / analito IJ 100 H cantidad de analito aadido K

contaminacin orgnica de aguas industriales, residuales; ya sea para servicios cientfico-tcnicos, o proyectos de investigacin del Centro. Aun cuando se encuentra reportado este mtodo en el Standard Methods /1/, se hace necesario realizar una validacin de adecuacin del mismo a las condiciones de trabajo de nuestro laboratorio; as como prever variantes que permitan la realizacin de este ensayo en situaciones emergentes o de contingencia, sin que por ello se afecte la calidad e inmediatez del servicio. Se presenta como solucin alternativa para la realizacin de la determinacin de la DQO, el empleo de un bao de arena en sustitucin de un termoreactor. Al contar con una gran cantidad de datos experimentales, se procedi a la comparacin del mtodo de determinacin de la DQO con la utilizacin de ambas variantes, empleando, en ambos casos como va de digestin, el reflujo cerrado y la deteccin por espectrofotometra visible a una l de 620 nm.

Se calcul el valor medio (X), desviacin estndar (DE), y se aplic un anlisis estadstico mediante una prueba t de Student para 95 % de confiabilidad, comparando con el 100 % de recobrado. Lmite de deteccin y de determinacin Se realizaron determinaciones de DQO en muestras blanco para n= 20. Procesamiento estadstico Se realizaron pruebas de hiptesis, test de Student para comparacin de muestras, y pruebas de Fisher para comparacin de varianzas; adems de pruebas de regresin y correlacin. Para ello, se emple el programa computacional STARGRAPHICTM.

Resultados y discusin
Como habamos referido anteriormente la determinacin de la DQO constituye uno de los anlisis que con ms frecuencias se solicitan a nuestra Unidad Analtica para el monitoreo o deteccin de la

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Los resultados obtenidos de la comparacin de varianza y de medias de los resultados experimentales entre ambas variantes son reflejados en la tabla 1. Como se deriva del anlisis estadstico, ambas variantes resultan similares para el mtodo en cuestin que analizamos, por lo que podra emplearse el calentamiento de las muestras con un bao de arena pudiendo emplear otras fuentes de energa para el calentamiento cuando las condiciones lo requieran.

A continuacin se procedi a la comparacin de los dos mtodos clsicos utilizados para la determinacin de este parmetro de importancia ambiental. El primero (mtodo 1) consiste en la digestin a reflujo abierto con un bao de arena y utilizando como va de deteccin la determinacin volumtrica /2/; el segundo (mtodo 2) consiste en la digestin a reflujo cerrado con un termoreactor, utilizando como va de deteccin por espectroscopa visible. Los resultados del anlisis estadsticos se reflejan en la tabla 2.

TABLA 1. RESULTADOS DE LOS ANLISIS ESTADSTICOS REALIZADOS PARA COMPARAR EL EMPLEO DE TERMOREACTOR O BAO DE ARENA

Parmetro Media Desviacin estndar Varianza Grados de libertad

Con termoreactor 999,60 4,16 17,37 9

Con bao de arena 1 000,70 4,08 16,67 9

Test de Fisher: F= 1,0419 p= 0,9521; p> 0,05 se cumple H0: 1= 2 (n.s) Test de Student : t= 0,5960 p= 0,5585; p> 0,05 se cumple H0: 1= 2 (n.s)

TABLA 2. RESULTADOS DE LOS ANLISIS ESTADSTICOS REALIZADOS PARA COMPARAR LOS DOS MTODOS PROPUESTOS PARA LA DETERMINAR DQO

Parmetro Media Desviacin estndar Varianza Grados de libertad

Mtodo 1 998,50 4,22 17,83 9

Mtodo 2 999,60 4,16 17,37 9

Test de Fisher : F= 1,0262 p= 0,9698; p> 0,05 se cumple H0: 1 = 2 (n.s) Test de Student : t= 0,5262 p= 0,5650; p> 0,05 se cumple H0: 1= 2 (n.s)

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Como se puede apreciar, para las condiciones experimentales en que se desarrollan los mtodos se cumple la hiptesis de igualdad, tanto de medias como varianzas; por lo que los resultados obtenidos al emplear uno u otro mtodo, no difieren significativamente para un 95 % de confianza, por lo tanto, ambos pudieran ser empleados para las muestras que se realizan en el laboratorio de analtica. Partiendo de estos resultados, y teniendo en cuenta la posibilidad de procesar un mayor nmero de muestras a la vez y contando con el equipamiento requerido, se realiz la validacin del mtodo a reflujo cerrado (mtodo 2) con la utilizacin del termoreactor. Adems de las ventajas referidas, y apoyndonos en los resultados estadsticos anteriormente mostrados, aun cuando las diferencias entre ambos mtodos no son estadsticamente significativas, se observa una mayor precisin en el mtodo seleccionado para

validar y un mayor acercamiento a los valores reales ensayados. Para la validacin del mtodo, se procedi a la determinacin de algunos de los parmetros referidos en el Proyecto de Norma Cubana para la "Validacin de mtodos de ensayos qumicos" /3/. La figura 1 representa la curva de calibracin a travs de la cual se realiza la evaluacin de la linealidad del mtodo, al aplicar la regresin lineal para n= 10, con el objetivo de obtener la recta de mejor ajuste. Para ello, se determinaron muestras de concentraciones desde 0-1 000 mg/L. Al obtener un coeficiente de correlacin y de regresin lineal por encima de los lmites establecidos (r 0,99 y r2 0,98) nos indica una alta correspondencia entre la concentracin y la respuesta analtica para las diez determinaciones realizadas, para un 95 % de confiabilidad.

0,2 0,16

A (620 nm )

0,12 0,08 0,04 0 0 200 400 600

y = 0,002x r2= 0,998 9 r= 0,999 4

800

1000

1200

Conc.(mg/l)

Fig. 1. Curva de calibracin para la determinacin de la DQO.

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La precisin del mtodo se evalu a travs de la determinacin de la desviacin tpica relativa (CV) para tres niveles de concentracin que abarcaron el intervalo de concentracin en que se encuentran las muestras que nos llegan al laboratorio, y en condiciones de repetibilidad. En la tabla 3 se reportan los resultados de este estudio.

Como se aprecia, el C.V obtenido para los tres niveles de concentracin, es menor que lo permitido como lmite para mtodos espectrofotomtricos (< 10 %), demostrando que el mtodo es preciso para las concentraciones establecidas en las condiciones de trabajo.

TABLA 3. RESULTADOS DEL ESTUDIO DE LA PRECISIN DEL MTODO DE DETERMINACIN DE DQO

Concentracin Terica (mg/L) 350 700 1 000

Media (mg/L) (x) (n= 10) 350,9 699,1 999,6

Desviacin estndar (D.E) 3,7 5,2 4,2

Desviacin tpica relativa (% C.V) 1,1 0,7 0,4

Sesgo

0,9 - 0,9 - 0,4

Todo mtodo analtico requiere, que sus determinaciones se realicen de una forma veraz y precisa, pues de ello resulta la confiabilidad de los resultados /6/. Los resultados obtenidos al realizar la determinacin de DQO a un material de referencia interno (en este caso el ftalato cido de potasio, que es el que se reporta en bibliografa /2/ ) y reflejados en la tabla 2,

apoyan la determinacin de la veracidad, pues evidencian correspondencia entre los resultados encontrados y los reportados para el control. No obstante, para evaluar la veracidad del mtodo propuesto para la determinacin de DQO, se realiz un ensayo de recuperacin a tres niveles de concentracin y en condiciones de repetibilidad (n= 10), obtenindose los siguientes resultados:

TABLA 4. RESULTADOS DEL ESTUDIO DE VERACIDAD DEL MTODO

Cantidad inicial Cantidad de muestra aadida (mg/L) (mg/L) 350 350 500 700 500 700

Cantidad recuperada (mg/L) 695 998 1403

Recuperado (%) 99,3 99,5 100,4

Resultado del test de Student

t exp .= -1,0540; p= 0,3193 (n.s) t exp .= -0,7529; p= 0,4707 (n.s) t exp.= 1,2121; p= 0,2283 (n.s)

Los resultados expresados como recuperacin son la media de diez determinaciones.

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Para los valores obtenidos, se hizo un test de Student (t) con datos pareados, donde se compararon las medias de recobrado para cada nivel de concentracin con respecto al 100 % de recobrado (terico), teniendo como resultado la no existencia de diferencias significativas (p 0,05) para un 95 % de confiabilidad. Como se puede observar en la tabla anterior, los elevados porcentajes de recobrado nos confirman la exactitud del mtodo, al lograr valores que no presentan diferencias significativas con el 100 %. Segn las normas empleadas /3, 4/, basta con probar con un solo nivel de concentracin, para determinar la veracidad del mtodo. No obstante, para tener mayor rango de confiabilidad de los resultados que se obtienen en el ensayo, nos decidimos probar con diferentes intervalos, que habitualmente encontramos en nuestras determinaciones, como se refiere en otros trabajos /8/. Tambin valoramos este

parmetro de validacin para la mayor concentracin, que determinamos que es 1 000 mg/L, pues cuando aadimos igual concentracin, se requiere hacer diluciones para poder leer nuestras muestras. Esto nos permitira comprobar la veracidad para muestras donde el analito est en concentraciones superiores a las concentraciones de la curva de calibracin. Para ello, tomamos 10 determinaciones del recobrado como tamao muestral, donde se obtuvo X= 98,9 %; D.E= 3,3, y los resultados del test de Student arrojaron una texp.= -1,0541 y una p= 0,3193; or lo que nos permiti tener confianza en la posibilidad de realizar determinaciones y la veracidad de los resultados de muestras con diluciones. Por ltimo, nos dispusimos determinar los lmites de determinacin y de cuantificacin, para lo cual se realizaron determinaciones a muestras blanco (n= 20 muestras), cuyos resultados se exponen a en la tabla 5.

TABLA 5. RESULTADOS DE LOS LMITES DE DETERMINACIN Y CUANTIFICACIN (LD Y LC)

PARMETROS No. de muestras Media ( x ) D.E Xmxima Xmnima Lmite de deteccin ( x 3 D.E )

mg /l 20* 0,14 0,06 0,20 0,07 0,31 0,71

Lmite de cuantificacin (x 10 D.E ) * parmetro adimensional

Conclusin

A partir de los resultados anteriormente mostrados, queda establecido, que el mtodo de determinacin de la DQO que se valida, puede analizar muestras cuya concentracin sea superior a 0,71 mg/L.

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